專利名稱：游離的維生素d的免疫分析的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于分析(測定)血液或血液成分樣品的游離的維生素D (freevitamin D)的免疫分析(免疫測定，immunoassay)方法。本發(fā)明還涉及免疫分析和用于進行(引導，conduct)這樣的免疫分析的試劑盒，其中所述免疫分析包括重點照顧檢驗(點照顧測試，point-of-care tests)。
背景技術：
被稱為“維生素D”的物質包括一組脂肪可溶解的激素原以及其代謝物和類似物。體內出現(xiàn)的維生素D的主要形式是維生素D2 (麥角鈣化醇)和維生素D3 (膽鈣化醇)。后者是維生素D的內源性形式，人類可在太陽光的影響下在皮膚中形成維生素D3。前者是從食物中攝取的維生素D的外源性形式。在美國，維生素D2被用作藥物學維生素D補充物。除非另外指出，本公開內容中的術語維生素D涉及維生素D的任何一種或多種形式，包含維生素D代謝物如25-輕基-維生素D或1，25 二輕基維生素D。雖然維生素D2和D3在它們的側鏈的分子結構方面不同，但是它們在現(xiàn)有的激素原中共有相同的生物活性，在兩個步驟中，最終被代謝為也稱為鈣三醇(骨化三醇，calcitriol)的1，25 二羥基維生素D (1，25-(OH) 2-維生素D)，或1，25 二羥基膽鈣化醇。前述的代謝物，25-羥基維生素D (25-(OH)-維生素D)或鈣三醇，由肝中的轉變產生，且其被認為是體內維生素D的貯藏形式。循環(huán)的維生素D主要由25- (OH)-維生素D3和25- (OH)-維生素D2組成。生物學上，25-(OH)-維生素D2與25-(OH)-維生素D3—樣有效。循環(huán)中25-(OH)-維生素D2的半衰期較短。對于臨床實踐，推薦使用25-(OH)-維生素D分析，其測量25-(OH)-維生素D3以及25-(OH)-維生素D2 (I)。維生素D長期已被認為是重要的物質，其活化形式在骨的形成和維持中以及在人類或動物身體的其他過程中發(fā)揮作用。因此，它通過促進腸內來自食物的鈣和磷的吸收和腎中鈣的重吸收，用于增加鈣到血流中的流量；使骨能夠正常礦化和預防低血鈣性抽搐。其也是造骨細胞和破骨細胞的骨成長和骨重建所必需的。維生素D缺乏引起削弱的骨礦化和導致骨軟化疾病，兒童佝僂病和成人軟骨病，并且可能產生骨質疏松癥。維生素D在人類健康中發(fā)揮許多其他的作用，包括抑制從甲狀腺的降血鈣素釋放。降血鈣素直接地作用于破骨細胞，引起骨再吸收和軟骨降解的抑制。維生素D也能抑制從甲狀旁腺的甲狀旁腺激素分泌，調節(jié)神經肌肉和免疫功能和減少炎癥。因此，具有適當?shù)木S生素D水平對于人類和動物的健康是基本的。然而，維生素D的過量(其可能由于過量用藥而發(fā)生)是有毒的。維生素D毒性的某些癥狀是由增加的腸鈣吸收引起的血鈣過多(血液中鈣的水平升高)。已知維生素D毒性是高血壓的原因。維生素D毒性的胃腸癥狀可包括厭食、惡心、和嘔吐。這些癥狀常常伴隨多尿(過多的產生尿)、煩渴(增加的口渴)、虛弱、神經過敏、瘙癢癥(發(fā)癢)、和最終地腎衰竭。
