專利名稱：一種快速鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速鑒定方法，尤其涉及一種將微粉碎提取技術(shù)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用在分析毛發(fā)中單乙酰嗎啡及嗎啡中的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)《2010世界毒品報(bào)告》，我國海洛因攝毒的總?cè)藬?shù)位居全球首位，是目前嚴(yán)重的社會問題之一。海洛因吸食和注射吸收良好，可大量穿透血腦屏障，迅速產(chǎn)生作用。海洛因進(jìn)入人體后在血脂酶的作用下迅速代謝成6-單乙酰嗎啡，然后進(jìn)一步在肝臟代謝成嗎啡并與葡醛酸結(jié)合。海洛因在尿中的代謝產(chǎn)物有6-單乙酰嗎啡、游離嗎啡、嗎啡-3-葡醛酸結(jié)合物、嗎啡-6-葡醛酸結(jié)合物和微量的去甲嗎啡(游離或結(jié)合)、可待因、二氫嗎啡酮等。中國專利CN101813675A披露了一種檢測全血、尿中嗎啡類生物堿的LC-MS/MS分析方法，其中液相色譜及質(zhì)譜的條件分別如下:1)色譜條件:流動(dòng)相由A、B兩組份組成，其中A組份為含2mmol/L甲酸銨和0.05% (v/v)甲酸的水，B組份為含2mmol/L甲酸銨和
0.05% (v/v)甲酸的乙腈，A、B兩組份的體積比為90: 10 ;柱溫為45°C ;流速為0.2mL/min ;進(jìn)樣量為10 ii L。2)質(zhì)譜條件:檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM ;掃描方式為正離子掃描；電噴霧電壓為3200V;霧化氣流速為N2 600 L/hr ;錐孔反吹氣流速為N2 50 L/hr ;離子源溫度為105°C ;碰撞氣為氬氣；內(nèi)標(biāo)為嗎啡-d3。中國專利CN101493415A披露了一種嗎啡定量和微量檢測方法，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜(簡稱SERS)定量檢測嗎啡濃度的方法。制備SERS活性基底，取AgNO3溶于水中，配制成AgNO3水溶液，熱到78°C 92°C后，加入檸檬酸三鈉，同時(shí)攪拌60分鐘，得到綠黃色的銀膠；將銀膠高速離心后得到高濃度銀膠；把嗎啡水溶液與部分高濃度銀膠混合進(jìn)行拉曼光譜測試，得到嗎啡-銀膠SERS譜圖；取剩余高濃度銀膠本底進(jìn)行拉曼光譜測試，得到銀膠本底SERS譜圖。將兩譜圖用計(jì)算機(jī)進(jìn)行光譜峰值的基線校正，得到高質(zhì)量的嗎啡SERS譜圖；與標(biāo)準(zhǔn)的嗎啡拉曼光譜強(qiáng)度-濃度曲線對照，得出嗎啡的濃度。在涉及海洛因?yàn)E用的認(rèn)定時(shí)，常因海洛因特征代謝物單乙酰嗎啡在體內(nèi)代謝快，吸毒12小時(shí)后尿液中不能同時(shí)檢出單乙酰嗎啡和嗎啡而無法提供有價(jià)值的信息。尿液的嗎啡陽性可源于海洛因的代謝，也可源于使用含有阿片類生物堿的藥物或者食品。因此，解決這一難題的唯一途徑是通過毛發(fā)分析，檢測毛發(fā)中的單乙酰嗎啡和嗎啡，提供海洛因?yàn)E用的證據(jù)。毛發(fā)分析以其易獲取、易保存、目標(biāo)物穩(wěn)定、檢測時(shí)限長、能反映較長時(shí)間(幾個(gè)月甚至幾年)的藥物使用情況等獨(dú)特優(yōu)勢而在法醫(yī)毒物學(xué)、臨床毒物學(xué)以及興奮劑檢測領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。單乙酰嗎啡、嗎啡固化在毛發(fā)的變性角蛋白中，須先使其呈游離態(tài)再提取。目前對于毛發(fā)中單乙酰嗎啡及嗎啡的提取方法主要有酸水解過夜、溶劑浸提法、超聲提取法、冷凍研磨法等。近年來，由于對嫌疑犯拘留不得超過24小時(shí)，因而對吸毒人員的鑒定要求快速、準(zhǔn)確。
采用酸水解和溶劑浸提法均需過夜、耗時(shí)長，不能滿足快速檢測的需要。而海洛因及其代謝物單乙酰嗎啡不穩(wěn)定，遇熱或長時(shí)間放置等容易分解，因而現(xiàn)行采用的甲醇超聲等毛發(fā)前處理方法，可能致部分單乙酰嗎啡分解為嗎啡，從而影響了毛發(fā)中目標(biāo)化合物定性結(jié)果的可靠性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。冷凍研磨技術(shù)是近年來新開發(fā)的毛發(fā)前處理技術(shù)，可使毛發(fā)在處理過程中始終處于_196°C下，同時(shí)毛發(fā)的粉碎處理增加了與溶劑的接觸面積，有效提高毛發(fā)中藥物釋放效率。