專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)色譜介質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有改進(jìn)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的色譜介質(zhì)的方法和方式。更確切地，本發(fā)明涉及雙峰粒徑分布和層功能化用作改變色譜介質(zhì)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的方式。
背景技術(shù)：
具有所需結(jié)合能力和效率的色譜介質(zhì)的粒徑和硬度在一些情況下確實(shí)不在它們的壓力規(guī)格內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)柱中能夠使用足夠高的流動(dòng)速率。甚至對(duì)于非常堅(jiān)硬的珠?？赡芤彩沁@樣。眾所周知填充珠粒之上的壓降隨粒徑的增大而減少。但是，為了減少背壓用較大尺寸的珠粒改變介質(zhì)會(huì)導(dǎo)致較低的分辨率和較低的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。因此，在這個(gè)領(lǐng)域中仍然需要替代性填充珠粒來(lái)減少背壓而不必犧牲色譜性能。發(fā)明概述
本發(fā)明提供降低填充床中的流動(dòng)阻力的簡(jiǎn)單方法。這可通過(guò)以下獲得將比如10-20%的大得多的帶殼顆粒加入小顆粒中，其具有與小珠粒相同類(lèi)型的功能化(配位體)，以便降低填充床中的流動(dòng)阻力。這種混合策略的重大優(yōu)勢(shì)是可使效率和吸附動(dòng)力學(xué)保持在接近于小顆粒的水平。通過(guò)使用殼功能化的大顆粒獲得了改進(jìn)的壓力流動(dòng)特性而沒(méi)有任何洗脫效率的損失。帶殼大珠?？蔀槎嗫字榱；蛟O(shè)計(jì)成具有無(wú)孔核和表面多孔固定相。如果目標(biāo)僅是降低填充床中的背壓，當(dāng)然可以使用未功能化的大珠粒。使用充分功能化的大珠粒會(huì)負(fù)面地影響分辨率。但是會(huì)使平衡時(shí)的結(jié)合能力損失最小化。通過(guò)轉(zhuǎn)而使用殼功能化的大珠粒，保全了效率，但是和充分功能化的大珠粒相比降低了平衡結(jié)合能力，但是在很多情況下動(dòng)態(tài)結(jié)合能力在常用的停留時(shí)間內(nèi)相同。利用混合珠粒、填充珠粒的概念可以?xún)?yōu)化有關(guān)背壓和吸附動(dòng)力學(xué)的柱填充且使用殼功能化的大珠?？墒垢呦疵撔?分辨率)保持在與小珠粒相同的水平。這是重要的，因?yàn)楦叻直媛蕦?duì)于某一尺寸的柱在精加工(polishing)應(yīng)用中將增大可能的樣品載荷。因此，第一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)具有改進(jìn)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的色譜介質(zhì)的方法，該方法包含使包含外功能化殼/蓋和內(nèi)核的大珠粒/顆粒與較小珠粒/顆?；旌希渲写笾榱：托≈榱５牧奖嚷蔥大顆粒的D5civ/小顆粒的D5civ] >1. 2，優(yōu)選>3，且其中柱中的大珠粒和小珠粒的體積比[大珠粒的總體積/珠粒的總體積]的范圍在0，05-0, 9。D50v是累積體積分布的中值粒徑。所述配位體的性質(zhì)不限于本發(fā)明的寬闊方面。因此，在本分離基質(zhì)的一個(gè)實(shí)施方案中，所述配位體選自陰離子交換配位體；陽(yáng)離子交換配位體；疏水相互作用色譜(HIC)配位體；反相色譜(RPC)配位體；固定金屬親合力色譜(IMAC)配位體；親硫配位體；親合力配位體；核酸基配位體；通過(guò)π相互作用、氫鍵和/或范德華力作用的配位體；和多峰配位體(有時(shí)表示為混合模式色譜配位體)。所述配位體可與載體直接耦合或通過(guò)增長(zhǎng)劑耦合。所述增長(zhǎng)劑是傳統(tǒng)的且因此可包含線性、支化、環(huán)狀飽和的、不飽和的和芳族基團(tuán)(例如具有最多1-20，比如1-10個(gè)碳的基團(tuán)。這些基團(tuán)可包含純烴基、羥基、烷氧基和芳氧基和硫代類(lèi)似物和或氨基。