專利名稱：PKN3/RhoC大分子復合體及其使用方法
PKN3/RhoC大分子復合體及其使用方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及使用蛋白激酶N3 (PKN3)和I^hoC來篩選具有抗癌活性的化合物和診斷患有進展性癌癥的患者。開發(fā)有效的癌癥治療方法越來越依賴于對疾病的潛在分子機制的認識以及鑒定到這些機制中可用于研發(fā)新藥的靶分子。一旦獲得此類靶分子，便能夠針對這些靶分子來測試候選化合物。在許多情況中，此類藥物候選物是由合成的或天然的化合物所組成的化合物文庫的成員。十分需要鑒定到與高度進展形式的癌癥相關(guān)的新的靶分子，以便能夠鑒定并驗證新的治療性化合物和方案。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供鑒定可用于治療癌癥的化合物的方法。所述方法的步驟包括將測試化合物與蛋白激酶N3 (PKN3)多肽(或其片段)、RhoC多肽(或其片段)和磷酸肌醇依賴型激酶-1 (PDKl)多肽(或其片段)混合，然后確定所形成的含有PKN3和I^hoC 的復合體(“complex”)的量，這稱為所述復合體的“測試水平”。然后將所述測試水平與參照相比較。所述測試水平與參照之間的任何差異代表所述測試化合物可能具有癌癥治療活性。在一些實施方式中，PKN3 AhoC和PDKl多肽(或它們的片段)在與所述測試化合物混合之前先進行一定程度的純化。在一些實施方式中，一或多種所述組份(所述組份為PKN3、RhoC和PDKl，或其相應(yīng)的片段)含有分子標簽，所述標簽用于鑒定所述組份并有助于分離所述組份以及與之連接的任何其他組份。分子標簽通常是本領(lǐng)域已知的。實例包括多組氨酸、GST和FLAG。在一些實施方式中，PKN3多肽包含分子標簽，并通過其分子標簽捕獲(pull down)PKN3多肽而分離所述復合體。在一些實施方式中，參照是在缺乏所述測試化合物的情況下所形成的復合體的水平。在其他實施方式中，參照是當所述測試化合物與PKN3、I^hoC和PDKl (或它們的相應(yīng)的片段)混合時所形成的復合體的水平，其中所述激酶的任一或兩者無激酶活性 (kinase一dead)0在一些實施方式中，所述測試水平低于參照。在一些實施方式中，所述測試化合物是降低癌細胞的侵襲性或降低腫瘤生長速度的化合物。在第二方面，本發(fā)明提供基于細胞的鑒定可用于治療癌癥的化合物的方法。所述方法的步驟包括將細胞與測試化合物接觸，然后確定在存在所述測試化合物的情況下所述細胞中形成的復合體的量(測試水平)。所述細胞含有PKN3多肽(或其片段),RhoC多肽(或其片段)和磷酸肌醇依賴型激酶-I(PDKl)多肽，而所述復合體也含有每一所述組份。然后將所述測試水平與參照相比較。所述測試水平與所述參照之間的任何差異代表所述測試化合物可能具有癌癥治療活性。在一些實施方式中，所述細胞是干細胞，例如長期造血干細胞(LT-HSC)。在其他實施方式中，所述細胞是來自腫瘤的培養(yǎng)細胞。在一些實施方式中，所述細胞具有高的轉(zhuǎn)移能力。在一些實施方式中，所述細胞例如是以下細胞中的一種PC3細胞、HEK293細胞、 MDA-MB231細胞、MCF7細胞、MDA361細胞、MCF468細胞、BT549細胞和HeLa細胞。在其他實施方式中，所述細胞含有作為異源重組多肽的所述組份的一種或多種或全部。在一些實施方式中，一或多種所述組份(所述組份是PKN3、RhoC和PDKl或其片段)對于所述細胞而言是內(nèi)源的。在一些實施方式中，一或多種所述組份是重組的并含有分子標簽，所述標簽用于鑒定所述組份并有助于分離所述組份以及與之連接的任何其他組份。分子標簽通常是本領(lǐng)域已知的。實例包括多組氨酸、GST和FLAG。在一些實施方式中， PKN3多肽包含分子標簽，并通過其分子標簽捕獲PKN3多肽而分離所述復合體。在一些實施方式中，參照是在缺乏所述測試化合物的情況下所形成的復合體的水平。在其他實施方式中，參照是當所述測試化合物與PKN3、MioC和PDKl (或它們的相應(yīng)的片段)混合時所形成的復合體的水平，其中所述激酶的任一或兩者無激酶活性。在一些實施方式中，所述測試水平低于參照。