但冷凍研磨技術(shù)耗時(shí)也比較長，通常需要3小時(shí)，且冷凍時(shí)需要用到大量液氮，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有鑒定單乙酰嗎啡和嗎啡方法中存在的問題，提供一種基于微粉碎提取和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的快速分析毛發(fā)中單乙酰嗎啡以及嗎啡的方法。該方法可簡便、快速地從復(fù)雜生物基質(zhì)中分離純化單乙酰嗎啡和嗎啡分子，滿足法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域海洛因吸毒者相關(guān)案件的鑒定和偵破的需要。為了實(shí)現(xiàn)上述目的提供一種快速鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法，包括以下順序步驟:步驟1:將待檢測毛發(fā)和萃取液、內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3、撞珠一同置于粉碎儀器內(nèi)進(jìn)行微粉碎處理。步驟2:將微粉碎處理后得到的混合物進(jìn)行離心分離。步驟3:取離心分離后混合物的上層清液，對上層清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。在上述提供的方法中，其中所述的方法還包括對毛發(fā)鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括對毛發(fā)依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷浸洗。毛發(fā)在各浸洗液中浸洗時(shí)間一般各為I 5min。在上述提供的方法中，其中所述的方法還包括對毛發(fā)鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括對毛發(fā)依次用十二烷基磺酸鈉、洗潔精、水和丙酮洗滌。毛發(fā)的洗滌時(shí)間為I 5 min。在上述提供的方法中，其中所述的方法還包括對毛發(fā)鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括在毛發(fā)中加入正己烷和丙酮進(jìn)行超聲波處理。毛發(fā)超聲波處理時(shí)間為15 60s。在上述提供的方法中，其中所述的微粉碎處理的時(shí)間控制在2 5min之間，振搖頻率為 3000 8000 轉(zhuǎn) /min。在上述提供的方法中，其中所述的萃取液是由乙腈和乙酸銨/甲酸水溶液以70:30的體積比所組成的混合物，所述乙酸銨/甲酸水溶液由20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸所組成。在上述提供的方法中，其中所述的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的條件如下:
I)液相色譜條件:流動(dòng)相由A、B組成，其中A為含20mmol/L乙酸銨和0.1% (v/v)甲酸的緩沖溶液，B為的乙腈，所述A、B的體積比在0 2min之間為20:80，在2 2.5min之間為 85:15，在 2.5 IOmin 之間為 20:80 ;流速:250u L/min ;進(jìn)樣量:5u L02)質(zhì)譜條件:
檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式/MRM ;掃描方式:正離子掃描模式/ESI+ ;離子噴霧電壓:
5.5 kV ;碰撞氣氮?dú)?7 psi ;氣簾氣:10 psi ;霧化氣:20 psi ;輔助氣:40 psi ;離子源溫度:4500C ;內(nèi)標(biāo):嗎啡-d3。
本發(fā)明提供鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法能實(shí)現(xiàn)簡便、快速地從復(fù)雜生物基質(zhì)中分離純化單乙酰嗎啡和嗎啡分子，其特異性、選擇性強(qiáng)，靈敏度高，可應(yīng)用于實(shí)際吸毒人員毛發(fā)樣品的檢測，應(yīng)用于法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域海洛因吸毒者相關(guān)案件的鑒定和偵破。


