專利名稱：氯胺酮膠體金檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膠體金免疫層析領(lǐng)域，具體涉及一種氯胺酮膠體金檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
氯胺酮(Ketamine，KET)是苯環(huán)己哌啶(N-l-phenycyclohexy-piperidine，PCP) 的衍生物，醫(yī)學(xué)上作為外科手術(shù)麻醉劑，黑市上俗稱“K粉”、“K仔”。近年來在娛樂場所濫用日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅健康。氯胺酮通常的使用方式以香煙吸服、鼻吸、靜脈注射或?qū)⒎勰┤苋腼嬃现羞M(jìn)行飲用。研究表明，在服用氯胺酮后都會(huì)出現(xiàn)“去人格化”、“去真實(shí)感”、人體形象改變、夢(mèng)境、幻覺以及惡心嘔吐，大劑量服用，會(huì)出現(xiàn)意識(shí)模糊、身體呈木僵狀，呼吸抑制， 甚至出現(xiàn)四肢抽搐以及呼吸停止等現(xiàn)象；長期使用氯胺酮可造成記憶缺失、認(rèn)知功能損害和精神病。人體服用的氯胺酮有70% -90%在肝內(nèi)代謝并經(jīng)尿液排出，其在體內(nèi)的代謝較快，清除半衰期約為2. 5小時(shí)，一般在吸食后2-4小時(shí)內(nèi)即可被檢出。
鑒于氯胺酮的嚴(yán)重危害性，國家對(duì)氯胺酮管理日趨嚴(yán)格，本領(lǐng)域?qū)β劝吠蜑E用毒品者生物標(biāo)本中的氯胺酮檢測提出了更高的要求。
膠體金免疫層析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種獨(dú)特的免疫診斷技術(shù)，由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單快速、易于操作、結(jié)果容易判讀，無需附加儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種氯胺酮膠體金檢測試劑盒及其制備方法，從而有效提高試劑盒的檢測靈敏度及質(zhì)量。
本發(fā)明一方面公開了一種氯胺酮膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，濾樣紙、免疫膠體金紙片、 免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于襯底上；所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，所述免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有包被有氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物的檢測線和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。
較優(yōu)的，所述膠體金的顆粒大小為39 42nm。
較優(yōu)的，所述膠體金是由兩步還原法制備獲得。
更優(yōu)的，所述兩步還原法的步驟為
a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為 1 8 9，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，即制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；
b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置4. 0°C水浴中保持溫度恒定，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0°C的抗壞血酸與PVP的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為25 26 1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為I : 2.0 2.1，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。最優(yōu)的，步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/Lo最優(yōu)的，步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。最優(yōu)的，步驟b)中，抗壞血酸與PVP的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/S。最優(yōu)的，步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合水溶液中，抗壞血酸的濃度為 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的濃度為 0. 137-0. 139g/L。步驟b)中，攪拌反應(yīng)約為50-70分鐘。采用上述方法制得的膠體金清亮透明，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發(fā)現(xiàn)非球形粒子。較優(yōu)的，所述免疫膠體金紙片是經(jīng)過預(yù)處理的玻璃纖維紙，所述預(yù)處理的預(yù)處理液包括0. 5 0. 8v*% Tween-20,12 18w/v*%鹿糖，溶劑為水。更優(yōu)的，所述免疫膠體金紙片是經(jīng)過預(yù)處理的玻璃纖維紙，所述預(yù)處理的預(yù)處理液配方為0. 7v% Tween-20,16w/v*%鹿糖。本發(fā)明的另一方面，提供了一種氯胺酮膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟I)兩步還原法制備膠體金；2)用步驟I)制備的膠體金標(biāo)記抗氯胺酮單克隆抗體，獲得膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體(免疫膠體金)；3)免疫膠體金紙片的制備預(yù)處理玻璃纖維紙；稀釋步驟2)獲得的膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，得到免疫膠體金溶液；用所述免疫膠體金溶液包被預(yù)處理過的玻璃纖維紙，獲得免疫膠體金紙片；4)將氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物和羊抗鼠IgG分別噴在硝酸纖維素膜檢測線 (T線)和質(zhì)控線(C線)的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得試劑條；6)最后將試劑條裝入塑料盒，即獲得氯胺酮膠體金檢測試劑盒。