專利名稱：檢測分枝桿菌感染的試劑、方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢驗領(lǐng)域，涉及一種微生物分子生物學檢測方法，尤其涉及檢測結(jié)核感染的試劑、方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是當今一個主要的公共健康問題，它的病原體是結(jié)核桿菌，屬于分枝桿菌屬。全世界每年大約有800-1000萬新發(fā)結(jié)核病例，每年有200-300萬人因此而失去生命，結(jié)核病是引起成年人死亡的頭號傳染病。據(jù)WHO報道，全球三分之一的人口(約20億)已感染了結(jié)核桿菌，如不采取措施，近10年內(nèi)還將有約3億人受結(jié)核桿菌感染。據(jù)第四次全國流行病學調(diào)查顯示，我國受結(jié)核桿菌感染人數(shù)超過4億，每年有13萬人死于結(jié)核病，是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二。在全面實施DOTS (直接督導(dǎo)治療)策略后，中國的結(jié)核發(fā)病率并沒有如預(yù)期地出現(xiàn)下降，這與潛在的大量未被診斷的潛伏感染以及痰菌陰性結(jié)核病人未被及時診斷有關(guān)，這些感染者是一個巨大的結(jié)核病源庫，DOTS計劃只能針對發(fā)病的肺結(jié)核患者，而對于消滅潛伏感染的病人或者痰菌陰性的癥狀不典型的患者沒有貢獻?，F(xiàn)在，發(fā)達國家已經(jīng)充分注意到這一現(xiàn)象，在7年前甚至更早已經(jīng)啟動對潛伏感染患者的干預(yù)。全球結(jié)核控制的一項策略是在高危人群中實施有效的篩查計劃，這樣可以鑒別出那些有潛伏感染的病人，通過治療他們來預(yù)防結(jié)核。而其中最突出的問題是如何準確迅速地發(fā)現(xiàn)潛伏感染者和高危人群并加以控制。目前診斷結(jié)核患者中主要采用的方法有胸部X光片、涂片鏡檢、培養(yǎng)法、TST皮試等。其中X光片無法早期及時發(fā)現(xiàn)；涂片法敏感性特異性差；培養(yǎng)法耗時長，需要4-8周時間；TST皮試實驗則特異性差，無法準確區(qū)分BCG(卡介苗)接種者和結(jié)核病患者。特異性抗原診斷一直是確認和評估病原體感染及感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價值，已經(jīng)在HBV、HCV、HIV等疾病的診斷方面獲得了廣泛的應(yīng)用。由于人體在對抗結(jié)核桿菌的感染中，細胞免疫起到了關(guān)鍵性的作用，所以尋找結(jié)核桿菌特異性的T細胞抗原和檢測T細胞免疫反應(yīng)已經(jīng)成為今年來研究的熱點。國際上已有報道的T-SPOT試劑正是使用結(jié)核桿菌的特異性抗原ESAT-6和CFP-10，以Elispot方法診斷結(jié)核早期感染(中國專利公開號1350546)。但是ESAT-6、Cfp-1O這兩個抗原屬于結(jié)核桿菌早期分泌蛋白，在結(jié)核持續(xù)感染中分泌量減少，導(dǎo)致檢測的敏感性不足，局限了該試劑的推廣。另一方面有研究顯示T-SPOT試劑在發(fā)展中國家的效果并不理想，推測可能與發(fā)展中國家非結(jié)核分枝桿菌感染率高有關(guān)。另外T-SPOT試劑價格昂貴，每一人份約合80美金，在發(fā)展中國家很難推廣。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的是提供了特異性高、能夠檢測應(yīng)用范圍廣且成本低廉的檢測結(jié)核感染的試劑、方法和試劑盒。
本發(fā)明的目的之一是提供檢測分枝桿菌感染的試劑，所述試劑中包含SEQ ID NO1-5所代表的蛋白、多肽或類似物中的任何一種或多種。SEQ ID1: vnspIvvgfIacftliaaigSEQ ID 2: atpvrlaevlvtcaaftfI
SEQ ID 3: wfatlgfgagrlrglftnpgSEQ ID 4: lrglftnpgswrildgliav
SEQ ID 5: vnsplvvgflacftliaaigaqnafvlrqgiqrehvlpvvalctvsdivliaagiagfgaligahpralnvvkfggaafligygllaarrawrpvalipsgatpvrlaevlvtcaaftflnphvyldtvvllgalanehsdqrwlfglgavtasavwfatlgfgagrlrglftnpgswrildgliavmmvalgisItvt
在本發(fā)明的較佳實施例中，所述類似物包括類似肽或通過生物素/抗生物素蛋白鏈菌素系統(tǒng)將多個類似肽的MHC II分子聚合在一起的聚合分子，所述類似肽與SEQ ID NO 1-5所代表的氨基酸序列同源。本發(fā)明的另一目的是提供一種應(yīng)用上述試劑檢測分枝桿菌的方法，包括以下步驟
