專利名稱：一種非標(biāo)記型電流型免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以鐵氰化鉀作為氧化還原探針物質(zhì)，以殼聚糖作為固定基質(zhì)的電流型免疫傳感器，屬于電化學(xué)傳感器領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
電化學(xué)免疫傳感器與傳統(tǒng)的放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析相比，具有相對(duì)較為簡(jiǎn)單的預(yù)處理過(guò)程、較短的分析時(shí)間、低檢出限以及對(duì)儀器要求較低等優(yōu)點(diǎn)，因而受到了廣泛的關(guān)注(臨床檢驗(yàn)雜志，2003，03，181.中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2006，2， 132.)。人們開(kāi)發(fā)出了多種類型的電化學(xué)免疫傳感器，如電流型、電壓型、電容型以及阻抗型的傳感器(Anal. Chem. 2001，73，3219. Electrochem. Commun. 2004，6，1222. Sens. Actuators B 1999，57，201. Anal. Chem. 2002, 74，4814.)，這些傳感器都是通過(guò)抗體抗原反應(yīng)后導(dǎo)致傳感器的電化學(xué)信號(hào)發(fā)生改變來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫檢測(cè)的。利用納米材料增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度的電流型免疫傳感器，主要分為標(biāo)記型和非標(biāo)記型兩種。標(biāo)記型電流型免疫傳感器是將抗體或者抗原分子固定在電極表面上，當(dāng)傳感器在含有待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗體的溶液中孵育后，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記在抗體上的酶與底物作用產(chǎn)生的電化學(xué)活性物質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)，間接測(cè)定待測(cè)抗原含量。辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等經(jīng)常被用作抗體的標(biāo)記酶(即酶標(biāo)抗體)。現(xiàn)有的標(biāo)記型電流型免疫傳感器需要在待測(cè)溶液中加入具有氧化還原能力的電活性物質(zhì)作為媒介體或者上述酶標(biāo)抗體的酶促底物等非免疫試劑，這些試劑將影響測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性。非標(biāo)記型電流型免疫傳感器是通過(guò)在電極表面先形成一層具有電化學(xué)活性的氧化還原探針物質(zhì)膜，然后在氧化還原探針物質(zhì)膜的表面連接抗體分子，接著對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行免疫識(shí)別并進(jìn)行電化學(xué)免疫檢測(cè)。非標(biāo)記型的電化學(xué)免疫傳感器不需要具有氧化還原能力的電活性物質(zhì)作為媒介體，也不需要標(biāo)記型電流型免疫傳感器中的酶標(biāo)抗體的酶促底物的介入，因此非標(biāo)記型的電化學(xué)免疫傳感器具有簡(jiǎn)單和快速等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也避免了標(biāo)記型電流型免疫傳感器存在的媒介體對(duì)電極表面污染的問(wèn)題。盡管如此，非標(biāo)記型電流型免疫傳感器主要通過(guò)靜電作用連接抗體，難以確保每次抗體固定量一致，因而影響傳感器的重現(xiàn)性。為了克服現(xiàn)有的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器存在的缺點(diǎn)，本發(fā)明首次利用殼聚糖將氧化還原探針物質(zhì)直接固定到電極表面，在電極上形成氧化還原探針物質(zhì)膜，并將抗體通過(guò)化學(xué)修飾固定到氧化還原探針物質(zhì)膜上，制備出新型非標(biāo)記型電流型免疫傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，從而解決現(xiàn)有技術(shù)免疫傳感器重現(xiàn)性差的缺陷。