專利名稱：使用微顆粒多重檢測法檢測非整倍性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于在微顆粒混合物中檢測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方法能 夠檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒的大小、任何附著的報告分 子的熒光光譜、報告分子的熒光強度和各分類箱中顆粒的數(shù)目。這些微顆粒種類特別地用 于許多遺傳或生化多重研究中并且特別地用作用于在生物體或生物體的胚胎中檢測非整 倍性的結(jié)合劑。在人中，至少24種微顆粒的檢測和分選可滿足用于針對所有染色體的同時 檢測的單管方法，其中各不同的微顆粒種類包含與多核苷酸序列(對特定的人染色體是唯 一的)互補和特異性地針對其的多核式酸序列。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本發(fā)明用于 同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性，所述生物體具有216或更少的染色體對。也提 供了用于在一個或多個人染色體中同時檢測非整倍性的試劑盒?，F(xiàn)有技術(shù)描述在說明書的末尾也收集了本說明書參考的文獻(xiàn)的詳細(xì)目錄。本說明書中的任何現(xiàn) 有技術(shù)不是也不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是承認(rèn)或任何形式的暗示在任何國家該現(xiàn)有技術(shù)形成了部分 共同的普遍知識。在正常情況下在二倍體生物體中，來自各親本的一個染色體傳遞給子代胚胎。然 而，于母本、父本或雙方中的不分離事件可導(dǎo)致具有異常染色體數(shù)目的胚胎，稱作非整倍性 的狀況。整倍性是具有正確數(shù)目的結(jié)構(gòu)正常的染色體的狀況。例如，整倍性人雌性個體具 有46條染色體(44條常染色體和2條X染色體)，而整倍性公牛具有60條染色體(58條常 染色體加一條X和一條Y染色體)。非整倍性是具有少于或多于天然整倍性染色體數(shù)目的狀況，并且最有可能觀察到 細(xì)胞形成異常的類型。換句話說，其是來自整倍性的任何異常，盡管許多作者將該術(shù)語限定 用于只有少量染色體丟失或添加的狀況。通常，因為大的異常幾乎是與存活不相容的并且這樣的個體通常在出生前就已死 亡，所以由于這個簡單的原因非整倍性被認(rèn)為是整倍性的小異常。兩個最普遍觀察到的非整倍性形式是單體性和三體性。單體性缺少成對染色體中的一個染色體。具有只有一個6號染色體的個體稱為具 有單體性6。在許多物種中見到的普遍的單體性是X染色體單體性，在人中也稱為Turner 綜合征。在出生前的發(fā)育期單體性是最普遍的致死因子。三體性是具有三條特定類型的染色體。人中普遍的常染色體三體性是Down綜合 癥，或三體性21，其中人具有三條而不是正常的兩條21號染色體。三體性是多體性的特 殊例子，多體性是更廣義的術(shù)語，其表示具有超過兩個任意給定的染色體(在二倍體生物中)。另一種非整倍性是三倍性。三倍體個體中每個染色體都有三條，即，三套單倍體的 染色體。三倍體人具有69條染色體(3套23個染色體的單倍體)，三倍體狗具有117條染 色體。三倍體的產(chǎn)生似乎相對普遍并且可通過例如用兩個精子受精產(chǎn)生。然而，活的三倍 體的出生是非常罕見的并且這種個體非常不正常的。出生后存活超過數(shù)小時的稀有三倍體 幾乎肯定是嵌合體，其具有很大比例的雙倍體細(xì)胞。當(dāng)染色體斷裂和碎片丟失時，便發(fā)生染色體缺失。這當(dāng)然涉及到遺傳信息的丟失 并導(dǎo)致針對該染色體被稱作“部分單倍性”的狀況。相關(guān)的畸形是染色體倒位。在該情況下，斷裂發(fā)生并且染色體片段倒置并重新連 接起來而不是丟失。因此倒位是重排，不涉及遺傳物質(zhì)的丟失，并且除非斷裂點破壞了重要 的基因，否則攜帶倒位的個體具有正常的表型。在單體性樣品中(具有2Π-1條染色體)，一條完整的染色體和所有其座位丟失。類 似地，在2n+l三體性樣品中，各細(xì)胞中出現(xiàn)一條額外的染色體，意味著由于不分離事件(通 常發(fā)生在雌配子形成過程中)造成一條特定的染色體出現(xiàn)三次。類似的但更明顯的情形在 三倍體樣品的情況下發(fā)生，在三倍體樣品中各染色體在所有細(xì)胞中出現(xiàn)三次而不是兩次。通過使用體外受精(IVF)技術(shù)可使不育婦女產(chǎn)生懷孕。