專利名稱：一種基于uplc-ms技術(shù)診斷肺癌的模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于診斷肺癌的模型，為肺癌的診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮亦稱支氣管肺癌。肺癌一般指的是肺實(shí)質(zhì)部的癌癥，通常不包含其他肋膜起源的中胚層腫瘤(mesothelioma)，或者其他惡性腫瘤如類癌 (carcinoid)、惡性淋巴瘤(malignant lymphoma)，或是轉(zhuǎn)移自其他來源的腫瘤。因此以下我們所說的肺癌，是指來自于支氣管(bronchial)或細(xì)支氣管(bronchiolar)表皮細(xì)胞 (epithelial cell)的惡性腫瘤，占了肺實(shí)質(zhì)惡性腫瘤的90_95%。肺癌目前是全世界癌癥死因的第一名。肺癌起源于支氣管粘膜上皮，局限于基底膜內(nèi)者稱為原位癌癌腫，可向支氣管腔內(nèi)或/和臨近的肺組織生長，并可通過淋巴血行或經(jīng)支氣管轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。癌瘤生長速度和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的情況，與癌瘤的組織學(xué)類型、分化程度等生物學(xué)特性有一定關(guān)系。肺癌的分布情況右肺多于左肺，上葉多于下葉，從主支氣管到細(xì)支氣管均可發(fā)生癌腫。起源于主支氣管、肺葉支氣管的肺癌，位置靠近肺門者，稱為中央型肺癌；起源于肺段支氣管以下的肺癌，位置在肺的周圍部分者，稱為周圍型肺癌。代謝組學(xué)(metabonomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究方式，是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分。其研究對象大都是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)。先進(jìn)分析檢測技術(shù)結(jié)合模式識別和專家系統(tǒng)等計算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法。 UPLC-MS (超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)技術(shù)是代謝組學(xué)的分析技術(shù)之一。色譜主要是讓混合物由流動相攜帶通過一根長長的內(nèi)壁涂有薄薄的一層液膜(液態(tài)固定相)的毛細(xì)柱。由于混合物的不同組分與固定相的結(jié)合能力不同，因此在柱的末端混合物中的各個組分會逐個地洗脫出來而達(dá)到分離的目的。質(zhì)譜則是先將物質(zhì)離子化，變?yōu)闅鈶B(tài)離子混合物，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的。具有較高的靈敏度和專屬性，可以實(shí)現(xiàn)對多個化合物的同時快速分析與鑒定。本發(fā)明利用代謝組學(xué)中UPLC-MS這一技術(shù)，建立了一種可用于診斷肺癌的模型， 為肺癌的診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用Waters ACQUITY UPLC_MS系統(tǒng)，檢測肺癌患者和健康人血清的代謝物輪廓，利用軟件分析肺癌與正常人血清不同的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)新的肺癌相關(guān)性有機(jī)物， 用于診斷肺癌。本發(fā)明將肺癌和健康人血清分別利用Waters公司UPLC-MS上機(jī)檢測，得到原始數(shù)據(jù)，從機(jī)器附帶的質(zhì)譜庫中找出相匹配的化合物。采用峰面積歸一化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)校正，數(shù)據(jù)校正后運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)的方法計算每種化合物在不同組樣品中差異的顯著性，以P值0. 05為閾值，判斷P值小于閾值的化合物為檢測含量有顯著性差異的化合物，篩選出在兩組中有顯著差異的Peak。然后進(jìn)行PCA分析，PCA是可以將分散在η維變量上的代謝指紋圖譜信息集中到某幾個綜合指標(biāo)(主成分)上的統(tǒng)計分析方法。通過這個分析可以初步判斷樣品之間的關(guān)系，并可以判斷是否有個別樣品的數(shù)據(jù)偏離較大而需要被剔除掉。最后確定出差異的標(biāo)志性代謝峰有3個，其質(zhì)荷比分別為m/z203、m/z250、m/z996。利用這3種代謝物， 將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型的平均濃度逐一進(jìn)行比對，可為肺癌的診斷提供指導(dǎo)。模型的檢測方法如下1.