專利名稱：液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及液質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，具體來說，涉及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MQ檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒。
背景技術(shù)：
在世界很多國(guó)家都爆發(fā)過有害的赤潮，海洋貝類可在體內(nèi)富集赤潮藻毒素并通過食物鏈對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生危害。廣泛調(diào)查顯示，中國(guó)雙殼貝類已經(jīng)受到了赤潮藻毒素的污染，其中腹瀉性貝毒(DSP)存在比較普遍。DSP是由有毒赤潮藻類鰭藻屬Dinophysis和原甲藻屬ftOrocentrum中部分藻種產(chǎn)生的一類脂溶性天然化合物，其主要成分為軟海綿酸 (okadaic acid, OA)及鰭藻毒素DTXl。0A、DTX1是腫瘤促進(jìn)因子，具有遺傳毒性，可導(dǎo)致DNA 加合物的形成。如果貝肝臟內(nèi)OA和DTXl的含量分別超過2 μ g/g和1. 8 μ g/g，就不宜食用。歐盟對(duì)OA、DTXl采用的食品安全限量標(biāo)準(zhǔn)分別是20μ g/100g、16y g/100g貝類鮮肉。 因此，建立快速、準(zhǔn)確的DSP檢測(cè)技術(shù)對(duì)食品安全和赤潮監(jiān)測(cè)都具有十分重要的意義。常用的DSP檢測(cè)方法有小鼠生物法、ELISA、免疫金標(biāo)、HPLC法等。生物法和免疫法不穩(wěn)定，常伴有假陽性、假陰性結(jié)果。0A、DTX1沒有紫外吸收，單純HPLC檢測(cè)樣品需經(jīng)繁瑣的衍生過程，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，誤差大。液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可確證分析藻類和貝類中的各種生物毒素，但對(duì)樣品前處理要求高，前處理繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)是液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，克服現(xiàn)有液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)DSP中的OA和 DTXl是樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)的缺陷，應(yīng)用超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/ Q-T0FMS)快速檢測(cè)OA和DTX1，并將其用于市售海產(chǎn)貝類的檢測(cè)，以期為有毒赤潮研究和食品安全檢驗(yàn)提供快捷、高效的檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，液質(zhì)聯(lián)用快速檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法， 包括如下步驟(1)貝類樣品的制備將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，混勻振蕩后，4°C離心，上清液加入正己烷萃取后，合并甲醇相，加入含乙酸的水，用三氯甲烷重復(fù)萃取，最后通入N2蒸干去掉有機(jī)相；殘?jiān)眉状荚偃芙舛ㄈ?，高速離心或過濾膜，待UPLC/MS檢測(cè)；(2)UPLC/Q-T0FMS分析ESI_模式，選擇離子化后的0A、DTX1的分子離子[Μ_Η]_作為前體離子進(jìn)行TOFMS掃描、測(cè)定；①色譜條件超高效液相色譜儀UPLC Acquity BEH色譜柱2. ImmX 100mm，1. 7μπι ；流動(dòng)相Α相為含甲酸的水，B相為含甲酸的乙腈；
梯度洗脫采用A B從Omin的85 15到25min的1 99 ；、流速0. 2 0. 5mL/min ；柱溫35 40°C;進(jìn)樣量20yL;②質(zhì)譜條件離子源ESI_電離源，噴霧電壓2 2. 6kV，霧化氣流量500 800L/h，去溶劑溫度300 350°C，離子源溫度100 150°C，碰撞能量3 4eV ；掃描時(shí)間0. 3s，掃描間隔時(shí)間0. 02s，掃描范圍m/z 50-1500 ；選取亮氨酸腦啡呔用于外標(biāo)校正。(3)0A和DTXl標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示0A和DTXl 的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 y = 0. 2504x-0. 978，R2 = 0. 999 ；y = 0. 2417χ_0· 557，R2 = 0. 998，其中，χ為峰面積，y為濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定被檢查貝類中OA和DTXl的含量。為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加精確，所述的步驟還包括回收率實(shí)驗(yàn)。優(yōu)選地，所述的步驟(1)貝類樣品的制備中，將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，漩渦混勻l_3min，超聲振蕩l-;3min，5000r/min，4°C離心5min ；上清液加入正己烷，漩渦混勻，靜置分層棄去上層正己烷，合并甲醇相，加入含0. 2 %乙酸的水，用三氯甲烷重復(fù)提取，合并下層的三氯甲烷相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀通入N2蒸干去掉有機(jī)相；殘?jiān)眉状荚偃芙舛ㄈ?，高速離心10000r/min，lOmin，待UPLC/MS檢測(cè)。優(yōu)選地，所述的步驟(1)中，殘?jiān)眉状荚偃芙夂蠖ㄈ?，過濾膜；待UPLC/MS檢測(cè)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、應(yīng)用范圍廣。