專利名稱：一種點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)與熒光染料探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥靶點(diǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種炔烴標(biāo)記技術(shù)通過點(diǎn)擊化學(xué)技術(shù)結(jié)合蛋白芯片技術(shù)尋找小分 子化學(xué)藥作用靶點(diǎn)的方法，屬于材料、化學(xué)合成、化工、藥學(xué)和生物的交叉領(lǐng)域，具體涉及一 種通過生物納米技術(shù)和蛋白芯片技術(shù)相結(jié)合尋找小分子化學(xué)藥作用靶點(diǎn)的方法，尤其是通 過炔烴標(biāo)記粒子在蛋白芯片上尋找小分子化學(xué)藥作用的靶蛋白的方法。
背景技術(shù)：
多年來人們研究表明，大多數(shù)藥物是通過干涉細(xì)胞中的酶或受體的功能來實(shí)現(xiàn)其 要藥效的，酶或受體都是蛋白質(zhì)，在它們的表面有很多可被小分子占住的空位，當(dāng)小分子如 同鎖的鑰匙一樣結(jié)合在酶或受體上的空位時(shí)，這些小分子即稱配體。當(dāng)一種藥物與配體具 有相同或相似的形狀，則這種藥物便可以結(jié)合到酶或受體上，結(jié)合藥物酶或受體將向細(xì)胞 發(fā)送一個(gè)信號，使細(xì)胞發(fā)生一系列的生理反應(yīng)。結(jié)合藥物的酶或受體即為藥物作用的直接 靶點(diǎn)(靶蛋白)。當(dāng)藥物能結(jié)合的靶點(diǎn)是多個(gè)時(shí)，這種藥物可能就有副作用。蛋白芯片具有高通量分析的特點(diǎn)，在揭示藥物作用的分子機(jī)理方面可顯示巨大的 優(yōu)越性。蛋白質(zhì)芯片是將蛋白質(zhì)高密度地固定在芯片上，這些蛋白質(zhì)可高度特異性地與靶 分子結(jié)合。當(dāng)藥物直接與芯片上的蛋白質(zhì)發(fā)生作用，即可達(dá)到高通量而且快速地分析藥物 作用的靶點(diǎn)，這是分析藥物作用靶點(diǎn)最直接的方法。對于小分子化學(xué)藥體系，可以在芯片上 固定多達(dá)17，000個(gè)人體蛋白，然后與小分子化學(xué)藥進(jìn)行孵育，從而初步確定小分子化學(xué)藥 作用靶點(diǎn)。但利用生物芯片研究藥物作用機(jī)制時(shí)，當(dāng)前使用較多的是基因芯片，如國內(nèi)與人 采用小鼠8192點(diǎn)基因芯片研究了中藥復(fù)方對MRL/pr狼瘡小鼠腎臟基團(tuán)表達(dá)及Thl/TH2細(xì) 胞因子比列的調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)熒光染料Cy3和Cy5來檢測雜交結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，這 種采用基因芯片研究藥物作用機(jī)制的方法在國內(nèi)外均有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，但這種方法不能 明確藥物直接作用的受體。雖然蛋白質(zhì)芯片就是已比較成功地用于高通量的藥物篩選(我國蛋白質(zhì)芯片就 是成功應(yīng)用于高通量藥物篩詵.)佰未見有將炔烴標(biāo)記技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)芯片技術(shù)來尋找小 分子化學(xué)藥靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種尋找小分子化學(xué)藥有作用靶點(diǎn) 的簡便方法。本發(fā)明公開了上訴尋找小分子化學(xué)藥作用靶點(diǎn)的方法，尤其是公開炔烴與小 分子化學(xué)藥連接以形成一種“炔烴_小分子化學(xué)藥”炔烴標(biāo)記探針，并將這種探針用于蛋白 芯片以尋找藥物作用靶點(diǎn)的方法。本發(fā)明是通過以下就是方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明將炔烴標(biāo)記粒子與小分子化學(xué)藥進(jìn)行 連接，形成一種“炔烴-小分子化學(xué)藥”探針，然后將這種探針直接與蛋白芯片共孵育，經(jīng)過 與B0DIPY-FL上的疊氮作用，洗滌后，根據(jù)檢測蛋白芯片上的B0DIPY-FL熒光標(biāo)記而確定藥物與芯片上固定的已知蛋白之間特異性的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而通過計(jì)算機(jī)軟件分析這些結(jié)合位 點(diǎn)的的蛋白。以下對本發(fā)明的制備方法和應(yīng)用進(jìn)一步說明，具體如下本發(fā)明通過共價(jià)鍵、配位鍵、氫鍵、靜電吸附中的任意一種或任意幾種的組合作用 將炔烴與小分子化學(xué)藥進(jìn)行連接。獲得的產(chǎn)物通過分離純化以除去游離的雜質(zhì)成分，然后 將獲得的探針與蛋白芯片進(jìn)行孵育?；蛘卟捎脤⑷矡N轉(zhuǎn)化成采用氯代炔烴或者溴代炔烴分子與小分子化學(xué)藥進(jìn)行連 接然后將獲得的探針與蛋白芯片進(jìn)行孵育。