專利名稱：：產(chǎn)前診斷和監(jiān)測的標(biāo)記的制作方法產(chǎn)前診斷和監(jiān)測的標(biāo)記相關(guān)申請的相互參考本申請要求在2005年3月18日提交的美國臨時申請第60/663,293號的優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容全部引用作為參考。
背景技術(shù)：
：通過例如絨毛膜絨毛取樣(CVS)或羊膜穿刺術(shù)的方法，可以使用從胎兒分離到的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前診斷。然而，盡管操作極其小心，但是這些常規(guī)的方法依然是侵入性的，并且對母親和胎兒具有明顯的危險(Taboretal.，Lancet11287-1293，1986)?，F(xiàn)已開發(fā)出對這些侵入性方法的替代方法，例如，依據(jù)在母體循環(huán)中可以找到幾種胎兒細(xì)胞這一發(fā)現(xiàn)，可以對胎兒異常進(jìn)行測定(Johansenetal.，Prenat.Diagn.15921-931，1995)，更重要的是可以在母體血漿和血清中對非細(xì)胞的循環(huán)胎兒DNA進(jìn)行測定(Loetal.，Lancet350485-487,1997)?，F(xiàn)已證明，與分離和富集母體循環(huán)中胎兒細(xì)胞的必須步驟相比，無需對血漿或血清進(jìn)行復(fù)雜的處理，母體血液中胎兒DNA的量就已足夠進(jìn)行遺傳分析。使用基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的技術(shù)，已經(jīng)在母體血液中通過胎兒DNA測定實(shí)現(xiàn)了胎兒恒河猴D(RhD)基因型測定(Loetal.，N.Engl.J.Med.3391734-1738，1998)，胎兒性別測定(Loetal.，Hum.Genet.90483-488,1993)以及若干胎兒病癥的診斷(Amicuccietal.，Clin.Chem.46301-302，2000；Saitoetal.,Lancet3561170，2000；及Chiuetal.,Lancet360998—1000，2002)。此外，已經(jīng)有報道說明在先兆子癇(Loetal.，Clin.Chem.45184-188，1999andZhongetal.,Am.J.Obstet.Gynecol.184414-419，2001)，胎兒21號染色體三體(Loetal.,Clin.Chem.451747-1751，1999andZhongetal.Prenat.Diagn.20795-798，2000)以及妊娠劇吐(Sekizawaetal.，ClinChem.472164-2165，2001)中母體血漿/血清中胎兒DNA的數(shù)量異常。美國專利第6,258,540號中也已經(jīng)公開了用于產(chǎn)前遺傳分析的母體血液中胎兒核酸測定的內(nèi)容。當(dāng)對胎兒DNA進(jìn)行分析時，研究人員通常將僅存在于男性胎兒中的Y染色體標(biāo)記用作胎兒特異性標(biāo)記。該方法將其技術(shù)的應(yīng)用局限于50%的孕婦，即懷有男性胎兒的。而且，其它遺傳多態(tài)現(xiàn)象的使用也增加了基于胎兒DNA分析的復(fù)雜性。在母體血漿中發(fā)現(xiàn)的胎兒RNA為克服這些限制提供了可能的新方法(Poemetal.,Clin.Chem.461832-1834，2000)。近來，美國專利申請第09/876,005號公開了基于在母體血液中對胎兒/胎盤RNA進(jìn)行測定的非侵入性技術(shù)。此外，美國專利申請第10/759,783號還公開了某些胎盤表達(dá)的mRNA標(biāo)記(例如人絨毛膜促性腺激素β亞基和人促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素)，這些標(biāo)記可用來對諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性以及未足月生產(chǎn)的妊娠和妊娠相關(guān)病癥進(jìn)行測定。已經(jīng)在母體血液中對多種胎盤來源的其它RNA類型進(jìn)行了測定，參見，例如Oudejansetal.，ClinChem.2003，49(9)1445-1449，以及Goetal.，Clin.Chem.2004,50(8)1413-1414。本發(fā)明還公開了其它的衍生自胎兒/胎盤的RNA類型，如表1至表6所示，這些RNA類型是在母體血液中發(fā)現(xiàn)的，并且可用作檢測妊娠、或胎兒基因型分析、或?qū)ο日鬃影B和諸如18號染色體三體和21號染色體三體的胎兒染色體非整倍性進(jìn)行診斷、監(jiān)測和預(yù)測的標(biāo)記。因此，本發(fā)明還提供了非侵入性產(chǎn)前診斷的其它工具以及妊娠檢測的替代方法。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及診斷、監(jiān)測或預(yù)測孕婦先兆子癇的方法。該方法包括以下步驟首先，定量測定所述孕婦生物樣品中的一種或多種RNA類型的含量。所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含IGFBP3、ABPUFNUSLC21A2、KIAA0992、TIMP3、LPL>INHBA、LEP>ADAMl2,PAPPA、PAPPA2和SIGLEC6的遺傳座位衍生得到的RNA類型，且所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛。其次，將第一步中所述RNA類型的量與正常非先兆子癇孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型的量的標(biāo)準(zhǔn)對照相比較。所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高或降低說明先兆子癇或發(fā)展為先兆子癇的高易感性。在一些實(shí)施方案中，所述RNA類型衍生自ADAM12、PAPPA2、FNUINHBA、LEP或SIGLEC6，且所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高說明先兆子癇或發(fā)展為先兆子癇的高易感性。在其它實(shí)施方案中，所述RNA類型衍生自PAPPA，所述RNA類型的量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照降低說明先兆子癇或發(fā)展為先兆子癇的高易感性。在一些實(shí)施方案中，所述的第一步包括使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)?？蛇x擇地，所述第一步還可包括在RT-PCR之后使用質(zhì)譜。在其它實(shí)施方案中，所述第一步包括使用多聚核苷酸雜交方法，或使用引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，被檢測的孕婦處于妊娠的頭三個月。在其它實(shí)施方案中，所述孕婦處于妊娠的中三個月或末三個月。在一些實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血漿部分進(jìn)行分析。在其它實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血清部分進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，所述RNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對照升高超過2倍。在其它實(shí)施方案中，所述RNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對照降低超過50%。本發(fā)明還提供了診斷、監(jiān)測或預(yù)測孕婦先兆子癇的試劑盒。該試劑盒包括ω對所述孕婦生物樣品中的一種或多種RNA類型含量進(jìn)行定量測定的PCR引物，其中所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含IGFBP3、ABPUFNUSLC21A2、ΚΙΑΑ0992、ΤΙΜΡ3、LPL>INHBA、LEP>ADAMl2,PAPPA、PAPPA2和SIGLEC6的遺傳座位衍生得到的RNA類型，其中的所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛；及Gi)代表正常非先兆子癇孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照。在第二方面，本發(fā)明涉及測定孕婦中胎兒存在18號染色體三體的方法，所述方法包含以下步驟首先，對所述孕婦的生物樣品中的RNA類型含量進(jìn)行定量測定，其中所述RNA類型衍生自RPL17。所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛。其次，將第一步中所述RNA類型的量與具有正常染色體胎兒的孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照相比較。所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照的偏差說明所懷胎兒具有18號染色體三體的高易感性。在一些實(shí)施方案中，所述RPL17RNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對照的升高說明所懷胎兒18號染色體具有三體的高易感性；而在其它情況下，所述RPL17RNA的量比標(biāo)準(zhǔn)對照降低也可說明所懷胎兒具有18號染色體三體的高易感性。在一些實(shí)施方案中，所述第一步包括使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)?？蛇x擇地，所述第一步還可包括在RT-PCR之后使用質(zhì)譜。在其它實(shí)施方案中，所述第一步包括使用多聚核苷酸雜交方法，或使用引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，被檢測的孕婦處于妊娠的頭三個月。在其它實(shí)施方案中，所述孕婦處于妊娠的中三個月或末三個月。在一些實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血漿部分進(jìn)行分析。在其它實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血清部分進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，所述RNA量比標(biāo)準(zhǔn)對照升高超過2倍。在其它實(shí)施方案中，所述RNA量比標(biāo)準(zhǔn)對照降低超過50%。還提供了測定孕婦中胎兒存在18號染色體三體的試劑盒。所述試劑盒包含(i)對所述孕婦的生物樣品中的RNA類型含量進(jìn)行定量測定的PCR引物，其中所述RNA類型衍生自RPL17，且其中所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛；及Gi)代表懷有正常染色體胎兒的孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照。在第三方面，本發(fā)明涉及測定孕婦中胎兒存在21號染色體三體的方法。所述方法包含以下步驟首先，定量測定所述孕婦生物樣品中的RNA類型含量，其中所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含COL6A1、COL6A2、SODUAPP>BTG3、ATP5J、ADAMTSUBACE2、DSCR5、ITSNUPLAC4、ATP50、LOC90625、EFEMPl禾口TFRC的遺傳座位衍生得到的RNA類型，其中所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛。其次，將第一步中所述RNA類型含量與具有正常染色體胎兒的孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照相比較。所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高或降低說明所懷胎兒具有21號染色體三體的高易感性。