較優(yōu)的，所述膠體金的顆粒大小為39 42nm，所述膠體金是由兩步還原法制備獲得。更優(yōu)的，所述兩步還原法的步驟為a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為 I 8 9，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，即制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置4. (TC水浴中保持溫度恒定，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比I : I. 9 2. 0加入4. (TC的 0. 003-0. 004mol/LHAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. (TC的抗壞血酸與PVP的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為25 26 1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為I : 2.0 2.1，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。最優(yōu)的，步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/L。最優(yōu)的，步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。最優(yōu)的，步驟b)中，抗壞血酸與PVP的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/S。最優(yōu)的，步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合水溶液中，抗壞血酸的濃度為 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的濃度為 0. 137-0. 139g/L。步驟b)中，攪拌反應(yīng)約為50-70分鐘。較優(yōu)的，步驟2)中，膠體金標(biāo)記抗氯胺酮單克隆抗體的比例為向膠體金中按照 8 U g抗體/ (ml膠體金)的比例加入抗氯胺酮單克隆抗體，制備得到免疫膠體金。較優(yōu)的，所述步驟3)免疫膠體金紙片的制備為A.用噴金緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，獲得OD54tl值為2. 0的免疫膠體金溶液；B.用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙,干燥后,再用免疫膠體金溶液噴涂預(yù)處理后的玻璃纖維紙，干燥，制得免疫膠體金紙片。本發(fā)明中，V%指體積百分比；w/V%指重量體積百分比,如Iw/V%即為IOOml溶液中含lg。更優(yōu)的，所述步驟A中的噴金緩沖液配方如下8 12v% I. OM Tris液，0. 2 0. 4w/v 聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v %牛血清白蛋白，0. I 0. 3w/v %脫脂牛奶， 0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v %疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5 ± 0. 05，余量為水。最優(yōu)的，所述步驟A中的噴金緩沖液配方如下10v% I. OM Tris液、0. 3w/v%聚乙二醇20000、0. 2w/v*%牛血清白蛋白，0. 2w/v*%脫脂牛奶、0. 3w/v*%酪蛋白，和0. 05w/v% 疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5 ±0. 05，余量為水。更優(yōu)的，所述步驟B中的預(yù)處理液包括0. 5 0. 8v*% Tween-20,12 18w/v*%鹿糖，溶劑為水。最優(yōu)的,所述步驟B中的預(yù)處理液包括0. 7v% Tween-20,16w/v%鹿糖,溶劑為水。更優(yōu)的，步驟B中，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙26ImmX 220mm，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每26ImmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。較優(yōu)的，步驟4)中，噴在硝酸纖維素膜質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG的濃度為
0.4 0. 6mg/ml，噴在硝酸纖維素膜檢測線(T線)上的氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物濃度為 0. 3 0. 5mg/ml。較優(yōu)的，每Im長硝酸纖維素膜分別包被有Iml的羊抗鼠IgG和氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為4. 0 6. 0mm。本發(fā)明的創(chuàng)新在于免疫膠體金紙片制備步驟的工藝改進(jìn)以及兩步還原法制備分子大小均一的膠體金顆粒，其余步驟均可采用常規(guī)制備膠體金檢測試劑條的條件進(jìn)行。免疫膠體金紙片制備步驟中，通過采用合理配方對(duì)玻璃纖維膜進(jìn)行預(yù)處理并采用較好的噴金緩沖液，在保障膠體金釋放完全的基礎(chǔ)上可有效減慢檢測時(shí)免疫膠體金的釋放層析，有利于抗原抗體充分反應(yīng)結(jié)合，有效的提高了反應(yīng)的靈敏度，同樣的閾值下，還可降低免疫膠體金的用量，節(jié)約成本；采用的兩步還原法，使得到的膠體金分子呈大小均一的40nm球形顆粒，由于膠體金顆粒大小適中、整體均一，使其與單克隆抗體的結(jié)合效率更高、效果更穩(wěn)定。本發(fā)明氯胺酮膠體金檢測試劑盒的工作原理，即是利用高度特異的抗體-抗原特異結(jié)合反應(yīng)及免疫膜層析技術(shù)，通過免疫競爭抑制法來定性檢測人尿液中出現(xiàn)的氯胺酮。試劑盒內(nèi)的檢測試劑條是實(shí)現(xiàn)氯胺酮檢測的關(guān)鍵，在試紙條檢測線(T線)包被了氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物；在試紙條的另一端固定有抗氯胺酮單克隆抗體-膠體金。 