專利名稱：傳染劑的快速死前檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及痕量的生物和化學(xué)產(chǎn)物(例如生物樣品中構(gòu)象改變形式的細(xì)胞朊病毒蛋白)的快速死前檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
傳染性海綿狀腦病(TSE, transmissible spongiform encephalopathy)或朊病毒病(prion disease)是哺乳動(dòng)物的傳染性神經(jīng)退行性疾病，包括牛海綿狀腦病(“瘋牛”病)、鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病、綿羊的羊瘙癢癥和人的克雅氏病(CJD， Creutzfeldt-Jakob disease)。TSE可通過(guò)攝取受感染的組織或輸血而在宿主之間傳遞。 TSE的臨床癥狀包括人的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性喪失和癡呆。其具有數(shù)月至數(shù)年的潛伏期，但當(dāng)臨床癥狀出現(xiàn)之后，其進(jìn)展迅速、不可醫(yī)治并最終致命。降低TSE風(fēng)險(xiǎn)的嘗試已經(jīng)導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品、藥物、化妝品、血液和組織捐獻(xiàn)以及生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)和貿(mào)易的顯著改變。TSE與宿主編碼的細(xì)胞朊病毒蛋白(PrPG)轉(zhuǎn)換為構(gòu)象改變形式(PrPse)相關(guān)。對(duì)來(lái)自死后動(dòng)物或人的腦組織的神經(jīng)病理學(xué)檢查仍是TSE診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，其通常顯示星形細(xì)胞增生和海綿狀變化，有時(shí)伴有含ft·!^的淀粉樣蛋白沉積的形成。與其它技術(shù)(Wells 和Wilesmith，1995 favier-Widen等，2005)相比，它非常特異但靈敏度較低。盡管通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)(使用特異性針對(duì)I^rP的抗體來(lái)檢測(cè)在淀粉樣蛋白沉積中的積累 (van Keulen等，1995; 1996))可提高顯微鏡觀察的靈敏度，但這些方法不適于快速、常規(guī)的分析。另外值得關(guān)注的是，由于TSE相關(guān)分子在機(jī)體組織中的不均勻分布(其在神經(jīng)系統(tǒng)組織中的濃度總是最高，而在容易獲取的體液(如，血液或尿)中的濃度卻非常低)，因此 TSE的實(shí)驗(yàn)室診斷變得愈發(fā)復(fù)雜。PrP^具有獨(dú)特的物理化學(xué)和生化特性，例如聚集性、不溶性、蛋白酶消化抗性和富含β片層的二級(jí)結(jié)構(gòu)。PrPk的這些經(jīng)變化特性之一一即對(duì)蛋白酶消化的部分抗性，構(gòu)成了大多數(shù)診斷性生化測(cè)試的基礎(chǔ)。為了區(qū)分IM3g和通常用蛋白酶K(PK，proteinase K)預(yù)處理樣品。由于具有部分消化抗性，而易于被1 消化，因此預(yù)處理的結(jié)果導(dǎo)致與富含M3g的樣品相比，在富含的樣品中的干擾消除或降低。然而，同時(shí)也提出，死于CJD的患者的腦中大多數(shù)M3se是的1 敏感性形式(SPrPse)，這使得在 PrP^濃度非常低的死前測(cè)定中用Hi進(jìn)行處理是不切實(shí)際的。開(kāi)發(fā)不需要蛋白水解處理樣品的診斷性測(cè)定可消除與蛋白水解消化相關(guān)的問(wèn)題以及測(cè)定靈敏度低的問(wèn)題。目前的Pri^e檢測(cè)方法很耗時(shí)，并在疑似患病動(dòng)物表現(xiàn)出一種或多種疾病癥狀之后應(yīng)用死后分析。目前的診斷性方法主要基于對(duì)I^Pg和押！^的物理化學(xué)差異的檢測(cè)，它們是迄今為止唯一可靠的TSE標(biāo)志物。例如，最廣泛使用的診斷性測(cè)試?yán)媚X樣品中I^rPse 的相對(duì)蛋白酶抗性并聯(lián)合使用針對(duì)IM3se之1 抗性部分的、基于抗體的檢測(cè)來(lái)區(qū)分I^Pg和 PrPsc0尚不能通過(guò)使用常規(guī)方法(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、血清學(xué)或細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定)來(lái)檢測(cè)朊病毒病。尚未鑒定出傳染劑特異性核酸，并且受感染的宿主不引發(fā)抗體應(yīng)答。PrPsc與本文中討論的三種抗體(8E9、11F12和5D6)的抗體-抗原結(jié)合事件已在 2008 年 10 月 31 日由 Chang 等人電子發(fā)表的 PrP Antibody Binding-Induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity, 205 J. NeuroimmunoL , 94,94-100 中表征，其內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。這些抗體與ft·!^上的不同表位相互作用。單克隆抗體(Mab， Monoclonal antibody) 8E9 結(jié)合 PrI^e 的 155 200 位氨基酸區(qū)域。Mab 11F12 結(jié)合 PrI^c 的93 122位氨基酸區(qū)域。Mab 5D6結(jié)合ft·產(chǎn)之尚不明確的構(gòu)象表位。在構(gòu)象表位的情形中，抗體不結(jié)合特異性的連續(xù)氨基酸序列，而是結(jié)合這樣的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)區(qū)域，所述區(qū)域可包括來(lái)自氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的幾個(gè)不連續(xù)區(qū)域的氨基酸殘基。使用這三種抗體進(jìn)行捕獲酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)。只有使用Mab 11F12作為捕獲試劑以及使用生物素化的單克隆抗體5D6作為檢測(cè)物時(shí)才可成功地結(jié)合并鑒定PrPSe。只有依此方式的抗體組合在感染的倉(cāng)鼠、感染羊瘙癢病的綿羊或感染CWD的鹿中提供同樣的結(jié)果。使用加熱和/或十二烷基硫酸鈉(SDQ變性，檢測(cè)得到進(jìn)一步地加強(qiáng)。據(jù)認(rèn)為，這種檢測(cè)加強(qiáng)是由PrI^e中抗體誘導(dǎo)的表位暴露所致。簡(jiǎn)言之，一種抗體(Mab 11F12)與的結(jié)合以某種方式暴露表位， 這使得第二種抗體(Mab 5D6)更好地結(jié)合。尚不知道這是否通過(guò)以下方式而發(fā)生PrP構(gòu)象改變、PrPc重折疊成PrKe和/或1 抗性形式或sPrPe形式的改變，使其更容易與另外的抗體相結(jié)合。Chang 等人在 2009 年 2 月 27 日電子發(fā)表的 Surround Optical Fiber Immunoassay(SOFIA) :An Ultra-Sensitive Assay for Prion Protein Detection,159 Journal of Virological Methods，15，15-22 中還公開(kāi)了包繞光纖免疫測(cè)定(SOFIA, surround optical fiber immunoassiiy) 。 SOFIA Mab Sf 1 帛白勺 |S| 胃?jìng)€(gè)生 g 1 繞光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度相結(jié)合。為檢測(cè)極低的信號(hào)水平，使用低噪的光電二極管 (photo-voltaic diode)作為系統(tǒng)的檢測(cè)器。SOFIA使用激光照射容納樣品的微毛細(xì)管。隨后，從所述樣品收集的光通過(guò)光纖被導(dǎo)向傳遞光學(xué)器件。之后，對(duì)所述光進(jìn)行光學(xué)過(guò)濾以用于檢測(cè)，所述檢測(cè)為測(cè)量電流并通過(guò)數(shù)字信號(hào)處理鎖定放大器針對(duì)噪聲而進(jìn)行放大。結(jié)果利用計(jì)算機(jī)顯示，并儲(chǔ)存于設(shè)計(jì)用于數(shù)據(jù)采集的計(jì)算機(jī)軟件中。羅丹明紅(Rhodamine Red)可被SOFIA檢測(cè)的濃度達(dá)到0. 1阿克(ag)。因此， SOFIA顯示，來(lái)自未用1 處理的倉(cāng)鼠腦的ft·產(chǎn)的檢出限約為10ag，并且推斷，來(lái)自綿羊和鹿之腦物質(zhì)的PrKe的檢出限約為1飛克(femtogram)。然而，假定抗體反應(yīng)性相同的話，Western印跡顯示，在克當(dāng)量基礎(chǔ)上，倉(cāng)鼠腦比綿羊和鹿之腦物質(zhì)中的PrKe高出至少10 100倍，即表明在后兩個(gè)物種中檢出的蛋白質(zhì)可以為10 IOOag的范圍或更多。已報(bào)道蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA，protein misfolding cyclic amplification)的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)支持向PrKe的特異性重復(fù)性轉(zhuǎn)換，其導(dǎo)致小量的擴(kuò)增。盡管已在唾液、血液、尿和糞便中檢測(cè)到CWD傳染劑，但是從上述物質(zhì)中直接免疫檢測(cè)尚未成功(Haley等，2009a，b)。另外，針對(duì)上述某些物質(zhì)中CWD傳染劑的成功檢測(cè)還需要對(duì)連續(xù)PMCA (sPMCA，serial PMCA)的產(chǎn)物進(jìn)行生物測(cè)定(Mathiason等，2006，2009 ； Haley等，2009a，b ；Tamguney等，2009)。為了利于用外周組織(尤其是血液)對(duì)TSE進(jìn)行臨床前檢測(cè)，可通過(guò)PMCA (Saborio等，2001)擴(kuò)增樣品中的靶標(biāo)I^rPse。已報(bào)道，PMCA提高了對(duì)來(lái)自實(shí)驗(yàn)性羊瘙癢病感染的嚙齒動(dòng)物(Saborio等，2001 ；Deleault等，2003 ；Bieschke 等，2004)、分別天然感染牛海綿狀腦病和羊瘙癢病的牛和綿羊(Soto等，2005)以及最近地來(lái)自患有克雅氏病的人(Jones等，2007)和患有慢性消耗性疾病的鹿(Kurt等，2007)的腦中ft·產(chǎn)檢測(cè)的靈敏度。另外，已報(bào)道PMCA在綿羊和倉(cāng)鼠(均處于疾病的終末期)的血液中和在癥狀發(fā)生前的動(dòng)物中(Castilla 等，2005a，b ；Saa 等，2006 ；Murayama 等，2007 ；Thorne 和 iTerry, 2008)以及在尿和腦脊液中(Atarashi 等，2007，2008 ；Murayama 等，2007)檢測(cè)出
使得該技術(shù)成為有用的診斷工具。然而，到目前為止，由于需要多輪循環(huán)從而通過(guò)免疫印跡法看到終產(chǎn)物，因此PMCA亦受到了阻礙。事實(shí)上，進(jìn)行多輪PMCA可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)過(guò)192個(gè)循環(huán)，對(duì)照血液樣品顯示出從I^Pg向Pri^e的自發(fā)轉(zhuǎn)換，因此，這在某種程度上使得該技術(shù)不足以用于診斷目的。PMCA具有巨大的潛力，但受到多種根本上的和技術(shù)上的困難(包括實(shí)現(xiàn)最佳靈敏度所需的時(shí)間長(zhǎng)度(約3周))的阻礙。當(dāng)前的學(xué)說(shuō)為PrP&與傳染性直接相關(guān)，其在腦中的積累導(dǎo)致神經(jīng)病變和臨床疾病。還假設(shè)ft"產(chǎn)積累之速率和方式以及由此的神經(jīng)病變形成之速率決定了疾病的潛伏期 O^rusiner等，1990 ；Carlson等，1994)。然而還顯示，與預(yù)期不同的是，在無(wú)癥狀小鼠的CNS 中可存在高水平的積累和傳染性(Bueler等，1994)。對(duì)天然和實(shí)驗(yàn)感染的綿羊的另一些研究(Madec等，2004 ；Bulgin等，2006)也已表明PrI^e水平、IHC染色拓?fù)鋵W(xué)、組織學(xué)病變和臨床疾病的程度之間不一致。為了提高食品安全性，使用死前、臨床前測(cè)試(即在癥狀出現(xiàn)前進(jìn)行測(cè)試)針對(duì)所有動(dòng)物篩查朊病毒病是非常有益的。然而，在癥狀出現(xiàn)前的宿主中，PrPk水平非常低。此外，PrP^在機(jī)體組織中一般不均勻分布，其在神經(jīng)系統(tǒng)組織中的濃度總是最高，而在容易獲取的體液(如，血液和尿)中的濃度卻非常低。因此，需要這樣的測(cè)試來(lái)檢測(cè)極少量的ft~P， 以及區(qū)分IM3g和PrPsc。確保能夠進(jìn)行早期診斷對(duì)于真正具有價(jià)值的治療性介入來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵性的。對(duì)于要進(jìn)入人類食物鏈的動(dòng)物以及血液和組織捐獻(xiàn)者來(lái)說(shuō)，可在出現(xiàn)任何臨床癥狀之前可對(duì)朊病毒傳染劑進(jìn)行檢測(cè)是必需的。因此，針對(duì)朊病毒的靈敏度更高的檢測(cè)方法有持續(xù)的需求。發(fā)明概述PrPc的構(gòu)象改變形式是PrPse。一些人認(rèn)為I^rPse是TSE中的傳染劑(朊病毒傳染劑)，而另一些人則不這么認(rèn)為。PrPk可以是疾病過(guò)程的神經(jīng)病變產(chǎn)物、傳染劑的組分、傳染劑本身等。不管它在疾病狀態(tài)中的實(shí)際功能是什么，但明確的是ft·!^與疾病進(jìn)程特異性地相關(guān)，并且對(duì)其的檢出指示了引起朊病毒病之傳染劑的感染。
