專利名稱：鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的構建方法及其標準指紋圖譜的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種廣東涼茶的質(zhì)量控制方法，具體涉及鄧老涼茶顆粒高效液相色譜法指紋圖譜的構建方法和標準指紋圖譜。
背景技術：
廣東涼茶是嶺南人民根據(jù)本地的氣候和水土特性，在長期預防疾病與保健過程中以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導，以中草藥為基礎，研制總結出來的具有清熱解毒、生津止渴等功效的一類植物飲料。鄧老涼茶是著名的廣東涼茶之一，由金銀花、菊花、白茅根、桑葉、蒲公英和甘草6味藥材組成，具有清熱解毒、祛濕生津、涼血排毒等功效，用于風熱感冒、咽喉腫痛等癥?，F(xiàn)已有鄧老涼茶含糖顆粒、無糖顆粒、罐裝飲料、蜜煉膏、草本含片等劑型上市。目前國內(nèi)還沒有文獻報道對鄧老涼茶質(zhì)量控制的研究。中藥指紋圖譜技術是一種表征中藥所含成分與其質(zhì)量關系的有效手段，已成為國內(nèi)外廣泛認可的重要質(zhì)量評價模式。因此，建立鄧老涼茶制劑的標準指紋圖譜，能從整體上全面反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量，為其質(zhì)量控制提供一種提供直觀、簡便、有效的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為鄧老涼茶顆粒的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供一種新的方法，通過建立鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的方法，并由此方法得到鄧老涼茶制劑的標準指紋圖譜。為達到本發(fā)明的目的所采用的技術方案用高效液相色譜法建立鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的方法，具體包括如下步驟(1)對照品溶液的制備A.綠原酸對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品適量，用甲醇配制成每Iml 含綠原酸0. 2 0. 5mg的溶液；B.新綠原酸對照品溶液的制備精密稱取新綠原酸對照品適量，用甲醇配制成每 Iml含新綠原酸0. 2 0. 5mg的溶液；C.異綠原酸A對照品溶液的制備精密稱取異綠原酸A對照品適量，用甲醇配制成每Iml含異綠原酸A 0. 2 0. 5mg的溶液；D.異綠原酸B對照品溶液的制備精密稱取異綠原酸B對照品適量，用甲醇配制成每Iml含異綠原酸B 0. 2 0. 5mg的溶液；E.混合對照品溶液的制備分別吸取1. OOmL綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸B對照品溶液，組成混合對照品溶液；(2)供試品溶液的制備精密稱取鄧老涼茶顆粒0. 5 20g，50% 100%甲醇提取，采用索氏提取或超聲提取或微波輔助萃取或加速溶劑萃取方法進行提取，提取時間為 10 150min，提取液濃縮定容至10 50mL，針孔式微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；(3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A 為0. 1 3%磷酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫時間為20 180min，柱溫20 50°C，流速0. 3 1. OmL/min,紫外檢測波長240 262nm ；(4)測定精密吸取供試品溶液0. 5 10 μ 1注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。(5)相似度評價供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004Α 版》進行評價，在240 檢測波長下的相似度均大于0. 80。本發(fā)明最佳的檢測方法可以通過下述步驟實施( 供試品溶液的制備稱取鄧老涼茶顆粒5. Og，用濾紙包好，置索氏提取器中，精密加入甲醇150mL，索氏提取1. ，提取液旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮至10mL，轉(zhuǎn)移至25mL的容量瓶中，甲醇加至刻度，搖勻，針孔式微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。( 色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為0. 5%的磷酸溶液，流動相B為乙腈，洗脫時間為20min，柱溫25°C，流速 0. 5mL/min,紫外檢測波長254nm ；在步驟(3)中，所述的梯度洗脫，優(yōu)選梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行流動相A為0. 5%的磷酸溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相A為95 %、流動相B為5 % ；3分鐘時，流動相A為95 %、流動相B為5 % ；9分鐘時，流動相A為80 %、流動相B為20 % ；13分鐘時，流動相A為80%、流動相B為20% ；20分鐘時，流動相A為5 %、流動相B為95 %。