烴基中的碳鏈可在一個(gè)或多個(gè)位置處被氮、醚氧和硫醚硫間隔。也可以有羰基，比如在酰胺和酮基及對(duì)于水解具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性的其它基團(tuán)中。珠粒的表面增長(zhǎng)劑功能化的外部可為/用作含有相互作用配位體的外殼。所述功能化的殼的孔隙率和孔尺寸兩者可高/大于和低/小于核中的孔隙率和孔尺寸或相同。所述珠粒(基礎(chǔ)基質(zhì))基于有機(jī)和/或無(wú)機(jī)材料。所述基礎(chǔ)基質(zhì)在生物分子應(yīng)用的情況下優(yōu)選親水且為聚合物的形式，所述聚合物在水中不溶解且或多或少可膨脹。已被衍生化而變得親水的疏水聚合物歸入此定義。合適的聚合物是多羥基聚合物，例如基于多糖，比如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉、支鏈淀粉等，和完全合成的聚合物，比如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羥基烷基乙烯基醚)、聚(羥基烷基丙烯酸酯)和聚甲基丙烯酸酯(例如聚縮水甘油基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯醇和基于苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物，且包括其中兩種或更多種單體相當(dāng)于上述聚合物的共聚 物。聚合物(其可溶于水)可被衍生化而變得不溶解，例如通過(guò)吸附或共價(jià)結(jié)合而交聯(lián)和與不溶體耦合。親水基可通過(guò)單體(呈現(xiàn)可被轉(zhuǎn)化成OH的基團(tuán))的聚合或通過(guò)成品聚合物的親水化而引入到疏水聚合物上(例如到單乙烯基和二乙烯基苯的共聚物上)，所述親水化例如通過(guò)吸附合適的化合物，比如親水聚合物。用于基礎(chǔ)基質(zhì)的合適的無(wú)機(jī)材料是二氧化硅、氧化鋯、石墨、氧化鉭等。在小和大的帶殼珠粒中可使用不同基礎(chǔ)基質(zhì)材料?；蚨嗷蛏偈杷幕A(chǔ)基質(zhì)可用于其中將并非生物分子的其它分子分離的色譜應(yīng)用中。也可以使用大和小的殼活化的珠粒兩者以便優(yōu)化分辨率。30 μ m帶殼珠粒可設(shè)計(jì)成具有非常接近于10 μ m珠粒的分辨率。如果人們使這些珠粒與90 μ m帶殼珠粒混合，其將可以填充具有關(guān)于分辨率和壓力/流動(dòng)性質(zhì)的非凡色譜性質(zhì)的精加工柱。根據(jù)本發(fā)明，提供了增大填充大帶殼珠粒的柱的樣品動(dòng)態(tài)容量的方法，該方法通過(guò)用小的多孔珠粒均勻代替一些大珠?；蛴门c帶殼大珠粒相同的配位體功能化的殼。本發(fā)明的一個(gè)有利的方面是提供制備根據(jù)本發(fā)明的大容量、高效和低壓力流動(dòng)分離填充色譜柱的方法，在所述方法中使帶殼大珠粒與多孔小珠?；旌希鲂≈榱１痪鶆蚍植加谡w珠粒的配位體取代。本發(fā)明涉及包含較大珠粒/顆粒的色譜介質(zhì)，所述較大珠粒/顆粒包含功能化的外殼和常常未功能化的多孔或無(wú)孔內(nèi)核。所述珠粒的核或內(nèi)部也可被功能化。在這種情況下，所述核配位體不與目標(biāo)分子例如殼中的陰離子交換配位體和核中的陽(yáng)離子交換配位體相互作用。在第二方面，本發(fā)明涉及包含與較小顆?；旌系陌瑑?nèi)核和外殼的較大珠粒/顆粒的色譜介質(zhì)，其中大珠粒和小珠粒的粒徑比率[大顆粒的D5civ/小顆粒的D5(iv]>1. 2，且其中柱中的大珠粒和小珠粒的體積比[大珠粒的總體積/珠粒的總體積]的范圍在
O.05_0· 9 ο附圖
簡(jiǎn)述
圖I是顯示壓降對(duì)填充了 Sephaose HP、Sepharose 6 Fast Flow的填充珠粒(柱Tricorn 5/50)和填充了這些介質(zhì)的(50/50 v/v)混合物的珠粒的影響的色譜圖。圖2 是顯不了溶菌酶在 SP Sepharose HP 和 SP Sepharose Fast Flow 上分離的色譜圖。兩種介質(zhì)都填充在Tricorn 5/50柱中。在20分鐘內(nèi)流動(dòng)速率為I. O mL/min且梯度為0-100% B。緩沖劑A :20 mM乙酸鈉(pH 6. I)。緩沖劑B :緩沖劑A + O. 20 M NaCl0圖3是根據(jù)本發(fā)明的帶殼珠粒,稱(chēng)作〃殼S Sepharose Fast Flow"的示意圖。