專利名稱：海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的定量方法，尤其是涉及一種基于時(shí)間序列觀察、自動(dòng)成像和數(shù)字化分析的落式熒光顯微鏡法的海洋環(huán)境中獨(dú)特的含細(xì)菌葉綠素(Bchl.a)的微生物群的準(zhǔn)確定量方法，
背景技術(shù)：
含細(xì)菌葉綠素的微生物(BCM，Bacteriochlorophyll a Containing Microbes) 是海洋環(huán)境微生物群落中一類具有特殊功能的組分，由于缺少有效的豐度計(jì)數(shù)用于構(gòu)建其動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，其生態(tài)功能還不是很清楚。好氧不產(chǎn)氧光合異養(yǎng)細(xì)菌(AAPB，Aerobic Anoxygenic Phototrophic Bacteria)是一類新近認(rèn)識(shí)的BCM主要類群，已經(jīng)有報(bào)道表明， 這類菌群對(duì)海洋碳循環(huán)有著極其重要的作用。全面理解AAPB的廣泛分布和獨(dú)特功能將對(duì)目前建立在產(chǎn)氧光合作用基礎(chǔ)上的海洋能量和氧平衡的理解產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。然而一直以來(lái)，由于單細(xì)胞細(xì)菌葉綠素含量很低，且受葉綠素的紅外干擾，BCM的準(zhǔn)確定量比較困難。目前為止，用于海洋中BCM的計(jì)數(shù)方法主要有以下幾種紅外快速脈沖速率 (IRFRI )誘導(dǎo)熒光瞬時(shí)動(dòng)力學(xué)技術(shù)(Kolber et al.，2000)、紅外落式熒光顯微鏡技術(shù) (IREM) (Kolber et al.，2001)、高效液相色譜法(HPLC) (Goericke，2002)、雙重調(diào)節(jié)技術(shù) (dual modulation techniques) (Koblizek et al. ,2005)和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QPCR) (Schwalbach and Fuhrman, 2005)等。上述各種方法中，無(wú)論是監(jiān)測(cè)細(xì)菌光合作用過(guò)程中電子傳遞的IRFRR技術(shù)，還是直接測(cè)定細(xì)菌葉綠素a和葉綠素a的含量及比值(BChl. a/Chl. a)的HPLC技術(shù)以及基于光合基因的定量QPCR技術(shù)都不能直接提供海洋中BCM的豐度，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物功能群的直接測(cè)量。而以BChl. a所發(fā)的紅外熒光為檢測(cè)信號(hào)IREM技術(shù)則是檢測(cè)海洋中BCM豐度的最簡(jiǎn)便的方法(Kolber et al. ,2001 ；Schwalbach and Fuhrman，2005)。但是，實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，所有含葉綠素的自養(yǎng)生物都會(huì)被IREM法計(jì)入BCM中，因?yàn)樗鼈冊(cè)谶m當(dāng)波長(zhǎng)的光的激發(fā)下都能在一定程度上發(fā)出紅外熒光。而野外海水樣中，藍(lán)細(xì)菌(海洋環(huán)境中常見(jiàn)的屬為原綠球藻和聚球藻)的豐度大到足以干擾BCM計(jì)數(shù)，導(dǎo)致了 IREM法的顯著陽(yáng)性誤差(Zhang and Jiao 2004； Schwalbach and Fuhrman，2005)。申請(qǐng)者在東海的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，淺水域中由聚球藻所引進(jìn)的正誤差可高達(dá)30% (Zhang and Jiao2007)。即便是應(yīng)用此類藍(lán)細(xì)菌(聚球藻)的紅色熒光圖像從細(xì)胞粒徑上或者通過(guò)紅外、紅色熒光信號(hào)的差減進(jìn)行誤差校正，而由另一類藍(lán)細(xì)菌——原綠球藻所引進(jìn)的誤差則又無(wú)法計(jì)算。因?yàn)樵G球藻不僅粒徑與細(xì)菌細(xì)胞相似， 而且所發(fā)出的紅色熒光信號(hào)可被海水樣中共存的具強(qiáng)熒光的聚球藻(Synechococcus)所掩蓋，從而在最初的藍(lán)細(xì)菌紅色熒光視野下無(wú)法被觀察到。