本發(fā)明提供了通過(guò)在生物樣品中檢測(cè)來(lái)診斷朊病毒病的方法等。所述生物樣品可以是腦組織、神經(jīng)組織、血液、尿、淋巴液、腦脊液或其組合。不存在表明未感染多達(dá)本方法檢出限的傳染劑。檢測(cè)到ft·!^的存在表明感染了與朊病毒病相關(guān)的傳染劑。 可在疾病進(jìn)展的癥狀出現(xiàn)前階段和有癥狀階段檢測(cè)朊病毒傳染劑的感染。這些及其它改進(jìn)已通過(guò)使用SOFIA(開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)的基于激光的免疫測(cè)定 (Chang等，2009))來(lái)實(shí)現(xiàn)。SOFIA的靈敏度和特異性(Chang等，2009)使得不需要進(jìn)行Hi 消化以區(qū)分正常和異常的I^rP同工型。此外，檢測(cè)血漿中的已通過(guò)有限次PMCA然后 SOFIA而解決了。由于SOFIA的靈敏性，可減少PMCA的循環(huán)數(shù)，從而降低了 Pri^e自發(fā)形成和檢出假陽(yáng)性樣品的機(jī)會(huì)。本發(fā)明滿足了前述的在癥狀出現(xiàn)前和有癥狀的TSE感染動(dòng)物(包括人)中進(jìn)行靈敏度提高的朊病毒病檢測(cè)的需要，其通過(guò)提供使用高靈敏度儀器(與先前所述的方法相比，該儀器需要更少的樣品制備物)連同新近開(kāi)發(fā)的針對(duì)PrP之Mab的分析方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明方法提供的靈敏度水平足以在腦組織中檢出PrPSc;。當(dāng)與有限次sPMCA聯(lián)用時(shí)，本發(fā)明方法提供的靈敏度水平足以在死前采集的血漿、組織和其它流體中檢出PrPSe。 對(duì)于腦物質(zhì)來(lái)說(shuō)，樣品采集和分析之間的時(shí)間可少于M小時(shí)。本方法將用于抗原捕獲和濃縮之Mab的特異性與包繞光纖檢測(cè)技術(shù)的靈敏度相結(jié)合。與先前所述的在腦勻漿物中檢測(cè)PrPk的方法不同的是，當(dāng)用于研究腦勻漿物時(shí)，這些技術(shù)不使用種子聚合(seeded polymerization)、擴(kuò)增或酶消化(例如，通過(guò)蛋白酶K(或“PK”))。這是很重要的，因?yàn)橄惹暗膱?bào)道已表明具有不同Hi敏感性的異構(gòu)體的存在降低了該測(cè)定的可靠性。該測(cè)定的靈敏性使其適于作為用于在生物流體中快速檢測(cè)朊病毒的平臺(tái)。除了朊病毒病之外，本發(fā)明方法可提供針對(duì)廣譜的感染和疾病的快速高通量測(cè)試方法。盡管已發(fā)現(xiàn)將約40個(gè)循環(huán)的sPMCA與免疫沉淀聯(lián)用不足以通過(guò)ELISA或Western 印跡檢測(cè)血漿中的PrPse，但是通過(guò)SOFIA方法卻很容易測(cè)量PrPSe。根據(jù)本發(fā)明，用于本發(fā)明測(cè)定平臺(tái)必需的有限數(shù)目的循環(huán)基本上消除了獲得PMCA相關(guān)之假陽(yáng)性結(jié)果(例如先前報(bào)道的那些(Thorne和Terry，2008))的可能性。以下代表了本發(fā)明的一些非限制性實(shí)施方案。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了用于在懷疑具有I^rPse的生物樣品中檢測(cè)是否存在PrP^的方法，其包括如下步驟通過(guò)將I^rPse 從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的；用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPse,以得到經(jīng)標(biāo)記的I^rPse ；以及利用分析儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的PrPSe。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了用于在懷疑具有的生物樣品中檢測(cè)是否存在PrP^的方法，其包括如下步驟通過(guò)將PrP^從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的IM3se ；用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPse,以得到經(jīng)標(biāo)記的IM3se ；以及利用分析儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的PrPSe。在該實(shí)施方案中，所述IM3se是未經(jīng)消化的。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了用于在懷疑具有的生物樣品中檢測(cè)是否存在PrP^的方法，其包括如下步驟通過(guò)將PrP^從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的IM3se ；用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPse,以得到經(jīng)標(biāo)記的PrPk ；以及利用分析儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的PrPSe。濃縮Pri^e與分析經(jīng)標(biāo)記PrKe之間的持續(xù)時(shí)間優(yōu)選為約48小時(shí)或更短。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了用于在懷疑具有ft·!^的生物樣品中檢測(cè)是否存在的方法，其包括如下步驟通過(guò)sPMCA擴(kuò)增樣品中的；通過(guò)將從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的；用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPse,以得到經(jīng)標(biāo)記的I^rPse ；以及利用分析儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的PrPSe。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案，公開(kāi)了用于在懷疑具有ft·!^的生物樣品中檢測(cè)是否存在的方法，其包括如下步驟通過(guò)sPMCA擴(kuò)增樣品中的；通過(guò)將從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的；用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的ft~PSe，以得到經(jīng)標(biāo)記的I^rPse ；以及利用分析儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的ft~PSe。在該實(shí)施方案中，所述生物樣品是腦組織、神經(jīng)組織、血液、尿、淋巴液、腦脊液或其組合。


圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明一些方法適于分析的儀器的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明一些方法適于分析之儀器的端部孔口組件(end port assembly)的一個(gè)實(shí)施方案的側(cè)視示意圖。圖3是根據(jù)本發(fā)明一些方法適于PrP^分析之儀器的樣品容器的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。圖4是從一個(gè)側(cè)面看圖3之樣品容器的示意圖。圖5是從頂部看圖3之樣品容器的示意圖。圖 6 顯示使用 Mab 08-1/5D6 (A)、08_1/11F12 (B)和 08_1/8E9(C)對(duì)來(lái)自感染洸3K 的倉(cāng)鼠(H)、感染羊瘙癢病的綿羊⑶和感染CWD的鹿⑶的未處理和經(jīng)1 處理的全腦裂解物的Wfestern印跡分析。圖7顯示使用比色法在OD4tl5測(cè)量抗體結(jié)合。捕獲ELISA測(cè)定使用Mab 11F12作為捕獲試劑和經(jīng)生物素化的5D6作為檢測(cè)試劑。來(lái)自正常的和感染的倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的腦組織勻漿物。使用未經(jīng)I3K處理和經(jīng)1 處理的腦裂解物進(jìn)行測(cè)定。圖8顯示在捕獲ELISA之后對(duì)未經(jīng)I3K處理的腦勻漿物進(jìn)行Wfestern印跡分析。在與圖7所述同樣的條件下，使用未經(jīng)生物素化的檢測(cè)試劑，利用正常綿羊(NS)、感染羊瘙癢病的綿羊(SS)、正常的鹿、感染CWD的鹿(CWD)、正常倉(cāng)鼠(NH)和感染261的倉(cāng)鼠Q63K) 進(jìn)行所述捕獲ELISA。使用Mab 8E9進(jìn)行免疫染色。圖9顯示使用來(lái)自未感染的和感染的倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的腦裂解物在捕獲ELISA中互換上述捕獲試劑和檢測(cè)試劑的比較。將使用5D6作為捕獲試劑和11F12作為生物素化的檢測(cè)試劑(5D6/生物素11FU)的研究與使用11F12作為捕獲試劑和5D6作為生物素化的檢測(cè)試劑(11F12/生物素5D6)的研究進(jìn)行比較。圖10顯示使用圖1的儀器獲得的數(shù)據(jù)，顯示羅丹明紅的稀釋物(■)以及來(lái)自小鼠㈩、倉(cāng)鼠( )、綿羊(▼)和鹿(·)的rPrP (重組的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。圖11顯示使用圖1的儀器在來(lái)自感染的倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的經(jīng)1 處理的和未處理的正常的(空心柱)和感染的(實(shí)心柱)的腦勻漿物中檢測(cè)ft~p。X軸的數(shù)值表示對(duì)初始樣品10倍連續(xù)稀釋的程度。例如，針對(duì)倉(cāng)鼠的“-10”表示樣品以1X10,的系數(shù)進(jìn)行稀釋。圖12顯示在Mab 8E9免疫沉淀之后對(duì)PrP進(jìn)行^festern印跡分析。圖13顯示PrP經(jīng)Mab 8E9免疫沉淀的捕獲ELISA分析結(jié)果。