其中采用的氯代炔烴或者溴代炔烴分子將與小 分子化學(xué)藥官能團(tuán)偶合反應(yīng)，官能團(tuán)包括羥基、羧基、氨基、脛基中的一種或任意幾種組合。 如有需要，一段烷烴分子鏈會加在炔烴與小分子化學(xué)藥之間，從而保障小分子化學(xué)藥的自由度。上述連接過程是在水相、有機(jī)相或水與有機(jī)溶劑的混合液中進(jìn)行的。所述的蛋白質(zhì)芯片，其點(diǎn)樣區(qū)的蛋白質(zhì)是受體、抗體或特異性蛋白質(zhì)，尤其是指與 待測藥物作用機(jī)理相關(guān)的受體、抗體或特異性蛋白質(zhì)。所述的小分子化學(xué)藥，是指通過化學(xué)合成的方法得到的從動物、植物或礦物中提 取的任意一種化合物或任意兩種或國中化合物的混合物。這些化合物具有抗癌或抗肝炎 作用、心腦血管藥理作用、抗愛滋病、抗衰老、治療糖尿病、治療前列腺疾病、抗老年癡呆、抗 菌、治療消化道疾病、抗風(fēng)濕或類風(fēng)濕疾病、治療骨質(zhì)疏松或更年期綜合證作用中的任意 一種或任意幾種作用。為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明一炔烴標(biāo)記分子來標(biāo)記小分子化學(xué)藥，進(jìn)而與 蛋白芯片共孵育，以獲得藥物作用的直接靶點(diǎn)。用炔烴標(biāo)記分子來標(biāo)記小分子化學(xué)藥對 于小分子化學(xué)藥本身的化學(xué)和物理性質(zhì)影響不大，炔烴標(biāo)記探針和B0DIPY-FL疊氮通過 Huisgen cycloaddition反應(yīng)結(jié)合穩(wěn)定，作用力強(qiáng)，便于檢測。此外，炔烴標(biāo)記會很好的保持 小分子化學(xué)藥的活性。將炔烴代替?zhèn)鹘y(tǒng)熒光分子與蛋白芯片技術(shù)相結(jié)合，則不僅能顯著提 高雜交信號的穩(wěn)定性，增強(qiáng)雜交信號的強(qiáng)度，而且還可以達(dá)到雙高通量檢測的效果。本發(fā)明 對于闡明小分子化學(xué)藥作用靶點(diǎn)和對小分子化學(xué)藥進(jìn)行篩選具有重要的實(shí)際意義。本發(fā)明具有實(shí)際性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，炔烴標(biāo)記分子優(yōu)越的光學(xué)性質(zhì)克服了傳統(tǒng)有 機(jī)熒光染料的不足，將炔烴與小分子化學(xué)藥連接，并與蛋白質(zhì)芯片孵育，可直接獲得小分子 化學(xué)藥作用的靶點(diǎn)，在研究小分子化學(xué)藥篩選方面具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方法實(shí)施例1 向50ml乙醚溶液中加入IOmmol的1_溴_4_羥基丁烷分子和Ilmmol的氫化鈉， 室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，獲得仍然澄清透明的溶液。向該溶液中加入IOmmol 3-溴丙炔， 室溫下攪拌反應(yīng)過夜。蒸干乙醚溶液后，重新加入二氯甲烷50ml，Ilmmol三乙胺和IOmmol 含有氨基的小分子化學(xué)藥，室溫下攪拌反應(yīng)過夜。分離游離的小分子化學(xué)藥，即獲得由共價(jià) 結(jié)合的方法得到的“炔烴_小分子化學(xué)藥”的分子。核磁共振和質(zhì)譜鑒定了分子結(jié)構(gòu)，小分 子化學(xué)藥已經(jīng)連接在炔烴分子上。實(shí)施例2:向50ml 二氯甲烷溶液中加入IOmmol的B0DIPY-FL羧酸分子和Ilmmol的硼烷，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，獲得仍然澄清透明的溶液。在冰浴下加水淬滅多余的硼烷后，二氯 甲烷溶液層被分離出來后加入Ilmmol三乙胺和lOmmolMsCl分子。室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí) 后，加入IOmmol疊氮鈉，室溫下攪拌反應(yīng)過夜。分離純化后，即獲得由共價(jià)結(jié)合的方法得到 的B0DIPY-FL疊氮分子。核磁共振和質(zhì)譜鑒定了分子結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3 將小分子化學(xué)藥炔烴標(biāo)記探針加到蛋白芯片上。整個(gè)結(jié)合反應(yīng)置于維持濕度的反 應(yīng)器中，在室溫下進(jìn)行1小時(shí)(無晃動)。之后蛋白芯片被大量PBS緩沖液淋洗。檢測芯片 上蛋白與小分子的結(jié)合時(shí)，加入B0DIPY-FL疊氮分子和等摩爾量的硫酸銅，抗壞血酸鈉。在 等體積的水和正丁醇中室溫下反應(yīng)30分鐘。，然后用PBS緩沖液以及等體積的水和正丁醇 洗凈這些芯片，由生物芯片掃描儀檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芯片上有5個(gè)蛋白B0DIPY-FL結(jié)合點(diǎn)， 說明小分子化學(xué)藥有可能作用于多人體蛋白。
權(quán)利要求