在一些實施方式中，所述測試化合物是降低癌細胞的侵襲性或降低原發(fā)腫瘤生長速度的化合物。在第三方面，本發(fā)明提供通過評估患者的PKN3活性和IihoC活性水平而診斷患者的癌癥的方法。根據(jù)所述方法，從患者獲得樣品，然后確定所述樣品中PKN3活性和IihoC活性的水平(此為所述測試水平)，然后將所述測試水平與參照相比較。所述測試水平與所述參照之間的差異代表所述患者具有進展性癌癥。在第四方面，本發(fā)明提供通過評估患者的PKN3活性和I^hoC活性水平而鑒定會對癌癥治療發(fā)生反應(yīng)的患者的方法。根據(jù)所述方法，從患者獲得樣品，然后確定所述樣品中 PKN3活性和IihoC活性的水平(此為所述測試水平)，然后將所述測試水平與參照相比較。 所述測試水平與所述參照之間的差異代表所述患者是否會對所述癌癥治療發(fā)生反應(yīng)的可能性。在第三和第四方面的一些實施方式中，所述參照是在非癌癥組織中確定的PKN3 活性和IihoC活性的水平。在一些實施方式中，所述樣品是腫瘤活檢樣品，且通過對腫瘤進行原位測定而確定所述測試水平，例如通過原位雜交、原位PCR或免疫染色。在一些實施方式中，所述參照僅僅是腫瘤樣品周圍或內(nèi)部的任何非癌癥組織。在一些實施方式中，所述測試水平高于所述參照。在第五方面，本發(fā)明提供通過評估施用處理之前和施用處理之后PKN3和IihoC活性水平的改變而確定癌癥治療性處理方案對患者的有效性的方法。根據(jù)所述方法，從患者獲得樣品，然后確定所述樣品中PKN3活性和IihoC活性的水平(此為治療前水平或第一水平)，然后給所述患者施用處理方案。在施用該處理后一段時間，從患者獲得第二樣品，并確定所述第二樣品中PKN3活性和IihoC活性的水平(此為治療后水平或第二水平)。將所述第一水平與第二水平相互比較。PKN3活性和I^hoC活性的第二水平相對于第一水平均降低代表所述處理方案對所述患者的癌癥是有效的。在第三、第四和第五方面的一些實施方式中，PKN3活性是表達編碼PKN3多肽或其片段的RNA。在其他實施方式中，PKN3活性表達PKN3多肽或其片段。在其他實施方式中， PKN3活性PKN3多肽的磷酸化。在另一些實施方式中，PKN3活性是PKN3的下游效應(yīng)物(例如糖原合酶激酶3 (GSK-3)-衍生肽)(另見表1)被磷酸化。
在第三、第四和第五方面的一些實施方式中，IihoC活性是表達編碼IihoC多肽或其片段的RNA。在其他實施方式中，MioC活性是表達IihoC多肽或其片段。在其他實施方式中，RhoC活性是I^hoC的下游效應(yīng)物(例如PKN3或糖原合酶激酶3 (GSK-3)-衍生肽)(另見表1)被磷酸化。在第三、第四和第五方面的一些實施方式中，通過使用特異性結(jié)合PKN3的轉(zhuǎn)角基序磷酸化位點T860的抗體或其他多肽來確定PKN3多肽的磷酸化狀態(tài)。見例如SEQ ID NO. 36。在第一至第五方面的一些實施方式中，所述癌癥是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、 肝細胞癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、皮膚黑素瘤和前列腺癌(CaP)中的一或多種。在第六方面，本發(fā)明提供組合物，其包含破壞或阻斷形成包含PKN3多肽和IihoC多肽的復合體的多肽或肽模擬物。在一些實施方式中，所述多肽或肽模擬物結(jié)合PKN3中與 RhoC結(jié)合的區(qū)域。在其他實施方式中，所述多肽或肽模擬物結(jié)合MioC中與PKN3結(jié)合的區(qū)域。在一些實施方式中，所述多肽或肽模擬物含有一或多個互補決定區(qū)(CDR)，所述CDR 識別PKN3或IihoC上的表位。在一些實施方式中，所述含CDR的多肽是抗體、單克隆抗體、 人源化抗體、單鏈、單鏈可變區(qū)片段(“ScFv”)、小模塊免疫藥物(“SMIP”)和納米抗體 (nanobody)(也稱為單結(jié)構(gòu)域抗體或VHH抗體)中的任何一種。在第六方面的一些實施方式中，PKN3中與IihoC結(jié)合的區(qū)域包含ACC1、ACC2或 ACC3氨基酸序列中的任何一或多種。