專利名稱：基于熒光量子點編碼二氧化硅球進行多種轉基因植物的檢測方法
技術領域：
一種基于熒光量子點編碼二氧化
硅球進行多種轉基因植物的檢測方法，屬于材料應用技術領域。
背景技術：
量子點，又可稱為納米晶，英文名稱quantum dots，簡稱QDs，是一種由II-VI族或III-V族元素組成的粒徑在1 IOnm間納米顆粒。QDs具有量子尺寸效應和表面效應， 受激后可以發(fā)射熒光。和傳統熒光染料相比，QDs具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā)射光譜和高的熒光量子產率。QDs已逐漸取代染料作為一種新型的生物標記材料，廣泛應用于細胞成像、 免疫熒光技術、活體成像、核酸識別方面，同時在實現高靈敏度、高通量的生物分析和檢測方面表現重大前景。二氧化硅，英文名稱silicon dioxide，是一種透明的惰性材料。二氧化硅的合成技術已經相當成熟，其表面含有比較豐富的硅羥基，可以在此基礎上修飾各種官能團，比如氨基、羧基、巰基等，更好地實現和目標生物分子的偶聯。本發(fā)明將不同數量、不同熒光特性的量子點包裹于二氧化硅球中，使二氧化硅球具有不同光譜特征和亮度特征，可進行多元光學編碼二氧化硅球。目前國內外只是集中在 QDs編碼聚苯乙烯微球的研究。本發(fā)明采用QDs編碼二氧化硅球，不僅對QDs的熒光性沒有影響，能夠阻止環(huán)境中的氧向納米晶體擴散，有效抑制納米晶體由于光氧化導致的降解，而且能夠阻止包覆后的納米晶體在水相中的聚集，提高納米晶體的穩(wěn)定性。本發(fā)明采用反相微乳法合成熒光量子點編碼二氧化硅球，該方法合成的二氧化硅球結構大小均一，熒光強度好。合成后的熒光量子點編碼二氧化硅球和特定DNA片段偶聯作為一種熒光探針，進行轉基因植物的檢測。根據二氧化硅球中編碼的量子點種類和數目不同，不同編碼的二氧化硅球具有不同的熒光強度比值，可實現多元轉基因序列的檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種熒光量子點編碼二氧化硅球進行多元轉基因檢測的方法。該方法制備的二氧化硅球結構均一，單分散性好，熒光強度好，并實現了多種轉基因植物的檢測。本發(fā)明的技術方案一種熒光量子點編碼二氧化硅球進行多種轉基因植物的檢測方法
A、采用下列不同體積比熒光量子點編碼二氧化硅球的制備
535nmQDs 629nmQDs=2 1，
535nmQDs 629nmQDs=l 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l :2:2
4(1)將15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合IOminJnA60mL的環(huán)己烷，攪拌20min ；
(2)取1400μ L 535nmQDs和700 μ L 629nmQDs混合均勻，加入到步驟(1)溶液中，均勻攪拌30min，配置成微乳體系；
(3)向上述微乳體系中加入2mL氨水，混合30min，加入^iL正硅酸四乙酯TEOS和2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，水解12h ；
(4)加入15mL丙酮破乳，攪拌30min，離心醇洗3次，將二氧化硅球分散在水中，制得 535nm :629nmQDs=2 :1編碼的二氧化硅球；
(5)調節(jié)QDs的種類和比例，制備其它三種熒光QDs編碼的二氧化硅球
取700 μ L 535nmQDs和1400 μ L 629nmQDs混合，其他按上述相同條件制得 535nmQDs 629nmQDs=l 2 編碼的二氧化硅球；
取 500 μ L 535nmQDs, 500 μ L 602nmQDs 和 1000 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同條件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 編碼的二氧化硅球；
取 400 μ L 535nmQDs,800 μ L 602nmQDs 和 800 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同條件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l :2:2 編碼的二氧化硅球； B、量子點編碼二氧化硅球檢測轉基因玉米、大豆、油菜、棉花
(1)分別制備編碼的二氧化硅球-probeDNA偶聯物
取2μ L羧基修飾的probe DNA 1，加入50 μ L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和50 μ L的N-羥基琥珀酰亞胺NHS，活化30min后，加入100 μ L的 535nmQDs 629nmQDs=2 1編碼二氧化硅球水溶液中，反應濁，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 1偶聯物；
同樣probe DNA 2活化后和535nmQDs 629nmQDs=l 2編碼二氧化硅球偶聯，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 2偶聯物；
probe DNA 3 活化后和 535nmQDs :602nmQDs 650nmQDs=l :1:2 編碼的二氧化硅球偶聯，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 3偶聯物；
probe DNA 4 活化后和 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 編碼的二氧化硅球偶聯，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 4偶聯物；