在一些實(shí)施方案中，所述RNA類型衍生自ADAMTS1、APP>ATP50、EFEMPl或TFRC，其中所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照中升高說明所懷胎兒具有21號染色體三體的高易感性。在一些實(shí)施方案中，所述的第一步包括使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)?？蛇x擇地，所述第一步還可包括在RT-PCR之后使用質(zhì)譜。在其它實(shí)施方案中，所述第一步包括使用多聚核苷酸雜交方法，或使用引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，被檢測的孕婦處于妊娠的頭三個月。在其它實(shí)施方案中，所述孕婦處于妊娠的中三個月或末三個月。在一些實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血漿部分進(jìn)行分析。在其它實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血清部分進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，所述RNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對照升高超過2倍。在其它實(shí)施方案中，所述RNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對照降低超過50%。還提供了測定孕婦中胎兒存在21號染色體三體的試劑盒。所述試劑盒包含(i)對所述孕婦的生物樣品中的RNA類型含量進(jìn)行定量測定的PCR引物，其中所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含COL6A1、COL6A2、SODUAPP>BTG3、ATP5J、ADAMTS1>BACE2、DSCR5、ITSNUPLAC4、ΑΤΡ50、LOC90625、EFEMPl和TFRC的遺傳座位衍生得到的RNA類型，且其中所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛；及Gi)代表懷有正常染色體胎兒的孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照。在第四方面，本發(fā)明涉及測定婦女懷孕的方法。該方法包括以下步驟首先，對所述婦女的生物樣品中的RNA類型含量進(jìn)行定量測定。所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含COL6A1、COL6A2、SODUATP50、ADAMTS1>DSCR5和PLAC4的遺傳座位衍生得到的RNA類型，其中所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛。其次，將第一步驟中所述RNA類型含量與正常非孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照相比較。所述RNA類型的量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高或降低說明懷孕。在一些實(shí)施方案中，所述RNA類型衍生自COL6A1，COL6A2，ATP50或PLAC4,所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高說明懷孕。在一些實(shí)施方案中，所述的第一步包括使用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。可選擇地，所述第一步還可包括在RT-PCR之后使用質(zhì)譜。在其它實(shí)施方案中，所述第一步包括使用多聚核苷酸雜交方法，或使用引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，被檢測的婦女處于妊娠的頭三個月。在其它實(shí)施方案中，所述婦女處于妊娠的中三個月或末三個月。在一些實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血漿部分進(jìn)行分析。在其它實(shí)施方案中，對血液進(jìn)行分餾并對血清部分進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，所述RNA量比標(biāo)準(zhǔn)對照升高超過2倍。在其它實(shí)施方案中，在所述RNA量比標(biāo)準(zhǔn)對照降低超過50%。還提供了測定婦女懷孕的試劑盒。該試劑盒包括(i)對所述婦女生物樣品中的RNA類型含量進(jìn)行定量測定的PCR引物，其中所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含COL6A1、COL6A2、SODl、ΑΤΡ50、ADAMTS1>DSCR5和PLAC4的遺傳座位衍生得到的RNA類型，且其中所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛；及Gi)代表正常非孕婦對應(yīng)樣品中的所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照。附圖的簡要描述圖1所示為妊娠頭三個月21號染色體三體與對照妊娠中胎盤組織RNA轉(zhuǎn)錄水平的比較。(A)代表ADAMTSlmRNA。(B)代表APPmRNA。每一個代表一個受試者ο圖2所示為在母體血沉棕黃層中胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄物的相對濃度。方框內(nèi)部的橫線代表中位值。所述方框代表25%-75%的區(qū)間。所述須線(whisker)代表10%-90%的區(qū)間。所述實(shí)心圓代表在10%-90%的區(qū)間之外的數(shù)據(jù)。圖3所示為分娩后母體血漿中胎盤mRNA的清除。(A)和(B)分別為分娩前和分娩后24小時母體血漿中COL6A1mRNA和COL6A2mRNA的濃度。每條線都代表從同一個受試者得到的成對血漿樣品。圖4所示為妊娠頭三個月21號染色體三體與對照妊娠中胎盤組織RNA轉(zhuǎn)錄水平的比較。(A)代表EFEMPImRNA。(B)代表TFRCmRNA。(C)代表ATP50mRNA。每一個代表一個受試者。(D)表示分娩后24小時母體血漿中的ATP50mRNA的清除。每條線都代表從同一個受試者得到的成對血漿樣品。圖5所示為妊娠末三個月先兆子癇(PET)與對照妊娠中胎盤組織RNA轉(zhuǎn)錄水平的比較。(A)代表Leptin(瘦素，LEP)mRNA。(B)代表SIGLEC6mRNA。方框內(nèi)部的橫線代表中位值。所述方框代表25%-75%的區(qū)間。所述須線代表10%-90%的區(qū)間。所述實(shí)心圓代表在10%-90%的區(qū)間之外的數(shù)據(jù)。圖6所示為在先兆子癇與對照妊娠的母體血漿中，Leptin(LEP)mRNA和INHBAmRNA濃度的比較，(A)代表Leptin(LEP)mRNA。(B)代表INHBAmRNA。方框內(nèi)部的橫線代表中位值。所述方框代表25%-75%的區(qū)間。所述須線代表10%-90%的區(qū)間。所述實(shí)心圓代表在10%-90%的區(qū)間之外的數(shù)據(jù)。圖7所示為未孕婦、妊娠前三個月和妊娠末三個月婦女血漿中PLAC4mRNA濃度的方框圖。方框內(nèi)部的橫線代表中位值。所述方框代表25%-75%的區(qū)間。所述須線代表10%-90%的區(qū)間。所述實(shí)心圓代表在10%-90%的區(qū)間之外的數(shù)據(jù)。圖8所示為分娩后母體血漿中PLAC4mRNA的清除。每條線都代表從同一個受試者得到的成對血漿樣品。圖9所示為妊娠末三個月先兆子癇(PET)與對照(正常)妊娠中胎盤組織RNA轉(zhuǎn)錄水平的比較。(A)代表LEPmRNA。(B)代表ADAM12mRNA。(C)代表PAPPAmRNA。(D)代表PAPPA2mRNA。(E)代表INHBAmRNA。(F)代表FNlmRNA。方框內(nèi)部的橫線代表中位值。所述方框代表25%-75%的區(qū)間。所述須線代表10%-90%的區(qū)間。所述實(shí)心圓代表在10%-90%的區(qū)間之外的數(shù)據(jù)。定義在本說明書中，術(shù)語“衍生自遺傳座位的RNA類型”是指核糖核苷酸聚合物，所述核糖核苷酸聚合物具有與人類基因組中預(yù)先選定位置的至少一部分相對應(yīng)的序列。在本申請中，“RNA類型”可以編碼或不編碼蛋白產(chǎn)物，其序列可包含非編碼序列或僅包括部分開放閱讀框。在本說明書中，術(shù)語“胎兒”，“衍生自胎盤的”或“胎盤表達(dá)的”是指可在孕婦的如血液生物樣品中檢測到的某些RNA類型的來源。換言之，胎兒RNA類型是從胎兒DNA序列轉(zhuǎn)錄而來的。而且，衍生自胎盤的或胎盤表達(dá)的RNA類型是在所述胎盤中發(fā)現(xiàn)的，并且是由胎兒DNA序列轉(zhuǎn)錄而來的。在本說明書中，術(shù)語“生殖道的洗滌物”是指對孕婦或檢測是否懷孕的婦女的生殖道進(jìn)行沖洗或清洗后收集的任意液體或溶液。在本說明書中，術(shù)語“先兆子癇”是指在妊娠中發(fā)生的疾病狀態(tài)，其主要癥狀是通常與蛋白尿和水腫(腫脹)相伴的多種高血壓。先兆子癇有時也稱為妊娠毒血癥，其還涉及稱為“驚厥”的更嚴(yán)重的病癥，該病癥是伴隨癲癇發(fā)作的先兆子癇。這些狀態(tài)通常在妊娠的后半段(20周以后)發(fā)展，盡管也有可能在出生后短期或妊娠20周前發(fā)作顯現(xiàn)。在本說明書中，術(shù)語“引物延伸反應(yīng)”是指在適當(dāng)條件下，由核苷酸聚合酶，如DNA聚合酶作用介導(dǎo)的對與模板序列至少部分互補(bǔ)的預(yù)定多核苷酸序列進(jìn)行延伸的任何聚合過程。在本說明書中，術(shù)語“染色體非整倍性”是指一種染色體異常狀態(tài)，其中所述染色體數(shù)不是正常單倍體數(shù)的整數(shù)倍通常情況是，有額外的一條染色體或其中的一條染色體丟失。染色體非整倍性的最常見情況是三體，其具有一條額外的染色體。例如，18號染色體三體就是在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)第三條18號染色體的一種染色體異常，而在細(xì)胞中存在第三體21號染色體的患者則患有21號染色體三體。與非整倍性相反，“染色體正?！泵枋龅氖侨旧w數(shù)量為單倍體數(shù)量整數(shù)倍的狀態(tài)，例如在二倍體中二倍的染色體數(shù)量，且每條染色體都具有相同的數(shù)量(除非是在例如男性的性染色體中，兩條不同的性染色體，X和Y都以單拷貝分別存在)。在本說明書中，術(shù)語“血液”是指來自孕婦或檢測是否懷孕婦女的血液樣品或制品。該術(shù)語還包括全血，或者是具有不同濃度，甚至是不含有造血細(xì)胞或任意其它類型細(xì)胞或細(xì)胞殘留物的母體或胎兒來源的任意血液成分，包括血小板。“血液”包括血漿和血清?；静缓屑?xì)胞的血液樣品也稱為“無細(xì)胞的”，其中通常沒有血小板。在本說明書中，術(shù)語“正?！泵枋龅南鄬τ谀承┲笜?biāo)，例如在母體血液中檢測到的衍生自胎兒/胎盤的RNA水平，是沒有先兆子癇，或懷有染色體正常胎兒的孕婦，這些指標(biāo)是隨機(jī)選用組群的無先兆子癇，或懷有染色體正常胎兒的婦女的典型值。該選用組群應(yīng)該包含足夠數(shù)量的婦女，從而使得從遺傳座位(其可編碼或不編碼特定的胎兒蛋白)轉(zhuǎn)錄得到的衍生自胎兒/胎盤的RNA平均水平能夠以合理的準(zhǔn)確性反映出懷有健康胎兒的健康孕婦的普通人群中的所述RNA水平。此外，所述選用組群的婦女應(yīng)該與對其血液進(jìn)行測定的婦女具有相似的妊娠齡，所述測定是為了說明先兆子癇或胎兒染色體非整倍性，如18號染色體三體和21號染色體三體。根據(jù)所要篩查的病癥的不同，實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選妊娠齡也不同。例如，孕婦進(jìn)行的先兆子癇篩查可優(yōu)選地在懷孕的中三個月進(jìn)行，而優(yōu)選地對胎兒染色體非整倍性進(jìn)行的篩查和診斷應(yīng)該盡可能早進(jìn)行。此外，考慮到某些標(biāo)記可能會在妊娠的某個階段比其它階段更容易進(jìn)行測定，因此優(yōu)選地進(jìn)行測定的妊娠年齡需要根據(jù)在檢測中所使用的RNA標(biāo)記而定。