專利名稱：氣相色譜－質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及新鮮尿、冷凍尿和尿濾紙片通過氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法。
背景技術(shù)：
由于尿中含有的氨基酸，糖類，脂質(zhì)和其它代謝終末或中間產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物的定量水平反應(yīng)身體本身的代謝情況。通過測定相關(guān)代謝物的種類和量值，可以參考判斷遺傳性代謝疾病，對我國的新生兒遺傳代謝病確癥，及時干預(yù)，治療及發(fā)病機(jī)制都有著重要的作用。北美或日本學(xué)者曾采用溶劑萃取方法來處理尿樣，處理后用氣相色譜-質(zhì)譜分析法進(jìn)行檢測?，F(xiàn)有的前處理方法是采用乙酸乙酯或者正己烷對尿樣進(jìn)行萃取，由于溶劑選擇性會丟失氨基酸和糖類等易溶于水的化合物。而且萃取操作和過后的干燥過濾操作繁瑣，且多次萃取操作易導(dǎo)致靈敏度下降，容易因操作人員的不同導(dǎo)致差異，結(jié)果難測，并且整個操作耗時2-3小時?？梢?，這樣的前處理使得一些水溶性的糖類和氨基酸由于溶解度的差異造成丟失，而且同時部分有機(jī)酸也出現(xiàn)含量降低。這種結(jié)果對于疾病的判斷和代謝疾病的發(fā)病機(jī)制推理都不能給出完整信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種快速準(zhǔn)確的氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法。為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，包括如下步驟1，對待檢尿液樣本完成尿酶處理；2，加入內(nèi)標(biāo)品，采用冷凍乙醇進(jìn)行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；3，對上述樣本進(jìn)行甲基硅烷化衍生處理；4，采用上述1-3的步驟處理標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，得到標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本；5，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本和待檢尿液樣本進(jìn)行檢測；6，以標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本的檢測結(jié)果作為參比曲線，用常規(guī)算法對待檢尿液樣本的有機(jī)酸進(jìn)行定量。進(jìn)一步地，步驟5中的檢測流程是這樣的采用分離模式進(jìn)樣，色譜柱DB-5ms，進(jìn)樣口溫度250°C，柱溫箱初溫100°C，保持4分鐘，以4°C /min速率升溫至250°C保持16分鐘；He氣流速1. lml/min ;溶劑延遲5分鐘；離子源模式+El ;離子源溫度20(TC;四極桿溫度150°C ;調(diào)諧模式自動調(diào)諧Autotune ;質(zhì)荷比范圍30m/z到600m/z,掃描周其月0. 4s,樣本分析時間60min ;計算機(jī)系統(tǒng)記錄色譜和質(zhì)譜圖形，應(yīng)用之前各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品建立的客戶定性譜庫做定性匹配，并采用已有參比鑒定的定量曲線校正方法進(jìn)行定量。
作為技術(shù)方案的比較選擇，發(fā)明人還嘗試過這樣的檢測流程柱溫箱初溫70°C，保持4分鐘，以10°C /min速率升溫至250°C保持8分鐘。He氣流速1. 3ml/min溶劑延遲3分鐘，離子源模式+El離子源溫度20(TC，四極桿溫度150°C調(diào)諧模式自動調(diào)諧Autotune質(zhì)荷比范圍30m/z到600m/z,掃描周期2s,樣本分析時間30min。實踐證明，這個程序的分離效果比較差，多個有機(jī)酸未能分開，而且由于掃描周期的延長會使峰形由于缺失數(shù)據(jù)點而失真，定量造成困難。步驟2中所述的內(nèi)標(biāo)品含有十七烷酸(MGA)，托品酸(IS-2)，二十四烷酸(C24)，重量比例如下十七烷酸(MGA) 35 45% ;托品酸(IS-2) 15 25% ;二十四烷酸(C24) 35 40%，混合為濃度為I. 2-1. 8mg/ml的水溶液。步驟4中的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸包括甲基琥珀酸，尿嘧啶，3-甲基戊二酸，5-氧合脯氨酸，
2-輕基馬尿酸,2-輕基異己酸,癸二酸,馬尿酸,其濃度均為0.6-1. Omg/mlo更進(jìn)一步地，檢測結(jié)束后用質(zhì)控品重復(fù)步驟1、2、3、5，從而校正標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的參比曲線，所述的質(zhì)控品中包括如下重量比的成分甲基琥拍酸10 20%,尿喃唳8 12%,
