專利名稱：利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于肝素的檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法。
背景技術(shù)：
肝素Q^parin)是由D- β -葡糖醛酸(或L- α -艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖通過糖苷鍵連接形成的重復(fù)二糖單元組成的一種糖胺聚糖，是蛋白多糖的一種。作為有效的抗凝劑，肝素能抑制血小板聚集，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放抗凝物質(zhì)和纖溶物質(zhì)，抑制凝血酶的形成及活性，并能促使纖維蛋白溶解。因此是臨床上常用的抗凝血藥物，主要用于外科預(yù)防血栓形成以及妊娠者的抗凝血治療，以及在心臟手術(shù)和腎臟透析時維持血液體外循環(huán)暢通。但當(dāng)肝素用量過大時會引起自發(fā)性出血，如各種黏膜出血、關(guān)節(jié)腔積血和傷口出血等，在臨床應(yīng)用中需要進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控。因此，研究肝素的定量測定方法具有十分重要的臨床意義。肝素的常用測量方法主要有電化學(xué)分析法、分光光度法、熒光法、區(qū)帶毛細(xì)管電泳法、 高效液相色譜法及比色法等。電化學(xué)方法則易受到溶液中氧氣的干擾，分光光度法靈敏度不高，熒光法容易產(chǎn)生光漂白問題，影響測定的準(zhǔn)確性，毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法需要昂貴的儀器，操作不便，而比色法主要是基于納米粒子與肝素作用改變納米顆粒的大小， 導(dǎo)致納米粒子的光信號改變，并可通過肉眼檢測顏色的變化，具有簡單，快速，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。貴重金屬納米粒子(NPs)，如Au NPs和Ag NPs由于其表面等離子共振吸收峰而具有獨(dú)特的光學(xué)性能，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用引起了相當(dāng)大的關(guān)注，尤其是在生物傳感、疾病診斷、光熱療法以及藥物和基因傳遞領(lǐng)域。在眾多的以聚合物輔助合成的Au Ws的實(shí)例中，以聚乙烯亞胺(PEI)為穩(wěn)定劑和還原劑通過原位自動還原的方法合成的納米粒子已經(jīng)引起人們大量的關(guān)注。這主要是由于聚乙烯亞胺價廉易得，并且利用其分子結(jié)構(gòu)中大量的氨基還原金納米顆?？梢员苊馀饸浠c等還原劑的使用，同時也不涉及高溫高壓的反應(yīng)條件， 是一種簡便、綠色的金納米顆粒的制備方法。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前還未見利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子來檢測肝素含量的方法的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，該方法簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，低能耗無污染，符合綠色化學(xué)的要求，同時所用金納米顆粒的穩(wěn)定劑為聚乙烯亞胺，價廉易得，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景。本發(fā)明的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，包括(1)在100_200μ L聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，加入2. 9mL pH值為 3.6的醋酸鹽緩沖溶液，室溫放置15min后測試其紫外吸收曲線；(2)在η份與步驟(1)中相同體積的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，分別加入2. 9mL含有不同濃度肝素的醋酸鹽緩沖溶液，得到η份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度為 0. 5-15 μ g/mL，20 ^ η ^ 80 ；(3)將步驟(2)得到的η份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液，在室溫下放置15min后，分別測試其紫外吸收曲線；(4)根據(jù)步驟⑴和(3)中所得到的紫外吸收曲線，得出步驟(2)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值的關(guān)系；(5)測試肝素樣品將90-330yg的肝素樣品溶解在^ml醋酸鹽緩沖液中，加入 Iml聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液，室溫放置15min，測試其紫外吸收曲線；然后計(jì)算肝素樣品的紫外吸收曲線中670nm處吸收值與處吸收值的比值，利用步驟(4) 中所述的肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值的關(guān)系確定肝素樣品中肝素的濃度。