在本說明書中，術(shù)語“正?！鳖愃频赜糜谥柑囟≧NA種類的含量，其是健康的未懷孕婦女的隨機(jī)選用組群血液中測得的典型量。在本說明書中，IGFBP3、ABPUFNUSLC21A2、KIAA0992、TIMP3、LPL>INHBA>LEP>SIGLEC6、RPL17、COL6A1、COL6A2、SODl、APP>BTG3、ATP5J、ADAMTSUBACE2、DSCR5、ITSNl、PLAC4、LOC90625、ATP50、EFEMPl和TFRC是指基因或建議的開放閱讀框(包括起變異體和突變體)及其多核苷酸轉(zhuǎn)錄物，如表2、表4和表6中提供的GenBank登錄號所對應(yīng)的序列。在本文的某些地方，這些術(shù)語還可用來指示由這些基因或開放閱讀框編碼的多肽。在本說明書中，術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)對照”是指為了測定RNA轉(zhuǎn)錄物，如COL6A1，COL6A2，APP,ATP50或LEP含量，適合用于本發(fā)明方法的樣品。這些樣品含有已知量的衍生自胎兒/胎盤的RNA類型，其能夠相當(dāng)接近地反映在正常孕婦中這些RNA類型的平均水平。類似地，“標(biāo)準(zhǔn)對照”也可來自正常健康的未懷孕婦女。在本說明書中，術(shù)語“所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高或降低”是指相對所述標(biāo)準(zhǔn)對照的量的正變化或負(fù)變化。增加優(yōu)選為至少2倍，更優(yōu)選為至少5倍，最優(yōu)選為至少10倍。類似地，降低優(yōu)選為至少50%，更優(yōu)選為至少80%，最優(yōu)選為至少90%。在本說明書中，術(shù)語“多聚核苷酸雜交方法”是指在適當(dāng)雜交條件下，根據(jù)其與已知序列的多聚核苷酸探針形成沃森-克里克堿基配對的能力，測定某種多聚核苷酸的存在和/或量的方法。這些雜交方法的例子包括Southern雜交和Northern雜交。在本說明書中，術(shù)語“PCR引物”是指可用于聚合酶鏈反應(yīng)中，對衍生自諸如COL6A1，COL6A2,APP,ATP50或LEP遺傳座位的RNA轉(zhuǎn)錄物所產(chǎn)生的核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增的寡核苷酸。至少有一種對衍生自以上名稱座位的RNA序列進(jìn)行擴(kuò)增的PCR引物對所述座位具有序列特異性。發(fā)明的詳細(xì)描述I概述本發(fā)明首次提供了診斷、監(jiān)測或預(yù)測孕婦先兆子癇、胎兒的18號染色體三體和21號染色體三體，以及婦女妊娠的方法與試劑盒，該方法與試劑盒是通過分析所述婦女血液中的一種或多種衍生自胎兒/胎盤的RNA類型、即具有表1至表6中所述序列的水平實(shí)現(xiàn)的。如本發(fā)明所述，這些母體血液樣品中的胎兒/胎盤來源的RNA轉(zhuǎn)錄物量是可以優(yōu)選地在完成擴(kuò)增過程，例如反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)之后進(jìn)行定量測定的。然后將一種或多種這些RNA類型含量與具有相同類型RNA水平的標(biāo)準(zhǔn)對照相比，所述該RNA水平是指處于類似妊娠齡但沒有這些妊娠相關(guān)病癥的正常孕婦典型值。所述RNA水平的升高或降低說明了所述病癥的存在或發(fā)展成所述病癥的高易感性。因此，本發(fā)明提供了診斷先兆子癇、以及諸如胎兒的18號染色體三體和21號染色體三體的胎兒染色體非整倍性的新的途徑，該途徑是非侵入性的，并且不依賴于性別和多態(tài)性。根據(jù)相同的方法，通過將婦女血液中從這些遺傳座位轉(zhuǎn)錄得到的一種或多種所述RNA類型的水平與從正常未妊娠婦女獲得的已確定的對照值進(jìn)行比較，本發(fā)明還可用來測定妊娠。盡管胎兒/胎盤表達(dá)的RNA已經(jīng)用作產(chǎn)前診斷和監(jiān)測，參見，例如美國專利申請第09/876,005號和第10/759,783號，但是卻發(fā)現(xiàn)對適于該目的特定RNA類型的標(biāo)記的鑒定具有不可預(yù)測性。因?yàn)椴⒉皇撬性谔ケP中表達(dá)的RNA類型都能夠在母體血液中檢測到。例如，本發(fā)明人未能在母體血液中檢測到某些衍生自胎兒/胎盤的RNA類型。一些示例性的未檢測到的類型包括NADH脫氫酶(泛醌)黃素蛋白3，IOkDa(NDUFV3)；α-胎蛋白(AFP)；e1-血紅蛋白(HBEl)以及IIA型磷脂酶A2(血小板，滑液)(PLA2G2A)。II血液樣品的制備A.血液樣品的獲得實(shí)施本發(fā)明的第一步就是從適合接受本發(fā)明方法檢測的妊娠齡的孕婦，或檢測是否妊娠的婦女中獲取生物樣品，例如血液樣品。如上所述，根據(jù)所檢測的病癥不同和有時所使用的RNA標(biāo)記不同，適合的妊娠齡也會有所變化。對婦女進(jìn)行的血液采集是按照醫(yī)院或診所的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行的。采集適量的外周血液，例如3-20ml，并且在進(jìn)行后續(xù)處理之前按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行保存。B.血漿或血清樣品的制備婦女血液的血清和血漿適于本發(fā)明，并可通過公知的方法獲得。例如，可將婦女的血液放置于含有EDTA或具體的商業(yè)化制品，如VacutainerSST(BectonDickinson,FranklinLakes,新澤西，美國)中以防止血液凝結(jié)，可通過離心從全血得到血漿。在另一方面，可在凝結(jié)后通過離心血液得到血清。離心通常在適合的速度，如1,500-3,000Xg，在冷藏的環(huán)境，如4-10°C的條件下進(jìn)行。在將血漿或血清轉(zhuǎn)移至新管進(jìn)行RNA提取之前，還可以對其進(jìn)行額外的離心處理步驟。在本發(fā)明的某些應(yīng)用中，血漿或血清可能是優(yōu)選的樣品類型。而在本發(fā)明的其它應(yīng)用中，全血可能是優(yōu)選地。而在另一些應(yīng)用中，優(yōu)選地則是血液的其它組分。III婦女血液中RNA量的定量測定A.RNA提取從生物樣品中提取RNA有多種方法。可以采用普通的RNA制備方法(例如SambrookandRussell,MolecularCloningALaboratoryManual3ded.,《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》第3版，2001);多種可商業(yè)獲得的試劑或試劑盒，如Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)，OligoteXDirectmRNAKits試劑盒(Qiagen，Valencia,加利福尼亞，美國)，RNeasyMiniKits試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)以及PolyATtractSeries9600(Promega,Madison,WI,美國)來從婦女的血液樣品中獲取RNA。也可以將這些方法組合來提取RNA。在某些應(yīng)用中，優(yōu)選地要去從RNA制品中去除所有或大部分污染性的DNA。因此，在擴(kuò)增和定量步驟中，應(yīng)該對樣品小心操作，徹底進(jìn)行DNA酶處理并且設(shè)定適當(dāng)?shù)年幮詫φ?。B.對RNA水平基于PCR的定量測定一旦從婦女血液樣品中提取到了RNA，就可以對衍生自感興趣的遺傳座位，如COL6A1，COL6A2，APP,ATP50或LEP的RNA量進(jìn)行定量測定。測定所述RNA水平的優(yōu)選方法是基于擴(kuò)增的方法，如PCR。在進(jìn)行擴(kuò)增步驟之前，必須合成所述感興趣RNA的DNA拷貝(cDNA)。這可以通過反轉(zhuǎn)錄來完成，其可作為分別的步驟進(jìn)行，或者以對擴(kuò)增RNA的聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行改進(jìn)的均一反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行。對核糖核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增的適合方法可參見Romero和Rotbart所著的《診斷分子生物學(xué)原理和應(yīng)用》(DiagnosticMolecularBiologyPrinciplesandApplications)401-406頁；Persing等人編輯，MayoFoundation,Rochester,MN,1993;Eggeretal.，J.Clin.Microbiol.331442-1447，1995；以及美國專利第5,075,212號。PCR方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，因此無需在此進(jìn)行描述。關(guān)于PCR方法的綜述，實(shí)驗(yàn)方法和引物設(shè)計(jì)原理可參考例如Innis等人的《PCR實(shí)驗(yàn)方法方法和應(yīng)用指南》(PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications)，AcademicPress,Inc.N.Y.，1990。也可從零售商，如RocheMolecularSystems獲得PCR試劑和操作方法。在大多數(shù)情況下，都采用熱穩(wěn)定酶以自動化的過程實(shí)施PCR。在該過程中，反應(yīng)混合物的溫度通常是在變性區(qū)，引物退火區(qū)，和延伸反應(yīng)區(qū)之間自動循環(huán)。在有些實(shí)驗(yàn)方法中，可以將退火區(qū)與延伸反應(yīng)區(qū)合并。適合這一目的的機(jī)器是商業(yè)可獲得的。盡管在實(shí)施本發(fā)明時通常采用的RNA擴(kuò)增方法是PCR。但本領(lǐng)域所述技術(shù)人員應(yīng)意識到，對母體血液中這些RNA類型的擴(kuò)增也可以通過其它公知的方法來實(shí)現(xiàn)，例如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增，以及自主序列復(fù)制或基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，其中的每一種都能提供足量的擴(kuò)增。還可以使用最近開發(fā)的分支DNA技術(shù)對母體血液中的RNA標(biāo)記量進(jìn)行定量測定。關(guān)于對臨床樣品中的核酸序列進(jìn)行直接定量的分支RNA信號擴(kuò)增的綜述，可參見Nolte，Adv.Clin.Chem.33201-235，1998。C.其它定量方法也可以使用本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定所感興趣的RNA類型。盡管擴(kuò)增步驟通常先于所述測定步驟，但在本發(fā)明的所述方法中擴(kuò)增可不需要。例如，無論是在擴(kuò)增步驟之前或之后進(jìn)行，都可以通過大小分離(如凝膠電泳)鑒定所感興趣的RNA類型。在經(jīng)過公知的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，并進(jìn)行溴化乙錠標(biāo)記之后(參見，例如上述的SambrookandRussell)，與標(biāo)準(zhǔn)對照相同的條帶的存在可以說明靶RNA的存在，可根據(jù)所述條帶的強(qiáng)度，對所述條帶的量與所述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較?？蛇x擇地，基于所述探針?biāo)a(chǎn)生信號的強(qiáng)度，可以采用與從如COL6A1，COL6A2,APP,ATP50或LEP的遺傳座位轉(zhuǎn)錄而來的RNA特異的寡核苷酸探針來檢測這些RNA類型的存在，并且與所述標(biāo)準(zhǔn)比較說明了所述RNA的量。序列特異性的探針雜交是在含有其它核酸類型的環(huán)景下檢測特異性核酸的公知方法。在足夠嚴(yán)苛的雜交條件下，所述探針特異性地僅與基本上互補(bǔ)的序列雜交?？蓪⑺鲭s交條件的嚴(yán)苛程度放寬從而允許不同量的序列錯配。