在其他實施方式中，所述多肽或肽模擬物含有相應(yīng)于 PKN3的ACC1、ACC2和ACC3中的一或多種的氨基酸序列。在第七方面，本發(fā)明提供多肽，其含有至少一種識別PKN3轉(zhuǎn)角基序磷酸化位點 T860的互補決定區(qū)(⑶R)。在一些實施方式中，所述多肽是抗體，包括例如，單克隆抗體、人源化抗體、單鏈、單鏈可變區(qū)片段(“&Fv”)、小模塊免疫藥物(“SMIP”)和納米抗體(也稱為單結(jié)構(gòu)域抗體或VHH抗體)。在第八方面，本發(fā)明提供試劑盒，其用于篩選調(diào)節(jié)PKN3和IihoC之間的相互作用的化合物，并可用于治療癌癥。所述試劑盒還可用于確定患者的癌癥的進展性或侵襲性。所述試劑盒還可用于評估癌癥治療對患者的有效性。在一些實施方式中，所述試劑盒含有(a) 檢測PKN3活性的物質(zhì)，(b)檢測MioC活性的物質(zhì)，(c)標簽和(d)包裝。在一些實施方式中，所述試劑盒還含有癌癥治療化合物。癌癥治療化合物是預防或延緩個體的癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移的化合物、組合物或處理方案。此類癌癥治療化合物包括，但不限于，化療藥、基因治療組合物、影響激素的化合物、免疫治療化合物、抗體和反義寡核苷酸。有用的化療藥的實例包括，但不限于，博來霉素、新制癌菌素(neocarcinostatin)、舒拉明、阿霉素、紫杉醇、 絲裂霉素C和順鉬。應(yīng)該理解，可用于本發(fā)明的癌癥治療化合物還包括那些將來研發(fā)出的新的化合物或療法。


圖1顯示了乳腺癌細胞系的蛋白質(zhì)印跡，細胞的惡性潛能越高，磷酸化的PKN3的水平也隨之升高。圖2顯示了非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系的蛋白質(zhì)印跡，細胞的抗藥性越高，磷酸化的PKN3的水平也隨之升高。
圖3A顯示了來自以Myc標記的他0和Rac構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡，使用抗磷酸化的PKN抗體和抗Myc抗體進行檢測。圖:3B顯示了來自以Myc標記的他0 和Rac構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞的抗Myc免疫沉淀物的蛋白質(zhì)印跡，使用抗磷酸化的PKN抗體和抗Myc抗體進行檢測。圖4A顯示了來自以Myc標記的Rho構(gòu)建體和Flag標記的PKN3構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡，使用抗Myc抗體和抗Flag抗體進行檢測。圖4B顯示了抗Flag 免疫沉淀物的蛋白質(zhì)印跡，其顯示以激酶依賴性方式形成含PKN3、I h0C和PDKl的三元復合體。圖5A顯示了來自以Myc標記的Rho構(gòu)建體和Flag標記的PKN3構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡，使用抗Myc、抗PDK1、和抗PKN3抗體檢測。圖5B顯示了抗Flag 免疫沉淀物的蛋白質(zhì)印跡，其顯示PKN3的激酶活性受到I h0C/PDKl/PKN3三元復合體的調(diào)控。圖6A顯示了來自PC-3細胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡，所述PC-3細胞表達由多西環(huán)素(Dox或Doxy)誘導的靶向PKN3或pllO β的shRNA。圖6B顯示了接種于MATRIGEL的代表性細胞群體。圖7A和圖7B顯示了對來自攜帶移植的PKN3 shRNA PC-3細胞的小鼠的腫瘤體積進行定量的直方圖。圖8A顯示了來自MDA-MB-231細胞的裂解物的蛋白質(zhì)印跡，所述MDA-MB-231細胞表達由Dox誘導的靶向ΡΚΝ3、ρ110β或CKI ε的shRNA。圖8B顯示了接種于MATRIGEL 的代表性細胞群體。圖9的散點圖顯示了攜帶PKN3 shRNA MDA-MB-231細胞的小鼠的腫瘤體積(經(jīng)或未經(jīng)多西環(huán)素誘導)。