圖14顯示sPMCA之后對(duì)PrP^進(jìn)行Western印跡。圖15顯示羊瘙癢病綿羊的第三眼瞼淋巴組織的免疫組織化學(xué)。在濾泡內(nèi)可見(jiàn) PrPsc免疫組化染色(紅色)。圖16顯示在進(jìn)行和不進(jìn)行sPMCA時(shí)，使用SOFIA檢測(cè)羊瘙癢病綿羊之血液樣品中的 PrPsc0圖17顯示在進(jìn)行和不進(jìn)行sPMCA時(shí)，使用SOFIA檢測(cè)CWD血液樣品中的PrPSc。發(fā)明詳述"PrPsc"應(yīng)理解為是指IM3g的構(gòu)象改變形式。I^rPse與疾病過(guò)程特異性地相關(guān)，對(duì)其的檢出指示感染了引起朊病毒病的傳染劑。TSE應(yīng)被理解為包括但不限于人類疾病克雅氏病(CJD)、格-施-沙綜合征(Gerstmarm- StraUSSler -Scheinker, GSS)、致命性家族性失眠癥(FFI,fatal familial insomnia)和庫(kù)魯病(kuru)，以及上述疾病在動(dòng)物中的形式 牛海綿狀腦病(BSE，bovine spongiform enc印halopathy，常稱為“瘋牛病”)、慢性消耗性疾病(CWD，chronic wasting disease)(在麋鹿和鹿中)和羊瘙癢病(在綿羊中)。應(yīng)理解，“蛋白質(zhì)的”意指朊病毒可包含蛋白質(zhì)以及其它生化實(shí)體，因而并非是指所述朊病毒僅由蛋白質(zhì)組成。涉及濃縮時(shí)使用的“盡可能地分離出來(lái)”應(yīng)理解為是指通過(guò)本文所述的方法，樣品中殘余的任何樣品基質(zhì)或非PrPk材料不足以被檢出或干擾檢測(cè)。“經(jīng)標(biāo)記的I^rPse”應(yīng)理解為是指已共價(jià)或非共價(jià)地連接熒光標(biāo)記物的PrPSe。優(yōu)選地，單個(gè)分子上連接一個(gè)熒光標(biāo)記物。“能夠檢測(cè)”意指與分析不含經(jīng)標(biāo)記之Prfe的樣品時(shí)儀器產(chǎn)生的背景噪聲信號(hào)相比，儀器產(chǎn)生顯著更高的信號(hào)。盡管特定樣品可包含高于阿摩爾(attomole)的量，但應(yīng)理解，分析時(shí)經(jīng)標(biāo)記的Pri^樣品要被稀釋至約0. 1阿摩爾/毫升，儀器會(huì)產(chǎn)生可重復(fù)的和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的信號(hào)?！鞍⒛柕牧俊币鉃?. 1阿摩爾至1飛摩爾?！八狼啊睉?yīng)理解為是指從中采集樣品的生物體死亡之前?！芭R床前”或“癥狀出現(xiàn)前”應(yīng)理解是指從不表現(xiàn)出朊病毒病癥狀的生物體中采集樣品?！胺N子聚合”應(yīng)理解為是指引發(fā)從PrPG向Pr嚴(yán)的轉(zhuǎn)換，所述I^rPse具有較高的 β-折疊片層(蛋白酶抗性的)含量。“酶促消化”應(yīng)理解為是指通過(guò)有意引入樣品中的蛋白酶降解蛋白質(zhì)，所述蛋白酶在特定氨基酸之間誘導(dǎo)選擇性切割。“酶促消化”應(yīng)理解為不包括自身消化或由樣品中天然存在的酶引起的消化。本文使用的“未經(jīng)消化的”應(yīng)理解為是指在樣品制備或分析期間均不進(jìn)行Prfe的酶促消化。本發(fā)明方法包括例如從期望確定是否已發(fā)生感染的動(dòng)物或人中獲得樣品的步驟， 所述樣品可含有或不含有異常的I^rP同工型(PrPse)。如果樣品來(lái)自被感染的生物體，則該樣品包含I^rPse和樣品基質(zhì)，應(yīng)理解所述樣品基質(zhì)包括非I^rPse組分(例如細(xì)胞、細(xì)胞組分、 生物分子、非ft·!^蛋白等)。所述樣品可采集自神經(jīng)組織、血液、尿、淋巴液、腦脊液、其它體液，及其組合，以及包含這些。一經(jīng)采集，所述至少被半純化或濃縮，其通過(guò)將目的I^rPse與樣品基質(zhì)進(jìn)行分
9離來(lái)實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行濃縮，所述方法包括但不限于使用分子抗體、免疫沉淀、磁珠、塑性表面上的抗體捕獲、應(yīng)用磷鎢酸鈉、甲醇的方法，及其組合。 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用單克隆抗體進(jìn)行濃縮。在SOFIA中，使用幾種PrP特異性Mab， 所述Mab最近被報(bào)道當(dāng)在捕獲ELISA中一起使用時(shí)具有協(xié)同作用(Chang等，PrP Antibody Binding-induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity,J. of Immunology, 205 卷，1-2 期，94-100 頁(yè)(2008))。還可通過(guò)Kim等，2005(其通過(guò)引用并入本文中)所述的技術(shù)(其為基于免疫沉淀的捕獲測(cè)定，使用經(jīng)染料標(biāo)記的抗I^rP Mab連同第二種經(jīng)生物素化的抗Mab和綴合有鏈霉親和素的磁珠)進(jìn)行濃縮。該技術(shù)的變化形式包括經(jīng)染料標(biāo)記的抗I^rP Mab以及直接與磁珠綴合的第二 I^rP Mab。濃縮的樣品可包含至少0. 1阿摩爾的I^rPse，或至少200阿摩爾，或者從約0. 1阿摩爾至約1. 0納摩爾、或者從約0. 1阿摩爾至約1飛摩爾、或者從約0. 4至約1. 0阿摩爾的 PrPsc0可用一個(gè)或多個(gè)熒光分子來(lái)標(biāo)記經(jīng)濃縮樣品中的PrPk以得到經(jīng)標(biāo)記的PrPSe?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法進(jìn)行標(biāo)記，包括但不限于熒光標(biāo)記、磷光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、生物素化以及本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的其它標(biāo)記方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記物是羅丹明紅。在一個(gè)替代性的實(shí)施方案中，可通過(guò)除熒光以外的方法檢測(cè)，包括但不限于磷光，紅外、可見(jiàn)光和紫外波長(zhǎng)的吸收，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的其它光譜手段。在一個(gè)實(shí)施方案中，隨后用合適的分析儀器分析所濃縮的樣品，所述儀器能夠靈敏而快速地檢測(cè)ft~PSe。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述儀器能夠檢出阿摩爾量的經(jīng)標(biāo)記ft~PSe。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括濃縮I^rPse、標(biāo)記和檢測(cè)的步驟的時(shí)間為48小時(shí)或更短，或者M(jìn) 小時(shí)或更短，或者12小時(shí)或更短，或者3小時(shí)或更短。在一個(gè)實(shí)施方案中，可針對(duì)本發(fā)明的目的應(yīng)用例如2005年12月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/634，其通過(guò)引用整體并入本文)所述的儀器。圖1示意系統(tǒng)100的一個(gè)替代性實(shí)施方案。在這一實(shí)施方案中，四個(gè)線性陣列(linear array) 101從樣品托 (sample holder) 102延伸至端部孔口(end port) 103，其中安置有伸長(zhǎng)的、透明的樣品容器 306。將端部孔口的遠(yuǎn)端104插入端部孔口組件200中。所述線性陣列包含多個(gè)具有第一端部和第二端部的光纖，所述多個(gè)光纖任選地被保護(hù)性的和/或阻隔性的鞘所包繞。光纖的數(shù)目可變，在一個(gè)實(shí)施方案中，光纖的數(shù)目為約10至約100個(gè)，或者從約25至約75個(gè)，或者為約50個(gè)。線性陣列的數(shù)目可變，且至少為2個(gè)。線性陣列的最大數(shù)目取決于樣品托的尺寸，因?yàn)闃悠吠斜仨氉銐虼笠韵蚬饫w的第一端部提供足夠的空間來(lái)包繞并靠近(例如， 約Imm至約Icm)樣品容器。在一個(gè)實(shí)施方案中，線性陣列的數(shù)目為2至10個(gè)，或者為約4 至6個(gè)，或者為4個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述線性陣列呈平面陣列安置，其中相鄰的線性陣列彼此之間等距定位并包繞所述樣品托。當(dāng)線性陣列的數(shù)目為4個(gè)時(shí)，相鄰線性陣列彼此之間以呈90度角定位。線性陣列的長(zhǎng)度可在很大范圍內(nèi)選擇，其取決于光纖的數(shù)目和性質(zhì)。其長(zhǎng)度必須足以允許在不損害光纖完整性的前提下捆束來(lái)自每個(gè)線性陣列的光纖。原則上講，光纖的長(zhǎng)度沒(méi)有上限，其應(yīng)使得樣品位于遠(yuǎn)離用于分析樣品之診斷設(shè)備的位置。光纖的第一端部可以以基本上線性的方式沿著包含樣品之容器的長(zhǎng)度而安置。光纖的第二端部被捆束在一起形成單個(gè)端部孔口。換句話說(shuō)，來(lái)自每個(gè)線性陣列之光纖的給定長(zhǎng)度之第二端部混雜在一起形成單個(gè)束。優(yōu)選地，來(lái)自每個(gè)線性陣列之光纖的第二端部在束內(nèi)隨機(jī)穿插。多個(gè)光纖接收由目的分析物發(fā)出的信號(hào)，并將該信號(hào)從光纖的第一端部傳遞至包含光纖之第二端部的端部孔口。所述光纖具有高數(shù)值孔徑(NA)，其對(duì)應(yīng)于 sinee/2，其中θ是所接收的入射光的角度(光接收角)。在這一實(shí)施方案中，NA可為約 0. 20至約0. 25，且光接收角為約20度至約45度。所選擇的光接收角使得基本上所有的發(fā)射信號(hào)均可被所述多個(gè)光纖攔截。這確保了對(duì)來(lái)自稀釋的分析物(例如，PrPsc)的信號(hào)的最佳收集效率。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述光纖包含熔融二氧化硅。光纖的直徑可為約50微米至約 400微米。將來(lái)自每個(gè)線性陣列的光纖進(jìn)行捆束提供了多種優(yōu)勢(shì)。可使用單個(gè)檢測(cè)器，而無(wú)需針對(duì)每個(gè)線性陣列的檢測(cè)器。對(duì)于包含四個(gè)線性陣列的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，這使得檢測(cè)區(qū)域的大小變?yōu)樗膫€(gè)單獨(dú)檢測(cè)器的1/4。這因此顯著降低了背景噪聲，繼而提高了信噪比，并因而降低了檢出限。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)器的尺寸為約0. 5mmΧ0. 5mm至約ImmX 1mm。本實(shí)施方案之系統(tǒng)的檢出限為至少0. 1阿摩爾分析物，或者為至少200阿摩爾、或者為約0. 1阿摩爾至約1. 0微摩爾、或者為約0. 1阿摩爾至約1納摩爾、或者為約0. 4至約1. 0阿摩爾分析物?；蛘?，在本實(shí)施方案中，系統(tǒng)的檢出限為至少0. 1阿克分析物，或者為至少10阿克的分析物。圖2示意本實(shí)施方案之端部孔口組件的一個(gè)實(shí)施方案。將包含成束光纖的單個(gè)端部孔口遠(yuǎn)端104插入到端部孔口組件200的入口 202。通過(guò)光纖，信號(hào)經(jīng)端部孔口組件200 傳遞至出口 207，并隨后被傳遞到傳出光纖208，其繼而與檢測(cè)器相連。傳出光纖208的直徑可為約300微米至約500微米，且優(yōu)選為約400微米。因此，所述端部孔口組件將單個(gè)端部孔口光耦合至檢測(cè)器。所述端部孔口組件可包含第一透鏡203，其用作使入射信號(hào)準(zhǔn)直。 所述端部孔口組件還可包含第二透鏡204，其用作將傳出信號(hào)會(huì)聚成適合傳出光纖208的 NA0所述端部孔口組件還可包含至少一個(gè)陷波濾波器(notch filter) 205和至少一個(gè)帶通濾波器(bandpass filter) 206。合適的檢測(cè)器的非限制實(shí)例包括光二極管檢測(cè)器、光電倍增管 (photo-multiplier)、電荷耦合裝置、光子計(jì)數(shù)儀、光譜儀，及其任何組合。圖3示意本實(shí)施方案之合適的樣品托102的一個(gè)實(shí)施方案。設(shè)置了隔擋物 (spacer) 303，從而為伸長(zhǎng)的、透明的容器306提供空間以穿過(guò)樣品托300。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品托300為毛細(xì)管，并可由玻璃、石英或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它合適材料制成。僅作為舉例，所述毛細(xì)管可容納100微升液體。設(shè)置隔擋物303還提供了使光纖的第一端部包繞并靠近透明容器的狹縫304或空間。隔擋物302被頂端板305和底端板302固定到位，所述頂端板和底端板利用緊固物301 (例如螺釘)連接至隔擋物303。所捕獲的發(fā)出信號(hào)通過(guò)光檢測(cè)器轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，并傳遞至分析儀(未顯示)，所述分析儀接收電信號(hào)并分析樣品中是否存在分析物。分析儀的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述分析儀可包括使得能夠進(jìn)行電信號(hào)之相靈敏度檢測(cè)的鎖定放大器(lock-in amplifier)，或本領(lǐng)域已知的用于分析由本文所述不同類型之光檢測(cè)器產(chǎn)生的電信號(hào)的任何其它方法。