按照本發(fā)明所提供指紋圖譜的建立方法所得鄧老涼茶顆粒的指紋圖譜中有16個特征共有峰，其中3號色譜峰最強，為綠原酸參照峰，4號色譜峰為新綠原酸參照峰，13號峰位異綠原酸A參照峰，14號色譜峰為異綠原酸B參照峰，圖譜總長為20min，其中單峰面積超總峰面積1 %的峰有16個，它們是1 16號峰；單峰面積超總峰面積5%的有6個，它們是2號峰、3號峰、4號峰、12號峰、13號峰、14號峰；單峰面積超總峰面積10%的有4個，它們是3號峰、4號峰、12號峰、14號峰。具體如下1號峰，平均保留時間RT為2. 26min, RSD為0. 41%，峰面積為34. 2495mAU*s為 4. 00%。2 號峰，平均保留時間 RT 為 3. 23min, RSD 為 0. 60%，峰面積為 103. 8625mAU*s，RSD 為 1. 12%。3號峰為綠原酸，平均保留時間RT為7. 24min, RSD為0. 19 %，峰面積為 183. 5252mAU*s，RSD 為 20. 12%。4號峰為新綠原酸，平均保留時間RT為7. 71min, RSD為0. 15 %，峰面積為 111. 0776mAU*s，RSD 為 8. 60%。5 號峰，平均保留時間 RT 為 8. 56min，RSD 為 0. 02%，峰面積為 27. 6046mAU*s，RSD 為 13. 09%。6 號峰，平均保留時間 RT 為 9. 65min，RSD 為 0. 21%，峰面積為 39. 1353mAU*s，RSD 為 13. 57%。7 號峰，平均保留時間 RT 為 10. 95min, RSD 為 0. 08%，峰面積為 27. 0746mAU*s，RSD 為 11. 97%。8 號峰，平均保留時間 RT 為 11. 15min，RSD 為 0. 11 %，峰面積為 33. 6M6mAU*s，RSD
4為 5. 69%。9 號峰，平均保留時間 RT 為 11. 34min，RSD 為 0. 11%，峰面積為 43. 5254mAU*s，RSD 為 7. 21%。10號峰，平均保留時間RT為11. 47min, RSD為0. 11%，峰面積為47. 5335mAU*s， RSD 為 8. 57%。11號峰，平均保留時間RT為11. 67min, RSD為0. 14%，峰面積為47. 5072mAU*s， RSD 為 8. 56%。12 號峰，平均保留時間 RT 為 12. 18min，RSD 為 0. 17%，峰面積為 108. 6137mAU*s， RSD 為 8. 00%。13號峰為異綠原酸A，平均保留時間RT為12. 50min，RSD為0. 19 %，峰面積為 56. 1588mAU*s，RSD 為 11. 94% 014號峰為異綠原酸B，平均保留時間RT為13. 83min，RSD為0. 27 %，峰面積為 117. 6081mAU*s，RSD 為 13. 42%。15號峰，平均保留時間RT為16. 54min, RSD為0. 04%，峰面積為41. 5771mAU*s， RSD 為 12. 79%。16號峰，平均保留時間RT為17. 94min, RSD為0. 03%，峰面積為42. 4393mAU*s， RSD 為 6. 55%。本發(fā)明的原理是根據(jù)鄧老涼茶顆粒中主要的活性成分是藥材金銀花、菊花、白茅根、桑葉、蒲公英和甘草的提取物，其指紋圖譜能從色譜的整體面貌上把握鄧老涼茶顆粒的質(zhì)量，所說的鄧老涼茶顆粒包括鄧老涼茶含糖顆粒劑和無糖顆粒劑。本發(fā)明的有益效果如下(1)按本發(fā)明提供的方法所建立的HPLC指紋圖譜，能有效的表征鄧老涼茶顆粒的質(zhì)量，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。(2)指紋圖譜注重各個構成指紋特征峰的前后順序和相互關系，注重整體面貌特征，既避免了因測定一、二個化學成分而判定鄧老涼茶顆粒整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達標而人為處理的可能性。(3)本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)型好等優(yōu)點。(4)該方法可快速、準確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。下面通過實施例及其附圖詳細闡述本發(fā)明的技術方案，所列舉的實施例及附圖對本發(fā)明并沒有限制。


圖1、11批次鄧老涼茶顆粒的疊加2、鄧老涼茶顆粒的HPLC標準指紋圖譜下面通過實施例及其附圖詳細闡述本發(fā)明的技術方案，所列舉的實施例及附圖對本發(fā)明并沒有限制。
具體實施例方式實施例1.鄧老涼茶無糖顆粒指紋圖譜的檢測
1儀器與試藥1. 1儀器Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，ChemStation色譜工作站。1.2試劑綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸B對照品；乙腈(色譜純)、 甲醇(色譜純)、二次重蒸水、磷酸(分析純)。2.高效液相色譜2.1色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料(Poroshell 120SB_C18色譜柱，100X2. Imm, 2. 7 μ m)；流動相為0.5%磷酸㈧與乙腈⑶組成的梯度洗脫液，柱溫 250C ；紫外檢測波長為2Mnm ；流速0. 5ml/min ；分析時間20min。進樣量供試品溶液與對照品溶液各1 μ 1。