明顯地，能夠診斷可能的維生素D缺乏的受試者是重要的。特別是對于補充維生素D的受試者，能夠檢驗潛在的維生素D過量的受試者，也是重要的?？偟?5-(0H)_維生素D的血清水平被認為是維生素D狀態(tài)的主要指示劑(2)。然而，這種觀念一直都有爭議。通過維生素D結合蛋白(88%)和白蛋白(12%)結合血清中幾乎所有循環(huán)的25-(OH)-維生素D。維生素D結合蛋白(DBP)是血清的主要成分，濃度為250_400mg/L血清。僅僅占據(jù)DBP的維生素D結合位點的小部分，大約為2%。25-(OH)-維生素D的非常小的部分(分數(shù)，fraction),0. 04%以游離的、非蛋白質結合形式循環(huán)。所有人類中DBP濃度都不是恒定的，并且可通過其他因素影響DBP的濃度，其他因素包括懷孕、口服避孕藥的使用、腎病和肝病。DBP濃度的認識對于患者的真實的25-(0H)_維生素D狀態(tài)的準確評價是至關重要的。例如，服用口服避孕藥的年輕女性可能具有處于正常范圍內的總的25-(0H)_維生素D水平。然而，由于她的升高的DBP，可顯著地降低游離的25-(0H)_維生素D的濃度，使得她處于臨床25-(0H)_維生素D不足的增加的風險之中和那個條件承擔的所有風險之中。已經顯示了，體內甲狀腺和留醇激素的生理活性與她們的游離的、非蛋白質結合的部分的相關性，比與血漿中荷爾蒙的總的濃度的相關性更好。特別是在升高或減少了結合蛋白水平的情形中，總的循環(huán)荷爾蒙的測量可導致錯誤的診斷。在這樣的情形中，游離循環(huán)的荷爾蒙濃度的測量提供較好的信息。這種觀念被稱為“游離的荷爾蒙假設”。Mendel
(3)表明，游離的荷爾蒙假設很可能對于所有組織的甲狀腺荷爾蒙、皮質醇、并且還對于維生素D的羥基化代謝物來說是正確的。Bikle等人(4)檢驗1，25-(OH) 2-維生素D的游離的荷爾蒙假設的正確性。數(shù)據(jù)表明，甚至在患有肝病和減少的DBP水平的受試者中，盡管總的1，25- (OH) 2-維生素D顯著減少，好像也能很好地維持游離的1，25- (OH) 2-維生素D水平。在隨后的關于25_(0H)_維生素D的研究中，推薦相同的組，從而在具有更改的結合蛋白濃度的情形中測量游離的25-(0H)_維生素D。作者推論，總的維生素D代謝物測量可能誤導具有肝病的患者的維生素D狀況的評價，并且推薦在進行維生素缺乏的診斷之前也確定游離的25-(OH)-維生素D水平。Bikle等人使用超濾作用以確定游離的25-(OH)-維生素D的水平(5)。這種方法需要高度純凈的放射性標記的維生素D并且傾向于過高估計游離的維生素D的部分。Lauridsen等人(6)顯示，不同DBP表型的女性具有不同的1，25 (OH) 2維生素D和25 (OH)維生素D的濃度。這些作者表明，在較低的血漿25 (OH)維生素D水平下，具有Gc2_2的女性是維生素D充足的。某些背景技術可涉及有關的游離的分析物的確定。美國專利4366143描述涉及有機物質或配體的游離部分的分析的發(fā)明，其中所述有機物質或配體以結合的和游離的形式存在于生物流體中。該方法基本上是競爭性免疫分析，其中，在一個步驟中，將標記的配體和特異性結合劑同時加入到樣品中。配體的游離部分和標記的配體競爭與特異性結合劑反應，且以依賴于樣品中存在的游離的配體部分的量的比例結合到特異性結合劑上。該公開方法的缺點是，由于特異性結合劑和標記的配體兩者的存在，存在能夠干擾結合的和游離的配體之間的平衡的多個因素，其使得該方法幾乎不適用于以相對較低的量存在的游離的配體，如維生素D的情況。事實上，其并沒有公開如何使用游離的維生素D測量的分析。美國專利第4，292，296號公開了用于在樣品中確定游離的分析物的方法，其中所述樣品含有游離的分析物和受體結合的分析物。該方法涉及兩個步驟，第一步驟是將樣品與分析物的吸收劑接觸，以從溶液中去除分析物。第二步驟包括將吸收劑結合的分析物與標記的分析物類似物接觸。因此，從吸收劑中去除溶解相，并且確定結合的和洗掉的相中的標記的量。描述了用于確定游離的甲狀腺荷爾蒙的濃度的方法。美國專利申請2008/0182341涉及用于測量流體中游離的或未結合的分析物濃度的穩(wěn)定劑。