在經(jīng)典的落式熒光顯微鏡(EM) 或IREM法中，為了防止聚球藻熒光猝滅而進(jìn)行快速觀察，導(dǎo)致在采用最初的藍(lán)細(xì)菌圖像進(jìn)行誤差校正時(shí)，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)原綠球藻對(duì)BCM計(jì)數(shù)造成的嚴(yán)重誤差的校正Ghang and Jiao 2004 ；Schwalbach and Fuhrman,2005)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)IREM法不能解決的聚球藻和原綠球藻共存所引起的海洋中BCM計(jì)數(shù)的誤差，提供一種新的能對(duì)海洋中BCM進(jìn)行準(zhǔn)確定量的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是基于時(shí)間序列觀察的扣除藍(lán)細(xì)菌誤差的紅外落式熒光 M '1 Ia (Time-series observation based cyanobacteria~calibrated Infrared Epifluorescence Microscopy, TIREM)，該法能準(zhǔn)確計(jì)算出聚球藻和原綠球藻的總數(shù)，再通過(guò)邏輯運(yùn)算從而對(duì)海洋中BCM進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。本發(fā)明包括以下步驟1)將樣品預(yù)過(guò)濾、固定、DAPI (4' 6-diamidino-2_phenylindole，一種雙鏈 DNA 熒光染料)染色、過(guò)濾并制片；2)用配有紅外敏感的電子耦合組件(CCD)照相機(jī)和汞燈的全自動(dòng)落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以不同的熒光激發(fā)塊分別對(duì)同一視野的紅外熒光(IR)、藍(lán)細(xì)菌紅色熒光 (Cyano)和DAPI藍(lán)色熒光圖像進(jìn)行觀察和拍照，所有的圖像均通過(guò)自動(dòng)曝光獲得，顯微聚焦后，進(jìn)行IR、Cyano和DAPI圖像時(shí)間序列上的獲??；在步驟2)中，所述汞燈可采用IOOW汞燈(OLYMPUS U-LH100HGAP0)；所述以不同的熒光激發(fā)塊可采用3組不同的熒光激發(fā)塊；所述顯微聚焦后，進(jìn)行^、Cyano和DAPI圖像時(shí)間序列上的獲取可每隔60s獲取一張圖像，持續(xù)10 15min。3)用 Image-Pro Plus(IPP)軟件(Media Cybernetics, Inc.)對(duì)圖像中的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像；4)計(jì)算在一個(gè)相同的視野下，分別獲得時(shí)間序列下初始時(shí)間的頂圖像(記為圖像a)、平臺(tái)期的Cyano圖像(記為圖像b)和初始時(shí)間的DAPI圖像(記為圖像c)，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化圖像(記為圖像d、圖像e和圖像f)，則海洋中BCM的豐度=Boolean AND [(d)，(f)]-Boolean AND [(d)，(e)]，其中 “Boolean AND” 指“邏輯運(yùn)算與”。在步驟4)中，所述平臺(tái)期的Cyano圖像是時(shí)間序列觀察中獲得的藍(lán)細(xì)菌數(shù)目最大的圖像，同時(shí)包括聚球藻和原綠球藻。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于技術(shù)的普及性(落式熒光顯微鏡在一般實(shí)驗(yàn)室均有提供)；容易操作且花費(fèi)??；能夠在單細(xì)胞水平上將海洋中BCM、聚球藻和原綠球藻與樣品中的其它細(xì)菌區(qū)別開(kāi)來(lái)，從而可對(duì)海洋中的BCM進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
