專利名稱：一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒，特別涉及采用LAMP方法快速檢 測衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲、囊蚴、蟲卵的技術(shù)，具體來說是一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒 和方法。
背景技術(shù)：
衛(wèi)氏并殖吸蟲，是人體并殖吸蟲的重要蟲種之一，是引起肺型并殖吸蟲病為主的 并殖吸蟲。衛(wèi)氏并殖吸蟲的致病，主要是童蟲或成蟲在人體組織與器官內(nèi)移行、寄居造成的 機(jī)械性損傷，及其代謝物等引起的免疫病理反應(yīng)。根據(jù)病變過程可分為急性期及慢性期。 它潛伏期不易確定，感染后急性發(fā)病。癥狀隨蟲體寄生的部位不同而異。以胸、腹、腦損害 的表現(xiàn)為多見。衛(wèi)氏并殖吸蟲的終宿主除人外，主要為肉食哺乳動(dòng)物如犬、貓。第一中間宿 主為生活于淡水的川卷螺類。第二中間宿主為淡水蟹和蜊蛄。生活史過程包括卵、毛蚴、胞 蚴、母雷蚴、子雷蚴、尾蚴、囊蚴(脫囊后稱后尾蚴)、童蟲及成蟲等階段。成蟲主要寄生于 肺，所形成的蟲囊往往與支氣管相通，蟲卵經(jīng)氣管隨痰或吞入后隨糞便排出。卵入水后，在 適宜條件下約經(jīng)3周左右發(fā)育成熟并孵出毛蚴。毛蚴在水中活動(dòng)，如遇川卷螺，則侵入并發(fā) 育，經(jīng)過胞蚴、母雷蚴、子雷蚴的發(fā)育和無性增殖階段，最后形成許多具有小球形尾的短尾 蚴。成熟的尾蚴從螺體逸出后，侵入淡水蟹或蜊蛄，或隨螺體一起被吞食而進(jìn)入第二中間宿 主體內(nèi)。在蟹和蜊蛄肌肉、內(nèi)臟或腮上形成球形或近球形囊蚴。囊蚴直徑約300-400 μ m，具 兩層囊壁。人吃了含有囊蚴的淡水蟹或蜊蛄而感染。該病的診斷主要采用病原學(xué)檢查痰或 糞便中的蟲卵，以及免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，但以上技術(shù)操作起來需要PCR儀等比較昂貴的儀器，所以 在大批量樣本檢測和蟲卵及囊蚴樣本分型時(shí)比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域 設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件(65°C 左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長時(shí)間溫度循環(huán)、繁 瑣的電泳、紫外觀察等過程。鑒于以上原因，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)這種高效，方便快捷的檢測技術(shù)可用于衛(wèi)氏并殖吸蟲的鑒定，進(jìn)而可 為衛(wèi)氏并殖吸蟲病的快速檢測和防控等提供有效的檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒和方法，所述的這種 快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒和方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲、囊蚴、 蟲卵的方法復(fù)雜，又費(fèi)時(shí)又費(fèi)力的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，包括DNA裂解液、LAMP反應(yīng) 液、SYBR green I顯色液和衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照液。
進(jìn)一步的，還包括Bst大片段聚合酶。進(jìn)一步的，所述的DNA裂解液由細(xì)胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四個(gè) 試劑配制而成，配制好后，在所述的DNA裂解液中，所述的細(xì)胞裂解液的終濃度為7-10 μ Μ, 所述的EDTA的終濃度為0. 5Μ，所述的蛋白酶K的終濃度為18-20mM，所述的RNase A溶液 的終濃度為3-5 μ Μ。進(jìn)一步的，所述的LAMP反應(yīng)液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜堿、引物FIP、引物 BIP、引物F3、引物B3、環(huán)引物L(fēng)oop F、環(huán)引物L(fēng)oopB和MgSO4溶液十二個(gè)試劑配制組成，所述 的引物FIP的序列如SEQ ID No :1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No :2所示，所述 的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQID No 4所示，所述的 環(huán)引物L(fēng)oopF的序列如SEQ ID No 5所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopB的序列如SEQ ID No 6所 示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的終濃度均為200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的 終濃度均為0. 2mM,環(huán)引物L(fēng)oop F.LoopB的終濃度均為0. 