樣品采集分別采集肺癌患者和正常對照外周靜脈血，離心后，取上清液置于-80°C保存?zhèn)溆谩?.色譜條件優(yōu)化包括色譜流動相的選擇，流動相梯度條件的優(yōu)化，以及色譜柱溫度和最佳流速的優(yōu)化，以達(dá)到最佳的分離效果。3.質(zhì)譜條件優(yōu)化包括離子源類型的選擇及其參數(shù)的設(shè)定，使得峰圖更加優(yōu)化。4.預(yù)實(shí)驗(yàn)及上樣檢測取稀釋后的血清樣品注入進(jìn)樣孔，進(jìn)行相關(guān)系數(shù)的設(shè)置。5.測試報告的分析獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)校正后，運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)方法找出含量明顯差異的物質(zhì)，運(yùn)用 PCA分析，將偏離較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到標(biāo)志性差異代謝物。


圖1三個峰在各樣本中的峰高灰色直線左側(cè)為正常組，灰色直線右側(cè)為肺癌組。Peak2. 409表示m/z203的代謝物，peak2. 78表示m/z250的代謝物，peak9. 526表示m/z996的代謝物。圖2發(fā)現(xiàn)的三個特征峰對正常組(normal)和肺癌組Q^patitis B)的分類圖中圓圈為正常組，棱形為肺癌患者。
具體實(shí)施例方式1.材料1. 1樣品采集分別使用抗凝管采集正常組和肺癌組靜脈血2ml，在4°C冰箱中靜置30min后離心 (4000rpm, 5min).取200ul上清液置于低吸附離心管中，_80°C冰箱中保存，備用。1. 2所需主要試劑與儀器甲醇、醋酸銨溶液、甲酸、丙酮等均購自上?；瘜W(xué)試劑公司。ACQUITY UPLC-MS系統(tǒng)購自Waters公司。2.方法
2.1高豐度蛋白的去除樣品室溫下融化，加入1.0ml的甲醇超聲波萃取2min。形成的懸浮液再離心 14000rpm, IOmin, 10°C。最后取0. 2ml上清液置于LC-MS進(jìn)樣瓶中，加入1. Oml水，置于-20°C待用。2. 2樣品吹干將進(jìn)樣瓶置于液氮吹干儀中吹干。2. 3預(yù)實(shí)驗(yàn)取20ul的樣品量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整相關(guān)系數(shù)，得到最佳的質(zhì)譜圖。2. 4正式實(shí)驗(yàn)將樣品一個一個地注入UPLC-MS系統(tǒng)，打出圖譜，得到原始數(shù)據(jù)。2. 5數(shù)據(jù)分析對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，以0. 05的ρ值為閾值，運(yùn)用統(tǒng)計學(xué)方法找出差異明顯的物質(zhì)，利用PCA分析，將偏差較大的物質(zhì)剔除掉，最后得到3種標(biāo)志性差異代謝物分別為m/ Z203、m/Z250、m/Z996。利用這3種物質(zhì)，將受檢人血清中相應(yīng)的物質(zhì)的濃度與本發(fā)明模型逐一進(jìn)行比對，可為肺癌的診斷提供輔助指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)實(shí)例取受檢者血清，經(jīng)檢驗(yàn)得到其代謝產(chǎn)物圖譜，得到質(zhì)荷比分別為m/Z203、m/Z250、 m/z996的特異代謝物的含量，與本實(shí)驗(yàn)中的對應(yīng)樣品的平均含量進(jìn)行比較，若含量近似為本模型平均含量的2倍，則為肺癌組，否則為正常組。以上是對本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
權(quán)利要求
1.用于肺癌診斷的模型，其特征在于由超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測的代謝物圖譜，經(jīng)過軟件統(tǒng)計分析得到肺癌患者多個特異代謝物的濃度，所說的特異代謝物的質(zhì)荷比分別為 m/z203、m/z250、m/z996。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于診斷肺癌的模型。本發(fā)明運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，檢測正常人及肺癌患者的外周血清樣品，找出與肺癌患者差異顯著的特異代謝產(chǎn)物，根據(jù)各代謝產(chǎn)物的濃度與正常人含量的平均值，建立一個診斷模型。只要將檢測人血清中三種相應(yīng)的代謝產(chǎn)物的濃度與本發(fā)明的模型進(jìn)行比較分析，就可以初步用于肺癌診斷。
文檔編號G01N30/72GK102323362SQ20101054540
公開日2012年1月18日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者曾華宗 申請人:上海聚類生物科技有限公司