理論塔板數(shù)按綠原酸計算應不低于3000。梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為95 %、流動相B為5 % ；3分鐘時，流動相A為95 %、流動相B為5 % ；9分鐘時，流動相A為80 %、流動相B為20 % ；13分鐘時，流動相A為80%、流動相B為20% ；20分鐘時，流動相A為5 %、流動相B為95 %。2.2對照品溶液的制備Α.綠原酸對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過濾，即得。B.新綠原酸對照品溶液的制備精密稱取新綠原酸對照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過濾，即得。C.異綠原酸A對照品溶液的制備精密稱取異綠原酸A對照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過濾，即得。D.異綠原酸B對照品溶液的制備精密稱取異綠原酸B對照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過濾，即得。E.混合對照品溶液的制備分別吸取1. OOmL綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸B對照品溶液，組成混合對照品溶液。2. 3供試品溶液的制備鄧老涼茶顆粒供試品溶液的制備精密稱取鄧老顆粒5. 0g，用濾紙包好，置索氏提取器中，加入甲醇150mL，索氏提取1.證，提取液旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮至10mL，轉(zhuǎn)移至25mL的容量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。2. 4測定精密吸取供試品溶液與對照品溶液各1 μ 1注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，所得指紋圖譜與圖2相似。實施例2.檢測11批次鄧老涼茶顆粒的標準指紋圖譜取鄧老涼茶顆粒11批次，按實施例1條件進行檢測，得11批次樣品的HPLC圖譜， 如圖1所示。通過11批HPLC圖譜的比較，進行相似度評價，確定其特征共有峰指紋圖譜中有16個特征共有峰，現(xiàn)將圖譜的保留時間、峰面積的平均值以及占總峰面積匯總，具體如下1號峰，平均保留時間RT為2. 26min, RSD為0. 41%，峰面積為34. 2495mAU*s為 4. 00%,占總峰面積的3. 22%。2 號峰，平均保留時間 RT 為 3. 23min, RSD 為 0. 60%，峰面積為 103. 8625mAU*s，RSD為1. 12%，占總峰面積的9. 75%。3號峰為綠原酸，平均保留時間RT為7. 24min, RSD為0. 19 %，峰面積為 183. 5252mAU*s，RSD 為 20. 12%,占總峰面積的 17. 23%。4號峰為新綠原酸，平均保留時間RT為7. 71min, RSD為0. 15 %，峰面積為 111. 0776mAU*s，RSD % 8. 60%,占總峰面積的 10. 43%。5 號峰，平均保留時間 RT 為 8. 56min，RSD 為 0. 02%，峰面積為 27. 6046mAU*s，RSD 為13. 09%,占總峰面積的2. 59%。6 號峰，平均保留時間 RT 為 9. 65min，RSD 為 0. 21%，峰面積為 39. 1353mAU*s，RSD 為13. 57%,占總峰面積的3. 67%。7 號峰，平均保留時間 RT 為 10. 95min, RSD 為 0. 08%，峰面積為 27. 0746mAU*s，RSD 為11.97%，占總峰面積的2. 54%。8 號峰，平均保留時間 RT 為 11. 15min，RSD 為 0. 11 %，峰面積為 33. 6M6mAU*s，RSD % 5. 69%,占總峰面積的3. 16%。9 號峰，平均保留時間 RT 為 11. 34min，RSD 為 0. 11%，峰面積為 43. 5254mAU*s，RSD % 7. 21%,占總峰面積的4. 09% ο10號峰，平均保留時間RT為11. 47min, RSD為0. 11%，峰面積為47. 5335mAU*s， RSD % 8. 57%,占總峰面積的4. 46% ο11號峰，平均保留時間RT為11. 67min, RSD為0. 14%，峰面積為47. 5072mAU*s， RSD % 8. 56%,占總峰面積的4. 46% ο12 號峰，平均保留時間 RT 為 12. 18min，RSD 為 0. 17%，峰面積為 108. 6137mAU*s， RSD % 8. 00%,占總峰面積的10. 20%。13號峰為異綠原酸A，平均保留時間RT為12. 50min，RSD為0. 19 %，峰面積為 56. 1588mAU*s，RSD 為 11. 94%，占總峰面積的 5. 27%。14號峰為異綠原酸B，平均保留時間RT為13. 83min，RSD為0. 27 %，峰面積為 117. 608lmAU*s, RSD 為 13. 42%,占總峰面積的 11. 04%。15號峰，平均保留時間RT為16. 54min, RSD為0. 04%，峰面積為41. 5771mAU*s， RSD % 12. 79%,占總峰面積的3. 90%。16號峰，平均保留時間RT為17. 94min, RSD為0. 03%，峰面積為42. 4393mAU*s， RSD % 6. 55%,占總峰面積的3. 98%。所述指紋圖譜中，鄧老涼茶顆粒的指紋圖譜中含有16個特征共有峰，其中3號色譜峰最強，為綠原酸參照峰，即S色譜峰，4號峰、13號峰、14號峰分別為新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B參照峰，圖譜總長為20min，其中單峰面積超總峰面積1 %的峰有16個，它們是1 16號峰；單峰面積超總峰面積5%的有6個，它們是2號峰、3號峰、4號峰、12號峰、13號峰、14號峰；單峰面積超總峰面積10%的有4個，它們是3號峰、4號峰、12號峰、 14號峰。相似度評價采用中國藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) 2004A版》對HPLC圖譜進行綜合評價，相似度評價結果見表1，11批次鄧老涼茶顆粒的疊加圖見附圖1。表1 HPLC指紋圖譜相似度評價