圖4是顯示核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C和溶菌酶在填充了 SP Sepharose HP的Tricorn 5/50上分離的色譜圖。在20分鐘內(nèi)流動(dòng)速率為I. O mL/min且梯度為0-100% B。緩沖劑A 20 mM乙酸鈉(pH 5. 8)。緩沖劑B :緩沖劑A + O. 25 M NaCl。圖5是顯示核糖核酸酶A、細(xì)胞色素C和溶菌酶在填充了 SP Sepharose HP和殼SSepharose Fast Flow的50/50混合物的Tricorn 5/50上分離的色譜圖。在20分鐘內(nèi)流動(dòng)速率為I. O mL/min且梯度為0-100% B。緩沖劑A :20 mM乙酸鈉(pH 5.8)。緩沖劑B :緩沖劑 A + O. 25 M NaCl。發(fā)明詳述
結(jié)合附圖將更確切地描述本發(fā)明。本文介紹的本實(shí)施例僅是為了說(shuō)明性的目的，且不應(yīng)該構(gòu)成限制如所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)部分
基于Sepharose 6 Fast Flow制備殼介質(zhì)-殼S 6FF 綜述
基質(zhì)的體積指的是沉降床體積且按克給出的基質(zhì)的重量指的是抽吸干重。用于反應(yīng)攪拌使用的是電動(dòng)攪拌器因?yàn)槭褂么帕Π魯嚢杵魅菀灼茐闹榱！Ｊ褂脗鹘y(tǒng)方法分析官能度并測(cè)定烯丙基化程度或珠粒上的配位體(_S03_基團(tuán))含量的程度。Sepharose 6 Fast Flow用烯丙基縮水甘油基醚烯丙基活化
在玻璃過(guò)濾器上用蒸懼水洗漆Sepharose 6 Fast Flow。將50 mL排干的Sepharose 6Fast Flow 轉(zhuǎn)移到反應(yīng)容器并加入 25 mL 蒸餾水、14. 5 g NaOH, 6. 5 g Na2SOjPl g NaBH40在50°C下攪拌O. 5小時(shí)之后加入70 mL烯丙基縮水甘油基醚(AGE)。在50°C下將反應(yīng)漿料攪拌18小時(shí)，隨后在玻璃過(guò)濾漏斗上用蒸餾水、乙醇和最后用蒸餾水洗滌。然后通過(guò)滴定測(cè)定烯丙基含量258 μ mol/mL。殼活化(3 μ m殼通過(guò)部分溴化)
使50 g烯丙基化的排干凝膠、烯丙基化的Sepharose 6 Fast Flow(相當(dāng)于總共12，9mmol烯丙基)和3 g乙酸鈉在500 mL的蒸餾水中強(qiáng)力攪拌。使O. 2當(dāng)量的溴(135μ )在密閉良好的玻璃容器中溶于110 mL蒸餾水。在強(qiáng)烈攪拌期間將溴溶液加入烯丙基凝膠漿料。在5分鐘的攪拌之后，用蒸餾水在玻璃過(guò)濾器上洗滌所述凝膠。S-蓋耦合
將50 g部分溴化的凝膠(參見(jiàn)上文)轉(zhuǎn)入燒瓶并與溶于40 mL蒸餾水的20 g亞硫酸鈉混合。攪拌時(shí)，加入50% NaOH至pH 12. 5，隨后在50°C下攪拌18小時(shí)并在玻璃過(guò)濾器上用蒸餾水洗滌。然后在玻璃過(guò)濾器上用蒸餾水洗滌所述凝膠。核烯丙基除去
用頂置式攪拌使50 mL S-殼凝膠(參見(jiàn)上文)與蒸餾水(50 mL)和0. 5 g乙酸鈉在燒杯中混合。加入溴直到漿料具有剩余的深橙/黃色。攪拌3分鐘之后，加入甲酸鈉直到漿料完全褪色。然后在玻璃過(guò)濾器上用蒸餾水洗滌所述凝膠，然后在50°C下在IM NaOH中攪拌16-18小時(shí)，隨后用蒸餾水洗滌。然后通過(guò)滴定測(cè)定H+容量49 μ mol/ mL?；旌辖橘|(zhì)(SPSepharose HP 和殼 S Sepharose 6 Fast Flow)的色譜評(píng)價(jià) 材料和方法(綜述)
為了測(cè)試混合大珠粒和小珠粒的壓力/流動(dòng)效果，使Sepharose HP (平均粒徑34 μ m)與Sepharose Fast Flow (平均粒徑90 μ m)混合并填充在柱(Tricorn 5/50)中。分別和填充Sepharose HP和Sepharose Fast Flow的柱對(duì)比壓力/流動(dòng)特性(圖I)。分離蛋白質(zhì)的測(cè)試方法的原理是將蛋白質(zhì)注入含有分離媒介/介質(zhì)的Tricorn5/50柱，用A-緩沖劑平衡。然后通過(guò)柱泵送大約5柱容積的A-緩沖劑；然后 是從A-緩沖劑到B-緩沖劑(A-緩沖劑+ NaCl)的20-mL線性梯度。然后在280 nm處監(jiān)測(cè)色譜曲線。圖 2-4 中展不 SP Sepharose HP、SP Sepharose Fast Flow 以及 SP Sepharose HP 和殼 SSepharose Fast Flow的混合物的色譜結(jié)果。實(shí)驗(yàn)