尿液從加樣孔加入，如果尿液中含有氯胺酮，它們將與氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物競爭膠體金-抗氯胺酮單克隆抗體上有限的抗原結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)氯胺酮濃度達(dá)到產(chǎn)品設(shè)計(jì)的閾值濃度以上時(shí)，它們將占據(jù)抗氯胺酮單克隆抗體上全部的抗原結(jié)合位點(diǎn)，這樣就阻止了抗氯胺酮單克隆抗體-膠體金和檢測線上的氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物結(jié)合，檢測線不能捕獲到膠體金顆粒而無紅色色帶出現(xiàn)，為陽性結(jié)果。如果尿液中沒有氯胺酮或氯胺酮的濃度低于閾值濃度，則抗氯胺酮單克隆抗體-膠體金隨同尿液運(yùn)行至檢測線，檢測線捕獲到膠體金顆粒而呈現(xiàn)紅色色帶，為陰性結(jié)果。試紙條的質(zhì)控線(C線)上包被有羊抗鼠IgG，以指示試劑盒反應(yīng)系統(tǒng)工作是否正常。質(zhì)控線的出現(xiàn)與氯胺酮或其代謝物的存在無關(guān)。質(zhì)控線色帶的出現(xiàn)表明①樣品加入量充足②樣品在紙條上運(yùn)行正常。從上述原理可以看到，在膠體金紙片上抗體-抗原特異結(jié)合反應(yīng)是膠體金試劑盒正常工作的關(guān)鍵因素，直接關(guān)系到試劑盒的靈敏度及質(zhì)量優(yōu)劣，因此免疫膠體金的包被就顯得尤其重要。本發(fā)明制得的氯胺酮膠體金檢測試劑盒的使用方法如下I.將試劑盒放置在水平臺(tái)面上。2.用加樣吸管吸取尿樣，然后滴3滴(約120ul)尿樣到試劑盒的加樣孔中。每檢測一份不同的樣品注意要使用不同的吸管。3.觀察結(jié)果在滴加樣品后3-8分鐘判讀結(jié)果。檢測結(jié)果的判斷方法陰性在結(jié)果觀察窗口內(nèi)出現(xiàn)兩條色帶。即檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)位置各出現(xiàn)一條紅色線條。表示樣品中無氯胺酮存在。陽性只在結(jié)果觀察窗口的質(zhì)控線(C線)位置出現(xiàn)一條紅色線條，檢測線(T線) 未出現(xiàn)任何線條，表示樣品中有氯胺酮存在。無效質(zhì)控線(C線)不出現(xiàn)。任何情況下，C線均應(yīng)形成，表示加樣和操作正確。 C線未出現(xiàn)表明測試結(jié)果是不確定的，應(yīng)重做。采用本發(fā)明制備的氯胺酮膠體金檢測試劑盒，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)充分，靈敏度高。


圖I :氯胺酮膠體金檢測試劑盒試劑條示意圖(I.濾樣紙2.免疫膠體金紙3.免疫硝酸纖維素膜4.吸水紙5.檢測線6.質(zhì)控線)圖2 膠體金透射電鏡圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1氯胺酮膠體金檢測試劑盒的制備
一、試劑來源
抗氯胺酮單克隆抗體、羊抗鼠IgG多克隆抗體、氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物 (KET-BSA)購自美國美迪生物技術(shù)有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)
硝酸纖維素薄膜、玻璃纖維紙購自德國賽多利斯公司(SART0RIUS)
二、制備步驟
方法1
1.膠體金的制備兩步還原法制備膠體金
a)第一次還原氯金酸溶液將6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml雙蒸水中，加熱煮沸30分鐘，之后緩慢攪動(dòng)并準(zhǔn)確加入50ml 0.016mol/L檸檬酸三鈉水溶液。 超聲振蕩2分鐘后冷卻至室溫，超聲震蕩的頻率為25KHZ，即制得約15nm粒徑的膠體金原溶液。
b)第二次還原氯金酸溶液取第一步制得的膠體金原核溶液^ml,并放置于4°C 水浴鍋中穩(wěn)定溫度，隨后加入50ml預(yù)冷為4. O0C的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即緩慢滴加250ml預(yù)冷為4. O0C的含0. 018mol/L的抗壞血酸與0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度為1-2滴/s，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，溶液呈透明的酒紅色，既制得40nm粒徑的膠體金溶液。
制備好的膠體金顆粒通過透射電鏡觀察，結(jié)果顯示，所制備的膠體金顆粒分散性好，粒徑大小均一，為40nm左右(說明書附2)。
2.免疫膠體金的制備
2. 1將抗氯胺酮單克隆抗體用0. IM pH 7. 8的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為1. Omg/ ml的抗體溶液。
2. 2取IOOOml的膠體金溶液，往里加入1/10倍膠體金體積的0. IM pH 7. 8磷酸鹽緩沖液混合3分鐘。在快速攪拌下，再緩緩將稀釋的抗氯胺酮單克隆抗體溶液8ml加入其中。室溫反應(yīng)5分鐘并不時(shí)緩緩攪拌。
2. 3反應(yīng)結(jié)束后，在上述反應(yīng)液中快速加入20ml的10wt%的牛血清白蛋白(BSA) 溶液。室溫反應(yīng)5分鐘并不時(shí)緩緩攪拌。
2. 4將制備好的免疫膠體金8000轉(zhuǎn)/min離心20分鐘，保留沉淀，并收集上清 12500轉(zhuǎn)/min離心30分鐘，棄上清。收集兩次離心沉淀用含有0. Iwt% BSA的硼酸緩沖液復(fù)溶到OD54tl在14。
3.免疫膠體金紙制備
3. 1預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取7ml Tween-20，160g蔗糖，加純化水定容至 1000ml。
3. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入IOOml 1. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脫脂牛奶，3. Og 酪蛋白溶液和0. 5g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。