步驟(1)和O)中所述的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液的制備方法為 稱取聚乙烯亞胺3-6mg，溶解在IOmL水中，然后邊攪拌邊滴加100-200 μ L濃度為48. 6mg/ mL氯金酸溶液，反應(yīng)2-6天，得到聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米顆粒的水溶液，隨后將該水溶液置于4°C冰箱中冷藏備用。上述的聚乙烯亞胺為超支化聚乙烯亞胺。上述的氯金酸與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為1.62 1。上述的反應(yīng)2-6天中的反應(yīng)溫度為25_37°C，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)時間會有所縮短，同時溫度太低不利于金納米顆粒的形成，溫度太高會使產(chǎn)生的金納米顆粒不夠穩(wěn)定，最后產(chǎn)物為酒紅色納米金的水溶液。步驟(1)和O)中所述的醋酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 02-0. 08Mo步驟O)中所述的η份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度分別為 1 μ g/mLU. 5 μ g/mL,2 μ g/mL,2. 5 μ g/mL,3 μ g/mL,3. 5 μ g/mL,4 μ g/ mL、4.5 μ g/mL、5 μ g/mL、5. 5 μ g/mL、6 μ g/mL、6. 5 μ g/mL、7 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、8 μ g/mL、 8.5 μ g/mL、9 μ g/mL、9· 5 μ g/mL、10 μ g/mL、10. 5 μ g/mL、11 μ g/mL、11. 5 μ g/mL、12 μ g/mL, η = 23。步驟(3)中測試得到的樣品的最大紫外吸收波長為5^nm，所用定量依據(jù)是樣品在670nm與529nm處的吸光值的比值與肝素濃度之間存在的定量關(guān)系。步驟中所述的步驟O)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與處吸收值的比值的關(guān)系為當(dāng)步驟O)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度為3-8 μ g/mL時，其濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與處吸收值的比值呈指數(shù)關(guān)系，其中 Y = O. 40614+1. 02292X IO"4Xe(x/L 02369), R2 = 0. 99058，如圖 6(b)所示； 當(dāng)步驟O)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度為 7-11 μ g/mL時，其濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值呈線性關(guān)系，其中Y = -0. 56446+0. 15069X，R = 0. 99757，如圖6(a)所示；肝素濃度的最低檢測限為 1. 5 μ g/mL。
從紫外圖(圖4)中可以看出，肝素的加入對金納米顆粒的紫外吸收曲線有較大的影響，同時隨著肝素濃度的增加，其紫外吸收值在529nm逐漸減小，而在670nm處吸收值逐漸增加，在一定范圍內(nèi)可用670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值定量計(jì)算肝素含量。測試結(jié)果表明當(dāng)肝素濃度在3-8 μ g/mL時，其濃度和金納米顆粒在670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值呈指數(shù)關(guān)系；當(dāng)肝素濃度在7_11 μ g/mL時，其濃度和金納米顆粒在670nm處吸收值與處吸收值的比值呈線性關(guān)系，最低檢測限為1. 5μ g/mL，表現(xiàn)出良好的實(shí)際應(yīng)用價值。選擇性測試(以驗(yàn)證常見聚合物的加入對金納米顆粒沒有影響，從而它們的存在不會干擾肝素的測定)(1)在100-200 μ L聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，加入ρΗ值為3. 6的醋酸鹽緩沖溶液2. 9mL，室溫放置15min后測試其紫外吸收曲線；(2)在ρΗ值為3. 6的醋酸鹽緩沖溶液中加入聚賴氨酸，得聚賴氨酸濃度為10 μ g/ mL的溶液B，取2. 9mL上述的溶液B，加入到與步驟(1)中相同體積的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，得到含有聚賴氨酸的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；(3)按照步驟O)的方法，分別制得含有殼聚糖、葡萄糖、半胱氨酸、硫酸軟骨素或氯化鈉的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；(4)將步驟( 和( 所得的溶液，在室溫放置15min后，本別測試其紫外吸收曲線.