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，其特征在于，工作電極表面覆蓋有4層膜第一層為殼聚糖、鐵氰化鉀和金屬納米材料的混合物在電極表面形成的氧化還原層；第二層為全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂與金屬納米材料的混合物在所述氧化還原層表面形成的保護(hù)層；第三層為在所述保護(hù)層表面形成的聚乙烯亞胺層；第四層為將所述第三層用戊二醛處理后再化學(xué)吸附抗體的聚乙烯亞胺層。所述抗體可以是本領(lǐng)域常用的免疫抗體，如免疫球蛋白及其家族、癌胚抗體以及其他癌癥標(biāo)志物抗體等。其中，所述第一層中，所述金屬納米材料為金納米顆?；蜚y納米顆粒。所述金屬納米材料的粒徑為10-60nm。所述全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂為全氟磺酸交換樹(shù)脂(naf ion)。將所述工作電極與對(duì)電極和參比電極組成免疫傳感器來(lái)檢測(cè)抗原。所述抗原可以是本領(lǐng)域常用的免疫抗原，如免疫球蛋白及其家族、癌胚抗原以及其他癌癥標(biāo)志物抗原等。在本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)電極為大面積鉬片電極。參比電極為飽和氯化鉀Ag/AgCl電極或飽和甘汞電極。本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的方法，其中，所述工作電極的制備包括以下步驟1)將殼聚糖水溶液與鐵氰化鉀水溶液混合，并加入金屬納米材料水溶液，將所得混合物涂刷到工作電極表面，并在常溫晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；2)將全氟磺酸交換樹(shù)脂的乙醇溶液與金屬納米材料的乙醇溶液混合，將所得混合物涂刷到經(jīng)步驟1)處理后的工作電極上，并在常溫晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；3)將經(jīng)步驟2、處理后的工作電極浸入聚乙烯亞胺水溶液中，取出后水洗并用氮?dú)獯蹈桑纬删垡蚁﹣啺穼樱?)將經(jīng)步驟幻處理后的工作電極浸入戊二醛水溶液中，形成富醛基表面；5)將經(jīng)步驟4)處理后的工作電極浸入抗體水溶液中，取出后用牛血清白蛋白水溶液封閉。其中，步驟1)中，所述殼聚糖水溶液的濃度為0.5-2wt%，鐵氰化鉀水溶液的濃度為 Ι-lOmM，金屬納米材料水溶液在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下的吸光度為1-5 ；殼聚糖水溶液 鐵氰化鉀水溶液金屬納米材料水溶液的體積比為0. 05-0. 2 0. 01-0. 1 0. 02-0. 1 ；步驟幻中，所述全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂的乙醇溶液的濃度為l-5wt%，金屬納米材料的乙醇溶液在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下的吸光度為1-5，全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂的乙醇溶液金屬納米材料的乙醇溶液的體積比為0. 05-0. 2 0. 02-0. 1 ；步驟3)中，聚乙烯亞胺水溶液的濃度為10-50mg/mL ；工作電極浸入聚乙烯亞胺水溶液的時(shí)間為5-30min ；步驟4)中，戊二醛水溶液的濃度為1. 0-5. Omg/mL ；工作電極浸入戊二醛水溶液的時(shí)間為5-30min ；步驟幻中，所述抗體水溶液的濃度為100-300ug/mL ；工作電極浸入所述抗體水溶液的時(shí)間為2-4小時(shí)；所述牛血清白蛋白水溶液的濃度為5-20mg/mL ；工作電極浸入所述牛血清白蛋白水溶液的時(shí)間為20-40min。本發(fā)明的又一目的在于提供一種所述非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的使用方法，具體為1)測(cè)定抗原的工作曲線。配置濃度范圍在0 lOOOng/mL的抗原標(biāo)準(zhǔn)水溶液，所用抗原需與工作電極中所吸附的抗體相對(duì)應(yīng)。在30 40°C下，將本發(fā)明的工作電極在抗原標(biāo)準(zhǔn)水溶液中孵育30 70min后，取出，使用二次蒸餾水洗滌，以孵育后的工作電極作為傳感器的工作電極、以大面積鉬片電極作為對(duì)電極，以飽和甘汞電極或者飽和氯化鉀Ag/AgCl電極作為參比電極，在 pH為6. 5 7. 3的磷酸緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液中采用循環(huán)伏安法、方波伏安法、 差示脈沖伏安法進(jìn)行檢測(cè)，得到該待測(cè)抗原的測(cè)定工作曲線；2)測(cè)定待測(cè)抗原。將免疫傳感器在30 40°C下，在含待測(cè)抗原的水溶液中孵育30 70min，取出， 使用二次蒸餾水洗滌，以孵育后的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器作為工作電極、以大面積鉬片電極作為對(duì)電極，以飽和甘汞電極或者飽和氯化鉀Ag/AgCl電極作為參比電極，在pH為 6. 