其表明，穩(wěn)定劑防止配體與它的結合蛋白的分離。參考采用同時分析程序并且列舉了各種穩(wěn)定劑。提供的穩(wěn)定劑不包括烷基胺氟表面活性劑。沒有現(xiàn)有技術參考文獻具體地提供關于確定維生素D的分析，其反映了游離的維生素D的狀況。應該注意，關于游離的維生素D的分析已經知道了幾十年，但是這些使用方法如平衡透析或速率透析作為它們的基礎。這樣的方法對于研究人員和高度訓練過的技術人員來說是可接受的，但是幾乎不適于常規(guī)的實驗室，其中所述常規(guī)的實驗室為了達到他們的財政目的需要高生產量自動化檢驗。因此，期望提供能夠自動化的且適用于重點照顧檢驗的游離的維生素D的分析。前述已編號的參考是I. Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment:challenges and needs.Am J Clin Nutr. 2008Aug;88 (2) :507S_510S.2. Holick MF. Vitamin D:extraskeletal health.Endocrinol Metab Clin North Am. 2010Jun;39(2):381-400.3. Mendel CM. The free hormone hypothesis: a physiological Iybasedmathematical model.Endocr Rev. 1989Aug; 10 (3) :232-74.4. Bikle D，Gee E, Halloran B，Haddad J. Free I, 25-Dihydroxyvitamin DLevels in Serum from Normal Subjects, Pregnant Subjects, and Subjects with LiverDisease.J Clin Invest. 1984;74:1966-1971.5. Bikle D，Gee E, Halloran B, Kowalski MAj Ryzen E，Haddad J. Assessment ofthe free fraction of 25-hydroxyvitamin D in serum and its regulation by albuminand the vitamin D-binding protein.J Clin Endocrinol Metab. 19860ct; 63 (4) : 954-9.6. Lauridsen AL, Vestergaard P，Hermann AP, Brot C，HeickendorffL，Mosekilde L，Nexo E.Plasma concentrations of 25-hydroxy-vitamin D andI,25-dihydroxy-vitamin D are related to the phenotype of Ge (vitamin D-bindingprotein): a cross-sectional study on 595early postmenopausal women.CalcifTissue Int. 2005Jul; 77 (I) : 15-22.
7. van Hoof HJj Swinkels LMj Ross HAj Sweep CG, Benraad TJ.Determination of non-protein-bound plasma 1，25-dihydroxyvitamin Dbysymmetric(rate)dialysis. Anal Biochem 1998May I;258 (2):176-83.