一入 ，(5)在ρΗ值為3. 6的醋酸鹽緩沖溶液中加入肝素和殼聚糖，得肝素和殼聚糖的濃度分別為5 μ g/mL、10 μ g/mL的溶液C，然后取2. 9mL上述的溶液C，加入到與步驟(1)中相同體積的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，室溫放置15min后測試其紫外吸收曲線。從紫外圖(圖幻中可以看出，聚賴氨酸，殼聚糖，葡萄糖，半胱氨酸，硫酸軟骨素和氯化鈉的加入對金納米顆粒的紫外吸收曲線基本沒有影響，證明金納米顆粒檢測肝素具有高選擇性。另外，在金納米顆粒中加入肝素和殼聚糖的混合液(濃度分別為5 μ g/mL和 10 μ g/mL,以驗(yàn)證加入正電荷物質(zhì)可以阻止肝素的負(fù)電性對金納米顆粒的影響)也對金納米顆粒沒有影響，進(jìn)一步證明了是肝素的負(fù)電性對金納米粒子產(chǎn)生了聚集作用。由于納米金的表面等離子體共振吸收峰隨顆粒粒徑的不同而改變，這一變化可以通過紫外吸收的改變進(jìn)行定量評價，并用于比色化學(xué)傳感器。這種比色化學(xué)傳感器具有響應(yīng)時間快，選擇性好，靈敏度高，可肉眼檢測顏色的變化，實(shí)際應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，在生物分子檢測中受到了廣泛的關(guān)注，并已用于DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的定量檢測。因此本發(fā)明利用肝素這一負(fù)電高聚物來誘導(dǎo)金納米顆粒的粒徑變化，來對肝素進(jìn)行定量。其具體原理為在水溶液中，肝素由于分子結(jié)構(gòu)中所具有的磺酸基和羧酸基酸性基團(tuán)解離而帶有負(fù)電荷，而金納米顆粒表面由于包裹聚乙烯亞胺分子而帶有正電荷。因此，肝素能與聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒發(fā)生靜電吸引作用，使金納米顆粒發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生明顯改變，并產(chǎn)生紫外吸收的變化。根據(jù)紫外吸收值的變化與肝素濃度的關(guān)系建立一種肝素含量的測定方法。本發(fā)明使用紫外-可見分光光度計(jì)(UV-Vis)、透射電子顯微鏡(TEM)、表面電勢、 粒徑等方法表征本發(fā)明制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒及其對肝素的檢測應(yīng)用，具體測試結(jié)果如下(1)紫外-可見光分光光度計(jì)的測試結(jié)果本發(fā)明制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒在529nm處有一個特征吸收峰，這是金納米顆粒的表面等離子體共振峰，參見附圖1 ；且該金納米顆粒材料在不同的PH值(pH 小于5. 6)和不同溫度-70°C )范圍內(nèi)均具有非常好的穩(wěn)定性。(2)透射電子顯微鏡測試結(jié)果本方法制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的TEM圖片和粒度分布直方圖(參見附圖2)，表明形成的金納米顆粒相當(dāng)均勻，粒徑大小為4. 4nm，分布在較窄的范圍內(nèi)。加入 10 μ g/mL肝素后的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的TEM圖片和粒徑分布直方圖(參見附圖3)，表明形成的金納米顆粒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，且粒徑顯著變大，粒徑大小為36nm。表明肝素的加入可以使聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒穩(wěn)定性變差，從而引起了金納米顆粒的聚集。(3)表面電勢及粒徑測試取制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒溶液100 μ L，加入pH 3. 6的醋酸鹽緩沖溶液2. 9mL,室溫放置15min后測試其表面電勢及粒徑，結(jié)果表明其表面電勢為+32. 6mV,粒徑為40. 47nm，表明形成的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒表面帶有大量的正電荷，可以維持其膠體的穩(wěn)定性，同時金納米顆粒的粒徑也較小，但是顯著大于透射電子顯微鏡測試的結(jié)果，主要是因?yàn)槠浼{米粒子和周圍聚乙烯亞胺的水化作用，使得其粒徑為多個納米粒子的團(tuán)簇的粒徑。取制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒溶液100 μ L，加入含有肝素的2. 9mL醋酸鹽緩沖溶液(肝素的終濃度為 ο μ g/mL)，室溫放置15min后測試其表面電勢及粒徑，結(jié)果表明其表面電勢為+5. 88mV，粒徑約為432. 5nm。與沒有加入肝素的金納米顆粒相比其表面電勢顯著變小，失去了膠體的穩(wěn)定性，所以粒徑顯著變大。但是顯著大于透射電子顯微鏡的結(jié)果，主要是因?yàn)槠浼{米粒子和周圍聚乙烯亞胺的水化作用，使得其粒徑為多個納米粒子的團(tuán)簇的粒徑。同時粒徑的結(jié)果也進(jìn)一步證明了由于加入了帶有大量的負(fù)電荷的肝素，可以使聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的表面正電性變小，穩(wěn)定性變差，從而引起了金納米顆粒的聚集。