3. 3用噴金緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，至溶液OD54tl值為2. 0， 獲得免疫膠體金溶液。3. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26ImmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。4.免疫硝酸纖維素膜的制備4. I將羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋成0. 5mg/ml，制得質(zhì)控線(C線)溶液。4. 2將氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為0. 5mg/ml 制得檢測線(T線)溶液。4. 3用點(diǎn)膜機(jī)噴點(diǎn)C、T線溶液，制得免疫硝酸纖維素膜。每Im長硝酸纖維素膜分別包被有Iml的C線和T線溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為6. 0mm。5.將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為4mm的試劑條(如圖I所示)。6.將檢測試劑條裝入塑料盒內(nèi)即得檢測試劑盒?？紤]到某些正常使用的藥物中也含有氯胺酮成分，實(shí)際工作中為避免假陽性的出現(xiàn)，參照國際通行的濃度值，本實(shí)施例設(shè)計(jì)的檢測試劑盒的閾值為1000ng/ml。方法2 I.膠體金的制備參考實(shí)施例I方法I的步驟。2.免疫膠體金的制備參考實(shí)施例I方法I的步驟。3.免疫膠體金紙制備3. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取5ml Tween-20,120g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml03. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入120ml I. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取2. Og聚乙二醇20000、I. 5g牛血清白蛋白，3. Og脫脂牛奶，2. 5g 酪蛋白溶液和0. 8g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解,混合均勻,加純化水至總體積1000ml。3. 3用噴金緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，至溶液OD540值為2. 0， 獲得免疫膠體金溶液。3. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26ImmX 220mm，浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。4.免疫硝酸纖維素膜的制備4. I將羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋成0. 6mg/ml，制得質(zhì)控線(C線)溶液。4. 2將氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為0. 3mg/ml 制得檢測線(T線)溶液。4. 3用點(diǎn)膜機(jī)噴點(diǎn)C、T線溶液，制得免疫硝酸纖維素膜。每Im長硝酸纖維素膜分別包被有Iml的C線和T線溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為4. Omm。5.將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為5mm的試劑條。6.將檢測試劑條裝入塑料盒內(nèi)即得檢測試劑盒。
方法3:
1.膠體金的制備參考實(shí)施例1方法1的步驟。
2.免疫膠體金的制備參考實(shí)施例1方法1的步驟。
3.免疫膠體金紙制備
3. 1預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取8ml Tween-20,180g蔗糖，加純化水定容至 1000ml。
3. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入80ml 1. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取4. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，1. Og脫脂牛奶，
3. 5g酪蛋白溶液和0. 2g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。
3. 3用噴金緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，至溶液OD540值為2. 0， 獲得免疫膠體金溶液。
3. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 ^lmmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。
4.免疫硝酸纖維素膜的制備
4. 1將羊抗鼠IgG用磷酸鹽緩沖液稀釋成O.^ig/ml，制得質(zhì)控線(C線)溶液。
4.2將氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物用磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為0. 4mg/ml 制得檢測線(T線)溶液。
4. 3用點(diǎn)膜機(jī)噴點(diǎn)C、T線溶液，制得免疫硝酸纖維素膜。每Im長硝酸纖維素膜分別包被有Iml的C線和T線溶液，檢測線和質(zhì)控線的間距為5. Omm。
5.將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為5mm的試劑條。
6.將檢測試劑條裝入塑料盒內(nèi)即得檢測試劑盒。
實(shí)施例2氯胺酮膠體金檢測試劑盒的靈敏度實(shí)驗(yàn)
1.檢測方法
(1)取實(shí)施例1制備的氯胺酮膠體金檢測試劑盒，將試劑盒放置在水平臺(tái)面上。
(2)用加樣吸管吸取樣品，然后滴3滴(約120ul)樣品到試劑盒的加樣孔中。每檢測一份不同的樣品使用不同的吸管。
(3)觀察結(jié)果在滴加樣品后3-8分鐘判讀結(jié)果。
2.檢測樣品
配置氯胺酮濃度為500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000ng/ml 的質(zhì)控參考品作為樣品，每個(gè)濃度重復(fù)3次。
3.檢測結(jié)果