步驟1，使權(quán)利要求1所述的試劑與宿 主T細胞相接觸，所述試劑中包含SEQ ID NO 1-5所代表的蛋白、多肽或其類似物中的任何一種或多種；
步驟2，通過測定T細胞與蛋白、多肽或類似物接觸后狀態(tài)是否發(fā)生變化，從而確定T細胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物
能夠識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陽性、感染分支桿菌；
不能識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陰性、未感染分支桿菌。在本發(fā)明的另一較佳實施例中，所述步驟2中的變化包括T細胞開始分泌細胞因子或分泌量增加，T細胞大小、數(shù)量(增殖)或表面標志的改變。如權(quán)利要求3所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述T細胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔積液、淋巴結(jié)、淋巴液及其它包含T細胞組織中檢出。在本發(fā)明的另一較佳實施例中，所述T細胞為⑶4+T細胞、⑶8+T細胞或Y S T細胞。在本發(fā)明的另一較佳實施例中，所述步驟2中包括預(yù)先加入抗體與所述細胞因子結(jié)合；通過測定抗體或抗體復(fù)合物的存在來檢測確定所述T細胞開始分泌細胞因子或分泌量增加。在本發(fā)明的另一較佳實施例中，所述細胞因子包括IFN-Y、IL-2、IP-10、IL-12、TNF- a。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于上述方法檢測分枝桿菌的試劑盒，包括如權(quán)利要求I所述的檢測分枝桿菌感染的試劑。在本發(fā)明的另一較佳實施例中，試劑盒還包括真空肝素管、用于ELISA實驗檢測IFN-Y的工具、包裝試劑的包裝盒和瓶子；所述工具包括植物血凝集素(PHA)、酶標板、IFN- y抗體、洗板液、樣品稀釋液、IgG 一抗、酶偶聯(lián)二抗、顯色液和終止液。本發(fā)明的試劑、檢測方法和試劑盒檢測的敏感性、特異性高，既能夠檢測活動性的結(jié)核患者、又能夠檢測潛伏性的結(jié)核患者和健康人群，檢測范圍廣并且制造方便、成本低廉
MTv o


圖1所示是含SEQ ID NO I所示的蛋白/多肽的試劑在對宿主檢測所得的IFN- y量的值。圖2所示是含SEQ ID NO 2所示的蛋白/多肽的試劑在對宿主檢測所得的IFN- y量的值。圖3所示是含SEQ ID NO 3所示的蛋白/多肽的試劑在對宿主檢測所得的IFN- y量的值。圖4所示是含SEQ ID NO 4所示的蛋白/多肽的試劑在對宿主檢測所得的IFN- y量的值。
具體實施例方式以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細的闡釋。本發(fā)明應(yīng)用于結(jié)核桿菌感染。結(jié)核桿菌感染通常指的是患有活動性或潛伏性結(jié)核桿菌的人群。也可以是健康的接觸者，其已暴露于結(jié)核桿菌中。因此，本發(fā)明也可用于調(diào)查健康接觸人群受結(jié)核感染情況。本發(fā)明的一種檢測分枝桿菌感染的試劑中包含SEQ ID NO 1_5所代表的蛋白、多肽或類似物中的任何一種或多種。本發(fā)明的由SEQ ID 1-5代表的氨基酸序列，完整或部分地來自于結(jié)核分枝桿菌基因Rvl986所編碼的蛋白。并且，本發(fā)明中涉及所有氨基酸序列都是從N端到C端的。本發(fā)明中的蛋白和多肽可以是天然分離的，也可以是人工合成的。優(yōu)選的方法是，由較長的融合蛋白制備或由其他多肽經(jīng)過物理或化學裂解所產(chǎn)生。在其他實施方案中，所用的多肽也可由固相甲?；铣蓛x合成。本發(fā)明中的類似物，是指其特性與上述蛋白或多肽相同，包括其同樣可以特異性的與T細胞或抗體結(jié)合。優(yōu)選的是該類似物具有相同的形狀、大小、柔韌性、電子排布等。典型的類似物是類似肽。它可與SEQ ID 1-5所代表的氨基酸序列同源。與另一肽同源的肽通常具有至少75%的同源性，優(yōu)選至少90%、95%的同源性。一般，同源肽的不同來自于氨基酸殘基的替換、插入、缺失和修飾。其可發(fā)生在序列的N端、C端或其他任何位置上。優(yōu)選的是類似物可以結(jié)合到相同的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子上，且類似物中處于等價位置上的氨基酸與同源肽中的那些是相同的或保守的。上述的修飾，通常指的是天然的轉(zhuǎn)錄后修飾或人工修飾。修飾可提供化學部分的改變，包括氨基、乙?；?、羥基、鹵素基團和碳水化合物基團。優(yōu)選的是氨基酸側(cè)鏈的修飾，即形成一個或多個非天然氨基酸。另一種有代表性的類似物是一種通過生物素/抗生物素蛋白鏈菌素系統(tǒng)將多個結(jié)合同源肽或類似肽的主要組織相容性復(fù)合體(MHC) II分子聚合在一起的聚合分子。此類似物典型地抑制肽/MHC II類復(fù)合物與T細胞受體的結(jié)合，或能與此復(fù)合物特異的抗體