8 μ M，甜菜堿的終濃度為10 μ Μ, MgSO4的終濃度為10mM。進(jìn)一步的，所述的SYBR green I顯色液為1 10倍稀釋液。進(jìn)一步的，衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照液的濃度為32. 0-45. Ong/μ L0進(jìn)一步的，所述的Bst大片段聚合酶的濃度為SU/μ L。本發(fā)明還提供了一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的方法，包括如下步驟(1)對(duì)被檢測的成蟲、囊蚴、蟲卵的DNA進(jìn)行提取；(2)采用恒溫加熱器技術(shù)，利用LAMP反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SYBR green I顯色液顯色后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，采用恒溫加熱器技術(shù)擴(kuò)增條件為在55-65°C恒溫下反 應(yīng)40-50分鐘。進(jìn)一步的，所述的LAMP反應(yīng)液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜堿、引物FIP、引物 BIP、引物F3、引物B3、環(huán)引物L(fēng)oop F、環(huán)引物L(fēng)oopB和MgSO4溶液十二個(gè)試劑配制組成，所 述的引物FIP的序列如SEQ ID No :1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No :2所示，所 述的引物F3的序列如SEQ ID No :3所示，所述的引物B3的序列如SEQ ID No :4所示，所述 的環(huán)引物L(fēng)oopF的序列如SEQ IDNo :5所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopB的序列如SEQ ID No :6所 示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的終濃度均為200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的 終濃度均為0. 2mM,環(huán)引物L(fēng)oop F.LoopB的終濃度均為0. 8 μ M，甜菜堿的終濃度為10 μ Μ, MgSO4的終濃度為IOmM的。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)技術(shù)擴(kuò)增了核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)_2基因 (The second internal transcribed spacers (ITS-2) ofnuclear ribosomal DNA)，發(fā)現(xiàn)了 該段基因能特異的區(qū)分衛(wèi)氏并殖吸蟲和其他常見感染人的寄生蟲。本申請(qǐng)人根據(jù)衛(wèi)氏并殖 吸蟲ITS-2基因的特性并結(jié)合LAMP技術(shù)的檢測特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種采用LAMP方法快速區(qū)檢測 衛(wèi)氏并殖吸蟲方法。本發(fā)明同時(shí)提供所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟(I)DNA的提取蟲體材料置于1. 5mL的離心管中，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次，移 去離心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)釋放基因組DNA，56°C過夜消化15_18h ；消化好的蟲體懸液按 Promega 試劑盒Wizard SV Genomic DNA purification system 使用說明 提取蟲體DNA，直接使用或于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｄ因蔇NA的提取參照MUller (2007)的方法，將溪蟹或蜊蛄去殼，搗碎，加入Iml人 工胃液，37°C搖床中消化1小時(shí)。取出瞬時(shí)離心，去上清；加入Iml的雙蒸水，搖勻，重復(fù)以 上步驟反復(fù)清洗兩次，最后離心去上清保留30 μ 1左右液體。加入液體體積一半的玻璃珠， 旋渦震蕩Imin后離心，沸水中煮5min，最后IOOOOrpm離心lmin，取3μ 1上清進(jìn)行PCR擴(kuò)
+飽
+曰ο蟲卵DNA的提取方法參照MUller (2007)提純蟲卵的方法并加以改良，取0. 1克陽 性糞便于1. 5ml Eppendorf管中，加入含有2%的Triton X-100和0. IM的氫氧化鉀的溶 液Iml室溫下作用lOmin，其間不斷搖勻。然后IOOOOrpm離心2min，去上清，重復(fù)前面的步 驟清洗兩次。離心去上清后加入1. 2ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，HOOOrpm離心5min。 此時(shí)蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中。分別吸取200 μ 1上清到另一個(gè)1. 5ml Eppendorf管中，加入1. 2ml雙蒸水，12000rpm離心2min。去上清，保留100 μ 1左右液體， 用移液器吹打使沉淀與液體混勻。