通過將聚乙烯亞胺和氯金酸溶液混合，可在室溫下利用聚乙烯亞胺的氨基原位還原合成金納米顆粒，同時聚乙烯亞胺又可以作為穩(wěn)定劑穩(wěn)定金納米顆粒，阻止其聚集，保證生成的Au Ws的尺寸分布較窄，形態(tài)均一。同時利用金納米顆粒的表面等離子共振吸收峰隨顆粒粒徑的不同而改變的特性將其應(yīng)用于比色化學(xué)傳感器，并成功地應(yīng)用于肝素的定量檢測。有益效果(1)本發(fā)明的檢測方法簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，低能耗無污染，符合綠色化學(xué)的要求，同時所用金納米顆粒的穩(wěn)定劑為聚乙烯亞胺，價廉易得，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前
旦
足；(2)本發(fā)明利用金納米顆粒的表面等離子體共振吸收峰隨顆粒粒徑的不同而改變的特性將其應(yīng)用于比色化學(xué)傳感器，并成功地應(yīng)用于肝素含量的測定，從而使它們具有潛力廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；
(3)本發(fā)明中的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒尺寸相當(dāng)均勻，粒徑分布在較窄的范圍內(nèi)，且粒徑較小，穩(wěn)定性較好，可用于不同領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的紫外吸收光譜圖；圖2為本發(fā)明制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的TEM圖片(a)和粒徑分布直方圖(b)；圖3為加入10 μ g/mL肝素后，本發(fā)明制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的TEM 圖片(a)和粒徑分布直方圖(b)；圖4為加入不同濃度肝素后聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的溶液圖片(a)和紫外吸收光譜圖(b)，圖中數(shù)字代表肝素濃度，單位為μ g/mL;圖5為加入其它不同材料后的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的溶液圖片(a)和紫外吸收光譜圖(b)，1-8分別為添加材料之前，和添加聚賴氨酸(10 μ g/mL)，殼聚糖(10 μ g/ mL)，葡萄糖(10 μ g/mL)，半胱氨酸(10 μ g/mL)，殼聚糖(10 μ g/mL)和肝素(5 μ g/mL)混合物，硫酸軟骨素(10 μ g/mL)，氯化鈉(10 μ g/mL)后的納米金顆粒溶液；圖6為聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的紫外吸收值與肝素濃度的定量關(guān)系，a為肝素濃度范圍7-11 μ g/mL, b為肝素濃度范圍3-8 μ g/mL。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1稱取聚乙烯亞胺6mg，溶解在IOmL水中制備聚乙烯亞胺溶液，然后邊攪拌邊滴加溶于200 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，室溫反應(yīng)6天，得到聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的水溶液，隨后將該水溶液置于4°C冰箱中冷藏備用；紫外-可見分光光度計(jì)的測試結(jié)果表明其最大吸收波長為M9nm，透射電子顯微鏡測量結(jié)果表明形成的金納米顆粒相當(dāng)均勻，粒徑大小為4. 4nm，分布在較窄的范圍內(nèi)。表面電勢及粒徑測試結(jié)果表明其表面電勢為+32. 6mV，粒徑約為40. 47nm。實(shí)施例2稱取聚乙烯亞胺6mg，溶解在IOmL水中制備聚乙烯亞胺溶液，然后邊攪拌邊滴加溶于200 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，37°C條件下反應(yīng)3天，得到聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的水溶液，隨后將該水溶液置于4°C冰箱中冷藏備用。紫外-可見分光光度計(jì)的測試結(jié)果表明其最大吸收波長為5^nm。實(shí)施例3稱取聚乙烯亞胺:3mg，溶解在IOmL水中制備聚乙烯亞胺溶液，然后邊攪拌邊滴加溶于100 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，室溫反應(yīng)4天，得到聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的水溶液，隨后將該水溶液置于4°C冰箱中冷藏備用。