表1氯胺酮膠體金檢測試劑盒的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種氯胺酮膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于襯底上；其特征在于，所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，所述免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有包被有氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物的檢測線和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膠體金的顆粒大小為39 42nm，所述膠體金是由兩步還原法制備獲得。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述免疫膠體金紙片是經(jīng)過預(yù)處理的玻璃纖維紙，所述預(yù)處理的預(yù)處理液包括0. 5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶劑為水。
4.如權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的氯胺酮膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)兩步還原法制備膠體金；2)用步驟1)制備的膠體金標(biāo)記抗氯胺酮單克隆抗體，獲得膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體；3)免疫膠體金紙片的制備預(yù)處理玻璃纖維紙；稀釋步驟幻獲得的膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，得到免疫膠體金溶液；用所述免疫膠體金溶液包被預(yù)處理過的玻璃纖維紙，獲得免疫膠體金紙片；4)將氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物和羊抗鼠IgG分別噴在硝酸纖維素膜檢測線和質(zhì)控線的位置上，烘干備用，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得試劑條；6)將試劑條裝入塑料盒，即獲得氯胺酮膠體金檢測試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述兩步還原法為a.第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0.0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為 1 8 9，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，即制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；b.第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置于4.0°C水浴中保持溫度恒定，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比1 1. 9 2. 0加入4. 0°C的 0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0°C的抗壞血酸與PVP的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為25 沈1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為1 2.0 2.1，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a中，加入的檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/L，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟b中，所述抗壞血酸與PVP的混合水溶液中，抗壞血酸的濃度為0. 017-0. 019mol/L, PVP的濃度為0. 137-0. 139g/L。
8.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)免疫膠體金紙片的制備為A.用噴金緩沖液稀釋膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，獲得OD54tl值為2.0的免疫膠體金溶液；B.用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂預(yù)處理后的玻璃纖維紙，干燥，制得免疫膠體金紙片。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟A中的噴金緩沖液配方如下 8 12v% I. OM Tris液，0. 2 0. 4界八％聚乙二醇20000,0. 15 0. 25w/v%牛血清白蛋白，0. I 0. 3w/v %脫脂牛奶，0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v %疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5 ±0. 05，余量為水。
10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述步驟B中的預(yù)處理液包括0.5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v*%鹿糖，溶劑為水。
11.權(quán)利要求1-3任一權(quán)利要求所述的試劑盒在制備氯胺酮檢測試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及膠體金免疫層析領(lǐng)域，具體公開了一種氯胺酮膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，所述試劑條包括襯底、濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙依次首尾銜接并固定于襯底上；所述免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的抗氯胺酮單克隆抗體，所述免疫硝酸纖維素膜上設(shè)有包被有氯胺酮-牛血清白蛋白復(fù)合物的檢測線和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控線。本發(fā)明的氯胺酮膠體金檢測試劑盒，具有抗原抗體結(jié)合反應(yīng)充分，靈敏度高，成本低，使用方便的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102539773SQ201110457819
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者張國華 申請(qǐng)人:上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司