然后把各管的液體都移到同一管中，離心管內(nèi)加滿雙蒸 水，12000rpm離心2min。去上清，再加入1. 2ml雙蒸水，如此重復(fù)3 5次。最后離心去上 清，保留30 μ 1液體。在顯微鏡下操作，用移液器從純化的蟲卵中分別吸取1個(gè)、3個(gè)、5個(gè)蟲卵到含有 30 μ 1雙蒸水的1. 5ml Eppendorf管中，做好標(biāo)記，以檢測蟲卵特異PCR檢測方法的敏感性。加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩Imin后瞬時(shí)離心，沸水中煮5min，最后 IOOOOrpm離心lmin，取3 μ 1上清PCR擴(kuò)增。(2) LAMP擴(kuò)增按照擴(kuò)增樣品數(shù)η (η =樣品數(shù)+2)取LAMP反應(yīng)液、Bst酶混合于一 離心管中，混勻，分裝；將陽、陰性對(duì)照液分別加入一個(gè)分裝管中，取各樣品的DNA加入對(duì)應(yīng) 反應(yīng)管中；各反應(yīng)管標(biāo)記后離心混勻，置于恒溫加熱器上反應(yīng)；(3)LAMP產(chǎn)物觀察取擴(kuò)增后的產(chǎn)物加樣于2. 0%瓊脂糖凝膠上，電泳后置于紫外 透射儀下觀察結(jié)果并拍照分析。(4) LAMP顯色反應(yīng)將上述LAMP產(chǎn)物各加入1 μ L SYBR greenl在室溫放置5min， 進(jìn)行顯色。(5)顯色反應(yīng)觀察肉眼觀察陽性反應(yīng)呈綠色，陰性不變色；在紫外燈下，陽性反 應(yīng)發(fā)出熒光，陰性反應(yīng)無熒光。步驟(2)所述Bst酶按每個(gè)PCR反應(yīng)含1. 25U加入。步驟⑵所述LAMP擴(kuò)增條件為肝片吸蟲LAMP檢測為61°C，大片吸蟲LAMP檢測 為62V，各反應(yīng)45分鐘。本發(fā)明試劑盒LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化過程為根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，對(duì)MgS04、Betaine、Bst DNAPoLymerase、dNTP、引物濃度 等分別進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)引物Tm值，將溫度按59°C、60°C、61。C、62。C、63°C、64。C、65。C依 次遞增，從多次重復(fù)試驗(yàn)中確定最佳退火溫度。反應(yīng)時(shí)間按30min、45min、60min、90min、 120min優(yōu)化，多次重復(fù)試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)時(shí)間。經(jīng)試驗(yàn)確定，LAMP反應(yīng)最佳反應(yīng)溫度為 600C ；添加環(huán)引物后反應(yīng)最快可在45min內(nèi)完成。本發(fā)明的有益效果是
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(1)本發(fā)明通過對(duì)來自于我國肺吸蟲病疫區(qū)廣東和福建的衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲分離 株、囊蚴、蟲卵進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)能在短時(shí)間檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲感染。(2)本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的 試劑盒，試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客觀，不僅可用于衛(wèi)氏 并殖吸蟲感染的快速檢測，還可用于人和動(dòng)物衛(wèi)氏并殖吸蟲病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查，為 衛(wèi)氏并殖吸蟲病診斷和防治技術(shù)等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。


圖1為衛(wèi)氏并殖吸蟲LAMP特異性顯色圖譜，1-10分別為衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲，衛(wèi) 氏并殖吸蟲囊蚴，衛(wèi)氏并殖吸蟲蟲卵，肝片吸蟲，大片吸蟲，中華分支睪吸蟲，麝貓后睪吸 蟲，日本血吸蟲，曼氏血吸蟲和空白對(duì)照。圖2為衛(wèi)氏并殖吸蟲LAMP特異性電泳圖譜，M，DL2000marker ； 1-9分別為衛(wèi)氏 并殖吸蟲成蟲，衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴，衛(wèi)氏并殖吸蟲蟲卵，肝片吸蟲，大片吸蟲，中華分支睪吸 蟲，麝貓后睪吸蟲，日本血吸蟲，曼氏血吸蟲和空白對(duì)照。圖3為衛(wèi)氏并殖吸蟲LAMP敏感性電泳圖譜，管1_6模板DNA的稀釋濃度依次為 KT3-IO-9Iig/μ 1，管7為陰性對(duì)照。圖4為衛(wèi)氏并殖吸蟲LAMP敏感性顯色圖譜，管1_6模板DNA的稀釋濃度依次為 KT3-IO-9Iig/μ 1，管7為陰性對(duì)照。