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紫外-可見分光光度計(jì)的測試結(jié)果表明其最大吸收波長為5^nm。實(shí)施例4稱取聚乙烯亞胺:3mg，溶解在IOmL水中制備聚乙烯亞胺溶液，然后邊攪拌邊滴加溶于100 μ L水的氯金酸溶液6mg/mL)，37°C條件下反應(yīng)2天，得到聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的水溶液，隨后將該水溶液置于4°C冰箱中冷藏備用。紫外-可見光分光光度計(jì)的測試結(jié)果表明其最大吸收波長為5^nm。實(shí)施例5肝素的定量測試，(1)取實(shí)施例1中制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒溶液100 μ L，加入ρΗ 3. 6 的醋酸鹽緩沖溶液2. 9mL，室溫放置15min后測試其紫外吸收曲線。(2)在ρΗ值為3. 6的醋酸鹽緩沖溶液中加入肝素，得溶液A，取2. 9mL上述的溶液 A，加入到ΙΟΟμ L實(shí)施例1中制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，得到含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；(3)在改變肝素的加入量的情況下，重復(fù)步驟0)，共得到23份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度分別為 1,1. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5,8,8. 5,9,9. 5， 10，10. 5，11，11. 5，12μ g/mL ；(4)將步驟(3)得到的23份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液， 在室溫下放置15min后，分別測試其紫外吸收曲線，如附圖4。(5)根據(jù)步驟⑴和⑷中所得到的紫外吸收曲線，得出步驟⑶中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值的關(guān)系。同時對加入10 μ g/mL肝素后的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒進(jìn)行透射電子顯微鏡測試，表明形成的金納米顆粒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，且粒徑顯著變大，粒徑大小為36nm。表面電勢及粒徑測試結(jié)果表明其表面電勢為+5. 88mV，粒徑約為432. 5nm。與沒有加入肝素的金納米顆粒相比其表面電勢顯著變小，粒徑顯著變大，由于水化作用大于透射電子顯微鏡的測試結(jié)果。同時粒徑的結(jié)果也進(jìn)一步證明了由于加入帶有大量負(fù)電荷的肝素，可以使聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒的表面正電性變小，穩(wěn)定性變差，從而引起了金納米顆粒的聚集。實(shí)施例6肝素測定的選擇性測試(1)取實(shí)施例1中制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的金納米顆粒溶液ΙΟΟμ L，加入ρΗ為 3. 6的醋酸鹽緩沖溶液2. 9mL測試其紫外吸收曲線。(2)在ρΗ值為3. 6的醋酸鹽緩沖溶液中加入聚賴氨酸，得聚賴氨酸濃度為10 μ g/ mL的溶液B，取2. 9mL上述的溶液B，加入到100 μ L實(shí)施例1中制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，得到含有聚賴氨酸的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；(3)按照步驟O)的方法，分別制得含有殼聚糖、葡萄糖、半胱氨酸、硫酸軟骨素或氯化鈉的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；(4)將步驟( 和( 所得的溶液，在室溫放置15min后，分別測試其紫外吸收曲線。 表明，所添加的非肝素類物質(zhì)在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，沒有引起金納米顆粒溶液顏色及紫外吸收光譜的變化，證明本發(fā)明制備的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的納米金顆粒對肝素的檢測具有良好的選擇性。
權(quán)利要求
1.一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，包括(1)在100-200μ L聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，加入2. 9mL pH值為3. 6 的醋酸鹽緩沖溶液，室溫放置15min后測試其紫外吸收曲線；(2)在η份與步驟(1)中相同體積的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，分別加入2. 9mL含有不同濃度肝素的醋酸鹽緩沖溶液，得到η份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液；其中每份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度為 0. 