1.一種炔烴標(biāo)記探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥作用靶點(diǎn)的方法，其特征在于采 用以下步驟將炔烴與小分子化學(xué)藥進(jìn)行連接，形成一種“炔烴-小分子化學(xué)藥”標(biāo)記探針， 然后將這種標(biāo)記探針直接與蛋白芯片共孵育，經(jīng)過與B0DIPY-FL ( 一種熒光染料)的疊氮化 合物反應(yīng)(點(diǎn)擊化學(xué))后而結(jié)合在一起，經(jīng)過洗滌后，根據(jù)檢測蛋白芯片上的熒光染料標(biāo)記 探針而確定藥物與芯片上固定的已知蛋白之間特異性的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而通過計(jì)算機(jī)軟件分 析這些結(jié)合位點(diǎn)的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種炔烴標(biāo)記探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥作用靶點(diǎn) 的方法，其特征在于通過共價(jià)鍵作用將炔烴與小分子化學(xué)藥進(jìn)行連接；獲得的產(chǎn)物通過 分離純化以除去游離成分，得到“炔烴-小分子化學(xué)藥”標(biāo)記探針，然后將這種探針與蛋白 芯片進(jìn)行孵育。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種炔烴標(biāo)記探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥作用靶點(diǎn) 的方法，其特征在于采用氯代炔烴或者溴代炔烴分子將炔烴與小分子化學(xué)藥進(jìn)行連接，然 后將獲得的探針與蛋白芯片進(jìn)行孵育，其中采用的氯代炔烴或者溴代炔烴分子將與小分子 化學(xué)藥官能團(tuán)偶合反應(yīng)，官能團(tuán)包括羥基、羧基、氨基、脛基中的一種或任意幾種組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中所述一種炔烴標(biāo)記探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥作用 靶點(diǎn)的方法，其特征在于所述連接過程是在水相、有機(jī)相或水與有機(jī)溶劑的混合液中進(jìn)行 的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述一種炔烴標(biāo)記探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥作用靶 點(diǎn)的方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)芯片其點(diǎn)樣區(qū)的蛋白質(zhì)是受體、抗體或特異蛋白質(zhì)， 尤其是指與待測藥物作用機(jī)理相關(guān)的受體、抗體或特異蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的標(biāo)記探針的組合，其特征在于由所述任意一種炔烴為核。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述一種炔烴標(biāo)記探針聯(lián)合蛋白芯片尋找小分子化學(xué)藥作用靶 點(diǎn)的方法，其特征在于所述的小分子化學(xué)藥，是指單一化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述B0DIPY-FL( —種熒光染料)的疊氮化合物是將B0DIPY-FL的 羧基轉(zhuǎn)化成疊氮化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中所述，炔烴標(biāo)記小分子化學(xué)藥探針與蛋白芯片進(jìn)行孵育后，與 B0DIPY-FL的疊氮化合物通過Huisgen cycloaddition反應(yīng)而結(jié)合在一起。
全文摘要
本發(fā)明將炔烴與小分子化學(xué)藥進(jìn)行連接，形成一種“炔烴-小分子化學(xué)藥”標(biāo)記探針，然后將這種標(biāo)記探針直接與蛋白芯片共孵育，經(jīng)過與BODIPY-FL(一種熒光染料)的疊氮化合物反應(yīng)后而結(jié)合在一起，經(jīng)過洗滌后，根據(jù)檢測蛋白芯片上的炔烴標(biāo)記探針和BODIPY-FL鏈霉親合素結(jié)合來確定藥物與芯片上固定的蛋白質(zhì)之間特異性的結(jié)合位點(diǎn)(即靶點(diǎn))，進(jìn)而通過計(jì)算機(jī)軟件分析這些結(jié)合位點(diǎn)的蛋白。本發(fā)明可簡便、快速地尋找小分子化學(xué)藥以及對細(xì)胞產(chǎn)生藥效的靶蛋白，可為高通量地篩選小分子化學(xué)藥新藥提供高效的技術(shù)手段。
文檔編號G01N33/543GK102095875SQ20111000081
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者余強(qiáng) 申請人:盛世泰科生物醫(yī)藥技術(shù)(蘇州)有限公司