發(fā)明詳述本申請令人驚訝地發(fā)現(xiàn)(a)蛋白激酶N3 (PKN3)優(yōu)先結(jié)合I^hoC，(b) PKN3以激酶依賴性方式結(jié)合MioC，和(c) PKN3和IihoC的結(jié)合有助于形成含有PDKl (PKN3/PDKl/RhoC復合體或PPRC復合體)的三元復合體。PPRC復合體是與高度進展性癌癥相關(guān)聯(lián)的可用靶點。 本申請還公開了 PPRC復合體的形成提高了 PKN3的磷酸化并繼而提高其激酶活性。PKN3是長度為889個氨基酸(人直系同源物)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其具有N端推定的調(diào)控區(qū)，該調(diào)控區(qū)含有三個反向平行卷曲螺旋(ACC)結(jié)構(gòu)域ACC1、ACC2和 ACC3，分別位于大約第15-77、97-170和184-236位殘基；C端催化區(qū)，位于第559-882位殘基；以及長度為大約100至130個殘基的C2樣結(jié)構(gòu)域，其位于所述推定的調(diào)控結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域之間。哺乳動物中存在至少三種不同的PKN同種型(PKNl/PKNa/PAK-1/PRK-l、 PKN2/PRK2/PAK-2/PKN γ和ΡΚΝ3/ΡΚΝ β )，各自具有不同的酶學特性、組織分布和不同的功能。有關(guān)PKN的綜述見Mukai，H.，J. Biochem. 133 :17-27，2003。也請參見
公開日為2004 年6月3日的美國專利申請20040106569，通過引用將其全部內(nèi)容并入本申請。本申請還發(fā)現(xiàn)，在具有高進展性和抗藥性的癌細胞中，PKN3是上調(diào)的(分別見圖 1和圖2·)。高進展性指的是癌細胞是轉(zhuǎn)移的，發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛能高，增殖速度快，或是具有抗藥性。進展性癌癥的實例例如為三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer)(見，例如，Dent 等，Clinical Cancer Research 13 :4429-4434, Aug. 1, 2007) 進展性癌癥還包括其中涉及PKN3/I h0C途徑的那些癌癥。抑制PPRC復合體活性的化合物可用于控制細胞的轉(zhuǎn)移和增殖行為，因此這為治療腫瘤和癌癥，特別是進展性的腫瘤和癌癥，提供了方法。受PPRC活性影響的信號途徑和其他活性的降低可能是源于轉(zhuǎn)錄水平、或翻譯水平、或一或多種PPRC復合體組份翻譯后修飾的水平或四級結(jié)構(gòu)形成水平(即，形成三元復合體)的降低。由于進展性癌癥中有PPRC復合體和I h0C/PKN3途徑的參與，因此該復合體及其組份可用作預后標記物、疾病分期標記物、患者分層標記物或用于診斷細胞的狀態(tài)或體內(nèi)具有這樣的細胞的患者中所述細胞是否會發(fā)生轉(zhuǎn)移或變成進展性的標記物。PKN3是PII誘導的細胞遷移和侵襲的發(fā)育調(diào)控介導物，其在表達和催化活性水平以Akt非依賴型方式受到PII調(diào)控。其具有限制性表達模式(內(nèi)皮、胚胎和腫瘤細胞)， 而對于大多數(shù)正常細胞功能而言不是必需的。其對于轉(zhuǎn)移性PC-3(PTEN-/_)細胞在同位移植小鼠模型中的生長是必需的。在正常細胞中，PI3激酶(磷脂酰肌醇-3-激酶)途徑的特征在于經(jīng)生長因子誘導的PI3激酶活性和平行的信號途徑。以生長因子刺激細胞引起細胞膜上其同源受體的活化，后者隨后與細胞內(nèi)信號途徑分子(例如PI3激酶)結(jié)合并使之活化。PI3激酶(由p85 調(diào)節(jié)亞單位和PllO催化亞單位組成)的活化導致Akt經(jīng)由磷酸化而激活，由此支持更下游的細胞應(yīng)答，例如增殖、存活或遷移。