可針對(duì)收集來(lái)自報(bào)告分子的光對(duì)開(kāi)發(fā)用于這些測(cè)定的儀器進(jìn)行優(yōu)化。在基于熒光的測(cè)定中，目前使用的染料具有接近或高于90%的量子效率。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述染料是羅丹明紅Xanvitrogen Corp. , Carlsbad CA)。此外，對(duì)跨導(dǎo)前置放大器 (transconductance pre-amplifier)和鎖定檢測(cè)器裝置進(jìn)行優(yōu)化以便于低信號(hào)/低噪聲檢測(cè)。首先，選擇用于光斬波器(optical chopper)的合適的調(diào)制頻率，其應(yīng)當(dāng)與線頻率或環(huán)境中其它電來(lái)源的噪聲不接近。此外，鎖定放大器應(yīng)當(dāng)采用線濾波(line filtering) 0 在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)制頻率為753Hz，且鎖定放大器設(shè)置在60Hz和120Hz濾波?；陬A(yù)期的信號(hào)水平來(lái)選擇跨導(dǎo)前置放大器的靈敏度，并使前置放大器的輸入阻抗最大化，并在一個(gè)實(shí)施方案中設(shè)定為InA/V。在一個(gè)實(shí)施方案中，帶通濾波器的頻率中心為斬波頻率，例如 753Hz ο
實(shí)施例1.組織樣品的采集^ M Chang, B.等，“PrP Antibody Binding-Induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity, “ J. Neuroimmunol. 205 1-2 10,94-100 M (2008) ^ 描述采購(gòu)并擴(kuò)增感染263K羊瘙癢病的倉(cāng)鼠品系。從感染了羊瘙癢病的綿羊和感染了 CWD 的白尾鹿的臨床患病期間收集腦，并在-80°C冷凍。類似地，收獲來(lái)自未感染之動(dòng)物的腦并冷凍° 按照 D. R. Brown 等，“Normal prion protein has an activity like that of superoxide dismutase，" Biochem J. 344卷 1-5頁(yè)(1999)的描述，將鹿、倉(cāng)鼠、小鼠和綿羊 PrP的全長(zhǎng)編碼區(qū)克隆進(jìn)pET-23載體中，從而得到無(wú)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(rfrP)。表達(dá)和純化與 C. E.Jones 等，"Preferential Cu2+ coordination by His96 and His111 induces β -sheet formation in the unstructured amyloidogenic region of the prion protein, " J. Biol. Chem. 279 頁(yè)，32018-32027 Q004)的操作步驟基本相同。使用在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中制備的20%羊瘙癢病綿羊腦勻漿物(來(lái)自臨床和免疫組織化學(xué)陽(yáng)性動(dòng)物的7份羊瘙癢病腦的混合物)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性口服感染。所有未感染的動(dòng)物都被安置在隔離的無(wú)羊瘙癢病的設(shè)施中。綿羊之羊瘙癢病的臨床癥狀包括輕微的頭部震顫發(fā)展到全身震顫、摩擦導(dǎo)致的羊毛脫落、啃咬肢端、高度敏感和步態(tài)異常。商業(yè)公司(Gene Check, Inc.，Greeley, CO)進(jìn)行了綿羊的基因分型。對(duì)于IHC而言，在水中清洗經(jīng)福爾馬林固定的第三眼瞼組織15分鐘，并在99%甲酸中浸泡1小時(shí)。用水清洗3小時(shí)后，在Microm STP 120中，所述組織被石蠟包埋，并切成 4微米用于封片。使載玻片干燥至少M(fèi)小時(shí)，脫石蠟并隨后使用Ventana (Ventana Medical Systems Inc.，Oro Valley,AZ)的專利試劑(朊病毒增強(qiáng)溶液和抗PrP抗體)和Benchmark LT自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行免疫染色。對(duì)于采血(經(jīng)IA⑶C批準(zhǔn))而言，束縛動(dòng)物并用針插入頸靜脈。采血(使用檸檬酸鈉作為抗凝劑)之后，立即將血液的一半冷凍并運(yùn)走。4°C下，將剩余一半的所收集全血樣品低速離心15分鐘。取出血漿，冷凍并利用干冰運(yùn)送。白尾鹿的飼養(yǎng)和取樣方案是經(jīng)Colorado Division of Wildlife' s (CDOff) IACUC 批準(zhǔn)的。使用罐裝濃縮牛奶和已有方案(Wild和Miller 1991 ；Wild等1994)用奶瓶飼喂來(lái)自幾個(gè)放養(yǎng)來(lái)源的新生白尾鹿的幼鹿。在整個(gè)研究中，除了采集樣品期間之外，鹿被限制在生物安全圍場(chǎng)中。在所有的圍場(chǎng)中，提供自由攝取的食物、水和補(bǔ)充劑。在約6月齡時(shí)，將約0. 5g同種的、合并的、經(jīng)感染的腦物質(zhì)置于舌根來(lái)口服接種白尾鹿幼鹿；先前的分析顯示這種接種混合物(inoculum pool)是感染性的，并且每克腦組織含有約6 μ g PrPcro (Raymond等2000 ；Wolfe等2007)。所有鹿均由對(duì)識(shí)別CWD之臨床癥狀富有經(jīng)驗(yàn)的獸醫(yī)來(lái)評(píng)估，并主觀地對(duì)行為改變、身體狀況變差、共濟(jì)失調(diào)、流涎或煩渴進(jìn)行打分。用于本研究的五只鹿在本源朊病毒蛋白基因第96位密碼子處的甘氨酸和絲氨酸是雜合的，在感染后253或343天(dpi，day post infection)的扁桃體活檢中有IM3·積累(Wolfe等 2007)，并在891至1774dpi時(shí)的尸檢中被證實(shí)為朊病毒感染。891dpi時(shí)，從所述五只接種的白尾鹿中采集血樣。取樣時(shí)，其中一只動(dòng)物(BC04) 處于臨床慢性消耗疾病的終末期，兩只(N204和W1004)顯示身體狀況有些差，而另外兩只 (I304、K304)臨床上正常。對(duì)于取血樣來(lái)說(shuō)，用甲苯噻嗪(xylazine)使鹿鎮(zhèn)靜，對(duì)覆蓋頸靜脈的皮膚進(jìn)行無(wú)菌處理，通過(guò)頸靜脈穿刺將血液收集進(jìn)入經(jīng)檸檬酸鈉處理的塑料袋中。冷卻血袋，并連夜運(yùn)走用于處理。2.單克隆抗體的制備使用最初由HiImert和Diringer (1984)報(bào)道并由Rubenstein等(1994)改良的方法，從感染的倉(cāng)鼠腦中分離出由含有第90-231位氨基酸(aa) (PrP90^231)之核心蛋白構(gòu)成的經(jīng)Hi處理的ft~PSe。使用鹽酸胍溶解該材料，按照先前的描述(Kang等，200 進(jìn)行提取和甲醇沉淀，并用作抗原。免疫PrP+小鼠，并按照先前描述的ELISA (Kascsak等，1987)監(jiān)測(cè)其免疫應(yīng)答。其中一只經(jīng)免疫的小鼠用于制備雜交瘤。此小鼠在融合前4天通過(guò)靜脈內(nèi)途徑接受磷酸鹽緩沖鹽水(“PBS”)中抗原的最后一次免疫。將脾細(xì)胞與表達(dá)降低水平之細(xì)胞表面I^rPe的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系融合(Kim等，2003)。按照先前的描述(Kascsak等， 1987)通過(guò)ELISA篩選雜交瘤，所得到的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋被克隆3次。使用一次性生物反應(yīng)瓶antegra Biosciences, Switzerland)進(jìn)行大規(guī)模Mab生產(chǎn)，使用蛋白G免疫親和層析(Pierce，Rockford，IL)從培養(yǎng)基中純化出抗體。利用微量BCA蛋白質(zhì)測(cè)定(Pierce) 來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)，并用小鼠Mab分型試劑盒(Pierce)進(jìn)行分型。使用EZ-Iink生物素化試劑盒(Pierce)對(duì)每種Mab進(jìn)行生物素化。使用溶解的IM3sg作為免疫原和低PrP表達(dá)的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系制備多種Mab。 選擇這些 Mab 中的三種(即 08-l/5D6(5D6)、08_1/11F12(11F12)和 08-1/8E9 (8E9))用于本研究，并分別分型為IgGl、IgG2b和IgG2b。所有這三種Mab均各自與正常的和疾病相關(guān)的PrP同工型反應(yīng)。全腦裂解物的Wfestern印跡(圖6)表明，所有這三種Mab都與來(lái)自感染^!BK的倉(cāng)鼠、感染羊瘙癢病的綿羊和感染CWD的鹿的未經(jīng)蛋白酶處理的腦樣品以及經(jīng)1 處理的反應(yīng)(圖6)。使用未處理的和經(jīng)1 處理的部分純化的PrKe制備物也觀察到類似的結(jié)果 (數(shù)據(jù)未顯示)。這些Mab也對(duì)正常的和異常的I^rP同工型以及分離自感染有ME7、139A和 22L的羊瘙癢病小鼠品系的小鼠腦和感染有CJD的人腦的經(jīng)1 處理的Pri^e以及來(lái)自所有受試物種(包括牛)的未感染腦物質(zhì)的I^rPe有免疫反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)間接ELISA，所述三種Mab對(duì)純化自^!BK感染的倉(cāng)鼠腦的經(jīng)Hi處理的I^rPse 有免疫反應(yīng)性。反應(yīng)性程度取決于變性處理的程度。單獨(dú)使用加熱或SDS處理提高免疫反應(yīng)性，而這兩種處理聯(lián)用得到最高水平的抗體結(jié)合和免疫反應(yīng)性(表1)，大致為兩種處理的加和作用，這提示表位暴露是受多種機(jī)制影響的。令人感興趣的是，盡管5D6結(jié)合構(gòu)象表位，但當(dāng)PrP變性時(shí)該Mab的反應(yīng)性并未損失，相反卻得到增強(qiáng)。先前有報(bào)道(Tayebi等， 2004)熱變性不足以破壞的多聚體結(jié)構(gòu)。另外，通過(guò)ELISA，Mab對(duì)來(lái)自未感染腦的 I^Pg和非變性腦勻漿物中的總正常和異常的PrP同工型)具有同等的免疫反應(yīng)性。用 SDS和熱變性后，免疫反應(yīng)性同等地增強(qiáng)約2倍。1 處理和變性之后，因?yàn)榈鞍姿庀嬖谳^少的外源性腦蛋白結(jié)合，PrPsc的免疫反應(yīng)性額外提高3倍(數(shù)據(jù)未顯示)。為了提高PrP檢測(cè)的特異性和靈敏度，使用了包括生物素化檢測(cè)抗體的捕獲 ELISA測(cè)定。如所預(yù)期地，對(duì)于每種生物素化的Mab來(lái)說(shuō)，每個(gè)抗體分子與5 6個(gè)生物素結(jié)合。另外，如通過(guò)使用部分純化的經(jīng)Hi處理的進(jìn)行間接ELISA所評(píng)估地，Mab的生物素化不干擾或降低其免疫反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，檢測(cè)抗體的結(jié)合和反應(yīng)性上的任何差異都不是物理生物素化過(guò)程的結(jié)果。使用經(jīng)Hi處理的已用SDS和熱變性的檢測(cè)了多種Mab組合，每種抗體均作為捕獲試劑和作為檢測(cè)試劑來(lái)進(jìn)行評(píng)估(表幻。僅有一種抗體組合，即Mab 11F12作為捕獲試劑和生物素化5D6作為檢測(cè)試劑的組合成功地結(jié)合并鑒定出ft~PSe。無(wú)論是否來(lái)自感染的倉(cāng)鼠、羊瘙癢病綿羊或感染CWD的鹿，結(jié)果都是相同的。然后，使用llF12-5D6Mab組合的捕獲ELISA測(cè)定用于評(píng)價(jià)其在來(lái)自未感染的和感染的倉(cāng)鼠、綿羊和鹿中的全部的和經(jīng)Hi處理的腦勻漿物中檢測(cè)PrP的能力(圖7)。與上述的利用純化的倉(cāng)鼠腦進(jìn)行的間接ELISA測(cè)定的結(jié)果類似，用捕獲ELISA測(cè)定檢測(cè) PrP也取決于表位可用性，并由對(duì)腦裂解物的最初處理而確定。與未感染的腦物質(zhì)相比，來(lái)自感染動(dòng)物的未處理之腦裂解物顯示出信號(hào)強(qiáng)度的略微(1. 5倍)增加，而單獨(dú)使用去污劑或熱變性導(dǎo)致4至7倍的增加。意料之中地，當(dāng)聯(lián)合使用SDS和加熱處理時(shí)，達(dá)到了