赤潮爆發(fā)季節(jié)貝類中的腹瀉性貝毒(DSP)的存在比較普遍，不論是保障食品安全還是赤潮監(jiān)測(cè)都需要針對(duì)DSP的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。因此本研究具有重要應(yīng)用價(jià)值。2、液-質(zhì)聯(lián)用可準(zhǔn)確分析藻類、貝類中的生物毒素，及時(shí)有效地監(jiān)測(cè)毒素的污染情況。應(yīng)用UPLC/Q-TOFMS檢測(cè)DSP中的OA和DTXl有如下優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC 的速度、靈敏度要高數(shù)倍。Q-TOF MS兼具高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，可以在極低的濃度下作全譜掃描、提供精確質(zhì)量，能對(duì)微量腹瀉性貝毒OA、DTXl進(jìn)行鑒別和測(cè)定。3、樣本預(yù)處理快，相對(duì)于傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，單個(gè)樣本預(yù)處理時(shí)間節(jié)省0. 5-lh。 經(jīng)比較選擇貝肉樣，提取流程經(jīng)簡(jiǎn)化，再比消化腺樣本節(jié)省提取時(shí)間約lh。4、儀器自動(dòng)進(jìn)樣，適于大批量生物樣品的篩查。5、UPLC/Q-TOFMS可以對(duì)樣本中的其它未知毒素進(jìn)行鑒定。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
在液質(zhì)聯(lián)用快速檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的應(yīng)用中，首先根據(jù)實(shí)施示例中樣本快速前處理流程提取DSP，研究UPLC/Q-T0FMS對(duì)DSP粗體液的分析檢測(cè)效果；針對(duì)貝肌肉樣和消化腺樣，再研究比較堿水解處理對(duì)染毒文蛤消化腺樣本和肌肉樣本中OA和DTXl含量的影響。結(jié)果表明，UPLC/Q-T0FMS能檢測(cè)分析快速提取樣本中的DSP，堿水解后染毒文蛤消化腺中OA和DTXl的含量相對(duì)于水解前劇烈增加，肌肉中毒素含量略有增加。鑒于水解過程耗時(shí)長(zhǎng)(約Ih/樣本)，為簡(jiǎn)化預(yù)處理，決定選擇肌肉樣本，不經(jīng)水解，可實(shí)現(xiàn)貝樣的快速前處理。實(shí)施例1.稱取2g已勻漿人工投喂染毒的文蛤肌肉樣品于IOml離心管中，加入3mL 80% 甲醇水溶液。漩渦混勻lmin，超聲振蕩lmin，4°C離心(5000r/min，5min)。上清液移入另一干凈離心管，殘?jiān)侔瓷鲜龇椒ㄌ崛∫淮巍：喜⑸锨逡?，加?mL正己烷，漩渦混勻，靜置分層棄去上層正己烷，重復(fù)一次，合并甲醇相，加入Iml水(含0. 2 %乙酸)，用6ml三氯甲烷重復(fù)提取兩次，合并下層的三氯甲烷相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀通入隊(duì)蒸干去掉有機(jī)相，殘?jiān)肏PLC 級(jí)甲醇再溶解，并定容至Iml (相當(dāng)與2g肌肉/ml)。高速離心(lOOOOr/min，IOmin)或過 0. 22 μ m濾膜，待UPLC/MS檢測(cè)。2. UPLC/Q-T0FMS分析電噴霧負(fù)離子模式，選擇離子化后的OA、DTXl的分子離子[M-H]-作為前體離子進(jìn)行TOFMS掃描、測(cè)定。色譜條件UPLC Acquity BEH色譜柱 (2. ImmXlOOmm, 1. 7 μ m)；流動(dòng)相A相為含0. 1 %甲酸的水，B相為含0. 1 %甲酸的乙腈；流速0. 4mL/min ； 采用A B從Omin(85 15)到25min(l 99)的梯度程序洗脫；柱溫40°C，自動(dòng)進(jìn)樣量 20 μ L0質(zhì)譜條件超高效液相色譜儀UPLC Acquity BEH, ESI電離源，負(fù)離子方式檢測(cè)時(shí)噴霧電壓為2. 6kV，霧化氣流量700L/h，去溶劑溫度350°C，離子源溫度100°C。碰撞能量為 4eV。掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0. 0k。掃描范圍m/z 50-1500。選取200mg/L亮氨酸腦啡呔用于外標(biāo)(Lock Spray)校正，流速0. 05mL/min。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取OA和DTXl標(biāo)準(zhǔn)母液，用無毒文蛤肌肉樣的基體加標(biāo)配成 0. 01,0. 02,0. 05,0. 10,0. 20,0. 50 μ g/mL 的 OA 禾口 DTXl 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。以 LC-MS 測(cè)得的提取離子的峰面積為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，OA和DTXl的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y = 0. 2504χ-0. 978，R2 = 0. 999 ；y = 0. 2417x-0. 557，R2 = 0. 998 (χ 為峰面積，y 為濃度)。4.回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取無毒的貝肌肉樣品2g，定量加入標(biāo)準(zhǔn)品，使添加量相當(dāng)于0. 2 μ g/g、0. 4 μ g/g、0. 8 μ g/g，測(cè)定加樣回收率?；厥章?樣品實(shí)測(cè)濃度/樣品理論濃度X 100%。結(jié)果OA的回收率為101. 58% -107. 14%，平均回收率103. 51%,DTXl的回收率為98. 06% -103. 93%，平均回收率100. 20%。對(duì)OA和DTXl基體加標(biāo)溶液(0. 2 μ g/g) 進(jìn)行6次重復(fù)進(jìn)樣分析，測(cè)得峰面積，分別計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。OA和DTXl的RSD 分別為4. 30%,4. 