因此，PTEN是腫瘤抑制物，其參與磷脂酰肌醇(PI)3激酶途徑，其在調(diào)控細胞生長和轉(zhuǎn)化中的作用在過去已經(jīng)得到了深入的研究(綜述請參見， 例如，Stein, R. C. and ffaterfield, Μ. D. Mol Med Today 6 :347-357, 2000)。腫瘤抑制物PTEN的功能是通過逆轉(zhuǎn)PI3激酶催化的反應(yīng)而作為PI3激酶的負調(diào)節(jié)物，由此確保該途徑的活化以暫時的和可控的方式發(fā)生。功能性滅活PTEN引起PI3激酶信號途徑持久過度活化。加入小分子抑制劑LY^4002阻斷PI3激酶活性?？赏ㄟ^例如小分子抑制劑PD98059抑制作為平行途徑起作用的信號途徑激酶MEK的活性以及下游應(yīng)答。因喪失PTEN功能而持久活化的PI3激酶途徑是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要促成因素， 這表明該腫瘤抑制物是受控細胞增殖的一個重要檢查點。PTEN敲除細胞顯示出與其中PI3 激酶途徑被活化形式的PI3激酶持久誘導的那些細胞具有類似的特征。磷脂酰肌醇3激酶活化足以造成進入細胞周期和促成癌性轉(zhuǎn)化特有的細胞改變。涉及PI3激酶途徑失調(diào)的疾病和狀況是已知的。因此，任何這些狀況和疾病均可通過本發(fā)明的方法以及藥物和診斷劑來解決，本文教導了本發(fā)明的方法以及藥物和診斷劑的設(shè)計、篩選或制造。狀況和疾病指的是以下示例性而非限制性的情況子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌、腺癌、子宮內(nèi)膜增生、Cowden綜合征、遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌、Li-Fraumene綜合征、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、Barmayan-Zonana綜合征、LDD(Lhermitte-Duklos "綜合征)、錯構(gòu)瘤-大頭畸形病(hamartoma-macrocephaly diseases)(包括 Cow 病(CD)和 Bannayan-Ruvalcaba Rily 綜合征(BRR))、皮膚粘膜病變 (例如，Trichilemmonmas)、大頭畸形、智力低下、胃腸道錯構(gòu)瘤、脂肪瘤，甲狀腺腺瘤，乳房纖維囊性疾病，小腦發(fā)育不良性神經(jīng)節(jié)細胞瘤和乳腺癌和甲狀腺惡性腫瘤。有鑒于此，PPRC復合體及其各組分是PI3激酶途徑的有價值的下游藥物靶點，可通過那些可能具有較低不良反應(yīng)的藥物而不是針對PPRC上游靶點的藥物來克服PI3激酶途徑。因此，本發(fā)明提供適合用于設(shè)計、篩選、研發(fā)和制備具有藥物活性的化合物的藥物靶點，所述化合物比本領(lǐng)域已知的那些通常靶向PI3激酶的化合物，例如2-(4-嗎啉基)8-苯并色酮(“LY^4002”)，具有更高的選擇性。通過控制這一特殊部分的效應(yīng)物分子，即MioC 和PKN3以及該途徑中涉及的任何更加下游的分子，僅有數(shù)量非常有限的其平行分支或該信號級聯(lián)中更加上游的靶點才可能引起不良反應(yīng)。因此，與細胞周期、DNA修復、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運、翻譯有關(guān)的PI-3激酶/PTEN途徑的其他活性將不受影響。胰島素信號途徑也不會被誘導，這意味著可切實避免與使用LY^4002有關(guān)的糖尿病反應(yīng)或其他不良反應(yīng)。編碼PKN3的完整核酸序列通?？蓮臄?shù)據(jù)庫獲得，例如登錄號NM_013355. 3。PKN3 的氨基酸序列也可以登錄號NP_037487.2從數(shù)據(jù)庫獲得。編碼IihoC的完整核酸序列通?？蓮臄?shù)據(jù)庫獲得，例如登錄號 NM_001042678. 1、NM_001042679. 1 和 NM_175744. 4。RhoC 的氨基酸序列也可以登錄號NP_001036143. 1、ΝΡ_001036144. 