專利名稱：一種豬細(xì)環(huán)病毒ⅱ型抗體間接阻斷elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬的一種病毒抗體檢測(cè)方法，具體說(shuō)是豬細(xì)環(huán)病毒II型(TTV2)抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有著非常重要的地位，然而豬病的肆虐不但制約著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)向規(guī)?；⒓s化方向的邁進(jìn)，而且影響著我國(guó)畜牧類產(chǎn)品的進(jìn)出口等國(guó)際化多邊貿(mào)易的發(fā)展，同時(shí)會(huì)給國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和人類生命財(cái)產(chǎn)損失。豬細(xì)環(huán)病毒常與豬圓環(huán)病毒、藍(lán)耳病毒發(fā)生混合感染，給豬的生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的影響和危害。豬細(xì)環(huán)病毒的防控直接影響著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)所關(guān)注的重點(diǎn)。1997年12月，日本學(xué)者Nishizawa等利用代表性差異分析法(represenatational difference analysis),首次從一位名為Torque Tero的輸血后非甲-非庚型肝炎病人的血清中克隆獲得了一種新的不明病原DNA(N22)，克隆的病毒DNA序列并不與任何一條參考序列相同或相近，因此證明此病毒可能是一個(gè)新的病毒。近十五年來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)TTV的研究取得了一定的進(jìn)展，對(duì)該病毒有了較深的認(rèn)識(shí)。2005年國(guó)際病毒分類命名委員會(huì)將該病毒分類為圓環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬，并統(tǒng)一命名為Torque Tero病毒，而不稱其為輸血傳播病毒 (transfusion trarismitted virus TTV),我國(guó)學(xué)者也將其翻譯為細(xì)環(huán)病毒。該病毒為一種小的十二面體的無(wú)囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，能感染多種脊椎動(dòng)物，包括人和豬。根據(jù)基因序列差異，將豬的TTV分為兩種不同的基因型，即基因I型和基因II型(TTV1和和 TTV2)。2002年，日本學(xué)者Okamoto首次從豬體內(nèi)檢測(cè)到了種屬特異的豬TTV病毒的存在， 與人TTV屬于同一類，此后世界各地陸續(xù)報(bào)道該病毒的發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)證明TTVs與PRRSV、 PCV等混合感染會(huì)加重豬皮炎和腎病綜合癥(PDNS)和斷奶和多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的癥狀。TTV在豬群中的感染呈全球性分布，包括美國(guó)、加拿大、中國(guó)、臺(tái)灣、韓國(guó)、法國(guó)、意大利和西班牙等國(guó)都有不同程度的感染，其感染率在24% 100%。通常在同一豬群中 TTV2的感染率較TTVl高，母豬較公豬易感。同一國(guó)家不同地區(qū)或不同豬場(chǎng)中TTV感染存在很大的差異。對(duì)意大利不同豬場(chǎng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些豬場(chǎng)不存在TTVl的感染，然而另外一些豬場(chǎng)的感染率卻高達(dá)53%。對(duì)我國(guó)廣東、福建、江西、河北、安徽、浙江和河南7省258份豬血樣品的TTV檢測(cè)結(jié)果表明TTV感染率在24. 1% 100%之間。此病毒感染一旦發(fā)生，就很難控制和消滅，因此及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)TTV，預(yù)防和控制該病毒的感染，對(duì)于畜牧業(yè)特別是養(yǎng)豬業(yè)具有重大的意義。目前豬TTV的檢測(cè)主要依賴PCR技術(shù)，但也有人應(yīng)用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法 (ELISA)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬細(xì)環(huán)病毒抗體間接阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒及豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)所表達(dá)蛋白(在本發(fā)明申請(qǐng)中以下簡(jiǎn)稱ORFl蛋白) 作為抗原(在本發(fā)明申請(qǐng)中以下簡(jiǎn)稱為重組抗原)包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備方法，為臨床檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒抗體提供快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)工具。本發(fā)明技術(shù)方案一種豬細(xì)環(huán)病毒抗體間接阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，包括抗體檢測(cè)板，酶結(jié)合物工作液，樣品稀釋液，顯色液A，顯色液B，終止液；阻斷抗體，洗滌緩沖液；所述的阻斷抗體為使用純化后的TTV2-0RF1基因抗原表位區(qū)蛋白免疫家兔后，從家兔體內(nèi)獲得的多克隆抗體；所述酶結(jié)合物工作液為商品化的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的山羊抗兔抗體，進(jìn)行 I 12000稀釋的稀釋液，酶標(biāo)二抗直接加入酶標(biāo)二抗稀釋液中，酶標(biāo)二抗稀釋液為 KH2PO4O. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, NaCl 29g, KCl 0. 