發(fā)明內容
為了較好地解決一個或更多前述的期望，在一個方面中，本發(fā)明提供了一種用于分析存在游離的維生素D (包括維生素D代謝物如25-輕基-維生素D或1，25 二輕基維生素D)的血液或血液成分樣品的方法，包括(a)將對于25-0H維生素D的固定的結合蛋白或抗體加入到樣品中；(b)將樣品與稀釋劑(diluent)混合，所述稀釋劑包括氟烷基表面活性劑(fluoroalkyl surfactant)；(c)將樣品孵育有效量的時間，以使得期望量的25-0H維生素D結合到結合蛋白上；(d)通過洗滌去除未結合的血清和血清成分；(e)利用標記的維生素D化合物，使包括結合到其上的25-0H維生素D的固定的結合蛋白或抗體經受競爭性結合(competitive binding)；(f)確定結合到結合蛋白上的標記的維生素D化合物的濃度。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于進行前述方法的試劑盒。在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于分析存在游離的維生素D的血液或血液成分的樣品的方法，所述方法包括在第一步驟中，在固定的結合劑(immobilized binder)如對于25-0H維生素D的固定的結合蛋白或抗體上捕獲維生素D，和在隨后的步驟中，使捕獲的25-0H維生素D相對于標記的維生素D變體經受競爭性結合分析，其中通過如此有限地螯合(sequestering)—定量的結合的維生素D以便滿足反復試驗來實現(xiàn)游離的維生素D的捕獲，其中使從其中捕獲維生素D的樣品經受捕獲維生素D和使捕獲的維生素D經受相同的競爭性結合分析的相同步驟，并且其中在兩個競爭性結合分析之后測量的游離的維生素D的濃度基本上是相同的。在還有的進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種用于分析存在游離的維生素D的血液或血液成分樣品的方法，該方法包括在第一步驟中，在固定的結合劑如對于25-0H維生素D的固定的結合蛋白或抗體上捕獲維生素D，和在隨后的步驟中，使捕獲的25-0H維生素D相對于標記的維生素D變體經受競爭性結合分析，其中捕獲0. 5-5wt%的結合的維生素D。在還有的另一個方面中，該方法可用于重點照顧檢驗。后者是指在病患照顧的地點處或附近進行檢驗，即，而不是采取血液樣品和將這些發(fā)送給診斷實驗室，可立即將樣品引入到便攜式的，優(yōu)選手持式裝置中，其能夠盡可能以有限的多個步驟進行分析，和盡可能利用有限的多個手動操作。在另一個方面中，本發(fā)明涉及氟烷基表面活性劑優(yōu)選全氟羧酸鹽表面活性劑并且更優(yōu)選全氟辛酸(PFOA)在用于確定游離的維生素D的免疫分析中作為維生素D的溶解性增強劑(solubility enhancer)中的應用。


圖I代表在本發(fā)明的分析的第一和第二通道(pass)中游離的維生素D濃度之間的相互關系。示出的線由利用具有不同游離的維生素D水平的10個樣品進行重復免疫提取而產生?；貧w線的斜率整體沒有顯著不同。
具體實施例方式廣義上，本發(fā)明涉及用于游離的維生素D的確定的兩步驟分析，包括從血液或血液成分特別是血清或血漿中免疫吸附非-蛋白質結合的25 (OH)-維生素D，之后，測量吸收的維生素D。可以本領域已知的任何方式，從受試者，特別是人類中采集這樣的樣品，期望在其血液中分析游離的25-0H-維生素D的存在。游離的維生素D是指維生素D的循環(huán)的、未結合的部分。這涉及維生素D的任何形式，包括維生素D2、維生素D3、和代謝物25(0H)_維生素D2、25_(OH)-維生素D3、1，25 (OH)2-維生素D2和1，25(0H)2-維生素D3。分析可用于單獨地或以組合測量游離的維生素D的這些形式中的任一種。優(yōu)選地，本發(fā)明的分析用于測量游離的25(0H)_維生素D，導致25 (OH)-維生素D2和25-(OH)-維生素D3的確定。