盡管體外受精率較高，但 按照這些方法的懷孕率相對較低，在15%至25%的范圍內(nèi)。人卵母細(xì)胞(不能體外受精后 固定的卵母細(xì)胞)的細(xì)胞發(fā)生研究顯示相對較高的染色體異常(非整倍性)發(fā)生率。同 樣，許多自然流產(chǎn)和不足月胚胎的研究顯示染色體異?？赡苁翘毫魇У闹饕?。在使 用IVF產(chǎn)生的胚胎中染色體異常的頻率遠(yuǎn)高于報道的針對精子和卵母細(xì)胞的總的異常性。在IVF方法中，非整倍性是產(chǎn)生的胚胎中最常觀察到的異常性。許多報道強有力 地表明染色體的非整倍性是卵母細(xì)胞受精和胚胎移植失敗的主要原因。非整倍性主要產(chǎn)生 于減數(shù)分裂性不分離時間；但許多環(huán)境因素也可以破壞紡錘體并最終導(dǎo)致非整倍體胚胎的 形成。使用目前本領(lǐng)域已知的方法估計胚胎總體染色體組成，可進(jìn)行細(xì)胞形成分析，例 如核型分析。然而，該方法不是針對單個細(xì)胞的實際解決方法，因而不能進(jìn)行植入前篩查。因此，需要發(fā)展用于在胚胎中檢測非整倍性的快速、便宜、自動化的方法，所述方 法可用于體外受精的植入前設(shè)計。本發(fā)明提供了方法，除其它以外，所述方法用作同時檢測 受試者的一個、多個或全部染色體非整性的快速、單管的方法。特別地，該方法可增加IVF的成功率，因為具有異常染色體成員(非整倍體)的胚 胎可通過胚胎發(fā)生的遺傳組成的植入前掃描篩查出來。發(fā)明簡述本發(fā)明提供用于在微顆粒混合物中檢測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方法能用 于檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒大小、任何附著的報告分子 的熒光光譜、報告分子的熒光強度。第四種分類特征是特定顆粒種類中顆粒的數(shù)目。通過使 用重復(fù)數(shù)目在對微顆粒重復(fù)實驗以區(qū)分獨立的實驗的結(jié)果是可能的。這些微顆粒種類具有 特別地應(yīng)用，在生物體或生物體的胚胎中檢測非整倍性中作為結(jié)合劑。在人中，至少24種 微顆粒的檢測和分選滿足用單管方法同時檢測所有染色體的非整倍性，其中各不同的微顆 粒種類包含多核苷酸序列，所述序列與對特定的人染色體來說是唯一的多核酸序列互補，且對其是特異性的。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本方法用于同時檢測生物體中所有染色 體的非整倍性，所述生物體具有216對或更少染色體對。也提供了用于在一種或多種人染 色體中同時檢測非整倍性的試劑盒。通過用于從微顆?；旌衔镏卸嘀貦z測和分選幾種不同種類的微顆粒的方法可部 分地預(yù)測本發(fā)明，所述方法基于微顆粒的大小、存在于微顆粒上的任何標(biāo)記、標(biāo)記的強度和 微顆粒存在的數(shù)目。本發(fā)明者已證實有可能區(qū)分在特定大小的微顆粒上給定的熒光標(biāo)記的強度。此 外，本發(fā)明者已制造了對于給定的標(biāo)記物具有6種不同熒光強度的微顆粒。另外，基于顆粒 數(shù)目可對事件進(jìn)行區(qū)分。因此，通過將微顆粒大小的數(shù)據(jù)與熒光強度數(shù)據(jù)相結(jié)合，本發(fā)明提供了對于單標(biāo) 記的微顆粒種類區(qū)分36種不同微顆粒種類的方法。然而，本發(fā)明也包括多重標(biāo)記的微顆 粒，例如雙標(biāo)記的微顆粒，所述微顆粒接著可分成至少216類。此外，本發(fā)明允許無限的基 于差別分類的種類，所述差別分類基于顆粒數(shù)目。因此，本發(fā)明涉及用于從微顆?；旌衔镏袡z測和分選標(biāo)記的或未標(biāo)記的微顆粒的 方法，其基于一個或多個下列特征(i)微顆粒大小(ii)微顆粒標(biāo)記物(iii)微顆粒標(biāo)記物強度(iV)微顆粒數(shù)目在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法使用流式細(xì)胞儀檢測和/或分選微顆 粒。本發(fā)明特別優(yōu)選的應(yīng)用是在生物體或生物體胚胎的一個或多個染色體中同時多 重檢測非整倍性。如果給定量的代表特定染色體數(shù)目的DNA (來自已知的對照二倍體DNA)與相似量 的來自給定的生物學(xué)樣品的DNA競爭有限數(shù)目的結(jié)合靶，那么所述DNA應(yīng)當(dāng)以其相對頻率 結(jié)合靶。