1和NP_786886. 1從數(shù)據(jù)庫獲得。 PKN3和IihoC的衍生物或其截短形式可用于本發(fā)明，條件是它們可實現(xiàn)所需的效果，這也屬于本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域人員可通過常規(guī)分析確定衍生化和截短的程度。就本發(fā)明而言，編碼PKN3和IihoC的核酸序列也包括與上述登錄號的核酸序列雜交的核酸或任何可衍生自上述氨基酸序列的核酸序列。此類雜交是本領(lǐng)域人員已知的。 此類雜交的細節(jié)可參見 Sambrook，J. Fritsch, Ε. F. and Maniatis, Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor :Cold Spring Harbor Laboratory.在優(yōu)選的實施方式中，雜交在嚴格性條件下進行，例如Sambrook所述的嚴格性條件。此外，編碼PKN3和IihoC的核酸還包括含有與上述任一核酸序列具有同源性的序列的核酸序列，其中序列同源性的程度為75 %、80 %、85 %、90 %或95 %。人PKN3的直系同源物可見于，例如，多種不同進化方向的生物體，例如小家鼠(M. musculus)和褐家鼠(R. norvegicus)、擬南芥(A. thaliana)，秀麗隱桿線蟲 (C. elegans)，黑腹果蠅(D. melanogaster)和釀酒酵母(S. cerevisiae)。對于 PKN3，上述各物種的百分比相同性分別是67 %、51 %、38 %、36 %、63 %和44%。人RhoC的直系同源物可見于小鼠、大鼠、擬南芥和果蠅，百分比相同性分別為100 %、99 %、47 %和86 %。本領(lǐng)域人員可以理解，任何這些或者其他直系同源物和同源物原則上都適用于本發(fā)明，條件是使用所述同源物產(chǎn)生的藥物或診斷劑仍然可與人PKN3或I^hoC或任何其他靶PKN3或I^hoC相互作用。PPRC復合體及其各成員可作為那些可用作藥物或候選藥物或用作診斷劑的化合物所針對的靶?？梢允褂貌煌悇e的合適的化合物，例如抗體、肽、Anticalines、適體、鏡像適體(Spiegelmers)、核酶、反義寡核苷酸和siRNA、以及小有機分子。通過使用PPRC復合體(所述復合體本身、其各成員或其組合)或與所述PPRC復合體有關(guān)的信息來設(shè)計、選擇、 篩選、產(chǎn)生或制備惡心化合物。在此類化合物的設(shè)計、選擇、篩選、產(chǎn)生和植被過程中，PPRC也被稱為靶，但該靶是在這一過程中使用的，而不是在最終將相應(yīng)的化合物施用于需要該化合物的患者這一過程中所使用的靶。在提供各類化合物的過程中，可以使用完整的PPRC復合體、其各成員或它們的組合、或編碼PPRC的任一或所有蛋白質(zhì)組份的核酸。術(shù)語“PPRC復合體或其組份”在本申請中包括PPRC及其組成成員的任何片段或衍生物，其使得能夠設(shè)計、選擇、篩選、產(chǎn)生或制備可用作藥物或診斷劑的所述化合物。
術(shù)語“編碼PPRC復合體或其組份的核酸”在本申請中包括含有編碼PPRC復合體的任何組份或其片段的核酸的任何核酸。對于編碼PPRC復合體或其組份的核酸的一部分也是如此看待，條件是其適合用于設(shè)計、選擇、篩選、產(chǎn)生或制備可用作藥物或診斷劑的所述化合物。編碼PPRC復合體或其組份的核酸可以是基因組核酸、hnRNA、mRNA、cDNA或它們各自的一部分。如上所述，除了本文所述的PPRC復合體或其組份或相應(yīng)的核酸序列以外，本發(fā)明還包括可用于產(chǎn)生或抑制由PPRC復合體的內(nèi)源性活性所引起的效應(yīng)的手段或化合物?？稍诤Y選方法中確定或選擇此類手段。在此類篩選方法中，第一步驟是提供一或多種所謂的候選或測試化合物。在本申請中，候選化合物指的是準備在一測試系統(tǒng)中測試其是否適合用于治療或減輕本文中所述的癌癥或用作癌癥的診斷手段或診斷劑的那些化合物。如果候選化合物在該系統(tǒng)中顯示出相應(yīng)的效應(yīng)，則該候選化合物是用于治療所述疾病和疾病狀況的合適的手段或治療劑，且原則上也是該疾病和疾病狀況的合適的診斷劑。