術語“游離的(free)”和“未結合的”是指沒有結合到任何蛋白質上的部分，主要包括維生素D結合蛋白(VDBP或DBP)。優(yōu)選在結合蛋白加入之前、期間、或之后稀釋樣品。樣品稀釋劑可以是水基的并且優(yōu)選是緩沖液(緩沖溶液，buffer solution)。優(yōu)選地,緩沖的pH在從6· O至8· O范圍內。緩沖液包括氟烷基表面活性劑。應該理解，可通過將稀釋劑加入到樣品中、通過將樣品加入到稀釋劑中、或通過同時將緩沖液和樣品加入彼此之中完成緩沖液與樣品的混合。出于實際的原因，優(yōu)選將稀釋劑加入到樣品中。不希望受到理論的束縛，本發(fā)明人認為，表面活性劑以這樣的方式增強了維生素D的溶解性使得導致維生素D的有限的螯合。在另一個方面中，本發(fā)明涉及分析游離的維生素D的新的概念。關于分析游離的維生素D的問題是，游離的維生素D的初始濃度是非常低的，且不能通過現(xiàn)有的免疫分析測量。解決這個問題的現(xiàn)有的嘗試基于期望避免維生素D從DBP上的去除(例如，通過“穩(wěn)定”游離的和結合的維生素D之間的平衡的嘗試)，或僅僅涉及屈服于不能分析游離的DBP的事實，和這些分析僅僅涉及維生素D從DBP的轉移。在本發(fā)明中，可預見維生素D的有限的螯合，其中螯合的維生素D的分數(shù)(部分，fraction)足夠低，優(yōu)選存在于樣品中的總的維生素D的O. 1-10%并且優(yōu)選不超過它的5%，從而仍然反映了最初的游離的維生素D的濃度。這可以在樣品中通過含氚的維生素D和稀釋緩沖液的加入無需過度的實驗而證實。結合到維生素D結合蛋白上的維生素D不應該減少超過5%。可替換地，樣品可被吸收到抗體涂覆的孔的壁上。在去除樣品之后，添加生物素化的維生素D，并且對吸收到抗體上的游離的維生素D定量。在第二個孔中引入從其上去除最初量的維生素D的樣品，且再一次孵育和定量。測量的游離的維生素D的濃度應該與來自第一次孵育的結果相同。優(yōu)選通過添加按重量計O. 05至O. 5%的氟烷基表面活性劑，優(yōu)選O. 1-0. 25%的氟烷基表面活性劑實現(xiàn)維生素D的有限的螯合。優(yōu)選氟烷基表面活性劑是全氟烷基表面活性齊U，更優(yōu)選是全氟羧酸鹽表面活性劑(perfluoro carboxylate surfactant),并且最優(yōu)選是全氟辛酸(PFOA)。優(yōu)選使用0. I至0. 2%，更優(yōu)選0. 15%的PFOA。在這些條件下，樣品與不同水平的DBP但是相同濃度的總的維生素D的反應，與通過對稱透析測量的游離的維生素D的濃度有關?？梢韵胂蟮?，在本發(fā)明中，可以使用PFOA自身、或它的衍生物。這些衍生物通常是指包括全氟辛酸部分(perfluoro octanoic moiety),特別地包括PFOA鹽,如PFOA銨鹽的衍生物，以及是指相應的磺酸，即PFOA磺酸鹽，簡寫為PFOS (全氟辛烷磺酸鹽，也被稱為全氟辛烷磺酸)。根據(jù)本發(fā)明確定游離的維生素D (包括維生素D代謝物)的方法的優(yōu)勢是，它提供了能夠自動化的分析形式。這顯著地將本發(fā)明的分析與確定游離的維生素D的現(xiàn)有的分析區(qū)分開來。在本發(fā)明的分析中，添加對于25-0H-維生素D的結合蛋白。對于維生素D的結合蛋白，例如，抗體是本領域已知的，并且廣泛用于維生素D的現(xiàn)有的免疫分析中。這些相同的抗體以及其他結合蛋白，也可用于本發(fā)明中。例如，代替對于維生素D的抗體，可使用如利用噬菌體展示技術產生的抗體片段。適當?shù)目贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。它們可以以已知的方式獲得，例如，多克隆山羊抗維生素D、多克隆兔抗維生素D、或如來自維生素D的免疫分析應用的領域中已知的任何其他適當?shù)木S生素D抗體。