檢測(cè)的最高水平(大于10倍)。另外，SDS的濃度增加超過(guò)降低了 Prfe的可檢測(cè)性， 這很可能是因?yàn)榭贵w-抗原結(jié)合的抑制和/或逆轉(zhuǎn)所致。如下文所示地，這種苛刻的變性處理不足以完全破壞PrP的構(gòu)象。先前有報(bào)道稱，羊瘙癢病的傳染性以及可能地構(gòu)象的某些方面可在經(jīng)過(guò)SDS、加熱和SDS-PAGE處理后的純化的I^rPse制備物中維持(Brown等， 1990 ；Rubenstein 等，1994)。通過(guò)捕獲ELISA，可從來(lái)自全部三個(gè)物種的未經(jīng)Hi處理的正常腦勻漿物中檢出 ft~PG。在所有情況下，信號(hào)強(qiáng)度( 0. 25-0. 3)不超過(guò)背景( 0. 12-0. 15)的兩倍。將該材料從孔中洗脫并用Western印跡進(jìn)行檢測(cè)。與上述直接從未經(jīng)Hi處理的腦勻漿物中檢測(cè)I^Pg的結(jié)果不同的是，所洗脫樣品的Western印跡結(jié)果僅檢出IgG輕鏈和重鏈。不可檢測(cè)是由于結(jié)合物質(zhì)的低水平所導(dǎo)致的。1 消化后，ELISA值降至背景水平，這表明被清除了。通過(guò)捕獲ELISA測(cè)定，可在來(lái)自感染的倉(cāng)鼠、羊瘙癢病和CWD綿羊的經(jīng)1 處理的腦勻漿物中很容易地檢測(cè)到I^rPset5令人感興趣的是，利用未經(jīng)1 處理的同時(shí)含有 PrPc和的腦勻漿物進(jìn)行的捕獲ELISA測(cè)定顯示出高于所致信號(hào)強(qiáng)度(通過(guò)未經(jīng) Hi處理的正常組織來(lái)測(cè)定)和所致信號(hào)強(qiáng)度(通過(guò)經(jīng)Hi處理的感染組織來(lái)測(cè)定)之總和的信號(hào)強(qiáng)度(圖7)。增加的信號(hào)強(qiáng)度可能是因?yàn)閟PrP^m存在和結(jié)合所導(dǎo)致。另一種解釋是蛋白質(zhì)(可能是全長(zhǎng)與捕獲Mab的結(jié)合誘導(dǎo)了抗原的空間改變，導(dǎo)致針對(duì)第二 Mab的表位更易接近。這一過(guò)程被稱為“正免疫協(xié)同性”。如圖7所示，用本研究中使用的給定Mab組合，正免疫協(xié)同性的程度是物種依賴性的。與僅從IM3g和組合計(jì)算得出的結(jié)果相比，來(lái)自感染CWD的鹿的與5D6的結(jié)合顯示了高出58%的最大水平，而羊瘙癢病綿羊的顯示了 46%的增加。來(lái)自感染的倉(cāng)鼠的Prfe顯示了最低的、卻依然顯著的40%的增加。圖7中的數(shù)值是根據(jù)每個(gè)物種的六份單獨(dú)樣品的三次讀數(shù)，并表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。抗體誘導(dǎo)的I^rPse空間重排和/或構(gòu)象改變可通過(guò)顯示11F12-5D6所捕獲物質(zhì)具有針對(duì)另一 PrP特異性Mab的改變的表位而加以證實(shí)。利用未經(jīng)Hi處理的、經(jīng)SDS和加熱變性的ft·!^進(jìn)行捕獲測(cè)定。然后，與生物素化的Mab 8E9、鏈霉親和素-堿性磷酸酶和底物一起孵育。沒(méi)有高于背景的信號(hào)表明Mab 8E9的表位不再可獲得或不再可接近。然而， 從微量滴定孔中洗脫11F12-5D6所捕獲的物質(zhì)并然后用Mab 8E9進(jìn)行Wfestern印跡和免疫染色，顯示出強(qiáng)的染色，這表明Mab 8E9表位又再次可獲得(圖8)?？赡苁荢DS-PAGE 樣品緩沖液的處理以及在SDS存在下進(jìn)行電泳改變了 11F12-5D6與的結(jié)合，并逆轉(zhuǎn)了抗體誘導(dǎo)的Prfe改變，從而再一次使8E9結(jié)合成為可能。盡管利用Western印跡和間接ELISA測(cè)定Mab 8E9能夠直接結(jié)合I^Pg和PrPs%但是在捕獲ELISA測(cè)定中用8E9替代5D6卻導(dǎo)致PrP的不可檢出(其表明生物素化的8E9不與抗原結(jié)合)。另外，11F12-5D6抗體對(duì)的PrPe特異性不僅由于這些特異性Mab的存在所致，也由于結(jié)合事件的順序所導(dǎo)致。當(dāng)與11F12-生物素化5D6組合(11F12/生物素5D6) 相比時(shí)，交換所述抗體的順序(即，使用5D6作為捕獲試劑，使用生物素化的11F12作為檢測(cè)試劑(5D6/生物素11F12))導(dǎo)致對(duì)來(lái)自未經(jīng)1 處理的腦裂解物的最小結(jié)合(圖 9)。通過(guò)比較PrP信號(hào)和背景信號(hào)的差異獲得信噪(S/N)比，所述PrP信號(hào)是在使用感染的腦裂解物的捕獲測(cè)定中獲得的，所述背景信號(hào)獲自來(lái)自倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的腦組織的未感染材料(S/N = (S-SO)/(3 σ SO)；其中S =信號(hào)，SO =平均背景信號(hào)，σ SO =背景信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。小于1的S/N比值表明Mab的結(jié)合非常弱，以致所測(cè)量的信號(hào)包含顯著量的噪聲。另一方面，等于1或大于1的S/N表明測(cè)量中的噪聲并不顯著，表明測(cè)量結(jié)果中的大部分功率是特異性Mab結(jié)合的結(jié)果。當(dāng)S/N比值增加時(shí)，置信水平指數(shù)增加。對(duì)于5D6/生物素11F12對(duì)來(lái)說(shuō)，倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的S/N比值分別為約0. 6,0. 1和0. 3，表明Mab的結(jié)合是非特異性的。然而，對(duì)于11F12/生物素5D6組合來(lái)說(shuō)，S/N比值為約19(倉(cāng)鼠)、28(綿羊) 和42(鹿)。這些比值表明高度顯著的特異性Mab結(jié)合特性。圖9中的值基于對(duì)每個(gè)物種的六份單獨(dú)樣品的三次讀數(shù)，所計(jì)算的ELISA結(jié)果以平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。將感染樣品的增加的抗體結(jié)合(根據(jù)OD4tl5)與未感染的對(duì)照相比較。對(duì)感染樣品的信號(hào)功率與對(duì)照樣品的功率(噪聲)計(jì)算得到的信噪比(S/N)以對(duì)數(shù)作圖。3.免疫測(cè)定為制備10%腦勻漿物，在ImM苯甲磺酰氟(PMSF)存在下(如果要用蛋白酶 K(PK)處理勻漿物，則從裂解緩沖液中省去PMSF)，在10倍體積的冰冷裂解緩沖液(IOmM Tris-HClU50mM NaClU % Igepal CA-630 (Nonidet Ρ-40)、0· 5%脫氧膽酸鹽、5mM EDTA, PH 8.0)中勻漿腦組織。以1，OOOXg離心10分鐘后，分裝上清液并儲(chǔ)存于-80°C。用于捕獲測(cè)定的方案和試劑描述于Chang，B.等，“PrP Antibody Binding-Induced Epitope Modulation Evokes Immunocooperativity, " J. Neuroimmunol.205卷，1-2期，94-100頁(yè)(2008)中，其內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。如下文所述，本文中使用的產(chǎn)生鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系已如所示進(jìn)行了保藏。對(duì)于捕獲 ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，在室溫下，用親和純化的11F12捕獲單克隆抗體(Mab) (5 μ g/ml)包被96孔板2 3小時(shí)。在4°C下，用PBS中的3%牛血清白蛋白(Sigma)過(guò)夜封閉所述經(jīng)包被的孔。用PBST將所述孔清洗三次?？乖翘砑恿私K濃度為的PMSF的未經(jīng)1 處理或經(jīng) PK處理(100 μ g/ml PK, 50°C，30分鐘)的腦裂解物。用1 % SDS (終濃度)處理所有樣品， 100°C下加熱10分鐘，并以16，OOOXg離心5分鐘。以10倍系列稀釋上清液，每孔中加入 100 μ 1。在37°C下孵育板1小時(shí)。將孔用PBST清洗三次，加入100 μ 1生物素化的5D6檢測(cè)劑Mab (5 μ g/ml)。60分鐘后，用PBST洗所述孔，并于37°C下加入100 μ 1鏈霉親和素綴合的堿性磷酸酶(1 5，000) 60分鐘。向每孔中添加PNPP (磷酸4-硝基苯二鈉鹽六水合物)(Sigma)底物溶液(100 μ 1),60 分鐘后，在 OD405 用 ELISA 讀數(shù)儀(Bio-Tek，Vermont, NY)測(cè)量產(chǎn)物。對(duì)于激光分析來(lái)說(shuō)，用生物素化的Mab 5D6孵育，然后添加鏈霉親和素綴合的羅丹明紅(1 1000)。37°C下孵育60分鐘后，用PBST清洗孔，并在100°C下用100 μ 1 的IN NaOH處理10分鐘，并隨后在室溫下振搖20分鐘。所述材料被置于ΙΟΟμΙ Microcap (Drummond Scientific,Broomal 1,PA)微毛細(xì)管中，所述微毛細(xì)管隨后被插入特別設(shè)計(jì)的管狀樣品托中用于激光激發(fā)和發(fā)射檢測(cè)。計(jì)算相對(duì)于初始的腦組織稀釋度。如圖例中所述，每個(gè)值(數(shù)據(jù)點(diǎn))表示來(lái)自多個(gè)測(cè)定的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。Western 印跡如上所述，在裂解緩沖液中制備10%的腦勻漿物。低速(2000Xg，10分鐘)離心樣品。將10微升上清液與最終的IX樣品緩沖液混合，在100°C下加入4分鐘，并用12%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并以NBT 和BCIP為底物使用鏈霉親和素綴合的堿性磷酸酶(Kascsak等，1986)或者按照先前所述 (LaFauci等，2006)利用super signal west femto最高靈敏度底物(Pierce)通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(PierCeTM)進(jìn)行免疫染色。對(duì)于SDS-PAGE之前經(jīng)1 消化的樣品，50°C下，將低速離心得到的40 μ 1上清液與100 μ g/ml PK (終濃度)孵育30分鐘， 然后添加1 % PMSF, 1 X SDS-PAGE樣品緩沖液，并在100°C下加熱5分鐘。5.免疫沉淀用PBS 將 MagnaBind 蛋白 G 珠(Pierce)清洗 3 次，用 50 μ 1 PBS 重懸，向 200 μ 1 的10%腦勻漿物中添加總體積1. 2ml PBS中的50 μ g Mab 8E9 (10mg/ml)。室溫下混合1小時(shí)后，利用磁場(chǎng)分離磁珠，用含有0. 2%吐溫20的PBS(PBST)洗3次，并隨后重懸于600 μ 1 PBS中。在100°C下加熱10分鐘并以16，OOOXg微量離心3分鐘后，將上清液用于捕獲 ELISA。對(duì)于血液樣品來(lái)說(shuō)，將111叫11動(dòng)丨11(1蛋白6珠重懸于10(^1 PBS中，然后添加總體積為5ml的PBS中的100 μ g Mab 8E9，并在室溫下混合1小時(shí)。用PBST清洗所述珠，用含有 500 μ 1血漿的5ml PBS重懸，并再孵育1小時(shí)。如上針對(duì)腦的描述來(lái)分離所述珠，用PBST 清洗，加熱，并通過(guò)捕獲ELISA分析經(jīng)微量離心的上清液。6.蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA，protein misfolding cyclic amplification)作為用于腦和血液sPMCA的來(lái)源，對(duì)來(lái)自正常倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的10% (重量/ 體積)腦勻漿物[在含有150mM NaClU. 0% Triton X_100、4mM EDTA和完全蛋白酶抑制劑混合物(complete protease inhibitor cocktail) (Calbiochem)的 PBS 中制備]進(jìn)行離心(1，500 X g，30秒)，并迅速冷凍上清液。將來(lái)自感染的倉(cāng)鼠、羊瘙癢病綿羊和CWD 鹿的腦勻漿物的500 μ 1等份的10倍系列稀釋物(10_8至10_")與來(lái)自對(duì)應(yīng)物種的100 μ 1 的10%正常腦上清液混合，并振搖孵育(37°C下1小時(shí))。