(2)將四種Target DNAl, Target DNA2, Target DNA3, Target DNA4 各取取 2 μ L 混合在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入100 μ L的535nmQDs :629nmQDs=2 :1編碼二氧化硅球-probe DNA1，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；
將沉淀離心、超純水洗滌3次，分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入經氨基-6-甲基香豆素乙酸鹽AMCA染料標記的capture DNA1，室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行Target 1檢測的熒光譜圖，進行轉基因玉米的檢測；
(3)在步驟(2)離心所得上清液中加入100μ L的535nmQDs 629nmQDs=l 2編碼二氧化硅球-probe 2，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；
將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的 capture DNA2,室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 2檢測的熒光譜圖，進行轉基因大豆的檢測；
(4)在步驟(3)離心所得上清液中加入100μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2編碼二氧化硅球-probe 3，室溫雜交12h，咼心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；
將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的 capture DNA3,室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 3檢測的熒光譜圖，進行轉基因油菜的檢測；
(5)在步驟(4)離心所得上清液中加入100 μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2編碼二氧化硅球-probe 4，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；
將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的 capture DNA4,室溫雜交12h。離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 4檢測的熒光譜圖，進行轉基因棉花的檢測?！N熒光量子點編碼二氧化硅球進行多元轉基因檢測的方法，包括熒光量子點編碼二氧化硅球的合成，硅球的修飾，多元轉基因成分的檢測。上述步驟簡明表示為
(1)將正己醇、曲拉通和環(huán)己烷均勻混合，加入不同種類、特定比例的QDs的水溶液， 攪拌均勻配置成微乳體系。加入氨水、正硅酸四乙酯(TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅燒 (APTES )，水解 1 1。(2)水解后，加入丙酮破乳，離心醇洗三次。(3)將二氧化硅硅球分散在雜交緩沖液中，加入probe DNAs，target DNAs和 capture DNAs進行sandwich雜交，室溫12h,離心洗滌。(4)將雜交后的二氧化硅硅球體系，進行熒光掃描，得到熒光譜圖。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法操作簡便易行，合成的二氧化硅球結構均一、形狀規(guī)則、單分散好，二氧化硅球的熒光性好，成功實現了熒光量子點編碼二氧化硅球檢測多種轉基因植物的目的。圖 1 535nm 629nmQDs=2 1編碼二氧化硅球的透射電鏡照片。圖 2 535nm 629nmQDs=2 1編碼的二氧化硅球進行轉基因玉米檢測,圖 3 535nm 629nmQDs=2 2編碼的二氧化硅球進行轉基因大豆檢測,535nm 602nmQDs=1 1:2編碼的二氧化硅球進行轉基因油菜檢測。 535nm 602nmQDs 650nmQDs=122編碼的二氧化硅球機型轉基因棉花檢測。
具體實施方式
實施例1
所用535nmQDs，602nmQDs，629nmQDs，650nmQDs量子點均購自武漢珈源有限公司。采用下列不同體積比
535nmQDs 629nmQDs=2 1，535nmQDs 629nmQDs=l 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2，
535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2編碼二氧化硅球的制備及其在進行轉基因玉米、大豆、油菜、棉花檢測中的應用。1.熒光量子點編碼二氧化硅球的制備
(1)將15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合IOminJnA 60mL的環(huán)己烷，攪拌20min。(2)取1400yL 5;35nmQDs和700 μ L 6^nmQDs混合均勻，加入到上述溶液中，均勻攪拌30min，配置成微乳體系。(3)向上述體系中加入2mL氨水，混合30min，加入2mL的TEOS和2mL的APTES，水解 12h。(4)加入15mL丙酮破乳，攪拌30min，離心醇洗3次，將二氧化硅球分散在水中，制得535nm :629nmQDs=2 :1編碼的二氧化硅球。(5)調節(jié)QDs的種類和比例，制備其它三種熒光QDs編碼的二氧化硅球。取 700μ L 535nmQDs 和 1400μ L 629nmQDs 混合，制得 535nmQDs 629nmQDs=l 2 編碼的二氧化硅球。同樣取 500 μ L 535nmQDs, 500 μ L 602nmQDs 和 1000 μ L 650nmQDs 混合，制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 編碼的二氧化硅球。取 400 μ L 535nmQDs, 800μ L 602nmQDs 禾口 800μ L 650nmQDs 混合，制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2編碼的二氧化硅球。2、量子點編碼二氧化硅球檢測轉基因玉米、大豆、油菜、棉花 (1)分別制備編碼的二氧化硅球-probe DNA偶聯物