具體實(shí)施例方式1)將所采樣品先以20 μ m的篩絹預(yù)過(guò)濾以除去大的有機(jī)生物體和無(wú)機(jī)物顆粒，后用終濃度為2%的多聚甲醛(PFA)固定15min，再以終濃度為5μ g/ml的DAPI染色30min， 之后細(xì)胞被過(guò)濾到0.2μπι孔徑的黑色聚碳酸酯(PC)膜(Whatman)上。剪取1/4膜樣，細(xì)胞面朝上置于玻片上，滴上防猝滅鏡油，蓋上蓋玻片。2)用全自動(dòng)落式熒光顯微鏡(OLYMPUS BX61)對(duì)制片進(jìn)行觀察，所用的熒光激發(fā)塊如下所示。含紅外熒光的細(xì)胞所用的熒光激發(fā)塊(Chroma Technology Corp)是 350-550nm 激發(fā)，LP 850nm 發(fā)射，650nm 分光(OLYMPUS U-MWIY2) (Kolber et al. ,2001 ； Zhang and Jiao,2004) (IR-settings) 0染DAPI的細(xì)胞用于對(duì)照，其所用的熒光激發(fā)塊是330-385nm 激發(fā)，420nm 發(fā)射，400nm 分光(OLYMPUS U-MWU2) (KoIber et al. ,2001 ；Zhang and Jiao，2004) (DAPI-settings)。藍(lán)細(xì)菌(主要包括聚球藻和原綠球藻)細(xì)胞紅色熒光信號(hào)所用的熒光激發(fā)塊是530-550nm激發(fā)，475IFnm發(fā)射(Li and Wood，1988 ；Sherry and Wood，2001)，570nm 分光(OLYMPUS U-MWIG3) (Cyano-settings)。每個(gè)顯微鏡視野用 XlOO 的油鏡觀察，對(duì)同一個(gè)視野同時(shí)獲得紅外圖像(IR)、藍(lán)細(xì)菌圖像(Cyano)和DAPI圖像。所有的圖像均通過(guò)自動(dòng)曝光獲得，其“gain limit”(增益限制，自動(dòng)成像軟件中的一個(gè)設(shè)置參數(shù))是8。時(shí)間序列的IR、Cyan0和DAPI圖像在初始約30秒的聚焦步驟后，連續(xù)被捕獲 10-15min,時(shí)間間隔是60秒。3)圖像中的細(xì)胞用 Image-Pro Plus(IPP)軟件(Media Cybernetics, Inc.)進(jìn)行識(shí)別和分析。首先通過(guò)測(cè)定平均背景灰度值重新生成灰度圖像，使原始圖像標(biāo)準(zhǔn)化。圖像中的細(xì)胞邊界以IPP的“Variance filter” (差異過(guò)濾，IPP軟件中的一個(gè)設(shè)置參數(shù))來(lái)測(cè)定并強(qiáng)化，“Variance filter”會(huì)以灰度值計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)替換周圍3X3相鄰像素點(diǎn)灰度值。生成的圖像以“3X3neighborhood median filter”(3X3相鄰中值過(guò)濾，IPP軟件中的一個(gè)設(shè)置參數(shù))進(jìn)行弱化。最后軟件以一固定設(shè)置的灰度值自動(dòng)識(shí)別細(xì)胞，從而獲得二元圖像。將CXD圖像中的點(diǎn)進(jìn)行二元數(shù)字化以產(chǎn)生一個(gè)新的圖像，可以獲得更可信可比的數(shù)據(jù)。在這個(gè)二元圖像中背景灰度值為“0”，而每個(gè)被識(shí)別的點(diǎn)不管大小都為“1”。最后，不同圖像之間的細(xì)胞定位可以通過(guò)邏輯運(yùn)算“與”(AND)來(lái)進(jìn)行。4)計(jì)算在一個(gè)相同的視野下，分別獲得時(shí)間序列下初始時(shí)間的頂圖像a、平臺(tái)期的藍(lán)細(xì)菌圖像b (時(shí)間序列觀察中獲得的藍(lán)細(xì)菌數(shù)目最大的圖像，同時(shí)包括聚球藻和原綠球藻)和初始時(shí)間的DAPI圖像c，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化分析結(jié)果圖像d、e和f，則海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的豐度=Boolean AND [(d), (f)]-Boolean AND [(d), (e)]。應(yīng)用本發(fā)明在中國(guó)南海、東海，以及太平洋、大西洋和印度洋進(jìn)行了跨熱帶、溫帶、 亞寒帶，沿近岸到大洋多個(gè)梯度上BCM檢測(cè)分析，并對(duì)其中的主要類群——好氧不產(chǎn)氧光合異氧細(xì)菌(AAPB)的豐度和所占總細(xì)菌的比例進(jìn)行了生態(tài)學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，該方法可糾正近海10% 60%、陸架約30% 500%，以及大洋高達(dá)200% 10000%的假陽(yáng)性誤差；所獲得的AAPB準(zhǔn)確豐度和比例數(shù)據(jù)顯示其分布與所處海區(qū)的營(yíng)養(yǎng)狀況呈正相關(guān)，其在近岸的比例可高達(dá)16%，而在開(kāi)闊大洋區(qū)域則低至甚至更低，修正了之前關(guān)于AAPB在大洋所占比例高達(dá)11%的報(bào)道。