圖1是微粉碎處理前毛發(fā)的掃描電子顯微鏡圖。圖2是微粉碎處理前單根毛發(fā)的掃描電子顯微鏡圖。圖3是微粉碎處理后毛發(fā)的掃描電子顯微鏡圖。圖4是微粉碎處理后單根毛發(fā)的掃描電子顯微鏡圖。圖5是微粉碎處理后毛發(fā)結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種快速鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法，先將待檢測毛發(fā)和萃取液、內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3、撞珠一同置于粉碎儀器內(nèi)進(jìn)行微粉碎處理；將微粉碎處理后得到的混合物進(jìn)行離心分離；取離心分離后混合物的上層清液，對上層清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。以下通過實(shí)施例對本發(fā)明提供的快速鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法做進(jìn)一步說明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內(nèi)容，但實(shí)施例的內(nèi)容并不限制本發(fā)明創(chuàng)造要求保護(hù)的范圍。樣品預(yù)處理
對于海洛因?yàn)E用者毛發(fā)處理前須經(jīng)洗滌劑和有機(jī)溶劑脫污染，有機(jī)溶劑通常包括丙酮、甲醇、二氯甲烷、正己烷等。僅使用水和甲醇不能有效除去外部污染。對毛發(fā)的預(yù)處理可以選用下面提供的一種或多種方法:(1)將毛發(fā)樣品依次用5mL 二氯甲烷、5mL水、5mL 二氯甲烷各浸洗I 5min。(2)將取毛發(fā)樣品依次用IOmL 0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)、IOmL
0.1%洗潔精、IOmL水、IOmL丙酮振蕩洗滌f5min。(3)將毛發(fā)樣品分別用ImL正己烷、丙酮超聲波處理15 60s。預(yù)處理過的毛發(fā)，在自然晾干后剪成約廣2_長的小段，待鑒定使用。將粉碎前的毛發(fā)樣品噴金后，進(jìn)行掃描電鏡，并記錄下掃描電子顯微鏡圖。單乙酰嗎啡及嗎啡的提取
單乙酰嗎啡和嗎啡固化在毛發(fā)的變性角蛋白中，須先使其呈游離態(tài)再提取。本發(fā)明采取微粉碎提取法提取毛發(fā)中的衡量單乙酰嗎啡和嗎啡。取剪碎的毛發(fā)樣品，準(zhǔn)確稱取50mg，置于聚丙烯酰胺塑料管中，加入萃取液(萃取液是由乙腈和乙酸銨/甲酸水溶液以70:30的體積比所組成的混合物，其中乙酸銨/甲酸水溶液是由20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸所組成)0.6mL，內(nèi)標(biāo)嗎啡_d3 50ng,再加入
0.5 Ig的玻璃撞珠，將塑料管密封好，置于全自動(dòng)細(xì)胞粉碎儀中微粉碎。粉碎儀設(shè)定的振搖時(shí)間在2 5min，振搖頻率為3000 8000轉(zhuǎn)/min。微粉碎結(jié)束后，冷卻，離心，取上清液200 u L直接進(jìn)樣。微粉碎后毛發(fā)結(jié)構(gòu)被破壞，毛發(fā)中的單乙酰嗎啡和嗎啡釋放出。將粉碎后的毛發(fā)樣品噴金后，進(jìn)行掃描電鏡，并記錄下掃描電子顯微鏡圖。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析液相色譜條件
色譜柱:Resteck Allure PFP 丙基柱(100mmX2.lmm, 5 u m),前接Phenomenex 保護(hù)柱(4mmX2mm)o流動(dòng)相由20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖溶液(A)與乙腈(B)所組成,流動(dòng)相A和B組分的體積比在(T2min之間為20:80，在2 2.5min之間為85:15，在2.5 IOmin之間為20:80。流速為250 y L/min，進(jìn)樣量為5 u L0串聯(lián)質(zhì)譜條件
電噴霧離子源(ESI )，正離子掃描模式/ESI+，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式/MRM檢測。離子噴霧電壓(IS):5.5 kV ;碰撞氣氮?dú)?CAD):7 psi (I psi ^ 6.9 kPa)，氣簾氣(CUR): 10 psi ；霧化氣(GSl):20 psi，輔助氣(GS2):40 psi ;離子源溫度(TEM):4500C0各化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1，選用兩對母離子/子離子對進(jìn)行定性分析，其中第一對離子對用于定量分析。