專利名稱：一種苦瓜葉乙醇提取物化學(xué)成分的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物資源的綜合開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，涉及采用現(xiàn)代分析檢測儀器檢測植 物、蔬菜化學(xué)成分的檢測方法，更具體的說是一種苦瓜葉不同提取物中化學(xué)成分的檢測方法。
背景技術(shù)：
苦瓜(Momordica Charantia L)又名錦荔枝、癩葡萄、癩瓜、涼瓜等，系葫蘆科苦 瓜屬蔓性草本植物，據(jù)嵩明人蘭茂所著的《滇南本草》記載，苦瓜葉片具有治胃痛、痢疾、 療瘡腫毒、驅(qū)蟲等功效，通過田間調(diào)查和實(shí)驗(yàn)證實(shí)苦瓜葉及其提取物還具有較強(qiáng)抗蟲性， K. Prabakar等對(duì)苦瓜、蛇瓜、絲瓜、冬瓜和西瓜這五種葫蘆科植物葉片的甲醇提取物對(duì)致倦 庫蚊(Celux quinquefasciatus)幼蟲殺蟲活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明苦瓜葉甲醇提取物對(duì) 致倦庫蚊的殺蟲活性最大，其LC5tl值為465. 85ppm，低于其它四種葫蘆科植物。陳宏等采用 乙醚、丙酮、乙醇、石油醚4種有機(jī)溶劑浸提和熱提苦瓜葉片，以提取液涂抹桑葉和甘藍(lán)葉 分別飼喂家蠶和菜青蟲，試驗(yàn)結(jié)果表明4種有機(jī)溶劑提取液處理試蟲，其取食量降低，生 長速率緩慢，存活率下降，其中以乙醚提取液的作用效果最強(qiáng)。但苦瓜葉中對(duì)幼蟲具有殺蟲 活性的化學(xué)成分有哪些至今未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種苦瓜葉不同提取物中化學(xué)成分的檢測方法及結(jié)果。本文 通過氣相色譜_質(zhì)譜_計(jì)算機(jī)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)苦瓜葉中的化學(xué)成分作了一個(gè)系統(tǒng)的分析，試圖 揭示苦瓜葉抗蟲作用的化學(xué)本質(zhì)，為苦瓜葉片抗蟲作用的進(jìn)一步研究提供參考，并為苦瓜 葉作為一種植物資源的綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明內(nèi)容提供如下的技 術(shù)內(nèi)容一種苦瓜葉乙醇提取物化學(xué)成分的檢測方法，其特征在于包括如下的步驟(1)苦瓜葉乙醇提取物稱取5g磨成粉末過40 60目篩的干燥苦瓜葉片，加入200mL乙醇，于25 士 2°C避 光處浸提三天，抽濾，殘?jiān)靡掖记逑? 3次，合并濾液和洗滌液，用乙醇定容至250mL ； 然后取ImL醇提液至2mL樣品瓶中，用隊(duì)吹干，加30yL MSTFA振搖30 s，70°C衍生化 30min, 300rPm離心，所得衍生液上機(jī)測試，備用；(2)采用GC-MS進(jìn)行分析，氣相色譜條件柱子初始溫度60°C保持2min，以5°C / min升至150°C保持3min，再以10°C /min升至220°C，保持3min，進(jìn)樣口溫度250°C ；質(zhì)譜 連接線溫度250°C，高純氦氣為載氣，流速l.Oml/min，分流比60 1，進(jìn)樣量1. O μ L，質(zhì) 譜條件質(zhì)譜電離方式為ΕΙ，電子轟擊源電子能量70eV，離子源溫度250°C ；電子倍增器電 壓1. 0X105 ；溶劑延遲時(shí)間:3min ；掃描范圍m/z :35_1000aum ；(3)利用峰面積歸一化法計(jì)算各峰面積的相對(duì)含量，從苦瓜葉醇提物中鑒定81種 化學(xué)成分，占總成分的重量百分比為90. 86%，其中(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和