然后對(duì)各樣品進(jìn)行超聲08W輸出功率)，然后添加額外的100 μ 1的10%正常腦勻漿物，并孵育(37°C下振搖孵育1小時(shí))。 這被定義為一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。每輪5個(gè)循環(huán)之后，通過(guò)從初始反應(yīng)管中移出500 μ 1的PMCA 反應(yīng)混合物至新的管并添加100 μ 1的10%正常的腦勻漿物來(lái)繼續(xù)進(jìn)行PMCA。與上述針對(duì)腦的PMCA類似，利用500 μ 1等份的未稀釋之羊瘙癢病綿羊或CWD鹿的血漿進(jìn)行PMCA。 PMCA之后，以2，000 Xg離心樣品10分鐘。對(duì)于腦樣品來(lái)說(shuō)，用蛋白酶K(PK) (100 μ g/ml) 消化200 μ 1上清液(500C, 30分鐘)，然后添加1 %蛋白酶抑制劑混合物和1 % SDS0 100°C 下加熱樣品10分鐘，用Western印跡法(Chang等2009)分析10 μ 1等分試樣。對(duì)于血液來(lái)說(shuō)，在PMCA之后，不處理或者用Hi處理500 μ 1經(jīng)擴(kuò)增的血液樣品，然后在Wfestern印跡或SOFIA分析之前，用Mab 8E9進(jìn)行免疫沉淀。對(duì)于全部PMCA樣品來(lái)說(shuō)，相對(duì)于初始的未稀釋腦或血液樣品來(lái)表示稀釋度。對(duì)未進(jìn)行PMCA的血液樣品進(jìn)行免疫沉淀，并如上所述進(jìn)行類似處理(但不進(jìn)行超聲處理和37 °C孵育循環(huán))。7. SOFIA用捕獲Mab 11F12 (100 μ 1，5 μ g/孔)在室溫下包被96孔高結(jié)合板(Costar，NY) 3 小時(shí)，并在4°C用TBS中的酪蛋白過(guò)夜封閉。將蛋白G磁珠和Mab 8E9混合60分鐘，用PBST 清洗3次，沉淀被重懸于800 μ IPBS中。離心血液樣品(800 X g，5分鐘)，并將800 μ 1上清液與SDS (1 %終濃度)混合，在100°C下加熱10分鐘，與G珠-Mab 8E9混合60分鐘，并用 PBST清洗3次。清洗過(guò)的最終沉淀用800 μ 1 PBS重懸，并加熱10分鐘。以16，OOOXg離心 5分鐘后，向每孔添加100 μ 1上清液。室溫下孵育(1小時(shí))并用PBST清洗，加入100 μ 1生物素化的Mab 5D6 O μ g/孔)1小時(shí)，然后進(jìn)行清洗并與100 μ 1鏈霉親和素-羅丹明紅-X 綴合物(Invitrogen) 一起孵育1小時(shí)。用PBST清洗4次后，添加100 μ 1的IN NaOH,并加熱該板(100°C，10分鐘)，室溫下混合30分鐘，并用等摩爾量的HCl中和。對(duì)90 μ 1等分試樣進(jìn)行分析。8.儀器所述裝置是圍繞常用的一次性100微升微毛細(xì)管(Drummond Scientific Co., Broomal 1,PA)而設(shè)計(jì)的樣品托。通過(guò)沿毛細(xì)管軸向會(huì)聚來(lái)自固態(tài)倍頻Nd:YAG激光器(Beam of Light Tech. , Clackamas, OR)的暫短調(diào)制光來(lái)激發(fā)樣品，功率一般為30mW，連續(xù)波的波長(zhǎng)為532nm，該波長(zhǎng)與羅丹明的吸收峰很好地匹配。光纖組件被設(shè)計(jì)成包含4個(gè)線性陣列， 其跨越毛細(xì)管長(zhǎng)度的約1/3，且彼此之間圍繞毛細(xì)管的周長(zhǎng)呈90度定位。由于光纖的大數(shù)值孔徑(0.22，或接受角為 23度)，光纖的這種定位導(dǎo)致對(duì)樣品視野的完全覆蓋。4個(gè)線性陣列收集的光被捆綁在一起(即，捆束或合并)，并會(huì)聚進(jìn)入傳遞光學(xué)系統(tǒng)，所述傳遞光學(xué)系統(tǒng)中安置了全息陷波濾波器(holographic notch filter) (Kaiser Optical Systems Inc. Ann Arbor,MI)和帶通濾波器(Omega Optical，he. Brattleboro，VT)。這些分別用于消除來(lái)自激發(fā)光源的散射光和對(duì)報(bào)告染料的熒光檢測(cè)進(jìn)行頻帶限制(band-limit)。光隨后被會(huì)聚回單個(gè)、多模式的400微米光纖(Thorlabs ，Inc. Newton, NJ)并偶聯(lián)至單個(gè)低噪聲光電二極管檢測(cè)器(United Detector Technology，Hawthorne，CA)(其被安置于直接位于檢測(cè)電子器件的前置放大器上的BNC連接器上)。信號(hào)檢測(cè)采用相靈敏的或“鎖定”的檢測(cè)方案。用光學(xué)斬波器(Thorlabs he.)調(diào)制激發(fā)源，以產(chǎn)生針對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的參考頻率。所述二極管檢測(cè)器被安置在跨導(dǎo)前置放大器(Manford Research Systems, Inc. Sunnyvale, CA)的輸入端，以降低總的線阻抗并消除與這些低水平信號(hào)相匹配的阻抗的難題。隨后用鎖定放大器(Stanford Research Systems)檢測(cè)所述信號(hào)，通過(guò) LabView (National Instruments Inc.，Austin, TX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。該程序由電子條形圖表組成，其支持鎖定放大器的電壓讀數(shù)，所述讀數(shù)周期性地將測(cè)量值的歷史數(shù)據(jù)呈現(xiàn)給操作者，并以ASCII文件存儲(chǔ)帶有時(shí)間印記的數(shù)值。應(yīng)當(dāng)選定鎖定放大器的時(shí)間常數(shù)，以提供十分之幾赫茲的頻帶寬。為進(jìn)行這些測(cè)量，選定了 3秒的時(shí)間常數(shù)。在獲得穩(wěn)定讀數(shù)的過(guò)程中(在該情形下為3至30秒)，所述鎖定需要多個(gè)時(shí)間常數(shù)。加載新樣品之后，在信號(hào)穩(wěn)定后(20至30秒) 記錄測(cè)量值。對(duì)激發(fā)源的調(diào)制和鎖定檢測(cè)器的參考頻率為753Hz，選擇該頻率用以使環(huán)境噪聲最小化。除了以線頻率過(guò)濾，鎖定放大器還使用兩倍線頻率過(guò)濾，以調(diào)制頻率帶通過(guò)濾前置放大器信號(hào)。對(duì)于所述樣品來(lái)說(shuō)，選定InA/V的前置放大器靈敏度，得到IM Ohm的輸入阻抗。在進(jìn)行測(cè)量時(shí)，保留一系列啟動(dòng)操作，包括所有電子器件(激光器、鎖定放大器、前置放大器)預(yù)熱15分鐘，目測(cè)檢查暗信號(hào)水平以確保系統(tǒng)正確地電接地，測(cè)量激光器的功率以檢查穩(wěn)定性和輸出水平，目測(cè)檢查激光器排列。使用裝有經(jīng)蒸餾的去離子水的毛細(xì)管來(lái)檢查基線信號(hào)的對(duì)照測(cè)量值。通過(guò)測(cè)量濃度遞減的羅丹明紅的熒光信號(hào)發(fā)射來(lái)測(cè)試儀器的靈敏度極限。濃度為 0.01阿克(ag)[20阿摩爾(am)]時(shí)，羅丹明紅是可檢測(cè)的(圖10)。通過(guò)使用來(lái)自鹿、倉(cāng)鼠、小鼠和綿羊的全長(zhǎng)重組ft~p(rprp)進(jìn)行測(cè)定來(lái)進(jìn)行特異性和靈敏度的測(cè)定。無(wú)論測(cè)試什么物種，可檢測(cè)的極限> IOag rPrP0再看圖10，數(shù)據(jù)是利用圖1中的儀器獲取的，其中向100 μ 1微毛細(xì)管中加入羅丹明紅(■)的水稀釋物，并記錄包繞光纖熒光信號(hào)發(fā)射?；谥挥兴畷r(shí)的熒光信號(hào)發(fā)射來(lái)計(jì)算相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。在來(lái)自小鼠(*)、倉(cāng)鼠( )、綿羊(▼) 和鹿(·)的情形中，用1 % PrP-7-腦勻漿物稀釋rfrP，并進(jìn)行SOFIA?；趩为?dú)使用rPrP 稀釋物(1% PrP+腦勻漿物)進(jìn)行的類似測(cè)定來(lái)計(jì)算相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度。針對(duì)每個(gè)rPrP 濃度，在InA/V的前置放大設(shè)置下，一式三份進(jìn)行測(cè)定，以信號(hào)強(qiáng)度(與對(duì)照相比的增加百分比)的平均值士SD對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。檢測(cè)來(lái)自正常和感染的倉(cāng)鼠、鹿和綿羊的腦勻漿物是否可用于本發(fā)明的方法。 10%腦勻漿物的Wfestern印跡證實(shí)初始材料中存在I^rPset5在I3K處理之前的10%腦勻漿物中清晰地顯示典型的PrP條帶模式，在1 消化后，條帶向較低分子大小的I^rPse特征性地移動(dòng)，伴有I^rPe從正常倉(cāng)鼠腦物質(zhì)中清除，作為完全蛋白水解消化的確證。來(lái)自臨床動(dòng)物的經(jīng)去污劑提取的腦勻漿物的系列稀釋物已證明Western印跡法對(duì)I^rPse的檢出限為約10_3 10_4，而用捕獲ELISA檢測(cè)ft·產(chǎn)在另外進(jìn)行IO1 IO2倍稀釋的情況下仍是靈敏的(數(shù)據(jù)未顯示)。相比之下，使用同樣的Mab和腦勻漿物，本文中報(bào)道的測(cè)定的靈敏度比Western印跡法和捕獲ELISA高出至少5個(gè)數(shù)量級(jí)。使用本發(fā)明的方法，使用信號(hào)與基線的比值(S/B) 來(lái)評(píng)估腦勻漿物中I^rP的可檢測(cè)性。已確定，大于1. 1的S/B比值表明存在ft~P。通過(guò)本發(fā)明的方法測(cè)定來(lái)自倉(cāng)鼠、綿羊和鹿的正常和感染的腦組織的、經(jīng)Hi處理的和未處理的腦勻漿物的系列稀釋物(圖11)。數(shù)值表示為以來(lái)自樣品的羅丹明紅熒光發(fā)射信號(hào)(S)與來(lái)自只有稀釋物腦勻漿物或勻漿緩沖液)熒光發(fā)射的背景基線信號(hào)(B)的比值。 數(shù)據(jù)表示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 SD，每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)都在InA/V的前置放大器設(shè)置下針對(duì)每個(gè)腦勻漿稀釋物一式三份進(jìn)行。如預(yù)期地，經(jīng)I3K處理后，無(wú)論測(cè)試濃度如何，來(lái)自正常腦組織的所有樣品的S/B比值均低于1. 1，表明不存在ft~Pe。如總的信號(hào)輸出或S/B比值高于1. 1所證明地，來(lái)自感染倉(cāng)鼠的經(jīng)Hi處理的腦勻漿物的10倍系列稀釋物的蛋白酶抗性押！^在10_"稀釋時(shí)是可檢出的，而來(lái)自綿羊和鹿的可檢測(cè)稀釋度為10_1(1。此外，對(duì)于倉(cāng)鼠以及綿羊和鹿來(lái)說(shuō)，來(lái)自I3K處理的腦勻漿物的最大檢測(cè)范圍為10_7 10_8稀釋。在10倍系列稀釋未經(jīng)1 處理的正常腦勻漿物的情形中，對(duì)于倉(cāng)鼠來(lái)說(shuō)，用SOFIA 可檢測(cè)I^Pg的稀釋度為10—11，對(duì)于鹿和綿羊來(lái)說(shuō)則為10,(峰值檢測(cè)10_6 10_7稀釋)，而后S/B比值都降至1. 1以下。來(lái)自感染的倉(cāng)鼠、感染羊瘙癢病的綿羊和感染CWD的鹿的未經(jīng)1 處理的腦組織的S/B比值也表明PrP的存在情況。來(lái)自感染組織的系列稀釋腦勻漿物都顯示對(duì)于綿羊和鹿來(lái)說(shuō)10_"稀釋(峰值檢測(cè)為10_7)以及對(duì)于倉(cāng)鼠來(lái)說(shuō)10_13稀釋(峰值檢測(cè)為10_8)時(shí)S/B值大于1. 1。這些結(jié)果表明，來(lái)自未經(jīng)蛋白酶處理的感染腦組織的PrP可被稀釋至超過(guò)I^Pg可檢測(cè)性水平來(lái)稀釋，但仍然維持對(duì)總PrKe的檢測(cè)能力。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，在臨床疾病期的感染腦中，與I^Pg相比，總押！^至少多出llog。支持這一點(diǎn)的是，以前已報(bào)道過(guò)，在羊瘙癢病感染的腦中有的積累并達(dá)到高于I^PgIO倍的濃度。使用以前發(fā)表過(guò)的針對(duì)感染261的倉(cāng)鼠的數(shù)據(jù)(R. Atarashi等〃 Ultrasensitive detection of scrapie prion protein using seeded conversion of recombinant prion protein, “ Nature Meth. vol. 4 Q007) 645-650頁(yè))，針對(duì)來(lái)自未經(jīng)PK處理的倉(cāng)鼠腦中的 PrPsc, SOFIA的檢出限為約10ag。