例如從下列參考文獻中已知適當?shù)目贵wHollis, Clin. Chem 31/11，1815-1819(1985) ；Hollis, Clin. Chem39/3，529-533(1993)。優(yōu)選以包括固體載體的顆粒形式加入結合蛋白。通常，將結合蛋白涂覆在固相(solid phase)上,例如,涂覆在微量滴定板上。在優(yōu)選的實施方式中,將結合蛋白涂覆到磁性粒子(magnetic particle)上,其在磁場中促進它們的分離。在添加結合蛋白例如抗體之后，使樣品孵育(培養(yǎng)，incubate)。需要的時間將取決于環(huán)境，如試劑的濃度、結合蛋白的類型、和孵育期間的條件，例如，搖動和溫度。通常，孵育時間的范圍從10秒至幾個小時，優(yōu)選I分鐘至2個小時。對于自動化的平臺，優(yōu)選短的孵育時間(10秒至10分鐘，優(yōu)選30秒至30分鐘)?；旧希瑫r間段不具有特別的關聯(lián)性，只要在期望的時間段期間在環(huán)境下在校準系統(tǒng)(calibration system)中確定要結合多少游離的維生素D。更短和更長的時間段明顯是可能的，條件是發(fā)生適當?shù)男省Ｒ虼?，?yōu)選地，在相同的條件下，利用校準器的比較涉及相同的時間段。在孵育時期之后，可以利用標記的維生素D化合物以已知的方式使樣品經受競爭性結合分析。許多標記的化合物是已知的，其能夠在用于確定維生素D的免疫分析中用作競爭性結合抗原。典型的標記是放射性標記(radiolabel)、熒光標記、發(fā)光標記(luminescent label)、生物素標記(biotin label)、金標記(gold label)、酶標記。競爭性結合分析對于本領域技術人員是已知的，且不需要說明，特別地是因為可以利用已知適合于確定維生素D的任何標記進行本發(fā)明的方法的這個部分?？墒褂玫臉擞浻绕涫窃诂F(xiàn)有的維生素D免疫分析的前述參考文獻中公開的那些標記。因此，利用允許測量濃度的標記，確定樣品中游離的維生素D的濃度。應該理解，通過校準測量，即通過相同的分析中的校準器的響應，確定測量的值的解釋?？商鎿Q地,借助于質譜分析(質譜法,mass spectroscopy),可以使捕獲的維生素D經受定量分析。
通過提供校準器可以完成用于本發(fā)明的分析的校準，其中所述校準器包括預定濃度的游離的25-0H-維生素D?？赏ㄟ^對稱透析確定這些校準器中的游離的維生素D的部分。在對稱透析中，在透析細胞的一個側面上裝載血清樣品。利用其中添加痕量的放射性標記的維生素D的相同樣品裝載其他的隔室(compartment)。放射性標記的維生素D從一個透析隔室到另一個的移動速率直接與維生素D的游離部分成比例(7)。根據(jù)本發(fā)明的游離的維生素D的測量在基本上不影響游離的維生素D的濃度的情況下，依賴于游離的維生素D的濃度的評價，還基于上述討論的維生素D的有限的螯合。在另一個方面，本發(fā)明以在血液或血液成分中用于確定25-0H維生素D的免疫分析的形式提供了產物，其中分析利用根據(jù)前述實施方式中任一個的方法。更具體地，將以用于進行免疫分析的試劑盒的形式提供這樣的產物。這樣的試劑盒可包括所包含的單獨的試齊U，即，結合蛋白和標記的維生素D化合物?？蓡为毺峁┻@些試劑，因此只在它們用于本發(fā)明的分析時形成試劑盒。優(yōu)選地，可以一起提供試劑，優(yōu)選一起包裝試劑，作為一個試劑盒套件(成套試劑盒，試劑盒部件，部件試劑盒，kit of part)。試劑盒可選地包括對于血液或 血液成分樣品的容器，但是按照慣例這也可被單獨提供。通常，試劑盒包括固定在固相上的結合劑和單獨結合的(conjugated)維生素D。按照本領域中的慣例,其他試劑盒成分可依賴于選擇的標記，因為不同的標記可需要不同的試劑。本發(fā)明還涉及氟燒基表面活性劑優(yōu)選全氟羧酸鹽(perfluoro carboxylate)表面活性劑并且更優(yōu)選全氟辛酸和/或全氟庚酸(perfluoroheptanoic acid)在用于確定游離的維生素D的免疫分析中作為維生素D的溶解性增強劑中的應用。