壓力流動(dòng)特性在色譜系統(tǒng)AKTAexplorer 100中用軟件UNICORN測(cè)試。將待研究的介質(zhì)填充在NextAKTA 7/10 mm柱中。作為流動(dòng)相使用的是Milli-Q水且通過(guò)柱施加增大的線性流動(dòng)速率(在60分鐘內(nèi)從O到10 ml/min)。為了評(píng)價(jià)色譜性質(zhì),使用了許多不同蛋白質(zhì)。將評(píng)價(jià)的介質(zhì)填充在Tricorn 5/50柱中且施用的蛋白質(zhì)用梯度洗脫(參見(jiàn)上文)洗脫。使用了兩種不同緩沖系統(tǒng)
1.緩沖劑A:100 mM乙酸酯緩沖劑(pH 5. 8)
緩沖劑B :100 mM乙酸酯緩沖劑(pH 5. 8)+0. 25 M NaCl
2.緩沖劑A:100 mM乙酸酯緩沖劑(pH 6. I)
緩沖劑B :100 mM乙酸酯緩沖劑(pH 6. 1)+0. 20 M NaCl。使用的樣品是核糖核酸酶A(l. 5 mg/ mL)、細(xì)胞色素C(0. 4 mg/ mL)和溶菌酶(O. 4mg/ mL)。所述蛋白質(zhì)溶于A-緩沖劑并施用200μ 。利用下面介紹的設(shè)備和設(shè)置監(jiān)測(cè)色譜系統(tǒng)的性能
設(shè)備(GE Healthcare Biosciences AB)
LC 系統(tǒng)ΑΚΤΑ Explorer 10 XT 軟件UNIC0RN
注入環(huán)200 μ柱Tricorn5/50 儀器參數(shù)
流動(dòng)速率1. O mL/min 檢測(cè)器池10 mm 波長(zhǎng)280 nm。結(jié)果和討論
本發(fā)明提出通過(guò)加入具有較大粒徑的帶殼珠粒用于調(diào)節(jié)基于"小"珠粒的色譜介質(zhì)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的方法。眾所周知當(dāng)粒徑增大時(shí)柱中填充的珠粒上的壓降將會(huì)更低。具有平均粒徑34 μ m(Sepharose HP)和90 mm(Sepharose Fast Flow)的瓊脂糖顆粒的背壓分別呈現(xiàn)于圖I。此圖說(shuō)明背壓如何隨著流動(dòng)速率而增大(詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)且清楚地表明大珠粒導(dǎo)致低得多的背壓。對(duì)于Sepharose HP得知的背壓的急劇增大歸因于小珠粒以及高流動(dòng)速率下珠粒的壓縮。圖I也清楚地表明當(dāng)Sepharose Fast Flow珠粒與Sepharose HP珠?；旌蠒r(shí)背壓降低了。期望這些結(jié)果。但是同樣眾所周知，較大珠粒也導(dǎo)致效率較低(較寬峰)的柱。這種現(xiàn)象在圖2中說(shuō)明，SP Sepharose HP (平均粒徑34 μ m)和SP SepharoseFast Flow (平均粒徑 90 μ m) ο這意味著不可能如小珠粒所獲得的那樣以保持的效率混合這類(lèi)珠粒。我們建議使具有與小珠粒相同功能化(相同配位體)的帶殼大珠?；旌?，但是所述配位體連接于可構(gòu)成固定表面增長(zhǎng)劑的薄外殼或外部(圖3)。這種珠粒設(shè)計(jì)導(dǎo)致在洗脫步驟中的較快的傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)且因此和被配位體均勻取代的同樣尺寸的珠粒(關(guān)于SP Sepharose Fast Flow)相比將導(dǎo)致較窄的峰。如果我們比較圖4和圖5，其清楚地表明這類(lèi)帶殼珠?？膳c被配位體均勻取代的小珠?；旌?，而不使峰寬變差。在圖4中描繪了在填充了 SP Sepharose HP的柱上