5 7. 3的磷酸緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液中采用循環(huán)伏安法、方波伏安法或差示脈沖伏安法進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與該抗原的測(cè)定工作曲線對(duì)照，查出其相應(yīng)的濃度。本發(fā)明的免疫傳感器具有制備過(guò)程簡(jiǎn)便、成本低廉、重現(xiàn)性優(yōu)良、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于各種免疫分析和檢測(cè)。


圖1為癌胚抗原(CEA)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為人IgG的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1一、制備用于CEA檢測(cè)的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器選擇盤狀平面玻碳電極，以CEA為檢測(cè)抗原，以CEA抗體為固定抗體1)將0. ImL的1 %的殼聚糖水溶液與0. 05mL的5mM的鐵氰化鉀水溶液混合，并加入0. 05mL的粒徑為25nm且在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下吸光度為5的金納米顆粒水溶液，混合均勻后涂刷到電極表面，在烘箱中以50°C烘干；2)將0. ImL的1. 25% nafion的乙醇溶液與0. 05mL的粒徑為25nm且在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下吸光度為5的金納米顆粒的乙醇溶液混合，將所得混合物涂刷到步驟1)處理后的電極表面，在烘箱中以50°C烘干；3)將步驟2)中所得修飾電極浸入聚乙烯亞胺水溶液(50mg/mL)中15min，取出后水洗并用氮?dú)獯蹈?，形成聚乙烯亞胺層?)將步驟幻中所得修飾電極浸入2. 5mg/mL戊二醛水溶液15min，形成富醛基的表面；
5)將步驟4)中所得修飾電極浸入200 μ g/mL的CEA抗體水溶液中孵育3小時(shí)，取出后放入lOmg/mL的牛血清白蛋白水溶液中30min，得到可檢測(cè)CEA的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器。二、CEA 的檢測(cè)1)測(cè)定CEA的工作曲線配置濃度范圍在O lOOOng/mL的CEA標(biāo)準(zhǔn)水溶液，在30°C下，將制備的CEA抗體修飾的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器分別在不同濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)水溶液中孵育30min后，取出，使用二次蒸餾水洗滌，以其作為工作電極，以大面積鉬片電極作為對(duì)電極，以飽和氯化鉀Ag/AgCl電極作為參比電極，在pH為7.0的磷酸緩沖溶液中采用方波伏安法進(jìn)行檢測(cè)， 得到CEA的測(cè)定工作曲線，如圖1所示。2)測(cè)定 CEA將CEA抗體修飾的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器在35°C下，在含待測(cè)抗原的水溶液中孵育30min，取出，使用二次蒸餾水洗滌，以其作為工作電極，以大面積鉬片電極作為對(duì)電極，以飽和氯化鉀Ag/AgCl電極作為參比電極，在pH為7. O的磷酸緩沖溶液中采用方波伏安法進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與步驟1)的CEA的測(cè)定工作曲線相對(duì)照，查出相應(yīng)濃度。結(jié)果顯示，對(duì)CEA的檢測(cè)限為3pg/mL。實(shí)施例2一、制備用于人IgG檢測(cè)的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器選擇盤狀平面金電極，以人IgG為檢測(cè)對(duì)象，以抗人IgG作為固定抗體1)將0. 2mL的2 %的殼聚糖水溶液與0. ImL的IOmM的鐵氰化鉀水溶液混合，并加入0. ImL的粒徑為20nm在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下吸光度為1的銀納米顆粒的水溶液，混合均勻后將所得混合物涂刷到電極表面，在烘箱中以80°C烘干；2)將0. 2mL的1 % nafion水溶液與0. ImL的粒徑為20nm且在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下吸光度為1的銀納米顆粒的乙醇溶液混合，并將所得混合物涂刷到步驟1)處理后的電極表面，在烘箱中以80°C烘干；3)將步驟2)中所得修飾電極浸入聚乙烯亞胺水溶液(濃度為20mg/mL)中30min， 取出后水洗并用氮?dú)獯蹈?