3棕櫚酸為苦瓜葉乙醇提取物中的主要化學(xué)成分，分別占總出峰面積的24. 48%,18. 18%和 13. 24% ；其它含量較高的化學(xué)成分還有龍腦(1.06% )，2_甲基-5-(l-甲基乙基)-苯酚 (2.86% )，4-(1，1_ 二甲基乙基酯)-1，2鄰苯二酚(3. 31% )，氧化石竹烯(2.07% )，植物 醇(2. 14% )，維甲酸- -葡糖苷酸-6' ,3'-內(nèi)酯(3. 19% )，辛烷酸(2.26% )；本發(fā)明采用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)分析技術(shù)對(duì)苦瓜葉乙醇提取物中的化 學(xué)成分進(jìn)行研究。結(jié)果從醇提物中簽定出81種化學(xué)成分，占總出峰面積的90. 86%，結(jié)果顯 示(Ζ，Ζ)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和棕櫚酸為苦瓜葉乙醇提取物中的主要化學(xué)成分， 本發(fā)明的檢測方法為苦瓜葉作為一種植物資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，提供了實(shí)證依據(jù)。本發(fā)明具更加優(yōu)選的試驗(yàn)方法如下1、材料與方法1.1儀器和試劑GC-MS 聯(lián)用儀(Thermo，F(xiàn)ocus GC, DSQ II，美國)TR-5MS 色譜柱(30mX 25mmX0. 25 μ m)，NIST05 標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA，F(xiàn)luka)，乙醇、乙醚、無水硫酸鈉和氫 氧化鈉均為分析純(天津市元立化工有限公司)苦瓜葉采自天津市郊區(qū)，經(jīng)鑒定為葫蘆目葫蘆科苦瓜屬長豐三號(hào)苦瓜的葉片，用 去離子水洗凈后烘干備用。1.2分析樣品的制備苦瓜葉乙醇提取物稱取5g磨成粉末的干燥苦瓜葉片(40 60目)置于棕色瓶中，加入200mL乙醇， 于室溫(25士2°C )避光處浸提三天，抽濾，殘?jiān)靡掖记逑? 3次，合并濾液和洗滌液， 用乙醇定容至250mL。苦瓜葉醇提物的衍生化處理取ImL醇提液至2mL樣品瓶中，用N2吹干，加30 μ L MSTFA，蓋緊蓋子，振搖30s， 70°C衍生化30min，所得衍生液上機(jī)測試。1. 3 GC-MS 分析條件氣相色譜條件柱子初始溫度60°C保持2min，以5°C /min升至150°C保持3min， 再以10°C /min升至220°C，保持3min ；進(jìn)樣口溫度250°C ；質(zhì)譜連接線溫度250°C，高純氦 氣為載氣，流速l.Oml/min ；分流比60 1;進(jìn)樣量1.01^。質(zhì)譜條件質(zhì)譜電離方式為EI，電子轟擊源電子能量70eV，離子源溫度250°C ；電 子倍增器電壓1. OX IO5 ；溶劑延遲時(shí)間3min ；掃描范圍m/z :35_1000aum。按上述GC-MS分析條件對(duì)苦瓜葉醇溶性成分上機(jī)測試，得乙醇提取物的總離子流 色譜圖(見圖1)和苦瓜葉乙醚提物物的總離子流色譜圖。各峰的鑒定主要通過NIST05譜 庫檢索，并根據(jù)有機(jī)化合物的質(zhì)譜斷裂一般規(guī)律和文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)分析確定，利用峰面積 歸一化法計(jì)算各峰面積的相對(duì)含量(結(jié)果見表1)。本發(fā)明共鑒定了苦瓜葉醇提物中的81種化學(xué)成分，占總成分的90. 86%，結(jié)果顯 示(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和棕櫚酸為苦瓜葉乙醇提取物中的主要化學(xué)成分， 分別占總出峰面積的24. 48%,18. 18%和13. 24% ；其它含量較高的化學(xué)成分還有龍腦 (1. 06，這是本實(shí)驗(yàn)首次在苦瓜葉中發(fā)現(xiàn)的，龍腦具有驅(qū)蟲作用，這可能就是苦瓜葉片具有抗蟲作用的原因之一 ；2-甲基-5-(l-甲基乙基)-苯酚(2.86% ) ；4-(1，1_ 二甲基乙基 酯)-1，2鄰苯二酚(3.31%)；氧化石竹烯(2.07%)；植物醇(2. 14% )；維甲酸_ _葡糖 苷酸-6'，3'-內(nèi)酯(3.19%)；辛烷酸(2.26%)等。