在本領(lǐng)域中有多種雜交方式，包括液相，固相或混合相雜交分析方法。下述文章提供了對多種雜交分析方式的綜述Singeretal.，Biotechniques(生物技術(shù))4230，1986；Haaseetal.,MethodsinVirology(病毒學(xué)方法)，pp.189-226,1984；Wilkinson,InsituHybridization(原位雜交)，Wilkinsoned.，IRLPress,OxfordUniversityPress,Oxford；以及HamesandHigginseds.，NucleicAcidHybridizationAPracticalApproach(核酸雜交操作方法)，IRLPress,1987。根據(jù)公知的方法可對雜交復(fù)合物進(jìn)行測定，所述測定并不是本發(fā)明的重點(diǎn)。可以采用任何常用于測定雜交核酸存在的方法標(biāo)記能特異性與靶核酸，即所感興趣的RNA類型或所述擴(kuò)增的DNA，雜交的核酸探針。常見的測定方法是采用由3H,125I,35S,14C或32P等等標(biāo)記的探針進(jìn)行放射自顯影。放射性同位素的選擇是根據(jù)研究偏好，考慮因素包括同位素的合成容易程度、穩(wěn)定性和半衰期。其它標(biāo)記包括化合物(例生物素和地高辛)標(biāo)記，所述化合物能與熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶標(biāo)記的抗配體(antiligands)或抗體相結(jié)合?？蛇x擇地，探針可以與諸如熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑或酶的標(biāo)記直接軛合。所述標(biāo)記的選擇依賴于所需要的敏感性、與所述探針軛合的難易程度、穩(wěn)定性要求以及可利用的設(shè)備?？梢允褂霉募夹g(shù)合成和標(biāo)記實(shí)施本發(fā)明所必需的探針和引物?？梢愿鶕?jù)首先由Beaucage和Carathers，TetrahedronLetts.,221859-1862，1981所述的固相亞磷酰胺三酯法，如Needham-VanDevanteretal.，NucleicAcidsRes.126159-6168,1984所述，使用自動合成儀，對用作探針和引物的寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)合成。如PearsonandRegnier,J.Chrom.，255137-149，1983所述，可采用天然丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換高效液相色譜(HPLC)對寡核苷酸進(jìn)行純化。IV.標(biāo)準(zhǔn)對照的建立為了建立標(biāo)準(zhǔn)對照，首先要選取一組懷有健康胎兒的健康孕婦。這些婦女應(yīng)具有類似的妊娠齡，所述妊娠齡應(yīng)該處于使用本發(fā)明方法對諸如先兆子癇和胎兒染色體非整倍性(包括18號染色體三體和21號染色體三體)的病癥進(jìn)行檢測的適當(dāng)?shù)膽言须A段之內(nèi)。類似地，可使用來自健康未懷孕婦女組別的樣品建立標(biāo)準(zhǔn)對照。應(yīng)該使用已建立的、常規(guī)使用的方法對所選擇的孕婦以及她們所懷的胎兒的健康狀態(tài)進(jìn)行確認(rèn)，這些方法包括監(jiān)測所述婦女的血壓，記錄產(chǎn)程開始，使用CVS以及羊水診斷進(jìn)行胎兒遺傳分析。此外，因該以適當(dāng)?shù)慕M別規(guī)模選擇懷有健康胎兒的健康孕婦或健康未孕婦女，從而使得從所述組別中計(jì)算得到的本申請指明的遺傳座位衍生出的RNA平均量能夠比較合理的代表懷有健康胎兒的健康孕婦或健康未孕婦女普通人群中的正?；蚱骄俊?yōu)選地，所選擇的組別包含至少10例婦女。一旦根據(jù)所選擇組別的每個婦女測定的個體值建立了所述胎兒/胎盤衍生RNA量的平均值，則就可認(rèn)為該值是所述RNA類型的標(biāo)準(zhǔn)。因此，含有所述相同類型類似量RNA的血液樣品都可用作標(biāo)準(zhǔn)對照。也可以人工配制含有所述相同類型的已建立平均濃度的感興趣的RNA類型的溶液并將其作為標(biāo)準(zhǔn)對照。僅以說明性目的而非限制性目的提供以下實(shí)施例。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)很容易理解，對多種非關(guān)鍵性參數(shù)進(jìn)行改變和修改也能得到基本類似的結(jié)果。實(shí)施例僅以說明性目的而非限制性目的提供以下實(shí)施例。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)很容易理解，對多種非關(guān)鍵性參數(shù)進(jìn)行改變和修改也能得到基本相同或類似的結(jié)果。實(shí)施例1在胎盤組織中表達(dá)的21號或18號染色體的遺傳座位TJ^j受試者胎盤組織和血液樣品采集自知情同意的處于頭三個月的孕婦，這些婦女是到香港威爾斯親王醫(yī)院的婦產(chǎn)科就診的。所述研究已獲得了臨床研究倫理委員會的批準(zhǔn)。微陣列分析的樣品制備在治療結(jié)束前，采用絨膜絨毛取樣(CVS)從孕婦獲得了5份頭三個月的胎盤組織樣品。所有病例中的胎兒核型分析隨后都被確認(rèn)為正常。在采集時立即將胎盤組織樣本儲存于RNAlaterTM(Ambion,奧斯丁，德克薩斯，美國)并保存于-80°C直至進(jìn)行RNA提取。在進(jìn)行組織采集的同時收集6毫升孕婦的外周血，并儲存于PAXgene血液RNA試管(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)中。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)指南，采用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)從胎盤組織中提取總RNA，并用RNeasymini-試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)進(jìn)行純化。按照制造商的指南，使用PAXgene血液RNA試劑盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)從外周血中提取總RNA，還包括進(jìn)行DNA酶處理(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden,德國)。通過高密度寡核苷酸微陣列進(jìn)行基因表達(dá)分析按照制造商的指南，對每個樣品而言，將所提取的10微克RNA用于標(biāo)記并與GeneChip人類基因組U133A和U133B陣列(Affymetrix，SantaClara,加利福尼亞，美國)雜交。雜交之后，洗滌每個陣列并在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)中進(jìn)行染色。用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)對所述芯片進(jìn)行掃描，用GeneChipMicroarraySuite5.0(Affymetrix)進(jìn)行分析。實(shí)時定量RT-PCR采用一步實(shí)時定量RT-PCR(QRT-PCR)對胎盤組織和母體血液樣品中的RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量測定。對持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)檢測的QRT-PCR分析在之前已有描述(Ngetal.2002)。其它待測基因的引物(Proligo，Singapore)和熒光探針(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,加利福尼亞，美國)序列如表IA所示。為了對胎盤組織和母體血沉棕黃層進(jìn)行分析，進(jìn)行了相對定量，其中將所研究的轉(zhuǎn)錄物水平標(biāo)準(zhǔn)化至相應(yīng)的GAPDHmRNA水平。根據(jù)制造商的指南(EZrTthRNAPCRreagentset,AppliedBiosystems)，在25μ1反應(yīng)體積中建立所述QRT-PCR反應(yīng)。在組合的熱循環(huán)儀和熒光檢測器(ABIPrism7900ΗΤ,AppliedBiosystems)上進(jìn)行所述QRT-PCR分析。對所有轉(zhuǎn)錄物而言，所述PCR引物和熒光探針的濃度分別為300ηΜ和ΙΟΟηΜ。在進(jìn)行QRT-PCR之前，根據(jù)制造商的推薦，使用DNaseI消化(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)去除所述胎盤組織RNA提取物中的污染DNA。使用17ng提取的胎盤RNA進(jìn)行擴(kuò)增。在每次分析中都包含有多個陰性水空白對照。所述熱處理過程如下所述反應(yīng)在50°C，2分鐘啟動，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘。經(jīng)過在95°C變性5分鐘之后，在92°C變性15秒和在58°C退火/延伸1分鐘進(jìn)行40個PCR循環(huán)。對母體血液中胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄物的定量分析將正常孕婦的母體全血樣品采集到EDTA管中。將所述血液樣品在l,600g，在4°C離心10分鐘后，將所述血沉棕黃層和血漿部分小心地轉(zhuǎn)移至分別的聚丙烯管中。將所述血漿樣品在16,000g，在4°C再離心10分鐘。將上清液收集至新的聚丙烯管中。如前所述，從所收集的母體血漿中提取RNA(Ngetal.，2002)。類似地，從0.3mL所述血沉棕黃層部分中提取RNA。采用與上述相同的條件對所研究的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行QRT-PCR分析。每個QRT-PCR反應(yīng)需要使用5微升所提取的血漿RNA或IOng所述血沉棕黃層的RNA。采用絕對定量來測定血漿樣品中的所述轉(zhuǎn)錄物濃度。以濃度從IxlO7拷貝到IxlO1拷貝，通過對具有所述擴(kuò)增子全長的經(jīng)過高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(Proligo，Singapore)進(jìn)行連續(xù)稀釋制備了校準(zhǔn)曲線。血漿中所述轉(zhuǎn)錄物的絕對濃度以拷貝/毫升血漿進(jìn)行描述。所合成DNA寡核苷酸的序列如表IB所示。所述血沉棕黃層部分的結(jié)果以基于對GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行相對定量表述。統(tǒng)計(jì)分析使用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。MM通過高密度寡核苷酸微陣列對胎盤表達(dá)基因的鑒定通過對每個獨(dú)立樣品進(jìn)行獨(dú)立的微陣列分析得到了5份頭三個月CVS樣品的基因表達(dá)譜。在人類基因組U133A和U133B芯片(Affymetrix)中大約22,000個可檢測的轉(zhuǎn)錄物中，在所述CVS樣品中總共有7226個基因轉(zhuǎn)錄物具有表達(dá)。我們之前已報到過在正常人血漿中的循環(huán)DNA主要衍生自造血細(xì)胞(Luietal.，2002)。因此，我們認(rèn)為在母體血液中多數(shù)背景母體核酸也具有源自所述造血部分。考慮到我們的目的是對母體血漿的所述循環(huán)RNA分子中胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行鑒定，所以我們進(jìn)一步獲得了母體全血的基因表達(dá)譜，并使用了GeneChipMicroarraySuite5.0軟件(Affymetrix)將所述表達(dá)譜與對應(yīng)的胎盤組織表達(dá)譜進(jìn)行了比較。在總共五組的與對應(yīng)全血樣品的比較中，通過對所述CVS組織中表達(dá)水平升高的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行選擇，鑒定了早期妊娠的胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄物。