，形成聚乙烯亞胺層?)將步驟幻中所得修飾電極浸入5mg/mL戊二醛水溶液30min，形成富醛基的表5)將步驟4)中所得修飾電極浸入300 μ g/mL的人IgG抗體水溶液中孵育3小時(shí)， 取出后放入20mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中30min，得到可以檢測(cè)人IgG的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器。二、人IgG的檢測(cè)1)測(cè)定人IgG的工作曲線配置濃度范圍在0 lOOOng/mL的人IgG標(biāo)準(zhǔn)水溶液，在40°C下，將制備的可以檢測(cè)人IgG的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，分別在不同濃度的人IgG標(biāo)準(zhǔn)水溶液中孵育35min 后，取出，使用二次蒸餾水洗滌，以其作為工作電極，以大面積鉬片電極作為對(duì)電極，以飽和甘汞電極作為參比電極，在PH為7.0的磷酸緩沖溶液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行檢測(cè)，得到人 IgG的測(cè)定工作曲線，如圖2所示；
2)測(cè)定人 IgG在35°C下，將可以檢測(cè)人IgG的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器在含待測(cè)抗原的水溶液中孵育30min，取出，使用二次蒸餾水洗滌，以其作為工作電極，以大面積鉬片電極作為對(duì)電極，以飽和甘汞電極作為參比電極，在PH為7. 0的磷酸緩沖溶液中采用循環(huán)伏安法進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與步驟1)的人IgG的測(cè)定工作曲線相對(duì)照，查出相應(yīng)濃度。結(jié)果顯示，對(duì)人IgG的檢測(cè)限為10pg/mL。本發(fā)明利用殼聚糖將氧化還原探針物質(zhì)直接固定到電極表面，在電極上形成氧化還原探針物質(zhì)膜，并將抗體修飾于氧化還原探針物質(zhì)膜上，得到了本發(fā)明的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，克服了現(xiàn)有的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器制備過(guò)程繁瑣耗時(shí)、重現(xiàn)性不夠好、制備傳感器成本較高等缺陷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在1)本發(fā)明非標(biāo)記型免疫傳感器中的氧化還原探針物質(zhì)膜制備過(guò)程簡(jiǎn)單；2)固定抗體時(shí)采用化學(xué)鍵固定，使每次固定的抗體量趨于一致，解決了通常固定抗體中使用的物理吸附導(dǎo)致的重現(xiàn)性差等問(wèn)題；3)本發(fā)明的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器對(duì)相應(yīng)抗原具有極高的檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器制備過(guò)程更為簡(jiǎn)便、成本更加低廉、重現(xiàn)性更加優(yōu)良、檢測(cè)更為靈敏，可廣泛用于各種免疫分析和檢測(cè)。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅僅是說(shuō)明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變， 修改，甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，其特征在于，工作電極表面覆蓋有4層膜第一層為殼聚糖、鐵氰化鉀和金屬納米材料混合物在電極表面形成的氧化還原層；第二層為全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂與金屬納米材料混合物在所述氧化還原層表面形成的保護(hù)層；第三層為在所述保護(hù)層表面形成的聚乙烯亞胺層；第四層為將所述第三層用戊二醛處理后再化學(xué)吸附抗體的聚乙烯亞胺層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，其特征在于， 所述金屬納米材料為金納米顆?；蜚y納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，其特征在于，所述金屬納米材料的粒徑為10-60nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器，其特征在于，所述全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂為全氟磺酸交換樹(shù)脂。