權利要求
1.一種鄧老涼茶顆粒制劑指紋圖譜的建立方法，其特征在于采用高效液相色譜法，具體包括如下步驟(1)對照品溶液的制備精密配制綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B對照品溶液，濃度為0. 2 0. 5mg/mL ；(2)供試品溶液的制備精密稱取鄧老涼茶顆粒，50% 100%甲醇提取，提取液濃縮定容后，針孔式微孔濾膜過濾，即得供試品溶液；(3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，梯度洗脫，柱溫20 50°C，流速0.3 l.OmL/min，紫外檢測；(4)測定精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜；(5)相似度評價供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》 進行評價。
2.根據(jù)權利要求1所述的鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(2)供試品溶液的制備，精密稱取鄧老涼茶顆粒0.5 20g，采用索氏提取或超聲提取或微波輔助萃取或加速溶劑萃取方法進行提取，提取時間為10 150min，提取液濃縮定容至 10 50mL。
3.根據(jù)權利要求1所述的鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(3)梯度洗脫的流動相為0.1 3%的磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫時間為20 180min，紫外檢測波長為240 ^2nm。
4.如權利要求3所述的鄧老涼茶顆粒制劑指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟(3) 色譜條件中所述的梯度洗脫，梯度洗脫程序以如下濃度配置進行O分鐘時，流動相A為95%、流動相B為5% ； 3分鐘時，流動相A為95%、流動相B為5% ； 9分鐘時，流動相A為80%、流動相B為20% ； 13分鐘時，流動相A為80%、流動相B為20% ； 20分鐘時，流動相A為5 %、流動相B為95 %。
5.根據(jù)權利要求1所述的鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(4)測定精密吸取供試品溶液0.5 20 μ 1注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
6.根據(jù)權利要求1所述的鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的建立方法，其特征是在于所述步驟(5)相似度評價供試品指紋圖譜在240 檢測波長下的相似度均大于0.80。
7.根據(jù)權利要求1所述的鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的建立方法，其特征在于測定所得的指紋圖譜中有16個特征共有峰，其中3號、4號、13號、14號色譜峰分別為綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B參照峰，最強峰為3號色譜峰。
全文摘要
鄧老涼茶顆粒指紋圖譜的構建方法及其標準指紋圖譜，涉及中藥制劑的質(zhì)量控制方法，具體是建立HPLC標準指紋圖譜以檢測鄧老涼茶顆粒質(zhì)量的方法。方法包括(1)對照品溶液的配制；(2)供試品溶液的配制；(3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相為0.1～3％磷酸與乙腈組成的梯度洗脫液；柱溫20～50℃；紫外檢測波長240～262nm；流速0.3～1.0mL/min；時間20～60min；(4)測定高效液相色譜法得指紋圖譜。本發(fā)明的有益效果有效表征鄧老涼茶顆粒的質(zhì)量，有利于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控；具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好；可快速準確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。
文檔編號G01N30/02GK102253135SQ201110098429
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權日2011年4月19日
發(fā)明者宋化燦, 張中強, 張翠仙, 李娜, 楊運云, 王冠華, 鄧潔薇, 郭鵬然 申請人:中國廣州分析測試中心