從來(lái)自倉(cāng)鼠數(shù)據(jù)的直接推測(cè)提示，可從綿羊和鹿的腦物質(zhì)中檢出1飛克ft~PSe。然而，假定抗體反應(yīng)性相同，對(duì)稀釋樣品的Western印跡表明，在克當(dāng)量基礎(chǔ)上，與綿羊和鹿的腦物質(zhì)相比，在倉(cāng)鼠腦中有至少多出10 100倍的(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明在前兩種物種中蛋白質(zhì)的檢出可以在10 IOOag或更低的范圍內(nèi)。9.血液中PrP^的檢測(cè)使用Mab 8E9的免疫沉淀作為連接PMCA和SOFIA的橋梁，所以，檢測(cè)該Mab在PrP 免疫沉淀中的應(yīng)用。對(duì)來(lái)自未感染的和感染的倉(cāng)鼠(未感染感染(％ )-100 0、 90 10,70 30,50 50)的多種比值的10 %腦勻漿物混合物進(jìn)行免疫沉淀，并通過(guò) Western印跡分析(圖12)。以不同比例組合10%正常腦勻漿物(NBH，normal brain homogenate)和感染^!BK的倉(cāng)鼠腦勻漿物063K BH)(泳道1、5_只有NBH ；泳道2、6-90 μ L NBH 禾口 10 μ L 263Κ BH ；泳道 3、7_70 μ L ΝΒΗ+30 μ L263 BH ；泳道 4、8_50 μ L ΝΒΗ+50 μ L 263Κ BH)，并用Mab 8Ε9進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀的樣品為未處理的(泳道1_4)或在用Mab 11F12進(jìn)行Wfestern印跡和免疫染色之前用Hi處理的(泳道5_8)。在未經(jīng)Hi消化時(shí)，無(wú)論腦勻漿物比值如何，所有樣品都表現(xiàn)出類似的免疫染色強(qiáng)度(泳道1-4)。當(dāng)與僅含有經(jīng)1 處理的感染263的腦勻漿物(未顯示數(shù)據(jù))直接相比時(shí)，經(jīng)Hi處理的免疫沉淀(泳道5-8) 的Wfestern印跡表現(xiàn)出類似的免疫染色。這些結(jié)果表明，Mab 8E9免疫沉淀和PrPs% 且I^Pg的存在不抑制或降低IM3se免疫沉淀最大值。為了定量和定性評(píng)估所分離的IM3，用 Mab 8E9免疫沉淀物進(jìn)行捕獲ELISA，所述免疫沉淀物來(lái)自正常和感染沈3的倉(cāng)鼠的I3K未處理的腦勻漿物的組合(圖13)。所述捕獲ELISA使用與SOFIA相同的Mab對(duì)(11F12為捕獲Mab，5D6為檢測(cè)劑Mab)。正常腦感染腦的組合的Mab 8E9免疫沉淀之后，捕獲ELISA 引起ELISA信號(hào)強(qiáng)度增加，這是因?yàn)槠鹗蓟旌衔镏懈腥灸X物質(zhì)水平增加。因?yàn)樗瞿X物質(zhì)未經(jīng)蛋白酶消化，所以每種混合物包含單獨(dú)的I^Pg或者I^Pg和I^rPse之混合物，如Wfestern
19印跡所證實(shí)的那樣(圖12)。然而，用捕獲ELISA進(jìn)行的免疫沉淀分析表明增加的信號(hào)強(qiáng)度依賴于IM3se而非的存在。這指出了這些特異性Mab的用途和用于檢測(cè)的方法。 盡管免疫沉淀-捕獲ELISA模式可以很容易地檢測(cè)來(lái)自感染的倉(cāng)鼠、羊瘙癢病綿羊和 CffD鹿的腦來(lái)源的PrPse,但無(wú)法在來(lái)自臨床動(dòng)物的血液中檢出ft·產(chǎn)。以前已經(jīng)報(bào)道了在連續(xù)PMCA(sPMCA)之后在來(lái)自感染的倉(cāng)鼠血液和羊瘙癢病綿羊樣品中檢測(cè)的能力。然而，Prfe檢測(cè)所需的大數(shù)目的PMCA循環(huán)數(shù)使得該技術(shù)在診斷測(cè)定中并不實(shí)用。在血液中檢測(cè)PrPk的問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)聯(lián)合sPMCA、隨后的免疫沉淀經(jīng)擴(kuò)增的靶標(biāo)以及用靈敏的SOFIA測(cè)定而得以解決(Chang等，2009)。使用倉(cāng)鼠腦評(píng)價(jià)并驗(yàn)證了 sPMCA(圖14)。對(duì)倉(cāng)鼠腦勻漿物的稀釋物進(jìn)行7、14和40個(gè)循環(huán)的PMCA(泳道 7-10)，同時(shí)，以類似的方式處理同樣的樣品，只是不超聲處理(泳道3-6)。用Mab 11F12對(duì) 10 μ L等份的每種樣品進(jìn)行Western印跡分析。對(duì)照樣品是感染沈；31(的倉(cāng)鼠腦勻漿物的 10_2稀釋物，在進(jìn)行Western印跡分析之前不用(泳道1)和用(泳道2) 消化。使用正常倉(cāng)鼠腦勻漿物作為I^Pg來(lái)源，對(duì)10_8 10—11稀釋(相對(duì)于初始的腦組織)的10%感染 263K的倉(cāng)鼠腦勻漿物進(jìn)行sPMCA。7個(gè)循環(huán)的sPMCA之后，在所有的稀釋物中都無(wú)法檢測(cè)到 M^，但完成14個(gè)循環(huán)后，在10_8稀釋的樣品中可以檢出(圖14，泳道10)。40個(gè)循環(huán)的 sPMCA(SPMCA40)之后，在受試的感染沈；31(的腦勻漿物的所有稀釋物中均可以檢出Hi抗性的(圖14，泳道7-10)。類似地，平行處理稀釋的倉(cāng)鼠腦勻漿物(只是省去PMCA超聲步驟)，未顯示任何PrP^擴(kuò)增，正像不存在Hi抗性的免疫染色所證實(shí)地(圖3，泳道 3-6)。比較不進(jìn)行PMCA(10_6，相對(duì)于初始腦組織)和sPMCA 檢測(cè)之后的的檢出限， 并考慮所分析的樣品大小，估計(jì)PMCA導(dǎo)致了 IO4倍的擴(kuò)增。使用來(lái)自臨床動(dòng)物的稀釋的綿羊腦或CWD腦勻漿物(以及相應(yīng)物種的未感染的腦勻漿物作為I^rPe的來(lái)源)進(jìn)行類似的PMCA實(shí)驗(yàn)表明，采用28個(gè)循環(huán)的PMCA，在感染腦的 10_8稀釋下，使用Western印跡對(duì)擴(kuò)增的ft·產(chǎn)有了最初的檢出。與倉(cāng)鼠腦相比，對(duì)于來(lái)自綿羊和鹿腦的的最初檢出需要增加循環(huán)數(shù)是由初始腦組織中起始的量較少所導(dǎo)致的。如預(yù)期地，SPMCA4tl結(jié)束時(shí)，增加的免疫染色強(qiáng)度和1 抗性之押！^的檢出限證明了來(lái)自羊瘙癢病綿羊和CWD鹿腦勻漿物中的ft·!^得以擴(kuò)增。與感染的倉(cāng)鼠腦相比，盡管綿羊和鹿腦組織含有較少的PrPse,但相對(duì)于初始的I^rPse水平，擴(kuò)增水平仍約為41og (未顯示)。對(duì)來(lái)自羊瘙癢病綿羊和CWD鹿的血漿進(jìn)行sPMCA4Q。綿羊的樣品由三組(表3，組 1-3)羊瘙癢病綿羊組成，在采血時(shí)，基于是否存在臨床癥狀和第三眼瞼淋巴濾泡的免疫組織化學(xué)(IHC)(圖15)進(jìn)行區(qū)分。在采血時(shí)組3中的所有動(dòng)物均未表現(xiàn)出臨床癥狀，其最終發(fā)展為臨床疾病。將未感染的綿羊組(表3，組4)進(jìn)行安置，并維持在隔離的無(wú)羊瘙癢病區(qū)域。CWD樣品由多只實(shí)驗(yàn)性感染的(口服途徑)臨床前和臨床白尾鹿(表4)組成。 對(duì)所有綿羊和CWD樣品分別進(jìn)行SPMCA4tl，并在1 消化后用Western印跡法分析。對(duì)血漿進(jìn)行SPMCA4tl后，在用Mab 8E9免疫沉淀濃縮PrP之前或之后，對(duì)經(jīng)I3K處理的PMCA產(chǎn)物的Western印跡未顯示任何ft~PSe。添加多聚腺苷酸[poly (A)](已報(bào)道其促進(jìn)來(lái)自綿羊血液之低水平的快速檢測(cè)(Thorne和Terry，2008))并未將擴(kuò)增效率提高至能夠檢測(cè)經(jīng) SPMCA40的來(lái)自羊瘙癢病綿羊或CWD鹿血漿中IM3se的程度。sPMCA4(1后來(lái)自綿羊血液的I^rPse 的不能檢出與所用的綿羊基因型無(wú)關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。也即，Prfe來(lái)源和正常綿羊腦之間綿羊基因型的配對(duì)不足以增加通過(guò)免疫印跡對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出。因?yàn)閃estern印跡未提供任何信息，因此不清楚是否起初就存在于來(lái)自CWD和包含羊瘙癢病的三組綿羊的任何動(dòng)物的血液中，或者是否PMCA能成功地在僅40個(gè)循環(huán)后檢出擴(kuò)增的PrPse,而Wfestern 印跡的靈敏度則不足以檢出。已報(bào)道，由于明顯自發(fā)產(chǎn)生的PrPs%對(duì)綿羊血液進(jìn)行PMCA可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果(Thorne和Terry，2008)。因此，使用包繞光纖免疫測(cè)定(SOFIA) (Chang 等，2009)檢測(cè)未處理的和經(jīng)Hi處理的、經(jīng)Mab 8E9免疫沉淀的sPMCA4(1產(chǎn)物中的PrPs%而非繼續(xù)增加PMCA循環(huán)數(shù)。我們的研究證明，在不進(jìn)行sPMCA 時(shí)，用SOFIA從羊瘙癢病綿羊和未感染綿羊之血漿樣品中得到的讀數(shù)是近似的，且接近基線水平(圖16)。在SPMCA4tl 之前，單個(gè)樣品的SOFIA信號(hào)強(qiáng)度(樣品/背景)范圍為0. 5 0. 9 (組1)、0. 7 1. 2 (組 2)、0. 8 1.3(組3)和0.6 1. 1(組4)。因?yàn)橐郧皩?duì)SOFIA動(dòng)態(tài)范圍的研究(Chang等， 2009)證明Hi未處理的臨床綿羊腦ft·產(chǎn)在飛摩爾范圍內(nèi)是可檢測(cè)的(Chang等，2009)，因此在羊瘙癢病綿羊血漿樣品中的I^rPse水平很可能低于可檢出范圍。為了使I^rPse水平擴(kuò)增至SOFIA的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，進(jìn)行了 SPMCA40以及隨后的Mab 8E9免疫沉淀。在經(jīng)免疫沉淀的 SPMCA40產(chǎn)物中可以用SOFIA檢出未經(jīng)I3K處理的I^rPse (圖16)。sPMCA 之后，對(duì)照組(組 4)的單個(gè)樣品的信號(hào)強(qiáng)度的范圍(0. 7 1. 2)與PMCA之前的樣品沒(méi)有顯著性差別。然而， 無(wú)論其臨床表現(xiàn)如何，所有三個(gè)羊瘙癢病綿羊組的SOFIA信號(hào)強(qiáng)度范圍都彼此相近(組1 4. 3-4. 8，組2 :4.4-5. 1，組3 :4. 8-5. 3)，并顯著大于PMCA之前值(pre-PMCA)以及未感染樣品(組4)。當(dāng)考慮到疾病的證實(shí)依賴于被羊瘙癢病感染的綿羊、但不依賴于臨床癥狀和神經(jīng)病變的存在時(shí)(因?yàn)樗腥M受試綿羊均存在I^rPse)(圖16)，就會(huì)理解本方法的價(jià)值。 PrPsc擴(kuò)增也與基因型相容性無(wú)關(guān)，因?yàn)楫?dāng)使用來(lái)自ARQ/ARQ或ARQ/VRQ綿羊的正常腦勻漿物時(shí)，與任何感染的綿羊血漿樣品的擴(kuò)增無(wú)差異。另外，沒(méi)有必要使用Hi消化來(lái)區(qū)分I^Pg 和因?yàn)闊o(wú)論在免疫沉淀和免疫測(cè)定分析之前SPMCA4tl產(chǎn)物為未處理的(圖16)或經(jīng) Hi處理的(未顯示)，SOFIA的結(jié)果都是相同的。根據(jù)與綿羊羊瘙癢病相關(guān)的臨床癥狀的出現(xiàn)和免疫組織化學(xué)(IHC)，通過(guò)將血漿樣品分為3組得到了圖16中的數(shù)據(jù)。對(duì)每種血漿樣品進(jìn)行PMCA4ci( ■)或不進(jìn)行PMCA孵育(□)。每種樣品或是未處理的或是經(jīng)Hi消化的， 然后進(jìn)行Mab 8E9免疫沉淀，并用SOFIA分析ft~PSe。一式三份地地測(cè)定來(lái)自3組中每一個(gè)的血漿樣品，且綜合每個(gè)組中所有樣品的數(shù)據(jù)，并表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。在獲自多個(gè)臨床前和臨床鹿CWD病例的血漿中進(jìn)行了類似的研究(圖17)。類似于上述綿羊血漿樣品，在不進(jìn)行SPMCA4tl時(shí)，對(duì)CWD樣品進(jìn)行SOFIA獲得的信號(hào)與未感染對(duì)照的沒(méi)有差異，其本身接近背景。此外，1 抗性的不能被SPMCA4tl后的捕獲ELISA或 Western印跡所檢出。