在第二步驟中，使所述候選化合物接觸PPRC表達系統(tǒng)、PPRC基因產(chǎn)物、PPRC活性系統(tǒng)、 或PPRC復合體或組份。PPRC活性系統(tǒng)在本文中也稱為檢測PPRC復合體的活性的系統(tǒng)，例如檢測PPRC激酶活性。在一些實施方式中，可通過確定底物的磷酸化來評估PPRC復合體的激酶活性，所述底物例如為診斷用GSK3 α衍生片段，其序列為GPGRRGRRRTSSFAEGG(SEQ ID NO :1)。表1給出了可用于實施本發(fā)明的一些額外的PPRC激酶底物。本文中所提到的PPRC篩選方法還可用于將非功能性或無活性化合物排除在進一步考慮之外。因此，可測定獲自對象或測試系統(tǒng)的第一樣品的PPRC活性，產(chǎn)生處理前水平， 隨后給所述對象或測試系統(tǒng)施用測試化合物，并在施用所述測試化合物一段時間后測定獲自所述對象或測試系統(tǒng)的第二樣品的PPRC復合體的活性或其各組份的活性，由此產(chǎn)生測試水平數(shù)據(jù)?？蓪⑻幚砬八?第一水平)與所述測試水平(第二水平)相比較，如果數(shù)據(jù)顯示所述測試水平相對于處理前水平無降低，則代表所述測試化合物對所述對象無效， 那么可將該測試化合物排除在進一步評價或研究之外。相反，數(shù)值的變化可代表所述測試化合物適合用作PPRC抑制劑或用于進一步的究中。表1 受PKN3調(diào)控的含磷蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
1.鑒定可用于治療癌癥的化合物的方法，所述方法包括a.將細胞與測試化合物接觸，所述細胞是離體的并包含PKN3多肽或其片段、I^hoC多肽或其片段和PDKl多肽或其片段；b.確定復合體的測試水平，所述復合體是在存在所述測試化合物時形成的，且所述復合體包含H(N3多肽、IihoC多肽和PDKl多肽；和c.將步驟(b)中確定的測試水平與參照相比較，其中在步驟(C)中，步驟(b)中確定的測試水平與所述參照之間的差異代表所述測試化合物具有癌癥治療潛能。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞選自PC3細胞、HEK293細胞、MDA-MB231細胞和 HeLa細胞。
3.權(quán)利要求1-2中任一項的方法，其中所述PKN3多肽包含分子標簽，所述分子標簽選自FLAG標簽、GST標簽和Myc標簽，且通過其分子標簽捕獲PKN3多肽而分離所述復合體。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述參照是(a)在缺乏所述測試化合物的情況下形成的包含PKN3多肽和IihoC多肽的復合體的水平，或(b)在存在所述測試化合物的情況下形成的包含PKN3多肽和I^hoC多肽的復合體的水平，其中所述H(N3多肽或PDKl多肽無激酶活性。
5.診斷患者的癌癥的方法，包括a.從患者獲得樣品；b.確定所述樣品中PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此產(chǎn)生測試水平；和c.將所述測試水平與參照比較，其中所述測試水平與所述參照之間的差異代表所述癌癥是進展性的可能性。
6.鑒定會對癌癥治療有反應(yīng)的患者的方法，包括a.從患者獲得樣品；b.確定所述樣品中PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此產(chǎn)生測試水平；和c.將所述測試水平與參照比較，其中所述測試水平與所述參照之間的差異代表所述患者將對癌癥治療發(fā)生反應(yīng)的可能性。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中所述參照包含在非癌癥組織中確定的PKN3活性和I^hoC 活性的水平。
8.權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述測試水平高于所述參照。