分離的三種蛋白質(zhì)的色譜圖和在圖5中顯不了來(lái)自填充SP Sepharose HP和殼S SepharoseFast Flow的混合物的柱的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)具有改進(jìn)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的色譜介質(zhì)的方法，其包含使包含內(nèi)核和外功能化殼/蓋的大珠粒/顆粒與較小珠粒/顆?；旌?，其中大珠粒和小珠粒的粒徑比率[大顆粒的D5civ/小顆粒的D5civ] >1. 2，且其中柱中的大珠粒和小珠粒的體積比[大珠粒的總體積/珠粒的總體積]的范圍在O. 05-0. 9。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述核多孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述核無(wú)孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中大珠粒和小珠粒的粒徑比率[大顆粒的D5civ/小顆粒的D5civ] >3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其中較大顆粒和小顆粒的殼用相同類(lèi)型的配位體功能化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述配位體為離子交換配位體、HIC、螯合、蛋白質(zhì)A、親合力或RPC配位體。
7.根據(jù)上述一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中多孔核用不與樣品中的目標(biāo)分子相互作用的配位體功能化。
8.根據(jù)上述一項(xiàng)或多項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述大珠粒的殼厚度(ST):ST〈[小顆粒的 D50V/2]。
9.色譜介質(zhì)，其包含與較小顆?；旌系陌瑑?nèi)核和外殼的較大珠粒/顆粒，其中大珠粒和小珠粒的粒徑比率[大顆粒的D5civ/小顆粒的D5(iv]>1. 2，且其中柱中的大珠粒和小珠粒的體積比[大珠粒的總體積/珠粒的總體積]的范圍在O. 05-0. 9。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的色譜介質(zhì)，其中所述核多孔。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的色譜介質(zhì)，其中所述核無(wú)孔。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11的色譜介質(zhì)，其中大珠粒和小珠粒的粒徑比率[大顆粒的D5tiv/小顆粒的 D5tiv] >3。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的色譜介質(zhì)，其中多孔核用不與樣品中的目標(biāo)分子相互作用的配位體功能化。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有改進(jìn)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的色譜介質(zhì)的方法和方式。更確切地，本發(fā)明涉及雙峰粒徑分布和層功能化用作改變色譜介質(zhì)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的方式。本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)具有改進(jìn)的壓力-流動(dòng)性質(zhì)的色譜介質(zhì)的方法，該方法包含使包含內(nèi)核和外功能化殼/蓋的大珠粒/顆粒與較小珠粒/顆?；旌?，其中大珠粒和小珠粒的粒徑比率[大顆粒的D50V/小顆粒的D50V]>1.2，且其中柱中的大珠粒和小珠粒的體積比[大珠粒的總體積/珠?？傮w積]的范圍在0.05-0.9。
文檔編號(hào)G01N30/36GK102844111SQ201180020915
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日
發(fā)明者J·伯格斯特倫, B-L·約翰遜 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司