表I液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種快速鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法，其特征在于，包括以下順序步驟: 步驟1:將待檢測毛發(fā)和萃取液、內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3、撞珠一同置于粉碎儀器內(nèi)進(jìn)行微粉碎處理； 步驟2:將微粉碎處理后得到的混合物進(jìn)行離心分離； 步驟3:取離心分離后混合物的上層清液，對上層清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對毛發(fā)鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括對毛發(fā)依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷浸洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述毛發(fā)在各浸洗液中浸洗時(shí)間各為I 5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對毛發(fā)鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括對毛發(fā)依次用十二烷基磺酸鈉、洗潔精、水和丙酮洗滌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述毛發(fā)的洗滌時(shí)間為f5 min0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對毛發(fā)鑒定前的脫污染處理，所述脫污染處理包括在毛發(fā)中加入正己烷和丙酮進(jìn)行超聲波處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述毛發(fā)超聲波處理時(shí)間為15飛Os。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微粉碎處理的時(shí)間控制在2 5min之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微粉碎處理的振搖頻率為30001000轉(zhuǎn) /min0
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取液為乙腈和乙酸銨/甲酸水溶液以70:30的體積比所組成的混合物，所述乙酸銨/甲酸水溶液由20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸所組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的條件如下: 1)液相色譜條件:流動(dòng)相由A、B組成，其中A為含20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸的緩沖溶液，B為乙腈，所述A、B的體積比在0 2min之間為20:80，在2 2.5min之間為85:15,在2.5 IOmin之間為20:80 ； 流速:250u L/min ； 進(jìn)樣量:5iiL ; 2)質(zhì)譜條件: 檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式/MRM ； 掃描方式:正離子掃描模式/ESI+ ； 尚子噴霧電壓:5.5 kV ； 碰撞氣氮?dú)?7 psi ； 氣簾氣:10 psi ;霧化氣:20 psi ； 輔助氣:40 psi ； 離子源溫度:450°C ； 內(nèi)標(biāo):嗎啡-d3。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法，包括以下順序步驟步驟1將待檢測毛發(fā)和萃取液、內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3、撞珠一同置于粉碎儀器內(nèi)進(jìn)行微粉碎處理；步驟2將微粉碎處理后得到的混合物進(jìn)行離心分離；步驟3取離心分離后混合物的上層清液，對上層清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。本發(fā)明提供鑒定毛發(fā)中單乙酰嗎啡和嗎啡的方法能實(shí)現(xiàn)簡便、快速地從復(fù)雜生物基質(zhì)中分離純化單乙酰嗎啡和嗎啡分子，其特異性、選擇性強(qiáng)，靈敏度高，可應(yīng)用于實(shí)際吸毒人員毛發(fā)樣品的檢測，應(yīng)用于法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域海洛因吸毒者相關(guān)案件的鑒定和偵破。
文檔編號G01N30/02GK103207242SQ201210007109
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者沈敏, 施妍, 向平, 沈保華, 孫英英 申請人:司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所