00%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)，符合定量分析的要求。根據(jù)信噪比S/ N = 10，計(jì)算最低定量限濃度。當(dāng)OA、DTXl濃度達(dá)2 μ g/L時(shí)，20 μ L上樣，此時(shí)OA和DTXl 基體加標(biāo)樣品的檢出限均為40pg(相當(dāng)于2X 10_3μ g/100g貝類鮮肉)，遠(yuǎn)低于人們對(duì)0A、 DTXl的控制標(biāo)準(zhǔn)(EU/SANC0，2001 20 μ g/100g, 16 μ g/100g貝類鮮肉)，能夠滿足食品安全檢測(cè)需要。 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.液質(zhì)聯(lián)用快速檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，包括如下步驟(1)貝類樣品的制備將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，混勻振蕩后，4°C離心，上清液加入正己烷萃取后，合并甲醇相，加入含乙酸的水，用三氯甲烷重復(fù)萃取，最后通入N2 蒸干去掉有機(jī)相；殘?jiān)眉状荚偃芙舛ㄈ?，高速離心或過濾膜，待UPLC/MS檢測(cè)；(2)UPLC/Q-T0FMS分析ESI_模式，選擇離子化后的OA、DTXl的分子離子[M_H]_作為前體離子進(jìn)行TOFMS掃描、測(cè)定；(3)OA和DTXl標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示0A和DTXl的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 y = 0. 2504x-0. 978，R2 = 0. 999 ；y = 0. 2417χ_0· 557，R2 = 0. 998，其中，χ 為峰面積，y為濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定被檢查貝類中OA和DTXl的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)的色譜條件為超高效液相色譜儀UPLC Acquity BEH色譜柱2. ImmX 100mm, 1. 7 μ m ；流動(dòng)相A相為含甲酸的水，B相為含甲酸的乙腈；梯度洗脫采用A B從Omin的85 15到25min的1 99 ；流速0. 2 0. 5mL/min ；柱溫35 40°C。
3.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)的質(zhì)譜條件為離子源ESI-電離源， 噴霧電壓2 2. 6kV, 霧化氣流量500 800L/h， 去溶劑溫度300 350°C， 離子源溫度100 150°C， 碰撞能量3 ^V。
4.如權(quán)利要求3所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)的質(zhì)譜條件中，掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0. 02s，掃描范圍m/z 50-1500 ；選取亮氨酸腦啡呔用于外標(biāo)校正。
5.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)UPLC/Q-T0FMS分析的色譜條件，其中，A相為含0. 1 %甲酸的水，B相為含0. 甲酸的乙腈。
6.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)UPLC/Q-T0FMS分析的色譜條件，其中，流速為0. 4mL/min ；柱溫40°C，自動(dòng)進(jìn)樣量 20 μ L0
7.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述步驟O)UPLC/Q-T0FMS分析的質(zhì)譜條件，其中，負(fù)離子方式檢測(cè)時(shí)噴霧電壓為2. 6kV，霧化氣流量700L/h，去溶劑溫度350°C，離子源溫度100°C ；碰撞能量為如V。
8.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述的步驟(1)貝類樣品的制備中，將貝樣勻漿，加入75-85%甲醇水溶液，混勻l-3min，振蕩 l-3min，離心；上清液加入正己烷，漩渦混勻，靜置分層棄去上層正己烷，合并甲醇相，加入酸性水，用三氯甲烷重復(fù)提取，合并下層的三氯甲烷相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀通入隊(duì)蒸干去掉有機(jī)相；所述高速離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，時(shí)間為lOmin。
9.如權(quán)利要求7所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中，殘?jiān)眉状荚偃芙夂蠖ㄈ?，過濾膜；待UPLC/MS檢測(cè)。
10.如權(quán)利要求1所述的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)貝肉中腹瀉性貝毒的方法，其特征在于，所述的步驟還包括回收率實(shí)驗(yàn)。
全文摘要
針對(duì)現(xiàn)有液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)DSP存在樣品前處理復(fù)雜、工作量大、成本高、耗時(shí)多的問題。研究了貝樣中DSP的快速提取流程，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中的UPLC/Q-TOFMS檢測(cè)，并將其用于市售海產(chǎn)貝類的實(shí)際檢測(cè)，以期為有毒赤潮研究和食品安全檢驗(yàn)提供高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102213702SQ201110129800
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者何培民, 馮子慧, 唐晨, 汪卿, 胡樂琴, 賈睿, 饒濤 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)