完成該步驟之后，去除在母體血細(xì)胞中表達(dá)高于所述胎盤組織或與之類似的轉(zhuǎn)錄物。由此，該分析確定了在妊娠頭三個月中具有胎盤特異性的1245個轉(zhuǎn)錄物組。選擇具有胎盤組織表達(dá)及在21號或18號染色體上的遺傳座位在通過上述方法鑒定的具有胎盤特異性轉(zhuǎn)錄物的組中，我們對位于21號染色體上基因的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行了進(jìn)一步的搜索。鑒定了13個位于21號染色體上的基因，如表2A所示。該基因選擇策略是基于這樣的原因具有21號染色體三體的胎兒的基因組中存在有額外21號染色體產(chǎn)生的基因劑量的改變，可導(dǎo)致位于21號染色體上的基因異常表達(dá)。正如我們之前所證明的，胎盤是母體血漿中循環(huán)胎兒RNA的重要來源(Ngetal2003)，由21號染色體三體引起的該靶基因的異常胎盤組織表達(dá)，可通過母體血液中所述轉(zhuǎn)錄物的異常濃度得以反映。因此，通過源自胎兒/胎盤的循環(huán)RNA分析用作胎兒21號染色體三體的非侵入性產(chǎn)前檢測的方法，是根據(jù)將懷有21號染色體三體的胎兒的孕婦的那些所選擇的轉(zhuǎn)錄物的異常血濃度與懷有正常胎兒的婦女的血液濃度相比較的檢測。采用了類似的策略以非入侵性的產(chǎn)前分析方式對18號染色體的三體的基因標(biāo)記進(jìn)行鑒定。采用人類基因組U133B陣列(Affymetrix)對CVS和母體全血樣品的表達(dá)譜進(jìn)行了分析。針對母體血液的情況，采用與如上相同的篩選標(biāo)準(zhǔn)確定了在CVS中具有優(yōu)先表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物組。根據(jù)相對胎盤特異性從所述轉(zhuǎn)錄物組中選擇了位于18號染色體上的胎盤表達(dá)基因。在此組中，選擇了在CVS中表達(dá)水平最高的轉(zhuǎn)錄物，如表2B所示。通過實(shí)時QRT-PCR對微陣列進(jìn)行驗(yàn)證采用一步實(shí)時QRT-PCR對上述基于微陣列的策略鑒定的標(biāo)記的胎盤組織表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。對10個正常妊娠和3個21號染色體三體妊娠的頭三個月CVS組織進(jìn)行了GAPDHmRNA、列示于表2A和2B的所選擇的轉(zhuǎn)錄物的測定。采用以下等式，將所測基因的相對mRNA水平對相應(yīng)的GAPDH水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化ΔCtx=CtGAPDH-Ctx其中Ct代表了閾循環(huán)數(shù)，即將樣品的QRT-PCR反應(yīng)累積的熒光達(dá)到預(yù)定閾強(qiáng)度所需要的PCR循環(huán)數(shù)。ΔCtx是所測轉(zhuǎn)錄物X的標(biāo)準(zhǔn)化mRNA水平；CteAPDH是GAPDHmRNA的Ct值；Ctx是所述轉(zhuǎn)錄物X的Ct值。由于Ct值與所述模板mRNA的量的對數(shù)呈反比，所以ACtx值越高則mRNA水平越高。由此確認(rèn)了所測轉(zhuǎn)錄物在采集自正常和涉及21號染色體三體胎兒妊娠的CVS組織中都有表達(dá)并具有可檢測性。在與從正常妊娠采集的樣品進(jìn)行比較時，在采集自21號染色體三體妊娠的CVS組織中發(fā)現(xiàn)了ADAMTS1mRNA(圖1A)(Mann-Whitney檢驗(yàn)，P=0.036)禾口APPmRNA(圖IB)(Mann-Whitney檢驗(yàn)，P=0.036)在胎盤組織表達(dá)的統(tǒng)計(jì)顯著性上調(diào)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的假設(shè)，說明位于所述三體染色體上的基因與胎盤組織表達(dá)的定量異常有關(guān)，因此，這些基因是21號染色體三體產(chǎn)前評價非常有用的標(biāo)記。母體血液中所述胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄物的可檢測性我們對從妊娠末三個月婦女采集到的血沉棕黃層和血漿樣品中某些轉(zhuǎn)錄物的可檢測性進(jìn)行了研究。研究的所有12個轉(zhuǎn)錄物在血沉棕黃層(圖2)和血漿樣品中(數(shù)據(jù)未顯示)都具有可檢測性。為了對所述轉(zhuǎn)錄物的妊娠特異性進(jìn)行檢測，還采集了10位孕婦生產(chǎn)前和產(chǎn)后24小時的血漿樣品。圖3A和3B說明COL6A1和COL6A2mRNA在產(chǎn)后的母體血漿中被迅速清除(Wilcoxon檢驗(yàn)，二者均為P<0.05)，而對應(yīng)的GAPDHmRNA水平則保持不變(數(shù)據(jù)未顯示，Wilcoxon檢驗(yàn)，P=1.000)。產(chǎn)后母體血漿中COL6A1和COL6A2mRNA的清除說明胎盤是這些轉(zhuǎn)錄物的最主要組織來源。結(jié)論本發(fā)明使用基于微陣列的方法，鑒定了在妊娠頭三個月的胎盤組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)對位于21號染色體上胎盤表達(dá)的基因的選擇，確定了13個用于21號染色體三體的產(chǎn)前檢測的轉(zhuǎn)錄本。類似地，也通過對在18號染色體上編碼的胎盤轉(zhuǎn)錄物的選擇，確定了用于18號染色體三體的產(chǎn)前檢測的RNA標(biāo)記。本發(fā)明通過實(shí)時QRT-PCR方法驗(yàn)證了在正常和非整倍型胎盤組織中所測轉(zhuǎn)錄物的可檢測性。例如，在21號染色體三體妊娠的胎盤組織中，ADAMTS1與APPmRNA具有異常表達(dá)。此外，在母體血沉棕黃層和血漿中所有所述靶基因的mRNA都具有可檢測性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的標(biāo)記選擇策略能夠鑒定在21號染色體三體中異常表達(dá)的RNA類型，并且在母體循環(huán)中具有可檢測性，其可促進(jìn)對胎兒21號染色體三體的非侵入性產(chǎn)前診斷策略的發(fā)展。例如，對21號染色體三體的非侵入性產(chǎn)前檢測可以根據(jù)對21號染色體三體妊娠的所述RNA標(biāo)記的異常濃度的測定和正常妊娠中的對應(yīng)濃度的比較來實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地，可以根據(jù)母體血漿中一或多種所述轉(zhuǎn)錄物的不同分子形式的相對定量比較實(shí)施非侵入性的產(chǎn)前診斷。還可以通過對母體血漿中RPL17mRNA的測定來診斷18號染色體三體。實(shí)施例2在21號染色體三體妊娠胎盤中表達(dá)升高的基因與正常妊娠的基因的比較^fe受試者所有胎盤組織和血液樣品均采集自知情同意的處于妊娠頭三個月的孕婦，這些婦女是到香港威爾斯親王醫(yī)院的婦產(chǎn)科就診的。所述研究已獲得了臨床研究倫理委員會的批準(zhǔn)。在本研究的第一部分，采用寡核苷酸微陣列對正常和21號染色體三體妊娠的胎盤組織基因表達(dá)譜進(jìn)行了鑒定。采用絨膜絨毛取樣(CVS)從孕婦獲得了頭三個月的胎盤組織樣品。招募了5名正常妊娠的婦女(妊娠齡10-12周)和3名懷有21號染色體三體胎兒的婦女(妊娠齡12-13周)，隨后分別對其進(jìn)行了胎兒核型分析并確診。在本研究的第二部分，使用QRT-PCR對通過所述寡核苷酸微陣列實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的基因表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證。為進(jìn)行所述研究，采用了來自于3名懷有21號染色體三體胎兒的婦女(妊娠齡13-14周)和5名正常妊娠婦女(妊娠齡9-13周)的CVS。微陣列分析的樣品制備采集后立即將CVS樣本儲存于RNAlaterTM(Ambion，奧斯丁，德克薩斯，美國)并保存于-80°C直至進(jìn)行RNA提取。在進(jìn)行組織采集的同時對五名正常妊娠的孕婦，收集6毫升外周血，并儲存于PAXgene血液RNA試管(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)中。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)指南，采用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，加利福尼亞，美國)從胎盤組織中提取總RNA，并用RNeasymini-試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)進(jìn)行純化。按照制造商的指南，使用PAXgene血液RNA試劑盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)從外周血中提取總RNA，還包括進(jìn)行DNA酶處理(RNase-FreeDNaseSet,Qiagen,Hilden,德國)。通過高密度寡核苷酸微陣列進(jìn)行基因表達(dá)分析按照制造商的指南，對每個樣品而言，標(biāo)記所提取的10微克RNA并與GeneChip人類基因組U133A和U133B陣列(Affymetrix，SantaClara,加利福尼亞，美國)雜交。雜交之后，洗滌每個陣列并在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)中進(jìn)行染色。用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)對所述芯片進(jìn)行掃描，用GeneChipMicroarraySuite5.0(Affymetrix)進(jìn)行分析。實(shí)時定量RT-PCR采用一步實(shí)時定量RT-PCR(QRT-PCR)對胎盤組織和母體血液樣品中的RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量測定。對持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)檢測的QRT-PCR分析在之前已有描述(Ngetal.2002)。其它檢測基因的引物(Proligo，Singapore)禾ΠTaqMan小溝結(jié)合(MGB)熒光探針(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,加利福尼亞，美國)序列如表3所示。采用相對定量來描述所表達(dá)的RNA量，其中根據(jù)相應(yīng)的GAPDHmRNA水平對所研究的轉(zhuǎn)錄物水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)制造商的指南(EZrTthRNAPCRreagentset,AppliedBiosystems)，在25μ1反應(yīng)體積中建立所述QRT-PCR反應(yīng)。在合并的熱循環(huán)儀和熒光檢測器(ABIPrism7900ΗΤ,AppliedBiosystems)上進(jìn)行所述QRT-PCR分析。對所有轉(zhuǎn)錄物而言，所述PCR引物和熒光探針的濃度分別為300ηΜ和ΙΟΟηΜ。在進(jìn)行QRT-PCR之前，根據(jù)制造商的推薦，使用DNaseI消化(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)去除所述胎盤組織RNA提取物中的污染DNA。使用17ng胎盤RNA提取物進(jìn)行擴(kuò)增。在每次分析中都包含有多個陰性水空白對照。所述熱處理過程如下所述反應(yīng)在50°C、2分鐘啟動，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘。經(jīng)過在95°C變性5分鐘之后，在92°C變性15秒和在58°C退火/延伸1分鐘進(jìn)行40個PCR循環(huán)。對母體血液中與胎盤轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的21號染色體三體的定量分析將從正常懷孕婦女中的母體全血樣品采集到EDTA管中。