9.確定患者的癌癥治療性處理方案的效果的方法，包括a.從患者獲得第一樣品；b.確定所述第一樣品中的PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此產(chǎn)生第一水平；c.給所述患者施用所述處理方案；d.在施用所述處理方案后從所述患者獲得第二樣品；e.確定所述第二樣品中的PKN3活性的水平和IihoC活性的水平，由此產(chǎn)生第二水平；和f.比較所述第一和第二水平，其中PKN3活性和IihoC活性的第二水平相對于第一水平均降低代表所述處理方案對所述患者的癌癥是有效的。
10.權(quán)利要求5-9中任一項的方法，其中所述PKN3活性選自(i)表達編碼PKN3多肽或其片段的RNA，(ii)表達PKN3多肽或其片段，(iii)PKN3多肽的磷酸化，和(iv)糖原合酶激酶3 (GSK-3)-衍生肽的磷酸化。
11.權(quán)利要求5-10中任一項的方法，其中所述MioC活性選自(i)表達編碼IihoC多肽的RNA, (ii)表達RhoC多肽，(iii)PKN3多肽的磷酸化，和(iv)糖原合酶激酶3 (GSK-3)的磷酸化。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中以抗體檢測所述PKN3多肽的磷酸化，所述抗體結(jié)合 PKN3轉(zhuǎn)角基序磷酸化位點T860。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其中所述PNK3多肽包含(a)與SEQID NO 26具有至少95%相同性的氨基酸序列，或(b)與SEQ ID NO :36具有至少95%相同性的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、 肝細胞癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、皮膚黑素瘤和前列腺癌(CaP)。
15.多肽，包含結(jié)合PKN3轉(zhuǎn)角基序磷酸化位點T860的互補決定區(qū)(⑶R)。
16.權(quán)利要求15的多肽，其中所述多肽是單克隆抗體。
17.試劑盒，包含檢測PKN3活性的物質(zhì)、檢測MioC活性的物質(zhì)、標簽和包裝。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，還包含癌癥治療性化合物。
19.滅活PPRC復合體的多肽，其中a.所述PPRC復合體包含PKN3多肽、IihoC多肽和PDKl多肽，b.所述多肽結(jié)合(i)MioC多肽上與PKN3多肽的同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，或(ii) PKN3多肽上與IihoC多肽的同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，和c.所述多肽⑴抑制PPRC復合體的形成或(ii)抑制與PPRC復合體相關(guān)的激酶活性。
20.權(quán)利要求19的多肽，其中所述多肽包含選自PKN3的ACC1、ACC2和ACC3中的至少一個ACC結(jié)構(gòu)域，但不包含PKN3的激酶結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含新的大分子組件的組合物和所述大分子組件的使用方法，所述大分子組件包含PKN3、PDK1和RhoC(PPRC復合體)。發(fā)現(xiàn)PPRC復合體具有激酶活性，并存在于高度惡性的細胞中，例如高度進展性的癌癥。在一些方面，本發(fā)明提供篩選具有癌癥治療潛能的化合物的方法，診斷進展性癌癥的方法，確定癌癥患者預后的方法，在臨床試驗中對患者進行分層或確定特定處理方案的有效性的方法，并提供調(diào)節(jié)PPRC復合體的形成的多肽以及包含PPRC復合體的一或多種組份的試劑盒。
文檔編號G01N33/50GK102348981SQ201080011777
公開日2012年2月8日 申請日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月12日
發(fā)明者A·克利佩爾-吉澤, K·云薩爾-卡奇馬茲 申請人:惠氏有限責任公司