在本發(fā)明中為了區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)和樣品，優(yōu)選地用于樣品和標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記物具有不同的發(fā) 射光譜。此外，當(dāng)進(jìn)行部分多重反應(yīng)時，樣品和標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記物的熒光光譜必須與附著在結(jié)合 劑上的標(biāo)記物的熒光光譜不同。因此，本發(fā)明提供了用于同時檢測受試者一個或多個染色體非整倍性的方法，所 述方法包括(i)產(chǎn)生報告分子標(biāo)記的多核苷酸樣品，所述多核苷酸樣品是所述受試者的各染 色體豐度的代表；(ii)產(chǎn)生針對各染色體的等量的非_非整倍性多核苷酸標(biāo)準(zhǔn)，其用不同報告分子 標(biāo)記；(iii)針對各染色體將所述樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)與一定量的結(jié)合劑混合，其中所述結(jié) 合劑包含與針對各染色體的樣品和標(biāo)準(zhǔn)互補的多核苷酸，其中所述結(jié)合劑多核苷酸固定在 微顆粒上，結(jié)合針對各染色體的多核苷酸序列的微顆粒在大小和/或熒光標(biāo)記物和/或熒 光標(biāo)記物強度上不同；
其中來自樣品和標(biāo)準(zhǔn)之標(biāo)記的在微顆粒上的熒光標(biāo)記物(如果存在)具有不同的 發(fā)射光譜；其中通過樣品和標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)合劑的不等同結(jié)合來檢測非整倍性。使用本發(fā)明的多重檢測方法能夠同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性。各 結(jié)合劑或結(jié)合劑組包含特異性針對特定染色體(和與來自該染色體的樣品和標(biāo)準(zhǔn)多核苷 酸序列互補)的多核苷酸，所述多核苷酸被固定在微顆粒上，所述微顆粒在大小、熒光標(biāo)記 物、熒光強度或這些特征的組合上與其它結(jié)合劑不同。然后單個地估計這些不同的微顆粒 對樣品和標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合。因此，其提供了針對樣品中多個染色體相對頻率的同時測量。在一個方面，結(jié)合于來自特定染色體的微顆粒的多核苷酸數(shù)目可以從大約1至大 約40，000。在優(yōu)選的方面，結(jié)合所述微顆粒的多核苷酸的數(shù)目從大約1至大約3，000。在 最優(yōu)選的方面，結(jié)合微顆粒的多核苷酸的數(shù)目大約為2，000。本發(fā)明的方法用于在任何生物體中非整倍性的檢測。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，受試者是使用體外受精產(chǎn)生的人或其它動物的胚 胎。本發(fā)明的方法能夠在提取的和/或從單個細(xì)胞擴(kuò)增的DNA中檢測非整倍性。因此， 本發(fā)明的方法尤其適合用于在移植利用體外受精產(chǎn)生的動物胚胎之前，在所述胚胎中檢測 非整倍性。為了檢測生物體中染色體的數(shù)目，本發(fā)明用于檢測生殖細(xì)胞中的不分離事件。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于在生物體、胚胎或生殖組織中對多個染色體同時檢測非整 倍性的試劑盒。表1提供此處所用的縮寫詞目錄表 1.縮寫詞
權(quán)利要求
下述三種材料在制備用于在受試者的一個或多個染色體中同時檢測非整倍性的診斷劑中的用途(i)熒光性標(biāo)記的多核苷酸樣品，所述多核苷酸樣品是所述受試者的各染色體豐度的代表；(ii)針對各染色體的等同的非 非整倍性多核苷酸標(biāo)準(zhǔn)，用與樣品不同的熒光標(biāo)記物標(biāo)記；和(iii)針對各染色體的有限量的結(jié)合劑，其用于與所述樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)混合，其中所述結(jié)合劑包含與針對各染色體的樣品和標(biāo)準(zhǔn)互補的多核苷酸，其固定在微顆粒種類上，并且針對各染色體的每一類微顆粒在熒光標(biāo)記物和該微顆粒種類中的微顆粒數(shù)目方面不同；其中所述微顆粒上的熒光標(biāo)記物，如果有的話，具有與樣品和標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記物不同的發(fā)射光譜；其中所述診斷劑通過所述樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)與所述結(jié)合劑的非等同結(jié)合來檢測非整倍性。