將所述血液樣品在l,600g,在4°C離心10分鐘后，將血漿部分小心地轉(zhuǎn)移至空的聚丙烯管中。將該血漿樣品在16,000g，在4°C再離心10分鐘。將上清液收集至新的聚丙烯管中。如前所述，從所收集的母體血漿中提取RNA(Ngetal.，2002)。采用與上述相同的條件對所述研究轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行QRT-PCR分析。每個QRT-PCR反應(yīng)需要使用5微升所提取的血漿RNA。統(tǒng)計(jì)分析使用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。MS非整倍體妊娠中異常胎盤組織表達(dá)基因基于微陣列的鑒定通過對每個單獨(dú)樣品進(jìn)行獨(dú)立的微陣列分析得到了5份頭三個月CVS樣品的基因表達(dá)譜。我們之前已報到過在正常人血漿中的循環(huán)DNA主要衍生自造血細(xì)胞(Luietal2002)。因此，我們假設(shè)在母體血液中背景母體核酸的多數(shù)也源自所述造血部分?？紤]到本研究的最終目的是鑒定胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄物，其在母體血漿中的循環(huán)RNA分子中是胎兒特異性的，所以我們進(jìn)一步獲取了成對母體全血的基因表達(dá)譜，并將這些表達(dá)譜與那些對應(yīng)的5個正常妊娠樣品中的表達(dá)譜進(jìn)行了比較。使用的是GeneChipMicroarraySuite5.0軟件(Affymetrix)。當(dāng)與全部5組比較中的對應(yīng)的全血樣品進(jìn)行比較時，通過對所述CVS組織中表達(dá)水平升高的轉(zhuǎn)錄物的選擇，鑒定了具有相對胎盤特異性的轉(zhuǎn)錄物。完成該步驟之后，去除在母體血細(xì)胞中表達(dá)高于所述CVS組織或與之類似的轉(zhuǎn)錄物。由此，該分析確定了在妊娠頭三個月中具有胎盤特異性的轉(zhuǎn)錄物組。在下一步中，鑒定了在非整倍性妊娠的胎盤組織中異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。使用GeneChipMicroarraySuite5.0軟件(Affymetrix)，將3份21號染色體三體的CVS組織的表達(dá)譜與上述5份妊娠齡匹配的正常妊娠中的胎盤特異性基因組進(jìn)行了比較。以正常的胎盤組織表達(dá)譜作為基線，將所述3份非整倍性的CVS樣品的每一份基因表達(dá)信號都單獨(dú)地與5份正常CVS樣品中的每一份進(jìn)行比較。總共進(jìn)行了15種比較，對于每個詢問的基因，計(jì)數(shù)(I-計(jì)數(shù))在所述非整倍體胎盤中表達(dá)上調(diào)的比較的數(shù)目。計(jì)算表達(dá)水平的成倍變化，并將其轉(zhuǎn)化成lo&值(信號Log比值，SLR)。然后對轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行選擇，條件為如果(i)當(dāng)與正常胎盤進(jìn)行比較時，所述信號Log比值至少為0.4的條件下，非整倍性胎盤中的所述轉(zhuǎn)錄物有所上調(diào)；以及Gi)所述上調(diào)與超過半數(shù)的比較給出的上調(diào)一致(I-計(jì)數(shù)勸)。表4總結(jié)了所述3種轉(zhuǎn)錄物的微陣列結(jié)果，即含有EGF的fibulin-樣細(xì)胞夕卜基質(zhì)蛋白1(EGF-containingfibulin—likeextracellularmatrixprotein1)(EFEMPl),轉(zhuǎn)鐵蛋白受體p90CD71(TFRC)和ATP50，它們是在21號染色體三體妊娠的基因小組中最大程度上調(diào)的優(yōu)選在胎盤表達(dá)的基因。通過實(shí)時QRT-PCR對微陣列進(jìn)行驗(yàn)證采用一步實(shí)時QRT-PCR驗(yàn)證了上述微陣列實(shí)驗(yàn)鑒定的21號染色體三體妊娠3種異常胎盤組織表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。對從3個21號染色體三體妊娠和5個具有相匹配妊娠齡的正常妊娠采集到的CVS組織中的所述3種轉(zhuǎn)錄物和GAPDH的mRNA水平進(jìn)行了定量。采用以下等式，將所測基因的相對mRNA水平對相應(yīng)的GAPDH水平進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化ΔCtx=CtGAPDH-Ctx其中Ct代表了閾循環(huán)數(shù)，即將樣品的QRT-PCR反應(yīng)累積的熒光達(dá)到預(yù)定閾強(qiáng)度所需要的PCR循環(huán)數(shù)。ΔCtx是所測轉(zhuǎn)錄物X的標(biāo)準(zhǔn)化mRNA水平；CteAPDH是GAPDHmRNA的Ct值；Ctx是所述轉(zhuǎn)錄物X的Ct值。由于Ct值與所述模板mRNA的量的對數(shù)呈反比，所以ΔCtx值越高則mRNA水平越高。在與從正常妊娠采集的CVS樣品進(jìn)行比較時，QRT-PCR顯示該21號染色體三體妊娠的CVS組織中EFEMP1mRNA(圖4A)，TFRCmRNA(圖4B)和ATP50mRNA(圖4C)確實(shí)有所上調(diào)。在非整倍性妊娠中所述三種轉(zhuǎn)錄物的異常胎盤組織表達(dá)，證明了其作為RNA標(biāo)記對21號染色體三體的產(chǎn)前檢測中的作用。母體血液中所述RNA標(biāo)記的可檢測性測定正常孕婦的血漿樣品的ATP50mRNA。在產(chǎn)后24小時，ATP5OmRNA的濃度具有統(tǒng)計(jì)顯著性的下降(圖4D;Wilcoxon,P<0.05),其在母體血漿中是可檢測的(圖4D)。這些數(shù)據(jù)說明胎盤是母體血漿中ATP50mRNA的重要組織來源。Mrk本發(fā)明使用基于微陣列的方法，對21號染色體三體的胎盤組織中具有異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行了鑒定。通過微陣列技術(shù)對所述三種轉(zhuǎn)錄物，EFEMP1、TFRC和ATP50進(jìn)行了鑒定，并通過QRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了其在21號染色體三體妊娠的胎盤組織中表達(dá)的異常特性。這些數(shù)據(jù)從而說明這3個轉(zhuǎn)錄物可用作21號染色體三體產(chǎn)前檢測的RNA標(biāo)記。ATP50mRNA在母體血漿中的可檢測性說明該轉(zhuǎn)錄物對胎兒21號染色體三體的非侵入性產(chǎn)前檢測具有適用性。例如，對21號染色體三體的非侵入性產(chǎn)前檢測可以根據(jù)對21號染色體三體妊娠中測定的所述RNA標(biāo)記和正常妊娠中的對應(yīng)濃度的比較的異常濃度來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例3受先兆子癇影響的妊娠胎盤中異常表達(dá)的基因與正常妊娠的對應(yīng)基因的比較Tffe受試者所有胎盤組織和血液樣品均采集自知情同意的處于妊娠末三個月的懷孕婦女，這些婦女是到香港威爾斯親王醫(yī)院的婦產(chǎn)科就診的。所述研究已獲得了臨床研究倫理委員會的批準(zhǔn)。在本研究的第一部分，采用寡核苷酸微陣列對正常和先兆子癇(PET)妊娠的胎盤組織基因表達(dá)譜進(jìn)行了鑒定。在剖腹產(chǎn)后，立即采集了5名PET妊娠的婦女(妊娠齡37-40周)和5名正常妊娠的婦女(妊娠齡38-40周)的胎盤組織。同時在產(chǎn)前采集外周血。在本研究的第二部分，使用QRT-PCR對通過所述寡核苷酸微陣列實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的基因表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證。在剖腹產(chǎn)后，立即采集了10名PET妊娠的婦女(妊娠齡25-40周)和10名正常妊娠的婦女(妊娠齡37-39周)的胎盤組織。對沒有高血壓病史的婦女而言，如果舒張血壓持續(xù)增加，一次>110mmHg、或者兩次或更多次在至少4小時間隔的的情況下>90mm，并且存在明顯的蛋白尿情況，則認(rèn)為該婦女患有先兆子癇。明顯的蛋白尿定義為蛋白尿>0.3g/天或在至少4小時間隔采集的兩次干凈收集的中段尿樣的浸漬條檢查法中』+。微陣列分析的樣品制備采集后立即將胎盤組織樣本儲存于RNAlater(Ambion,奧斯丁，德克薩斯，美國)并保存于-80°C直至進(jìn)行RNA提取。在進(jìn)行組織采集的同時收集6毫升外周血，并儲存于PAXgene血液RNA試管(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)中。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)指南，采用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)從胎盤組織中提取總RNA，并用RNeasymini-試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)進(jìn)行純化。按照制造商的指南，使用PAXgene血液RNA試劑盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)從外周血中提取總RNA，還包括進(jìn)行DNA酶處理(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden，德國)。通過高密度寡核苷酸微陣列進(jìn)行基因表達(dá)分析按照制造商的指南，對每個樣品而言，標(biāo)記所提取的10微克RNA并與GeneChip人類基因組U133A和U133B陣列(Affymetrix，SantaClara,加利福尼亞，美國)雜交。雜交之后，洗滌每個陣列并在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)中進(jìn)行染色。用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)對所述芯片進(jìn)行掃描，用GeneChipMicroarraySuite5.0(Affymetrix)進(jìn)行分析。實(shí)時定量RT-PCR采用一步實(shí)時定量RT-PCR(QRT-PCR)對胎盤組織和母體血漿樣品中的RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量測定。對持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)檢測的QRT-PCR分析在之前已有描述(Ngetal.2002)。其它檢測基因的引物(Proligo，Singapore)禾ΠTaqMan小溝結(jié)合(MGB)熒光探針(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,加利福尼亞，美國)序列如表5所示。采用相對定量來描述所表達(dá)的RNA量，其中根據(jù)相應(yīng)的GAPDHmRNA水平對所研究的轉(zhuǎn)錄物水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)制造商的指南(EZrTthRNAPCRreagentset,AppliedBiosystems)，在25μ1反應(yīng)體積中建立所述QRT-PCR反應(yīng)。在組合的熱循環(huán)儀和熒光檢測器(ABIPrism7900ΗΤ,AppliedBiosystems)上進(jìn)行所述QRT-PCR分析。對所有轉(zhuǎn)錄物而言，該P(yáng)CR引物和熒光探針的濃度分別為300ηΜ和ΙΟΟηΜ。在進(jìn)行QRT-PCR之前，根據(jù)制造商的推薦，使用DNaseI消化(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)去除所述胎盤組織RNA提取物中的污染DNA。使用17ng胎盤RNA提取物進(jìn)行擴(kuò)增。在每次分析中都包含有多個陰性水空白對照。所述熱處理過程如下所述反應(yīng)在50°C，2分鐘啟動，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘。經(jīng)過在95°C變性5分鐘之后，在92°C變性15秒和在56°C退火/延伸1分鐘進(jìn)行40個PCR循環(huán)。對母體血液中與先兆子癇相關(guān)的胎盤轉(zhuǎn)錄物的定量分析將孕婦母體全血樣品采集到EDTA管中。將所述血液樣品在l,600g，4°C離心10分鐘后，將血漿部分小心地轉(zhuǎn)移至空的聚丙烯管中。將該血漿樣品在16,000g，4°C再離心10分鐘。將上清液收集至新的聚丙烯管中。如前所述，從所收集的母體血漿中提取RNA(Ngetal2002)。采用與上述相同的條件對所研究的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行QRT-PCR分析。每個QRT-PCR反應(yīng)需要使用5微升所提取的血漿RNA。統(tǒng)計(jì)分析使用SigmaStat2.03軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果通過基于微陣列的方法對先兆子癇妊娠中具有異常胎盤組織表達(dá)基因的鑒定我們的最終目的是通過對母體血漿中的PET-相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的測定開發(fā)診斷PET的方法。因此對基因的選擇首先要鑒定在所述PET胎盤而不是在母體外周血細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。該策略的設(shè)計(jì)是基于我們之前的發(fā)現(xiàn)，即在正常個體中，胎盤是母體血液中循環(huán)胎兒RNA的重要來源以及造血系統(tǒng)是血漿DNA的主要來源(Luietal.，2002)。通過寡核苷酸微陣列，測定了5個PET胎盤組織及其對應(yīng)外周血樣品的基因表達(dá)譜。為了鑒定胎盤表達(dá)的基因，選擇的是在所述5個被分析胎盤組織樣品中至少在4個樣品中具有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。然后將在母體血細(xì)胞中具有表達(dá)的基因通過轉(zhuǎn)錄物的陽性選擇進(jìn)行去除，所述轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平當(dāng)與全部5組成對的胎盤和母體血液樣品中所對應(yīng)的全血樣品進(jìn)行比較時，或者在全部5個外周血樣品中都“不存在”，或者在胎盤中“升高”。因此，將在母體血細(xì)胞中具有與胎盤組織中表達(dá)類似或更高程度的轉(zhuǎn)錄物去除。通過這些程序得到了所選擇的轉(zhuǎn)錄物組，所述轉(zhuǎn)錄物優(yōu)選地在胎盤組織中表達(dá)。在下一步中，鑒定了在PET胎盤中具有異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。使用GeneChipMicroarraySuite5.0軟件(Affymetrix)，將5份PET中的每一份胎盤的表達(dá)譜與妊娠齡匹配的正常妊娠的胎盤表達(dá)譜進(jìn)行了比較。以正常的胎盤組織表達(dá)譜作為基線，將從所述5份上述PET妊娠樣品中鑒定出的胎盤特異性基因的表達(dá)信號都單獨(dú)地與5份正常胎盤樣品中的每一份進(jìn)行比較。總共進(jìn)行了25種比較，對于所詢問的每個基因，計(jì)數(shù)(I-計(jì)數(shù))在所述PET胎盤中表現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)的比較的數(shù)目。計(jì)算表達(dá)水平的成倍變化，并將其轉(zhuǎn)化成lo&值(信號Log比值，SLR)。然后對轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行選擇，條件為如果(i)當(dāng)與正常胎盤進(jìn)行比較時，所述信號Log比值至少為0.4(表達(dá)改變1.3倍)的程度下，PET胎盤中的所述轉(zhuǎn)錄物有所上調(diào)；以及Gi)所述上調(diào)與超過半數(shù)的比較給出的上調(diào)一致(I-計(jì)數(shù)213)。表6總結(jié)了在PET妊娠的胎盤中具有上調(diào)的優(yōu)先表達(dá)的10個已鑒定的轉(zhuǎn)錄物的結(jié)果。通過實(shí)時QRT-PCR對微陣列進(jìn)行驗(yàn)證采用一步實(shí)時QRT-PCR驗(yàn)證了從所述微陣列實(shí)驗(yàn)中選中的PET相關(guān)轉(zhuǎn)錄物。對從10個PET和具有相匹配妊娠齡的正常妊娠中采集到的每一個胎盤組織中的GAPDHmRNA濃度進(jìn)行了測定。將該GAPDHmRNA濃度用于對不同樣品之間的所述轉(zhuǎn)錄物水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。然后將通過微陣列分析鑒定的兩組妊娠胎盤組織樣品中的所述10個轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平進(jìn)行比較。采用以下等式，將所測基因的相對mRNA水平對相應(yīng)的GAPDH水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化ΔCtx=CtGAPDH-Ctx其中Ct代表了閾循環(huán)數(shù)，即將樣品的QRT-PCR反應(yīng)累積的熒光達(dá)到預(yù)定閾強(qiáng)度所需要的PCR循環(huán)數(shù)。ΔCtx是所測轉(zhuǎn)錄物X的標(biāo)準(zhǔn)化mRNA水平；CteAPDH是GAPDHmRNA的Ct值；Ctx是所述轉(zhuǎn)錄物X的Ct值。由于Ct值與所述模板mRNA的量的對數(shù)呈反比，所以ΔCtx值越高則mRNA水平越高。當(dāng)通過QRT-PCR分析對正常妊娠進(jìn)行比較時，在PET胎盤中證實(shí)了顯著的Leptin(LEP)和唾液酸結(jié)合Ig-樣凝集素6(sialicacidbindinglg-likelectin6)(SIGLEC6)mRNA的上調(diào)(圖5A和圖5B分別為Leptin和SIGLEC6mRNA)(Mann-Whitney檢驗(yàn)，對兩種情況都為P<0.05)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的轉(zhuǎn)錄物選擇策略能夠鑒定出在PET胎盤組織中異常表達(dá)的標(biāo)記。母體血液中所述PET相關(guān)RNA標(biāo)記的可檢測性通過QRT-PCR對25個健康和26個受PET影響妊娠末三個月的血漿樣品進(jìn)行了LEP和INHBAmRNA的測定。當(dāng)與正常妊娠相比較時，受PET影響的妊娠中母體血漿的LEP和INHBA濃度顯著升高(LEP圖6A，Mann-Whitney,P=0.017；INHBA圖6B,MannWhitney,P=0.006)。結(jié)論本發(fā)明使用基于微陣列的方法，鑒定出了在PET胎盤中具有不同表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物，并考慮將其作為診斷PET的重要標(biāo)記。在通過微陣列分析鑒定出的PET-相關(guān)轉(zhuǎn)錄物清單中，選擇了10個與正常妊娠相比在PET胎盤中最異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物。實(shí)時QRT-PCR也證實(shí)了在與正常胎盤相比較時在PET胎盤中LEP和SIGLEC6的表達(dá)都顯著上調(diào)。與正常妊娠相比，PET妊娠中母體血漿的INHBA和LEP水平也顯著增高，由此說明使用這些標(biāo)記進(jìn)行PET非侵入性產(chǎn)前評估的可能性。實(shí)施例421號染色體三體和正常妊娠母體血漿中胎盤特異的PLAC4mRNAPLAC4mRNA的可檢測性與妊娠特異性的測定使用實(shí)時QRT-PCR分析測定母體血漿中的PLAC4mRNA。除此之外，在嬰兒誕生之后PLAC4mRNA會從該母體的血漿中清除出去。所以，母體血漿中的PLAC4mRNA是源于胎兒的，并且是妊娠特異性的。樣品采集和處理從5名非妊娠婦女，5名妊娠頭三個月和8名妊娠末三個月婦女采集外周血液樣品。同樣還在產(chǎn)前和產(chǎn)后24小時從6名妊娠末三個月的婦女采集了外周血。將該血液樣品收集于EDTA管中。如實(shí)施例1所述收集血漿樣品。根據(jù)實(shí)施例1所述的步驟，從母體血漿中提取RNA。實(shí)時QRT-PCR分析的開發(fā)如實(shí)施例1所述開發(fā)了對PLAC4mRNA的QRT-PCR分析。所述引物(IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA，美國)和TaqMan小溝結(jié)合(MGB)熒光探針(AppliedBiosystems,FosterCity,加利福尼亞，美國)和校準(zhǔn)物(Proligo，Singapore)的序列如表7所示。根據(jù)制造商的指南(EZrTthRNAPCRreagentset,AppliedBiosystems)，在25y1反應(yīng)體積中建立所述QRT-PCR反應(yīng)。在ABIPrism7900HT(AppliedBiosystems)上進(jìn)行所述QRT-PCR分析。所述PCR引物和熒光探針的濃度分別為400nM和lOOnM。5y1所提取的RNA用于擴(kuò)增。所述熱處理過程為所述反應(yīng)在50°C、2分鐘啟動，然后在60°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘。經(jīng)過在95°C變性5分鐘之后，在95°C變性15秒和在60°C、1分鐘進(jìn)行45個PCR循環(huán)。PLAC4mRNA能在母體血漿中檢測并且是妊娠特異性的在所有頭三個月和末三個月懷孕婦女而不是非妊娠個體中檢測到PLAC4mRNA(圖7)。在頭三個月和末三個月妊娠的血漿中的PLAC4mRNA的中位濃度分別為299.6拷貝/ml和529.3拷貝/ml。測定了所述循環(huán)PLAC4mRNA的妊娠特異性。在產(chǎn)前血漿樣品中，PLAC4mRNA的中位濃度為500.0拷貝/ml。在所有的產(chǎn)后血漿樣品中都檢測不到所述轉(zhuǎn)錄物(圖8)。在整倍體和21號染餼體三體妊娠中循環(huán)PLAC4mRNA的比較在核型分析正常和21號染色體三體的妊娠之間對循環(huán)PLAC4mRNA的濃度進(jìn)行比較。從29名懷有整倍體胎兒的孕婦以及處于頭三個月和中三個月妊娠的5名懷有21號染色體三體胎兒的孕婦中收集血漿樣品。然后通過實(shí)時一步RT-PCR測定所述血漿樣品中的PLAC4mRNA濃度。測定所有三體血漿樣品的PLAC4mRNA濃度。21號染色體三體和正常妊娠中的中位值分別為5581拷貝/ml和4836拷貝/ml。由于樣本數(shù)較少，因此沒有在正常和21號染色體三體妊娠之間沒有建立統(tǒng)計(jì)顯著性差異。實(shí)施例5受先兆子癇影響的妊娠胎盤中異常表達(dá)的基因與正常妊娠中對應(yīng)基因的比較Tffe受試者所有胎盤組織和血液樣品均采集自知情同意的處于妊娠末三個月的懷孕婦女，這些婦女是到香港威爾斯親王醫(yī)院的婦產(chǎn)科就診的。所述研究已獲得了臨床研究倫理委員會的批準(zhǔn)。在本研究的第一部分，采用寡核苷酸微陣列對正常和先兆子癇(PET)妊娠的胎盤組織基因表達(dá)譜進(jìn)行了鑒定。在剖腹產(chǎn)后，立即采集了5名PET妊娠的婦女(妊娠齡37-40周)和5名正常妊娠的婦女(妊娠齡38-40周)的胎盤組織。同時在產(chǎn)前采集外周血。在本研究的第二部分，使用QRT-PCR對通過所述寡核苷酸微陣列實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的基因表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證。在剖腹產(chǎn)后，立即采集了6名PET妊娠的婦女(妊娠齡30-39周)和6名正常妊娠的婦女(妊娠齡37-39周)的胎盤組織。對沒有高血壓病史的婦女而言，如果舒張血壓持續(xù)增加，一次>110mmHg、或者兩次或更多次在至少4小時間隔的的情況下>90mm，并且存在明顯的蛋白尿情況，則認(rèn)為該婦女患有先兆子癇。明顯的蛋白尿定義為蛋白尿>0.3g/天或在至少4小時間隔采集的兩次干凈收集的中段尿樣的浸漬條檢查法中》+。