優(yōu)選的表面活性劑是全氟烷基表面活性劑，更優(yōu)選全氟羧酸鹽如全氟庚酸或全氟辛酸。更優(yōu)選地，表面活性劑是全氟辛酸(PF0A)、或它的衍生物。這些衍生物通常是指包括全氟辛酸部分的衍生物，特別地包括PFOA鹽，如PFOA銨鹽，以及是指相應的磺酸，即PFOA磺酸鹽，簡寫為PFOS (全氟辛烷磺酸鹽，也稱為全氟辛烷磺酸)。還可使用其他全氟羧酸鹽表面活性劑的類似衍生物。應該理解，本發(fā)明不限于上文描述的實施方式和配方。也應該理解，在權利要求書中單詞“包括”不排除其他要素或步驟。其中當涉及單數(shù)名詞例如“一個”或“一種”、“該”時使用不定冠詞或定冠詞，除非具體地地指出別的物件，否則這包括那些名詞的復數(shù)。將參考下列非限制性的實施例和所附非限制性的

本發(fā)明。實施例材料涂覆的微量滴定板利用抗小鼠IgG抗體以200ng/孔的濃度涂覆Nunc maxisorp微量滴定板。隨后，將單克隆抗_25(0H)維生素D抗體的層以2ng/孔的濃度吸收到抗小鼠IgG層上。利用含有BSA和蔗糖的硼酸鹽緩沖液封閉板。樣品稀釋劑樣品稀釋劑由含有防腐劑和0. 15%的PFOA的pH 8. 0的0. IM TRIS緩沖液組成。結合物(coniugate) (g卩，標記的維牛素D化合物)是生物素化的維生素D。在含有0. 1%牛血清白蛋白和防腐劑的pH 7. 5的0. IMTris緩沖液中以25pg/ml的濃度提供結合劑。
鏈霉親和素-HRP和TMB來自商業(yè)來源。方案如下進行分析。在微量滴定板的孔中，用滴管吸取90μ I的樣品稀釋劑。接下來，將10μ I的樣品加入到稀釋劑中。將這種混合物在37° C下孵育90分鐘。隨后，利用洗滌緩沖液將孔洗滌三次。將100 μ I的HRP結合物加入到試管中，且孵育30分鐘。再次利用洗滌緩沖液將孔洗滌三次。然后，通過辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素產生比色信號。在37° C下孵育20分鐘之后，利用洗滌緩沖液將孔洗滌三次。隨后，將100 μ I TMB溶液加入到孔中。在室溫下在黑暗中孵育20分鐘之后，加入100 μ I終止溶液，且在450nm上讀取吸收率?！ぴ诳字挟a生的信號與樣品或校準器中的游離的25 (OH)維生素D的濃度成反比。通過將未知的信號與校準器的響應進行比較，可計算出原始樣品中游離的25(0H)維生素D的濃度。結果在標準參考樣品上利用本發(fā)明的分析，產生關于游離的25(0H)維生素D的測量的
典型的校準曲線，且在下面的表格中說明。
權利要求
1.一種用于分析存在游離的維生素D (包括維生素D代謝物如25-羥基-維生素D或.1，25 二羥基維生素D)的血液或血液成分的樣品的方法，包括 (a)將對于25-0H維生素D的固定的結合蛋白或抗體加入到所述樣品中； (b)將所述樣品與稀釋劑混合，所述稀釋劑包括氟烷基表面活性劑； (c)將所述樣品孵育有效量的時間，以使得期望量的維生素D結合到所述結合蛋白上； Cd)通過洗滌去除未結合的血清和血清成分； Ce)利用標記的維生素D化合物使包括結合到其上的捕獲的維生素D的固定的結合蛋白或抗體經受競爭性結合； Cf)確定結合到所述結合蛋白上的標記的維生素D化合物的濃度。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其中，所述氟烷基表面活性劑是全氟羧酸，優(yōu)選選自由全氟辛酸、全氟庚酸、以及它們的混合物組成的組。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其中，所述表面活性劑的濃度為按重量計O.05%至O.5%，優(yōu)選按重量計O. 1%-0. 25%。