權(quán)利要求
1.海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法，其特征在于包括以下步驟1)將樣品預(yù)過(guò)濾、固定、DAPI染色、過(guò)濾并制片；2)用配有紅外敏感的電子耦合組件照相機(jī)和汞燈的全自動(dòng)落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察， 以不同的熒光激發(fā)塊分別對(duì)同一視野的紅外熒光、藍(lán)細(xì)菌紅色熒光和DAPI藍(lán)色熒光圖像進(jìn)行觀察和拍照，所有的圖像均通過(guò)自動(dòng)曝光獲得，顯微聚焦后，進(jìn)行IR、Cyano和DAPI圖像時(shí)間序列上的獲??；3)用Image-ProPlus軟件對(duì)圖像中的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像；4)計(jì)算在一個(gè)相同的視野下，分別獲得時(shí)間序列下初始時(shí)間的頂圖像、平臺(tái)期的 Cyano圖像和初始時(shí)間的DAPI圖像，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化圖像，則海洋中BCM的豐度=Boolean AND [(d)，(f)]-Boolean AND [(d)，(e)]，其中“Boolean AND” 指“邏輯運(yùn)算與”。
2.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法，其特征在于在步驟 2)中，所述汞燈采用IOOW汞燈。
3.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法，其特征在于在步驟 2)中，所述以不同的熒光激發(fā)塊采用3組不同的熒光激發(fā)塊。
4.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法，其特征在于在步驟 2)中，所述顯微聚焦后，進(jìn)行IR、Cyano和DAPI圖像時(shí)間序列上的獲取是每隔60s獲取一張圖像，持續(xù)10 15min。
5.如權(quán)利要求1所述的海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法，其特征在于在步驟 4)中，所述平臺(tái)期的Cyano圖像是時(shí)間序列觀察中獲得的藍(lán)細(xì)菌數(shù)目最大的圖像，同時(shí)包括聚球藻和原綠球藻。
全文摘要
海洋中含細(xì)菌葉綠素的微生物的定量方法，涉及一種微生物的定量方法。將樣品預(yù)過(guò)濾、固定、DAPI染色、過(guò)濾并制片；用配有照相機(jī)和汞燈的全自動(dòng)落式熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，以不同的熒光激發(fā)塊對(duì)同一視野的紅外熒光、藍(lán)細(xì)菌紅色熒光和DAPI藍(lán)色熒光圖像進(jìn)行觀察和拍照，所有的圖像均通過(guò)自動(dòng)曝光獲得，顯微聚焦后，進(jìn)行IR、Cyano和DAPI圖像時(shí)間序列上的獲??；用Image-Pro Plus軟件對(duì)圖像中的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和分析，并獲得新的二元數(shù)字化圖像；在一個(gè)相同的視野下，分別獲得時(shí)間序列下初始時(shí)間的IR圖像、平臺(tái)期的Cyano圖像和初始時(shí)間的DAPI圖像，并分別獲得相應(yīng)的二元數(shù)字化圖像，即得海洋中BCM的豐度。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102346146SQ20111020056
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者張瑤, 焦念志, 趙子豪 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)