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述微顆粒進(jìn)一步在大小和/或熒光標(biāo)記物強度方面不同。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述微顆粒在下述方面不同每一種類中的微顆粒的 數(shù)目、大小、熒光標(biāo)記物和熒光強度。
4.權(quán)利要求1至3中任一項的用途，其中所述受試者是二倍體生物。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述受試者是哺乳動物。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的用途，其中所述受試者是人。
7.權(quán)利要求1至5中任一項的用途，其中所述受試者是家畜動物。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述家畜動物選自牛、綿羊和馬。
9.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述受試者是胚胎。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述胚胎利用體外受精產(chǎn)生。
11.權(quán)利要求9的用途，其中所述診斷劑適于在移植之前在所述胚胎中檢測非整倍性。
12.權(quán)利要求11的用途，其中從卵裂球中分離、產(chǎn)生或擴(kuò)增所述多核苷酸樣品。
13.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述多核苷酸樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生自來自體細(xì)胞的基 因組DNA。
14.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述多核苷酸樣品和/或所述標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生自來自生殖細(xì) 胞或配子的基因組DNA。
15.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述結(jié)合劑包含固定在微顆粒上的對所述樣品和標(biāo)準(zhǔn) 具有結(jié)合特異性的核酸。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述微顆粒是二氧化硅微顆粒。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述二氧化硅微顆粒被硅烷化。
18.權(quán)利要求2的用途，其中使用流式細(xì)胞儀測定標(biāo)記的樣品和/或標(biāo)準(zhǔn)，和/或標(biāo)記 的樣品與標(biāo)準(zhǔn)的相對量。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在微顆?；旌衔镏袡z測和分選微顆粒的方法。本發(fā)明的方法能夠檢測和分選許多不同的微顆粒種類。檢測和分選基于微顆粒的大小、任何附著的報告分子的熒光光譜、報告分子的熒光強度和各分類箱中顆粒的數(shù)目。這些微顆粒種類特別地用于許多遺傳或生化多重研究，并且特別地作為用于在生物體中或生物體的胚胎中檢測非整倍性的結(jié)合劑。在人中，至少24種微顆粒的檢測和分選可滿足用于針對所有染色體的同時檢測的單管方法，其中各不同的微顆粒種類包含與多核苷酸序列(對特定的人染色體是唯一的)互補和特異性地針對其的多核苷酸序列。此外，使用目前可獲得的技術(shù)，本發(fā)明用于同時檢測生物體中所有染色體的非整倍性，所述生物體具有216或更少的染色體對。也提供了用于在一個或多個人染色體中同時檢測非整倍性的試劑盒。
文檔編號G01N33/543GK101956002SQ20101025078
公開日2011年1月26日 申請日期2004年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者A·P·懷爾登伯格, K·波特 申請人:杰納羅生物系統(tǒng)有限責(zé)任公司