2g, PEG6000 40g,加 ddH20 定容至 1000ml，加入0. 01% 0. 05%硫柳汞，調(diào)pH至7· 4 ;所述樣品稀釋液為KH2PO4O. 2g，Na2HPO4 · 12Η20 2. 9g, NaCl 29g，KCl 0. 2g, PEG600040g，加 ddH20 定容至 1000ml，加入 0. 01% 0. 05%疊氮鈉，調(diào) pH 至 7· 4 ;所述顯色液A 為0. 2mol/L Na2HPO4 51. 4ml, O. lmol/L 檸檬酸 48. 6ml，用 HCl 調(diào) pH 值至 5· O 5· 4，加 30% H2O2 67 μ I ；所述顯色液B為TMB50mg,加無(wú)水乙醇5ml,攪拌溶解后加O. lmol/L朽1檬酸5ml, O. lmol/L EDTAO. 5ml，加 ddH20 定容至 100ml ；所述終止液為2mol/L H2SO4溶液；所述抗體檢測(cè)板為豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl抗原表位區(qū)蛋白重組抗原包被的可拆卸 96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，阻斷抗體為兔抗豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白多克隆抗體。所述的檢測(cè)試劑盒，所述阻斷抗體的制備使用純化后的豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl 基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白與弗氏佐劑制成油乳劑，對(duì)體重在2kg左右的健康公兔進(jìn)行免疫，使其產(chǎn)生抗體；第一次免疫取ImL純化產(chǎn)物，與ImL完全弗氏佐劑混合制成油乳劑，皮下多點(diǎn)免疫家兔；14天后進(jìn)行第二次免疫，取2mL純化產(chǎn)物與2mL不完全弗氏佐劑混合制成油乳劑，皮下多點(diǎn)免疫家兔；7天后進(jìn)行第三次免疫，取3mL純化產(chǎn)物與3mL不完全弗氏佐劑混合制成油乳劑，皮下多點(diǎn)免疫家兔；7天后進(jìn)行第四次免疫，取O. 5mL純化產(chǎn)物注射入耳緣靜脈免疫家兔；一周后無(wú)菌采取心血，分離出的血清即為阻斷抗體。所述的檢測(cè)試劑盒，所述豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白重組抗原的制備方法為豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白重組抗原的制備選擇豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl (⑶570197. I)中一段優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)的696bp的堿基序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化以后，在寶生物公司公司合成優(yōu)化后的基因序列，而后將其克隆到pET32a(+)表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)化到受體菌DH5a和R0setta(DE3)中，將兩株重組菌分別命名為大腸埃希氏菌 DH5 a -pET-ORFl 株和大腸埃希氏菌 Rosetta-pET—ORFl 株，將 Rosetta-pET—ORFl 經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)裂解、純化后獲得。
所述的檢測(cè)試劑盒,所述抗體檢測(cè)板的制備方法為使用pH = 9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被液，將純化的ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白作為抗原按照I : 320 的體積比例稀釋后，每個(gè)樣孔加入100 μ L抗原，置于4°C 10 20h，進(jìn)行包被，使用樣品稀
釋液覆蓋后抽空封裝，置4°C保存。本發(fā)明還提供一種引用上述檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟I)將IOX洗滌緩沖液加入ddH20稀釋成IX洗滌工作液，將阻斷抗體用樣品稀釋液進(jìn)行2000倍稀釋，將待檢樣品進(jìn)行I : 5稀釋；
3min ；
2)在抗原包被板上設(shè)定阻斷抗體對(duì)照孔，加入阻斷抗體，每孔iooyI;
3)將待檢樣品加入檢測(cè)樣孔中，每孔 οομ1，封裝于封口袋中37°C孵育Ih ；
4)將各樣孔中的液體倒掉后用IX洗滌工作液洗滌，每孔300 μ I，洗滌3次，每次
5)將稀釋后的阻斷抗體加入檢測(cè)樣孔，每孔100 μ 1，封裝于封口袋中37°C孵育 I 4)；
加入酶標(biāo)二抗工作液，每孔100 μ I，封裝于封口袋中37°C孵育30mim，重復(fù)步驟每孔按順序加入顯色液A50 μ 1，再向每孔中加入顯色液Β50μ 1，室溫顯色每孔按順序加入終止液(2Μ H2SO4) 50 μ I終止反應(yīng)，450nm單波長(zhǎng)測(cè)定OD值，計(jì)檢測(cè)樣品的判斷標(biāo)準(zhǔn)為
lh，重復(fù)步驟4) 6)
4)；7)
IOmin ；8)
算抑制率；9)
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)環(huán)病毒II型抗體間接阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括抗體檢測(cè)板，酶結(jié)合物工作液，樣品稀釋液，顯色液A，顯色液B，終止液；阻斷抗體，洗滌緩沖液；所述的阻斷抗體為使用純化后的TTV2-0RF1基因抗原表位區(qū)蛋白免疫家兔后，從家兔體內(nèi)獲得的多克隆抗體；所述酶結(jié)合物工作液為商品化的辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的山羊抗兔抗體，進(jìn)行I : 12000 稀釋的稀釋液，酶標(biāo)二抗直接加入酶標(biāo)二抗稀釋液中，酶標(biāo)二抗稀釋液為KH2P040. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g, NaCl 29g, KCl 0. 2g, PEG6000 40g,加 ddH20 定容至 1000ml,加入 0. 