圖5為衛(wèi)氏并殖吸蟲LAMP成蟲分離株、尾蚴、蟲卵LAMP檢測顯色圖譜，其中管1 代表衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲，管2-4代表感染囊蚴的溪蟹，管5-7代表感染囊蚴的蜊蛄；管8-13 代表肺吸蟲病人的痰液，管14-18代表肺吸蟲病人的胸水管19-20代表未感染衛(wèi)氏并殖吸 蟲的溪蟹和健康人的痰液，管21代表陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，包括DNA裂解液、LAMP反應(yīng)液、SYBR green I顯色液和衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照液。進(jìn)一步的，還包括Bst大片段聚合酶。進(jìn)一步的，所述的DNA裂解液由細(xì)胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四個(gè) 試劑配制而成，配制好后，在所述的DNA裂解液中，所述的細(xì)胞裂解液的終濃度為7-10 μ Μ, 所述的EDTA的終濃度為0. 5Μ，所述的蛋白酶K的終濃度為18-20mM，所述的RNase A溶液 的終濃度為3-5 μ Μ。進(jìn)一步的，所述的LAMP反應(yīng)液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜堿、引物FIP、引物 BIP、引物F3、引物B3、環(huán)引物L(fēng)oop F、環(huán)引物L(fēng)oopB和MgSO4溶液十二個(gè)試劑配制組成，所述 的引物FIP的序列如SEQ ID No :1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No :2所示，所述 的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQID No 4所示，所述的 環(huán)引物L(fēng)oopF的序列如SEQ ID No 5所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopB的序列如SEQ ID No 6所 示，配制好后，所述的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的終濃度均為200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的 終濃度均為0. 2mM,環(huán)引物L(fēng)oop F.LoopB的終濃度為0. 8 μ M，甜菜堿的終濃度均為10 μ Μ,MgSO4的終濃度為10mM。進(jìn)一步的，所述的SYBR green I顯色液為1 10倍稀釋液。進(jìn)一步的，衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照液的濃度為32. 0-45. Ong/ μ L。進(jìn)一步的，所述的Bst大片段聚合酶的濃度為SU/μ L。實(shí)施例2本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的試劑盒試劑盒內(nèi)含DNA裂解液，其中含Nuclei lysis solution (終濃度7-10 μ Μ)、 EDTA(終濃度 0. 5Μ)、蛋白酶 Κ(終濃度 18-20mM)和 RNase A solution (終濃度 3-5 μ Μ)； LAMP反應(yīng)液100個(gè)反應(yīng)(25 μ L/反應(yīng))是終濃度為200 μ M的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，終 濃度為 0. 2mM 的引物 FIP、BIP、F3、B3，0. 8 μ M 環(huán)引物 Loop F、LoopB, 10 μ M 的 betaine、終 濃度為IOmM的MgSO4的混合溶液；1 10倍SYBRgreen I顯色液；25 μ L Bst DNA聚合酶 (8U/ μ L)；衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照。檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲、囊蚴、蟲卵的特異性檢測引物見下表。
權(quán)利要求
一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于包括DNA裂解液、LAMP反應(yīng)液、SYBR green I顯色液和衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于還包括 Bst大片段聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于所述的 DNA裂解液由細(xì)胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四個(gè)試劑配制而成，配制好后， 在所述的DNA裂解液中，所述的細(xì)胞裂解液的終濃度為7-10 μ Μ,所述的EDTA的終濃度為 0. 