取2μ L羧基修飾的probe DNA 1，加入50 μ L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和50yL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，活化30min后，加入100 μ L的 535nmQDs 629nmQDs=2 1編碼二氧化硅球水溶液中，反應濁。離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 1偶聯物。同樣probe DNA 2活化后和535nmQDs 629nmQDs=l 2編碼二氧化硅球偶聯， probe DNA 3 活化后和 535nmQDs :602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 編碼的二氧化硅球偶聯，probe DNA 4 活化后和 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 編碼的二氧化硅球偶聯。離心洗滌3次，分別制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 2偶聯物，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 3偶聯物，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 4偶聯物。(2)將四種 Target DNAl, Target DNA2, Target DNA3, Target DNA4 各取取 2 μ L 混合在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入100 μ L的535nmQDs :629nmQDs=2 :1編碼二氧化硅球-probe DNA1，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中。將沉淀離心、超純水洗滌3次，分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入經氨基-6-甲基香豆素乙酸鹽(AMCA)染料標記的capture DNA1，室溫雜交12h，離心洗滌3 次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行Target 1檢測的熒光譜圖。用于進行轉基因玉米的檢測。(3)在步驟(2)離心所得上清液中加入100 μ L的535nmQDs 629nmQDs=l 2編碼二氧化硅球-probe 2，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中。將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的capture DNA2,室溫雜交12h。離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 2檢測的熒光譜圖。用于進行轉基因大豆的檢測。 (4)在步驟(3)離心所得上清液中加入100μ L的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2編碼二氧化硅球-probe 3，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中。 將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的capture DNA3,室溫雜交12h。離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 3檢測的熒光譜圖。用于進行轉基因白菜的檢測。(5)在步驟(4)離心所得上清液中加入100μ L的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2編碼二氧化硅球-probe 4，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中。將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的capture DNA4,室溫雜交12h。離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 4檢測的熒光譜圖。用于進行轉基因棉花的檢測。所述的DNA列表如表1所示。表 權利要求
1. 一種熒光量子點編碼二氧化硅球進行多種轉基因植物的檢測方法，其特征在于A、采用下列不同體積比熒光量子點編碼二氧化硅球的制備 535nmQDs 629nmQDs=2 1，535nmQDs 629nmQDs=l 2，535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2，535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l :2:2(1)將15mL的曲拉通和15mL的正己醇混合IOminJnA60mL的環(huán)己烷，攪拌20min ；(2)取1400μ L 535nmQDs和700 μ L 629nmQDs混合均勻，加入到步驟(1)溶液中，均勻攪拌30min，配置成微乳體系；(3)向上述微乳體系中加入2mL氨水，混合30min，加入^iL正硅酸四乙酯TEOS和2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES，水解12h ；(4)加入15mL丙酮破乳，攪拌30min，離心醇洗3次，將二氧化硅球分散在水中，制得 535nm :629nmQDs=2 :1編碼的二氧化硅球；(5)調節(jié)QDs的種類和比例，制備其它三種熒光QDs編碼的二氧化硅球取700 μ L 535nmQDs和1400 μ L 629nmQDs混合，其他按上述相同條件制得 535nmQDs 629nmQDs=l 2 編碼的二氧化硅球；取 500 μ L 535nmQDs, 500 μ L 602nmQDs 和 1000 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同條件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2 編碼的二氧化硅球；取 400 μ L 535nmQDs,800 μ L 602nmQDs 和 800 μ L 650nmQDs 混合，其他按上述相同條件制得 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 編碼的二氧化硅球；B、量子點編碼二氧化硅球檢測轉基因玉米、大豆、油菜、棉花(1)分別制備編碼的二氧化硅球-probeDNA偶聯物取2μ L羧基修飾的probe DNA 1，加入50 μ L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽EDC和50 μ L的N-羥基琥珀酰亞胺NHS，活化30min后，加入100 μ L的 535nmQDs 629nmQDs=2 1編碼二氧化硅球水溶液中，反應濁，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 1偶聯物；同樣probe DNA 2活化后和535nmQDs 629nmQDs=l 2編碼二氧化硅球偶聯，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 2偶聯物；probe DNA 3 活化后和 535nmQDs :602nmQDs 650nmQDs=l :1:2 編碼的二氧化硅球偶聯，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 3偶聯物；probe DNA 4 活化后和 535nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2 編碼的二氧化硅球偶聯，離心洗滌3次，制得編碼的二氧化硅球-probe DNA 4偶聯物；(2)將四種Target DNAl, Target DNA2, Target DNA3, Target DNA4 各取取 2 μ L 混合在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入100 μ L的535nmQDs :629nmQDs=2 :1編碼二氧化硅球-probe DNA1，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；將沉淀離心、超純水洗滌3次，分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入經氨基-6-甲基香豆素乙酸鹽AMCA染料標記的capture DNA1，室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、ρΗ為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行Target 1檢測的熒光譜圖，進行轉基因玉米的檢測；(3)在步驟(2)離心所得上清液中加入100μ L的535nmQDs 629nmQDs=l 2編碼二氧化硅球-probe 2，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的 capture DNA2,室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 2檢測的熒光譜圖，進行轉基因大豆的檢測；(4)在步驟(3)離心所得上清液中加入100μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 1 2編碼二氧化硅球-probe 3，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的 capture DNA3,室溫雜交12h，離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 3檢測的熒光譜圖，進行轉基因油菜的檢測；(5)在步驟(4)離心所得上清液中加入100μ L 的5;35nmQDs 602nmQDs 650nmQDs=l 2 2編碼二氧化硅球-probe 4，室溫雜交12h，離心，分別將上清液和沉淀放在不同的管中；將沉淀離心洗滌3次，分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，加入AMCA標記的 capture DNA4,室溫雜交12h ；離心洗滌3次，取沉淀分散在200 μ L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，進行熒光掃描，即得到進行target 4檢測的熒光譜圖，進行轉基因棉花的檢測。
全文摘要
基于熒光量子點編碼二氧化硅球進行多種轉基因植物的檢測方法，屬于材料應用技術領域。本發(fā)明采用反相微乳法制備的二氧化硅球結構均一，過程簡單易操作，控制QDs的種類和比例能夠準確編碼二氧化硅球，二氧化硅對QDs的熒光起到保護作用，提高QDs的穩(wěn)定性。利用熒光量子點編碼二氧化硅球成功實現了多種轉基因植物檢測的目的。
文檔編號G01N21/64GK102169089SQ20101060467
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權日2010年12月24日
發(fā)明者王利兵, 胥傳來, 趙媛, 郝昌龍, 陳偉 申請人:江南大學