5-15 μ g/mL, 20 彡 η 彡 80 ；(3)將步驟( 得到的η份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液，在室溫下放置15min后，分別測試其紫外吸收曲線；(4)根據(jù)步驟(1)和(3)中所得到的紫外吸收曲線，得出步驟(2)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值的關(guān)系；(5)將90-330μ g的肝素樣品溶解在^ml醋酸鹽緩沖液中，加入Iml聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液，室溫放置15min，測試其紫外吸收曲線；然后計(jì)算肝素樣品的紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值，利用步驟中所述的肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值的關(guān)系確定肝素樣品中肝素的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于步驟(1)和O)中所述的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液的制備方法為稱取聚乙烯亞胺3-6mg，溶解在IOmL水中，然后邊攪拌邊滴加100-200 μ L濃度為 48. 6mg/mL氯金酸溶液，反應(yīng)2_6天，得到聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米顆粒的水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于所述的聚乙烯亞胺為超支化聚乙烯亞胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于所述的氯金酸與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為1.62 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于所述的反應(yīng)2-6天中的反應(yīng)溫度為25-37°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于步驟(1)和O)中所述的醋酸鹽緩沖溶液的濃度為0. 02-0. 08Mo
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于步驟(2)中所述的含有不同濃度肝素的醋酸鹽緩沖溶液的制備方法為在 PH值為3.6的醋酸鹽緩沖溶液中加入不同質(zhì)量的肝素，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于步驟( 中所述的η份含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度分別為 1 μ g/mLU. 5 μ g/mL,2 μ g/mL,2. 5 μ g/mL,3 μ g/mL,3. 5 μ g/mL,4 μ g/ mL、4.5 μ g/mL、5 μ g/mL、5. 5 μ g/mL、6 μ g/mL、6. 5 μ g/mL、7 μ g/mL、7. 5 μ g/mL、8 μ g/mL、 8.5 μ g/mL、9 μ g/mL、9· 5 μ g/mL、10 μ g/mL、10. 5 μ g/mL、11 μ g/mL、11. 5 μ g/mL、12 μ g/mL, η = 23。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，其特征在于步驟中所述的步驟O)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與處吸收值的比值的關(guān)系為當(dāng)步驟O)中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度為3-8μ g/mL時，其濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與處吸收值的比值呈指數(shù)關(guān)系，其中 Y = O. 40614+1. 02292X IO"4Xe(x/L 02369), R2 = 0. 99058 ；當(dāng)步驟(2) 中所述的含有肝素的聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中肝素的濃度為7-11 μ g/mL 時，其濃度和紫外吸收曲線中670nm處吸收值與529nm處吸收值的比值呈線性關(guān)系，其中Y =-0. 56446+0. 15069X, R = O. 99757 ；肝素濃度的最低檢測限為 1. 5 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子檢測肝素含量的方法，包括(1)在聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中加入醋酸鹽緩沖溶液，測試紫外吸收曲線；(2)在n份聚乙烯亞胺穩(wěn)定化金納米粒子的水溶液中，分別加入含有不同濃度肝素的醋酸鹽緩沖溶液；(3)分別測試步驟(2)得到的n份溶液得紫外吸收曲線；(4)根據(jù)步驟(1)和(3)中所得到的紫外吸收曲線，得出肝素的濃度和紫外吸收曲線中670nm與529nm處吸收值的比值的關(guān)系；(5)測試肝素樣品得紫外吸收曲線，得出肝素樣品中肝素的濃度。本發(fā)明的檢測方法簡單，反應(yīng)條件溫和，低能耗無污染，同時所用金納米顆粒的穩(wěn)定劑為聚乙烯亞胺，價廉易得，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號G01N21/33GK102435571SQ20111027639
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者史向陽, 溫詩輝 申請人:東華大學(xué)