5.一種制備以上權(quán)利要求所述非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的方法，其特征在于，所述工作電極的制備包括以下步驟1)將殼聚糖水溶液與鐵氰化鉀水溶液混合，并加入金屬納米材料水溶液，將所得混合物涂刷到工作電極表面，并在常溫晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；2)將全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂的乙醇溶液與金屬納米材料的乙醇溶液混合，將所得混合物涂刷到經(jīng)步驟1)處理后的工作電極上，并在常溫晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；3)將經(jīng)步驟2)處理后的工作電極浸入聚乙烯亞胺水溶液中，取出后水洗并用氮?dú)獯蹈?，形成聚乙烯亞胺層?)將經(jīng)步驟幻處理后的工作電極浸入戊二醛水溶液中，形成富醛基表面；5)將經(jīng)步驟4)處理后的工作電極浸入抗體水溶液中，取出后用牛血清白蛋白水溶液封閉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟1)中，所述殼聚糖水溶液的濃度為0. 5-2wt %，鐵氰化鉀水溶液的濃度為1-lOmM，金屬納米材料水溶液在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下的吸光度為1-5 ；殼聚糖水溶液鐵氰化鉀水溶液金屬納米材料水溶液的體積比為0. 05-0. 2 0. 01-0. 1 0. 02-0. 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟2)中，所述全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂的乙醇溶液的濃度為l-5wt%，金屬納米材料的乙醇溶液在最大可見(jiàn)吸收峰波長(zhǎng)下的吸光度為1-5，全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂的乙醇溶液金屬納米材料的乙醇溶液的體積比為0. 05-0. 2 0. 02-0. 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的制備方法，其特征在于， 步驟幻中，聚乙烯亞胺水溶液的濃度為10-50mg/mL;工作電極浸入聚乙烯亞胺水溶液的時(shí)間為5-30min ；步驟4)中，戊二醛水溶液的濃度為1. 0-5. Omg/mL ；工作電極浸入戊二醛水溶液的時(shí)間為 5_30min ；步驟幻中，所述抗體水溶液的濃度為100-300ug/mL ；工作電極浸入所述抗體水溶液的時(shí)間為2-4小時(shí)；所述牛血清白蛋白水溶液的濃度為5-20mg/mL ；工作電極浸入所述牛血清白蛋白水溶液的時(shí)間為20-40min。
9.一種權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的使用方法，其特征在于，工作電極的處理在30-40°C下，將工作電極在抗原標(biāo)準(zhǔn)水溶液中孵育30-70min后取出，并用二次蒸餾水洗滌；接著將處理后的工作電極在緩沖溶液中采用電化學(xué)方法檢測(cè)抗原。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的非標(biāo)記型電流型免疫傳感器的使用方法，其特征在于，所述緩沖溶液為pH為6. 5 7. 3的磷酸緩沖溶液或者Tris-HCl緩沖溶液；所述電化學(xué)方法為方波伏安法或循環(huán)伏安法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種非標(biāo)記型電流型免疫傳感器。本發(fā)明免疫傳感器的工作電極表面覆蓋有4層膜第一層為殼聚糖、鐵氰化鉀和金屬納米材料的混合物在電極表面形成的氧化還原層；第二層為全氟化質(zhì)子交換樹(shù)脂與金屬納米材料混合物在所述氧化還原層表面形成的保護(hù)層；第三層為在所述保護(hù)層表面形成的聚乙烯亞胺層；第四層為將所述第三層用戊二醛處理后再化學(xué)吸附抗體的聚乙烯亞胺層。本發(fā)明的免疫傳感器以鐵氰化鉀作為氧化還原探針物質(zhì)，以殼聚糖作為固定基質(zhì)，有效提高了電流型免疫傳感器的重現(xiàn)性。
文檔編號(hào)G01N27/48GK102183562SQ20111004343
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者石文韜, 馬占芳 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)