彡口口 本發(fā)明的一種應(yīng)用上述試劑檢測分枝桿菌的方法，包括以下步驟 步驟1，使權(quán)利要求1所述的試劑與宿主T細胞相接觸，所述試劑中包含SEQ ID NO 1-5所代表的蛋白、多肽或其類似物中的任何一種或多種；
步驟2，通過測定T細胞與蛋白、多肽或類似物接觸后狀態(tài)是否發(fā)生變化，從而確定T細胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物
能夠識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陽性、感染分支桿菌；
不能識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陰性、未感染分支桿菌。本發(fā)明中的T細胞通常在體內(nèi)被來自結(jié)核桿菌的抗原預(yù)先致敏，這些T細胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔積液、淋巴結(jié)、淋巴液及其它包含T細胞組織中被檢出。并且，T細胞可以是未加工過的，也可以是體外分離的或者是體內(nèi)的。優(yōu)選的是采用包含T細胞的、未經(jīng)分離的外周抗凝全血。在其他的實施例中，也可使用從血液或其他樣本中分離的單核細胞(PBMC)，其中包括T細胞和APC。APC是抗原遞呈細胞，可將抗原肽遞呈給T細胞。APC可以是天然生成的或者是人工APC。典型的APC是在體外新分離的細胞或經(jīng)過培養(yǎng)的細胞。優(yōu)選的一種體內(nèi)檢查以確定T細胞識別蛋白或多肽的方法是通過遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity,DTH)的出現(xiàn)來指示肽在體內(nèi)的識別,例如檢查硬化、紅斑或水腫等。通常通過體內(nèi)注射本發(fā)明或施給表達本發(fā)明的多核苷酸。此外，本發(fā)明中的識別，通常是通過測定T細胞與本發(fā)明接觸后T細胞狀態(tài)的變化來確定的。這種變化主要由于MHC/肽復(fù)合物與TCR(T細胞受體)特異的結(jié)合而誘發(fā)的T細胞的激活，可以是T細胞開始分泌細胞因子或分泌量增加，也可以是T細胞大小、數(shù)量(增殖)或表面標志的改變。所述1'細胞因子包括正^￥、11-2、1 -10、11-12、1即-[1等，優(yōu)選的是檢測T細胞因子IFN- y。在本發(fā)明的一個實 施例中，采用預(yù)先加入抗體與T細胞分泌的細胞因子相結(jié)合，然后通過測定抗體或抗體復(fù)合物的存在來檢測所述的因子?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體，也可以是商品化購買的或者使用標準技術(shù)制備的。測定細胞因子的方法通常是領(lǐng)域內(nèi)常用的方法，如體外酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(Elisa)、酶聯(lián)免疫斑點試驗法(Elispot)、或免疫印跡法(Immunoblotting)等。在本發(fā)明的實施例中，檢測的細胞因子是T細胞分泌的IFN- y。使用的檢測系統(tǒng)是體外酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)分析。IFN-Y與固定在固相載體上的第一 IFN-Y抗體特異結(jié)合，然后是用酶聯(lián)標記第二 IFN-Y抗體特異結(jié)合一抗復(fù)合物。也可使用生物素偶聯(lián)的第二 IFN-Y抗體結(jié)合一抗復(fù)合物，然后使用酶聯(lián)的抗生物素蛋白鏈菌素與生物素特異結(jié)合。最后通過酶的顯色底物形成有色的溶液，通過吸光度的改變來檢測T細胞分泌IFN-Y，同時使用已知濃度的IFN-Y作為標準品進行定量。在另一個實施例中，使用的檢測系統(tǒng)也可是酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)。同時，本發(fā)明中的檢測T細胞與本發(fā)明試劑的結(jié)合也可以通過FACS (流式細胞儀)儀器來進行。