01% 0. 05%硫柳汞，調(diào)pH至7· 4 ;所述樣品稀釋液為=KH2PO4 O. 2g，Na2HPO4 · Iffi2O 2. 9g，NaCl 29g，KCl O. 2g， PEG600040g，加 ddH20 定容至 1000ml，加入 0· 01% 0· 05%疊氮鈉，調(diào) pH 至 7. 4 ;所述顯色液 A 為0. 2mol/L Na2HP0451. 4ml, O. lmol/L檸檬酸 48. 6ml，用 HCl 調(diào) pH值至 5· O 5· 4，加 30% Η20267 μ I ；所述顯色液B為TMB 50mg,加無(wú)水乙醇5ml,攪拌溶解后加O. lmol/L朽1檬酸5ml,O.lmol/L EDTA O. 5ml，加 ddH20 定容至 100ml ；所述終止液為2mol/L H2SO4溶液；所述抗體檢測(cè)板為豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白重組抗原包被的可拆卸96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，阻斷抗體為兔抗豬細(xì)環(huán)病毒II型(TTV2)0RF1基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述阻斷抗體的制備使用純化后的豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白與弗氏佐劑制成油乳劑，對(duì)體重在2kg 左右的健康公兔進(jìn)行免疫，使其產(chǎn)生抗體；第一次免疫取ImL純化產(chǎn)物，與ImL完全弗氏佐劑混合制成油乳劑，皮下多點(diǎn)免疫家兔；14天后進(jìn)行第二次免疫，取2mL純化產(chǎn)物與2mL不完全弗氏佐劑混合制成油乳劑，皮下多點(diǎn)免疫家兔；7天后進(jìn)行第三次免疫，取3mL純化產(chǎn)物與3mL不完全弗氏佐劑混合制成油乳劑，皮下多點(diǎn)免疫家兔；7天后進(jìn)行第四次免疫，取O.5mL純化產(chǎn)物注射入耳緣靜脈免疫家兔；一周后無(wú)菌采取心血，分離出的血清即為阻斷抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白重組抗原的制備方法為豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白重組抗原的制備豬細(xì)環(huán)病毒II型 ORFl基因(GU570197. I)優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)，中一段優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)的696個(gè)堿基序列，進(jìn)行密碼子優(yōu)化以后，在寶生物公司合成優(yōu)化后的基因序列，而后將其克隆到pET32a(+)表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)化到受體菌DH5CI和Rosetta(DE3)中，將兩株重組菌分別命名為大腸埃希氏菌 DH5 a -pET-ORFl 株和大腸埃希氏菌 Rosetta-pET—ORFl 株，將 Rosetta-pET—ORFl 經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)裂解、純化后獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述抗體檢測(cè)板的制備方法為使用pH = 9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被液，將純化的豬細(xì)環(huán)病毒II型ORFl基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)蛋白作為抗原按照I : 320的體積比例稀釋后，每個(gè)樣孔加入IOOyL抗原，置于4°C 10 20h，進(jìn)行包被，使用樣品稀釋液覆蓋后抽空封裝，置4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)將IOX洗滌緩沖液加入CldH2O稀釋成IX洗滌工作液，將阻斷抗體用樣品稀釋液進(jìn)行2000倍稀釋，將待檢樣品進(jìn)行I : 5稀釋；2)在抗原包被板上設(shè)定阻斷抗體對(duì)照孔，加入阻斷抗體，每孔IOOyI ;3)將待檢樣品加入檢測(cè)樣孔中，每孔100μ1，封裝于封口袋中37°C孵育Ih ；4)將各樣孔中的液體倒掉后用IX洗滌工作液洗滌，每孔300μ 1，洗滌3次，每次 3min ；5)將稀釋后的阻斷抗體加入檢測(cè)樣孔，每孔 οομ1，封裝于封口袋中37°C孵育lh，重復(fù)步驟4)；6)加入酶標(biāo)二抗工作液,每孔100μ I，封裝于封口袋中37°C孵育30mim，重復(fù)步驟4)；7)每孔按順序加入顯色液A50μ 1，再向每孔中加入顯色液B50 μ 1，室溫顯色I(xiàn)Omin ；8)每孔按順序加入終止液(2ΜH2SO4) 50 μ I終止反應(yīng)，450nm單波長(zhǎng)測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率;9)檢測(cè)樣品的判斷標(biāo)準(zhǔn)為
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬細(xì)環(huán)病毒抗體間接阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒。包括抗體檢測(cè)板，酶結(jié)合物工作液，樣品稀釋液，顯色液A，顯色液B，終止液；阻斷抗體，洗滌緩沖液；所述的阻斷抗體為使用純化后的TTV2-ORF1基因抗原表位區(qū)蛋白免疫家兔后，從家兔體內(nèi)獲得的多克隆抗體。本發(fā)明有益的積極效果是特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，適合于臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用，具有良好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102590503SQ20121001856
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者劉驍, 廖珊, 徐志文, 朱玲, 李凇, 郭萬(wàn)柱 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)