從化合物類型來看，苦瓜葉乙醇提 取物的主要化學(xué)成分為脂肪酸、醇類、酯類和萜類等，其中以醇類的含量最為豐富。表1苦瓜葉乙醇提取物化學(xué)成分的GC-MS分析結(jié)果 3 結(jié)論將樣品衍生化技術(shù)和GC-MS聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于苦瓜葉化學(xué)成分的分析鑒定上，本發(fā) 明從乙醇提取液中鑒定出81種化學(xué)成分，占總出峰面積的90. 86%。結(jié)果顯示(Z，Z)-9， 12-十八碳二烯酸、百里酚和棕櫚酸為苦瓜葉乙醇提取液中的主要化學(xué)成分。本研究首次發(fā) 現(xiàn)苦瓜葉中含有龍腦和百里酚，相對(duì)含量分別為1.06%和18. 23%，龍腦具有驅(qū)蟲作用，百 里酚對(duì)昆蟲有毒殺作用，這與苦瓜葉提取液具有驅(qū)蟲和毒殺害蟲的藥理作用相一致，這為 苦瓜葉抗蟲作用的進(jìn)一步研究和苦瓜葉的綜合開發(fā)利用提供了實(shí)證依據(jù)。


圖1苦瓜葉乙醇提取物的總離子流色譜圖。
具體實(shí)施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供下述制備方法實(shí)施實(shí)例。這些實(shí)施實(shí)例僅 僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍，所用原料均有市售。實(shí)施例1(1)苦瓜葉乙醇提取物將采自天津市郊區(qū)的苦瓜葉，用去離子水洗凈后烘干備用。稱取5g磨成粉末過60 目篩的干燥苦瓜葉片，加入200mL乙醇，于25士2°C避光處浸提三天，抽濾，殘?jiān)靡掖记逑?3次，合并濾液和洗滌液，用乙醇定容至250mL ；然后取ImL醇提液至2mL樣品瓶中，用N2吹 干，加30 μ L N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺振搖30s，70°C衍生化30min，300rPm離心， 取上層液作GC-MS分析。實(shí)施例2采用GC-MS進(jìn)行分析，氣相色譜條件柱子初始溫度60°C保持2min，以5°C /min升至150°C保持3min，再以10°C /min 升至220°C，保持3min，進(jìn)樣口溫度250°C ；質(zhì)譜連接線溫度250°C，高純氦氣為載氣，流速 1. Oml/min，分流比60 1，進(jìn)樣量1.0yL。質(zhì)譜條件質(zhì)譜電離方式為EI，電子轟擊源電子能量70eV，離子源溫度250°C ；電 子倍增器電壓1. OX IO5 ；溶劑延遲時(shí)間3min ；掃描范圍m/z :35_1000aum。按上述GC-MS分析條件對(duì)苦瓜葉醇溶性成分上機(jī)測試，得乙醇提取物的總離子流 色譜圖(見圖1)。各峰的鑒定主要通過NIST05譜庫檢索，并根據(jù)有機(jī)化合物的質(zhì)譜斷裂一 般規(guī)律和文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)分析確定，利用峰面積歸一化法計(jì)算各峰面積的相對(duì)含量(結(jié)果 見表1)。實(shí)施例3(1)苦瓜葉乙醇提取物
稱取5g磨成粉末過40目篩的干燥苦瓜葉片，加入200mL乙醇，于25士2°C避光處 浸提三天，抽濾，殘?jiān)靡掖记逑? 3次，合并濾液和洗滌液，用乙醇定容至250mL ；然后 取ImL醇提液至2mL樣品瓶中，用N2吹干，加30 μ L MSTFA振搖30s，70°C衍生化30min， 300rPm離心，所得衍生液上機(jī)測試，備用；(2)采用GC-MS進(jìn)行分析，氣相色譜條件柱子初始溫度60°C保持2min，以5°C / min升至150°C保持3min，再以10°C /min升至220°C，保持3min，進(jìn)樣口溫度250°C ；質(zhì)譜 連接線溫度250°C，高純氦氣為載氣，流速l.Oml/min，分流比60 1，進(jìn)樣量1. O μ L，質(zhì) 譜條件質(zhì)譜電離方式為ΕΙ，電子轟擊源電子能量70eV，離子源溫度250°C ；電子倍增器電 壓1. 