通常在已接觸的T細胞的出現(xiàn)頻率是10_3-10_6，如果被分選細胞的頻率高于正常對照值，則可定量確定細胞已接觸此抗原。另外，在檢測分枝桿菌的過程中，本發(fā)明的蛋白、多肽或類似物與T細胞接觸的時間長短可以根據(jù)所測定的識別方法有所變化。T細胞與蛋白或多肽一起孵育的典型時間是6小時到5天不等，優(yōu)選的，在使用全血時是20-24小時，而使用1:5或1:10稀釋后的全血時是3_5天,體內(nèi)檢測時是2_3天。加入蛋白或多妝的濃度是0. l-100ug/ml。其中，優(yōu)選使用10 ug/ml的多肽溶液。本發(fā)明的一種試劑盒，包括一種或多種本發(fā)明的蛋白或多肽或類似物其包括真空肝素管。在其他實施例中，還可包括植物血凝集素(PHA)、酶標板、IFN-Y抗體、洗板液、樣品稀釋液、IgG —抗、酶偶聯(lián)二抗、顯色液、終止液等用于ELISA實驗檢測IFN- y的工具，以及用于包裝上述試劑的包裝盒和瓶子。試劑盒中的多種蛋白或多肽可以是單獨使用，也可以混合、連續(xù)使用，以提高檢測的敏感性。試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照。陽性對照所選用的抗原對絕大多數(shù)個體的T細胞均能產(chǎn)生應(yīng)答，如市售的PHA(植物血凝素)。陰性對照通常不加入抗原成分，選用培養(yǎng)基或其他緩沖液。以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的蛋白/多肽試劑、方法做詳細說明，具體實施例是在本發(fā)明的試劑盒中進行的。實施例1
從外周全血檢測IFN-Y的分泌
1)采取肝素抗凝靜脈血至采血管中；
2)加入本發(fā)明的多肽/蛋白溶液至終濃度為10ug/ml，蓋上蓋子，37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，選用5 ug/ml植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)作為陽性對照和培養(yǎng)基作為陰性對照；
3)取出室溫下3000rpm離心lOmin，吸取上清液。使用ELISA方法進行IFN- y的定量
1.包被IFN-Y抗體溶解于包被緩沖液中，加入96孔酶標板中(Nunc)，100ul/孔，4°C過夜；
2.洗板洗滌液200ul/孔，洗2次；
3.封閉封閉液，300ul/孔,室溫孵育2h；
4.洗板洗漆液300ul/孔，洗3次；
5.加入全血培養(yǎng)上清液加入稀釋后的一抗100ul/孔，室溫孵育Ih;
6.洗板洗滌液300ul/孔，洗5次；
7.加酶標二抗新鮮稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記抗體IOOul/孔,室溫孵育Ih ；
8.洗板洗滌液300ul/孔，洗5次；
9.顯色新鮮配置的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液，100ul/孔，室溫，5-10min ；
10.終止2MH2SO4, 50 ul/孔；
11.測定酶標儀檢測450nm，以第一個空白磷酸鹽緩沖液(PBS)對照孔調(diào)零后測各孔OD值。統(tǒng)計和判定方法
如圖1至4中所示，本發(fā)明的包含SEQ ID NO 1-5所示的蛋白/多肽的試劑在對宿主檢測所得的IFN-Y量的值。其中，黑色三角和圓點顯示的是結(jié)核感染(TB)組，方塊點顯示的健康人(Control)對照組；縱坐標顯示的是IFN-Y量。以對照組為研究對照，抗原孔減去陰性對照孔的IFN- Y量進行接受者操作特性曲線分析(ROC)，選擇最優(yōu)值作為判定結(jié)核感染的閾值。在本實施例中，經(jīng)過計算，閾值為
12.5 pg/ml，若抗原孔減去陰性對照孔的IFN-Y量大于閾值且大于陰性對照孔的IFN-Y量，即判斷為陽性、感染結(jié)核分枝桿菌；反之為陰性、未感染結(jié)核分枝桿菌。利用SPSS (Statistics Package for Social Science)對兩組之間進行統(tǒng)計分析，采用非配對分組t-檢驗(independent group t_test)進行組別間差別的顯著性測定，若P〈0. 05,為樣品間存在顯著性差異。結(jié)核感染組和對照組是從2010年起在復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院組織招募的。從受測者中抽取的血液樣品經(jīng)過肝素或EDTA抗凝處理。結(jié)核患者為臨床結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，臨床檢查與X射線檢查結(jié)果相符，且接受治療的時程少于三周。對照組為不明原因發(fā)熱待查病人，后明確診斷排除結(jié)核感染的病例，HIV檢測為陰性。蛋白/多肽的臨床驗證結(jié)果