5Μ，所述的蛋白酶K的終濃度為18-20mM，所述的RNase A溶液的終濃度為3_5 μ Μ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于所述的 LAMP反應(yīng)液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜堿、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、環(huán)引 物L(fēng)oop F、環(huán)引物L(fēng)oopB和MgSO4溶液十二個(gè)試劑配制組成，所述的引物FIP的序列如SEQ ID No 1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No 2所示，所述的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQ ID No 4所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopF的序列如 SEQ IDNo :5所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopB的序列如SEQ ID No :6所示，配制好后，所述的dATP、 dTTP、dGTP和dCTP的終濃度均為200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的終濃度均為0. 2mM，環(huán)引 物L(fēng)oop F、LoopB的終濃度均為0. 8 μ Μ，甜菜堿的終濃度為10 μ M5MgSO4的終濃度為10mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于所述的 SYBR green I顯色液為1 10倍稀釋液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于衛(wèi) 氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照液的濃度為32. 0-45. Ong/ μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，其特征在于所述的 Bst大片段聚合酶的濃度為8U/ μ L0
8.一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的方法，其特征在于包括如下步驟(1)對(duì)被檢測的成蟲、囊蚴、蟲卵的DNA進(jìn)行提??；(2)采用恒溫加熱器技術(shù)，利用LAMP反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SYBRgreen I顯色液顯色后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的方法，其特征在于所述步驟 (2)中，采用恒溫加熱器技術(shù)擴(kuò)增條件為在55-65°C恒溫下反應(yīng)40-50分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的方法，其特征在于所述的 LAMP反應(yīng)液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜堿、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、環(huán)引 物L(fēng)oop F、環(huán)引物L(fēng)oopB和MgSO4溶液十二個(gè)試劑配制組成，所述的引物FIP的序列如SEQ ID No 1所示，所述的引物BIP的序列如SEQ ID No 2所示，所述的引物F3的序列如SEQ ID No 3所示，所述的引物B3的序列如SEQ ID No 4所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopF的序列如 SEQ IDNo :5所示，所述的環(huán)引物L(fēng)oopB的序列如SEQ ID No :6所示，配制好后，所述的dATP、 dTTP、dGTP、dCTP的終濃度均為200 μ M，引物FIP、BIP、F3、B3的終濃度均為0. 2mM，環(huán)引物 Loop F、LoopB的終濃度均為0. 8 μ Μ，甜菜堿的終濃度為10 μ M5MgSO4的終濃度為IOmM的。全文摘要
本發(fā)明一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的試劑盒，包括DNA裂解液、LAMP反應(yīng)液、SYBR green I顯色液和衛(wèi)氏并殖吸蟲DNA陽性對(duì)照，DNA裂解液由細(xì)胞裂解液、EDTA、蛋白酶K和RNase A溶液四個(gè)試劑配制而成；LAMP反應(yīng)液由dATP、dTTP、dGTP、dCTP、甜菜堿、引物FIP、BIP、F3、B3、環(huán)引物L(fēng)oop F、環(huán)引物L(fēng)oopB和MgSO4溶液十二個(gè)試劑配制而成。本發(fā)明還提供了一種快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲的方法。本發(fā)明是一種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲的方法，可準(zhǔn)確地鑒定衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲、囊蚴、蟲卵。本發(fā)明操作簡單，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果客觀。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101956013SQ201010298790
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者張仁利, 張永年, 朱興全, 李鑫, 艾琳, 陳家旭, 陳木新, 陳韶紅 申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所