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述稀釋劑是緩沖液，所述緩沖液具有在從6. O至8. O范圍內的緩沖的pH。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述結合蛋白是抗體。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述結合蛋白是維生素D結合蛋白。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述樣品是人類血清或血漿。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，以涂覆在磁性粒子上的形式提供所述結合蛋白。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述標記的維生素D化合物包括選自由放射性標記、熒光標記、發(fā)光標記、生物素標記、金標記、酶標記組成的組中的標記。
10.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中，參考對于游離的25-OH維生素D的校準濃度來確定所述濃度。
11.一種用于分析存在游離的維生素D的血液或血液成分的樣品的方法，包括在第一步驟中，在對于維生素D的固定的結合劑上捕獲維生素D，和在隨后的步驟中，使捕獲的維生素D相對于標記的維生素D變體經受競爭性結合分析，其中通過如此有限地螯合一定量的結合的維生素D以便滿足反復試驗來實現(xiàn)游離的維生素D的捕獲，其中使從其中捕獲維生素D的樣品經受捕獲維生素D和使捕獲的維生素D經受相同的競爭性結合分析的相同步驟，并且其中在兩個競爭性結合分析之后測量的游離的維生素D的濃度基本上是相同的。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，根據(jù)權利要求1-10中任一項進行。
13.根據(jù)權利要求11或12所述的方法，其中，螯合的維生素D的分數(shù)是所述樣品中存在的總的維生素D的O. l-10wt%，并且優(yōu)選不超過它的5wt%。
14.一種用于從血清或血漿樣品中對游離的維生素D定量的方法，包括根據(jù)權利要求I中限定的步驟(a)、(b)、(c)和(d)，以及借助于質譜分析使捕獲的維生素D經受定量分析。
15.一種用于確定血液或血液成分中的游離的維生素D的免疫分析，其中，所述分析利用根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法。
16.一種利用權利要求1-10中任一項所述的方法用于進行免疫分析的試劑盒，所述試劑盒包括固定在固相上的對于維生素D的結合蛋白、和標記的維生素D化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開的是從血液或血液成分，特別是血清或血漿中進行游離的25(OH)維生素D的免疫吸附，之后，測量被吸收的材料。使用氟烷基表面活性劑來增強維生素D的溶解性并且可以測量游離的維生素D。因此，本發(fā)明采用結合蛋白來吸收游離的25(OH)維生素D。其后，利用標記的維生素D化合物，優(yōu)選放射性標記的、熒光標記的、發(fā)光標記的、生物素標記的、金標記的或酶標記的化合物，使包括25-OH維生素D的結合蛋白經受競爭性結合分析?？商鎿Q地，可通過質譜分析對免疫捕獲的25-OH維生素D進行定量。
文檔編號G01N33/82GK102985826SQ201180027487
公開日2013年3月20日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權日2010年4月1日
發(fā)明者米夏埃爾·弗朗西斯庫斯·威廉默斯·科內利斯·馬滕斯, 喬治·亨利·帕森斯, 弗朗西斯庫斯·瑪麗亞·安娜·羅斯馬勒恩, 萊昂·瑪麗亞·雅各布斯·威廉默斯·斯文科爾斯 申請人:未來診斷有限公司