結(jié)果如表I中所示，結(jié)核感染者對抗原的應(yīng)答率顯著高于對照組。而對照組對抗原蛋白產(chǎn)生陽性應(yīng)答較低，特異性均大于95%。表1:兩組人群全血對多肽/蛋白的應(yīng)答結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測分枝桿菌感染的試劑，其特征在于，所述試劑中包含SEQ ID NO 1-5所代表的蛋白、多肽或類似物中的任何一種或多種。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測分枝桿菌感染的試劑，其特征在于，所述類似物包括類似肽或通過生物素/抗生物素蛋白鏈菌素系統(tǒng)將多個類似肽的MHC II分子聚合在一起的聚合分子，所述類似肽與SEQ ID NO 1-5所代表的氨基酸序列同源。
3.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的試劑檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，使權(quán)利要求1所述的試劑與宿主T細胞相接觸，所述試劑中包含SEQ ID NO 1-5所代表的蛋白、多肽或其類似物中的任何一種或多種； 步驟2，通過測定T細胞與蛋白、多肽或類似物接觸后狀態(tài)是否發(fā)生變化，從而確定T細胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物 能夠識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陽性、感染分支桿菌； 不能識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陰性、未感染分支桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述步驟2中的變化包括T細胞開始分泌細胞因子或分泌量增加，T細胞大小、數(shù)量(增殖)或表面標志的改變。
5.如權(quán)利要求3所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述T細胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔積液、淋巴結(jié)、淋巴液及其它包含T細胞組織中檢出。
6.如權(quán)利要求5所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述T細胞為CD4+T細胞、CD8+T細胞或Y 8 T細胞。
7.如權(quán)利要求4所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述步驟2中包括預(yù)先加入抗體與所述細胞因子結(jié)合；通過測定抗體或抗體復(fù)合物的存在來檢測確定所述T細胞開始分泌細胞因子或分泌量增加。
8.如權(quán)利要求4或7所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述細胞因子包括IFN- y、IL-2、IP-10、IL-12、TNF- a。
9.一種用于如權(quán)利要求3所述方法檢測分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求I所述的檢測分枝桿菌感染的試劑。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包括真空肝素管、用于ELISA實驗檢測IFN-Y的工具、包裝試劑的包裝盒和瓶子；所述工具包括植物血凝集素(PHA)、酶標板、IFN- y抗體、洗板液、樣品稀釋液、IgG 一抗、酶偶聯(lián)二抗、顯色液和終止液。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測分枝桿菌感染的試劑、方法和試劑盒。試劑中包含SEQIDNO1-5所代表的蛋白、多肽或類似物。方法通過試劑與宿主T細胞相接觸，檢測確定T細胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物，從而判斷分枝桿菌感染狀態(tài)。試劑盒包括上述用于檢測分枝桿菌感染試劑。本發(fā)明的試劑、檢測方法和試劑盒檢測的敏感性、特異性高，檢測范圍廣并且制造方便、成本低廉。
文檔編號G01N33/569GK103063836SQ201110315979
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者張文宏, 陳嘉臻, 沈瑤杰, 邵凌云, 王森, 張穎, 翁心華 申請人:復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院