微陣列分析的樣品制備采集后立即將胎盤組織樣本儲存于RNAlater(Ambion,奧斯丁，德克薩斯，美國)并保存于-80°C直至進(jìn)行RNA提取。在進(jìn)行組織采集的同時收集6毫升外周血，并儲存于PAXgene血液RNA試管(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)中。根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)指南，采用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad,加利福尼亞，美國)從胎盤組織中提取總RNA，并用RNeasymini-試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)進(jìn)行純化。按照制造商的指南，使用PAXgene血液RNA試劑盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon,瑞士)從外周血中提取總RNA，還包括進(jìn)行DNA酶處理(RNase-FreeDNaseSet，Qiagen,Hilden，德國)。通過高密度寡核苷酸微陣列進(jìn)行基因表達(dá)分析按照制造商的指南，對每個樣品而言，標(biāo)記所提取的10微克RNA并與GeneChip人類基因組U133A和U133B陣列(Affymetrix，SantaClara,加利福尼亞，美國)雜交。雜交之后，洗滌每個陣列并在GeneChipFluidicsStation400(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞，美國)中進(jìn)行染色。用GeneArrayScanner(Affymetrix,SantaClara，加利福尼亞，美國)對所述芯片進(jìn)行掃描，用GeneSpringv7.2(AgilentTechnologies,PaloAlto,加利福尼亞，美國)進(jìn)行分析。微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)的挖掘/分析將所述微陣列數(shù)據(jù)以CEL格式導(dǎo)入GeneSpringv7.2(AgilentTechnologies)。對正常和PET妊娠的樣品(胎盤組織和母體血細(xì)胞)獨(dú)立地進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。在每一組妊娠中，首先確定在胎盤組織樣品中的表達(dá)相對高于母體血細(xì)胞的基因。依次采用以下步驟對5份胎盤和配對的母體血細(xì)胞的微陣列原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(1)以GC含量背景校正(GC-RMA)，使用RobustMulti-chipAverage對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；(2)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，由此低于0.001的微陣列數(shù)值都被設(shè)置成0.001；及(3)用每個基因的信號強(qiáng)度除以全部樣品中測定的中位值。然后確定在胎盤組織或母體血細(xì)胞中具有統(tǒng)計(jì)顯著性(P<0.05)表達(dá)的基因。根據(jù)確定具有較高倍數(shù)差異轉(zhuǎn)錄物的目的，將這些基因以在胎盤組織表達(dá)和母體血細(xì)胞表達(dá)的倍數(shù)差異的順序進(jìn)行儲存。這樣的數(shù)據(jù)挖掘處理可以鑒定出在胎盤組織中比母體血細(xì)胞中相對較高表達(dá)的的基因。在另一方面，數(shù)據(jù)挖掘也可用來鑒定在胎盤組織中具有較高絕對表達(dá)水平的基因。通過GC-RMA處理然后將低于0.001的微陣列數(shù)值設(shè)置成0.001進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化對所述胎盤組織的原始微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)水平對基因進(jìn)行排序。同樣也對從正常和先兆子癇妊娠采集的胎盤組織進(jìn)行獨(dú)立地數(shù)據(jù)挖掘。如果基因在所述PET胎盤相對配對母體血液的倍數(shù)差異高于正常妊娠的倍數(shù)差異，或者那些基因在PET中比正常胎盤中高得多的絕對表達(dá)水平，而在胎盤組織和母體血液中的表達(dá)至少有200倍的差異，則對這些選中的基因進(jìn)行深入研究。實(shí)時定量RT-PCR采用一步實(shí)時定量RT-PCR對胎盤組織中的RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行定量測定。以濃度從2.5xl06拷貝到2.5拷貝，通過對經(jīng)過高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸進(jìn)行連續(xù)稀釋制備了校準(zhǔn)曲線。所述引物(Proligo)，熒光探針(AppliedBiosystems)和所研究基因的寡核苷酸校準(zhǔn)物的序列如表8所示。根據(jù)制造商的指南(EZrTthRNAPCRreagentset,AppliedBiosystems)，在50u1反應(yīng)體積中建立所述QRT-PCR反應(yīng)。在聯(lián)合的熱循環(huán)儀和熒光檢測器(ABIPrism7900HT,AppliedBiosystems)上進(jìn)行所述QRT-PCR分析。對所有研究轉(zhuǎn)錄物而言，所述熒光探針的濃度是100nM。對妊娠相關(guān)血漿蛋白A(pregnancy-associatedplasmaproteinA)，pappalysinl(PAPPA)，INHBA和FN1進(jìn)行分析的每個反應(yīng)中分別使用300nM的正向和反向引物。對LEP，ADAM金屬肽酶結(jié)構(gòu)域12(meltrinalpha)(ADAM12)和pappalysin2(PAPPA2)進(jìn)行分析的每個反應(yīng)中則分別使用400nM的正向和反向引物。在進(jìn)行QRT-PCR之前，根據(jù)制造商的推薦，使用DNasel消化(Invitrogen)去除所述胎盤組織RNA提取物中的污染DNA。使用lng提取的胎盤RNA進(jìn)行擴(kuò)增。在每次分析中都包含有多個陰性水空白對照。依胎盤總RNA的拷貝數(shù)/ng對胎盤組織RNA濃度進(jìn)行表述。所述熱處理過程如下所述反應(yīng)在50°C、2分鐘啟動，使得所包含的尿嘧啶N-糖基化酶起作用，然后在60°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘。經(jīng)過在95°C變性5分鐘之后，在92°C變性15秒，以及對于LEP、ADAM12、PAPPA和INHBA在56°C，對于PAPPA2和FN1在57°C退火/延伸1分鐘進(jìn)行40個PCR循環(huán)。統(tǒng)計(jì)分析使用SigmaStat3.0軟件(SPSS)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。MM從所述微陣列分析中鑒定出的基因包括LEP、ADAM12(GenBank登錄號NM_003474,NM_021641)、PAPPA(GenBank登錄號NM_002581)、PAPPA2(GenBank登錄號NM_020318，NM_021936)、INHBA和FN1。采用一步實(shí)時QRT-PCR對PET和正常妊娠中選中的轉(zhuǎn)錄物的胎盤組織表達(dá)水平進(jìn)行測定。結(jié)果如圖9所示。收集自PET妊娠的胎盤中，LEP、ADAM12、PAPPA2、INHBA和FN1的濃度高于正常妊娠胎盤中的濃度，而PAPPAmRNA在收集自PET妊娠的胎盤中的濃度則低于正常妊娠胎盤中的濃度。碰本發(fā)明使用基于微陣列的方法，鑒定出了在PET胎盤中具有異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物，并考慮將其作為診斷PET的重要標(biāo)記。從所述微陣列分析中選出了6種轉(zhuǎn)錄物，并通過實(shí)時QRT-PCR驗(yàn)證了其在PET胎盤中異常表達(dá)譜的特性。參考文獻(xiàn)Lui,YYN,Chik,KW,Chiu,RWK,Ho,CY,Lam,CWandLo,YMD(2002).《性別錯配骨髓移植后血漿和血清中無細(xì)胞DNA的主要造血來源》(Predominanthematopoieticoriginofcell-freeDNAinplasmaandseramaftersex-mismatchedbonemarrowtransplantation.)ClinChem48,421_427.Ng，EKO，Tsui，NBY,Lam,NY,Chiu,RWK,Yu,SC,Wong,SC,Lo,ES,Rainer,TH,Johnson,PJandLo,YMD(2002).《在癌癥患者和健康個體中可過濾和不可過濾mRNA的存在》(PresenceoffilterableandnonfilterablemRNAintheplasmaofcancerpatientsandhealthyindividuals.)ClinChem48,1212-1217.Ng,EKO,Tsui,NBY,Lau,TK,Leung,TN,Chiu,RWK,Panesar,NS,Lit,LCW,Chan,KWandLo,YMD(2003).《胎盤來源的mRNA在母體血漿中的易檢測性》(mRNAofplacentaloriginisreadilydetectableinmaternalplasma.)ProcNatlAcadSciU.S.A.100,4748-4753.為所有目的，將本申請所引用的所有專利、專利申請以及其它出版物，包括公開的氨基酸或多核苷酸序列全部引用作為參考。表1A對21號染色體上及具有胎盤表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行實(shí)時QRT-PCR檢測的引物和探針的序列權(quán)利要求1.測定孕婦中存在21號染色體三體的胎兒的試劑盒，所述試劑盒包含(i)對所述孕婦生物樣品中的RNA類型含量進(jìn)行定量測定的PCR引物，其中所述RNA類型獨(dú)立地選自從包含PLAC4、EFEMPl和TFRC的遺傳座位衍生得到的RNA類型，其中所述生物樣品為血液、生殖道的洗滌物、羊水、尿液、唾液或絨毛膜絨毛；及(ii)代表懷有正常染色體胎兒的孕婦對應(yīng)樣品中所述RNA類型含量的標(biāo)準(zhǔn)對照。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述RNA類型衍生自PLAC4、EFEMPl或TFRC,其中所述RNA類型含量比所述標(biāo)準(zhǔn)對照升高說明所懷胎兒具有21號染色體三體的高易感性。3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述PCR包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，還包含用于質(zhì)譜分析的試劑。5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述孕婦處于妊娠的頭三個月、中三個月或末三個月。6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述血液是血漿或血清。7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述RNA含量比標(biāo)準(zhǔn)對照升高超過2倍或比標(biāo)準(zhǔn)對照降低超過50%。全文摘要本發(fā)明通過對母體血液中衍生自一系列遺傳座位的一種或多種RNA類型的含量進(jìn)行定量測定，并將所述RNA類型含量與標(biāo)準(zhǔn)對照相比較，提供了診斷、監(jiān)測或預(yù)測孕婦先兆子癇、胎兒的18號染色體三體和21號染色體三體、以及婦女懷孕的方法和試劑盒。文檔編號G01N27/62GK102010902SQ201010266359公開日2011年4月13日申請日期2006年3月17日優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日發(fā)明者盧煜明,徐寶賢,詹兆沖,趙慧君申請人:香港中文大學(xué)