然而，在sPMCA40產(chǎn)物進(jìn)行免疫沉淀之后，用SOFIA可從全部臨床前和臨床的CWD血液中檢出ft·產(chǎn)(圖17)。此外，與羊瘙癢病的綿羊樣品類似，SOFIA值有賴于從感染動(dòng)物來(lái)源的樣品，但用SOFIA對(duì)疾病的驗(yàn)證是不依賴于患病動(dòng)物的臨床狀態(tài)的。 圖17中的數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)來(lái)自五個(gè)CWD病例的每種血漿樣品進(jìn)行SPMCA4tl ( ■)或維持不進(jìn)行 PMCA(D)而得到的。所有樣品或是未消化的或是經(jīng)Hi處理的，隨后進(jìn)行Mab 8E9免疫沉淀和SOFIA。顯示Hi未處理樣品的結(jié)果，其值表示為一式三份測(cè)定的平均值士SD。在4個(gè)未感染鹿的血漿樣品的情形中，一式三份地分析4個(gè)樣品中的每一個(gè)，4個(gè)樣品綜合的結(jié)果表示為平均值士SD。在本發(fā)明的全部實(shí)施方案中，除非另外特別說(shuō)明，所有百分比均為占總組成重量的百分比。除非另外特別說(shuō)明，所有比值均為重量比值。所有范圍是開(kāi)放式的并且可進(jìn)行組合。有效位的數(shù)目不表示對(duì)所示數(shù)量的限制，也不表示測(cè)量的精確度。除非另外特別指明， 所有數(shù)字表示的量都理解為被詞語(yǔ)“約”所修飾。發(fā)明詳述中引用的所有文獻(xiàn)的相關(guān)部分均通過(guò)引用并入本文；對(duì)任何文獻(xiàn)的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)其為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。如果本文中術(shù)語(yǔ)的含義或定義在某種程度上與通過(guò)引用并入本文的文獻(xiàn)中的同一術(shù)語(yǔ)的含義或定義相沖突時(shí)，以本文中的含義或定義為準(zhǔn)。盡管已舉例說(shuō)明并描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是很明顯地，對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來(lái)說(shuō)，可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下進(jìn)行多種其它改動(dòng)和修改。因此， 其旨在囊括所附權(quán)利要求覆蓋的本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些改動(dòng)和修改。參考文獻(xiàn)列表Atarashi, R. et al. 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1.在懷疑含有PrKe的生物樣品中檢測(cè)PrP^是否存在的方法，所述方法包括；a.通過(guò)將ft·!^從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的 PrPsc ；b.用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPse,以得到經(jīng)標(biāo)記的PrPk；和c.使用能夠檢測(cè)阿摩爾量之經(jīng)標(biāo)記PrKe的儀器來(lái)檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記的PrPSe。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述ft·!^是未經(jīng)消化的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中濃縮所述和檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記之間的持續(xù)時(shí)間為 48小時(shí)或更短。
4.權(quán)利要求1的方法，其中濃縮所述和檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記之間的持續(xù)時(shí)間為 M小時(shí)或更短。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包括腦組織、神經(jīng)組織、血液、尿、淋巴液、腦脊液， 或其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品包含約0.1阿摩爾至約200阿摩爾的經(jīng)標(biāo)記ft~PSc;。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品不進(jìn)行種子聚合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述分子標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物、磷光標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物，或其組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述分子標(biāo)記物是熒光標(biāo)記的抗PrP抗體。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述分子標(biāo)記物還包含生物素化的抗PrP抗體。
11.權(quán)利要求1的方法，其中濃縮所述ft·!^的步驟采用抗體、免疫沉淀、磁珠，或其組合。
12.在懷疑含有I^rPse的生物樣品中檢測(cè)PrP^是否存在的方法，所述方法包括a.通過(guò)sPMCA擴(kuò)增所述樣品中存在的PrKe；b.通過(guò)將ft·!^從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的 PrPsc ；c.用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPse,以得到經(jīng)標(biāo)記的PrPk；和d.使用能夠檢測(cè)阿摩爾量之經(jīng)標(biāo)記PrKe的儀器來(lái)檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記的PrPSe。
13.權(quán)利要求12的方法，其中濃縮所述ft·!^的步驟采用分子抗體、免疫沉淀、磁珠，或其組合。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述ft·!^是未經(jīng)消化的。
15.權(quán)利要求12的方法，其中擴(kuò)增IM3se和檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記ft·嚴(yán)之間的持續(xù)時(shí)間為48 小時(shí)或更短。
16.權(quán)利要求12的方法，其中擴(kuò)增ft·產(chǎn)和檢測(cè)所述經(jīng)標(biāo)記ft·產(chǎn)之間的持續(xù)時(shí)間為M 小時(shí)或更短。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品包括腦組織、神經(jīng)組織、血液、尿、淋巴液、腦脊液，或其組合。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品包含約0.1阿摩爾至約200阿摩爾的經(jīng)標(biāo)記 PrPsc0
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述分子標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物、磷光標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物，或其組合。
20.權(quán)利要求12的方法，其中濃縮所述ft·!^的步驟通過(guò)單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分而發(fā)生，其中所述抗體具有與雜交瘤08-1/8E9所產(chǎn)生的抗體基本上一致的重鏈和輕鏈氨基酸序列。
21.權(quán)利要求12的方法，其中標(biāo)記所述的步驟通過(guò)如下而發(fā)生a.單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體具有與雜交瘤08-1/11F12所產(chǎn)生的抗體基本上一致的重鏈和輕鏈氨基酸序列；b.用生物素化的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分標(biāo)記所述捕獲的PrPs%其中所述抗體具有與雜交瘤08-1/5D6所產(chǎn)生的抗體基本上一致的重鏈和輕鏈氨基酸序列。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析儀器公開(kāi)于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/211，264中。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述分析儀器公開(kāi)于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)11/634，546中。
24.權(quán)利要求12的方法，其中所述分析儀器公開(kāi)于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/211，264中。
25.權(quán)利要求12的方法，其中所述分析儀器公開(kāi)于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)11/634，546中。
26.單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合并增強(qiáng)第二單克隆抗體與PrP^的結(jié)
27.單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其在第二單克隆抗體與ft·!^結(jié)合之后以增強(qiáng)的方式與正常結(jié)合。
28.單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其與Pri^e正常結(jié)合，其在第二單克隆抗體與I^rPse 結(jié)合之后不能結(jié)合。
29.用于檢測(cè)的試劑盒，其包含；a.第一單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合并增強(qiáng)第二單克隆抗體對(duì)的結(jié)合；和b.第二單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其在第一單克隆抗體與ft·!^結(jié)合之后以增強(qiáng)的方式與結(jié)合。
30.權(quán)利要求四的試劑盒，其中所述第一抗體具有與雜交瘤08-1/11F12所產(chǎn)生的抗體基本上一致的重鏈和輕鏈氨基酸序列，并且所述第二抗體具有與雜交瘤08-1/5D6所產(chǎn)生的抗體基本上一致的重鏈和輕鏈氨基酸序列。
31.權(quán)利要求四的用于檢測(cè)IM3se的試劑盒，其還包含； 能夠免疫沉淀PrP^的第三單克隆抗體。
32.權(quán)利要求四的用于檢測(cè)IM3se的試劑盒，其還包含；與能夠檢測(cè)阿摩爾量之經(jīng)標(biāo)記PrP^的儀器聯(lián)用的至少一個(gè)瓶、皿或毛細(xì)管。
全文摘要
在懷疑含有PrPSc的生物樣品中檢測(cè)PrPSc之存在與否的方法，所述方法包括如下步驟通過(guò)將PrPSc從樣品基質(zhì)中盡可能地分離出來(lái)以濃縮可能存在于所述樣品中的PrPSc；用至少一個(gè)分子標(biāo)記物標(biāo)記濃縮的PrPSc，以得到經(jīng)標(biāo)記的PrPSc；利用能夠檢測(cè)阿摩爾量之經(jīng)標(biāo)記PrPSc的儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的PrPSc，并且其中濃縮PrPSc與分析經(jīng)標(biāo)記PrPSc之間的持續(xù)時(shí)間為約48小時(shí)或更短。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102365096SQ201080013755
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者佩里·克萊頓·格雷, 理查德·魯本斯坦, 馬丁·S·皮爾奇 申請(qǐng)人:洛斯阿拉莫斯國(guó)家安全有限責(zé)任公司, 紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)