0X105 ；溶劑延遲時(shí)間:3min ；掃描范圍m/z :35_1000aum ；(3)利用峰面積歸一化法計(jì)算各峰面積的相對(duì)含量，從苦瓜葉醇提物中鑒定81種 化學(xué)成分，占總成分的重量百分比為90. 86%，其中(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和 棕櫚酸為苦瓜葉乙醇提取物中的主要化學(xué)成分，分別占總出峰面積的24. 48%,18. 18%和 13. 24% ；其它含量較高的化學(xué)成分還有龍腦(1.06% )，2_甲基-5-(l-甲基乙基)-苯酚 (2.86% )，4-(1，1_ 二甲基乙基酯)-1，2鄰苯二酚(3. 31% )，氧化石竹烯(2.07% )，植物 醇(2. 14% )，維甲酸- -葡糖苷酸-6' ,3'-內(nèi)酯(3. 19% )，辛烷酸(2.26% )。
權(quán)利要求
一種苦瓜葉乙醇提取物化學(xué)成分的檢測方法，其特征在于包括如下的步驟(1)苦瓜葉乙醇提取物稱取5g磨成粉末過40～60目篩的干燥苦瓜葉片，加入200mL乙醇，于25±2℃避光處浸提三天，抽濾，殘?jiān)靡掖记逑?～3次，合并濾液和洗滌液，用乙醇定容至250mL；然后取1mL醇提液至2mL樣品瓶中，用N2吹干，加30μL N 甲基 N 三甲基硅烷三氟乙酰胺振搖30s，70℃衍生化30min，300rPm離心，備用；(2)采用GC MS進(jìn)行分析，氣相色譜條件柱子初始溫度60℃保持2min，以5℃/min升至150℃保持3min，再以10℃/min升至220℃，保持3min，進(jìn)樣口溫度250℃，質(zhì)譜連接線溫度250℃，高純氦氣為載氣，流速1.0ml/min，分流比60∶1，進(jìn)樣量1.0μL；質(zhì)譜條件質(zhì)譜電離方式為EI，電子轟擊源電子能量70eV，離子源溫度250℃，電子倍增器電壓1.0×105，溶劑延遲時(shí)間3min，掃描范圍m/z35 1000aum；(3)利用峰面積歸一化法計(jì)算各峰面積的相對(duì)含量，從苦瓜葉醇提物中鑒定81種化學(xué)成分，占總成分的重量百分比為90.86％，其中(Z，Z) 9，12 十八碳二烯酸、百里酚和棕櫚酸，分別占總出峰面積的24.48％、18.18％和13.24％；其它含量較高的化學(xué)成分還有1.06％龍腦，2.86％2 甲基 5 (1 甲基乙基) 苯酚，3.31％4 (1，1 二甲基乙基酯) 1，2鄰苯二酚，2.07％氧化石竹烯，2.14％植物醇，3.19％維甲酸 á 葡糖苷酸 6′，3′ 內(nèi)酯，2.26％辛烷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苦瓜葉乙醇提取物化學(xué)成分的檢測方法，即通過GC-MS技術(shù)鑒定苦瓜葉片化學(xué)成分的方法和結(jié)果。它是采用有機(jī)溶劑室溫浸提苦瓜葉片的方法得到提取液，經(jīng)過衍生化處理后再經(jīng)毛細(xì)管色譜柱分離，將所得樣品質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫中的譜圖對(duì)比定性，并采用峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。從苦瓜葉乙醇提取物中鑒定出81種化學(xué)成分，占總出峰面積的90.86％，結(jié)果顯示(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、百里酚和棕櫚酸為苦瓜葉乙醇提取物中的主要化學(xué)成分，并且還發(fā)現(xiàn)乙醇提取物中含具有驅(qū)蟲作用的龍腦和對(duì)昆蟲具有毒殺作用的百里酚。本發(fā)明為苦瓜葉作為一種植物資源的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，提供了實(shí)證依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N30/88GK101929990SQ20101022532
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者吳志杰, 陳宏 , 雷盯函 申請人:天津師范大學(xué)