3-甲基戊二酸10 20%，5-氧合脯氨酸15 25%，2-羥基馬尿酸10 20，2-羥基異己酸5 10%，癸二酸5 10%，馬尿酸8 12% ;將各標(biāo)準(zhǔn)品混合后制成凍干粉而得，使用時復(fù)溶為濃度為0. 7-1. Omg/ml的水溶液。采用本發(fā)明建立的方法具有如下優(yōu)點1、該方法可以檢測新鮮尿，冷凍尿，尿濾紙片多種形式的尿液，有利于對遺傳代謝疾病的確癥，研究及干預(yù)。2、尿酶處理除去尿素，減少分析干擾，結(jié)果更準(zhǔn)確。3、用冷凍乙醇進(jìn)行沉淀蛋白，同時出去一些物理雜質(zhì)，保證樣本干凈，減少對儀器的污染。4、前處理過程快速，操作時間不超過一個小時，且沒有因操作人員不同而產(chǎn)生的誤差。5、所制作的質(zhì)控品對分析方法進(jìn)行校準(zhǔn)，保證測試結(jié)果。6、采用由各有機(jī)酸的外標(biāo)法建立的定量方法和客戶定性譜庫更有針對性，各有機(jī)酸等的定量更加準(zhǔn)確，有助于遺傳代謝缺陷病的檢測和干預(yù)。樣本色譜峰分離效果良好，可以對近70種有機(jī)酸等進(jìn)行準(zhǔn)確外標(biāo)定量，該方法可以對質(zhì)譜圖信息完整，易于分析，檢測結(jié)果更可靠。具體實施示例I、配制內(nèi)標(biāo)品，重量比例如下十七烷酸(MGA)40% ;托品酸(IS_2)20% ;二十四烷酸(C24) 40%，混合后稀釋為總濃度為1.5mg/ml的水溶液。備用。2、配制質(zhì)控品，重量比例如下甲基琥珀酸15%，尿嘧啶10%，3_甲基戊二酸15%, 5-氧合脯氨酸20%，2-羥基馬尿酸15，2-羥基異己酸7%，癸二酸8%，馬尿酸10%；混合后制成凍干粉。備用。3、尿樣本收集新鮮尿待用；冷凍尿室溫解凍；尿濾紙片的樣本是采用31ET濾紙收集任意次尿，陰干后置于濾紙干燥袋內(nèi)。測試前用300ul的純化水洗脫，離心，收集洗脫液。4、測定尿樣的肌酐濃度，通過稀釋使得濃度在1000 4000nmol/L范圍內(nèi)(3000nmol/L比較好)，然后取尿樣IOOul于2ml離心管中。5、向離心管中添加尿素酶20ul，然后在水浴37°C中孵育30分鐘。6、取出后在同一離心管內(nèi)加冰乙醇900ul，加步驟I中的內(nèi)標(biāo)品20ul。
7、離心管置于冷凍離心機(jī)中于4度8500rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘。8、取上清液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶中，氮吹儀37°C恒溫下用適量氮氣持續(xù)吹干，該過程一般I小時即可吹干。如樣本緊急可以加大氮氣的流速，加快吹干。9、吹干后在反應(yīng)瓶中加入娃燒化試劑lOOul，恒溫80 C反應(yīng)30分鐘，結(jié)束后觀察反應(yīng)液若無沉淀，液體澄清，取Iul進(jìn)樣分析，不澄清時在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，再取樣分析。
10、用以上5-9的步驟分別處理甲基琥珀酸，尿嘧啶，3-甲基戊二酸，5-氧合脯氨酸，2-羥基馬尿酸，2-羥基異己酸，癸二酸，馬尿酸的樣本。11、氣相色譜質(zhì)譜分析應(yīng)用安捷倫7890/5975C型GC-MS進(jìn)行樣本分析，配備7693 型自動進(jìn)樣器，DB-5ms,30m*0. 25mm(id) ,0. 25um 色譜柱。色譜和質(zhì)譜分析條件如下采用分離模式進(jìn)樣，分流比I : 10，進(jìn)樣口溫度250°C，柱溫箱初溫100°C，保持4分鐘，以4°C /min速率升溫至250°C保持16分鐘。He氣流速1. lml/min溶劑延遲5分鐘，離子源模式+EI離子源溫度20(TC，四極桿溫度150°C調(diào)諧模式自動調(diào)諧Auto tune質(zhì)荷比范圍30m/z到600m/z,掃描周期0. 4s,樣本分析時間60min ;計算機(jī)系統(tǒng)記錄色譜和質(zhì)譜圖形。12、用市售的Agilent Chemstation工作站軟件(版本號為B. 04. 01),分別處理步驟11中得到的譜圖；以各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品做定量曲線，針對各結(jié)果給出的譜圖進(jìn)行譜庫搜索得到物質(zhì)質(zhì)譜碎片峰匹配的確認(rèn)結(jié)果。13、依上述對多種尿樣進(jìn)行檢測分析。每天進(jìn)行檢測之前，將步驟2中的質(zhì)控品復(fù)溶，配制成濃度為0. 8mg/ml的水溶液，用于標(biāo)定檢測儀器及校正標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸定量曲線。
權(quán)利要求
1.氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，包括如下步驟1，對待檢尿液樣本完成尿酶處理；2，加入內(nèi)標(biāo)品，采用冷凍乙醇進(jìn)行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；3，對上述樣本進(jìn)行甲基硅烷化衍生處理；4，采用上述1-3的步驟處理標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，得到標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本；5，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本和待檢尿液樣本進(jìn)行檢測；6，以標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本的檢測結(jié)果作為參比曲線，用常規(guī)算法對待檢尿液樣本的有機(jī)酸進(jìn)行定量。
2.如權(quán)利要求I所述的氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，其特征在于步驟5中的檢測流程是這樣的采用分離模式進(jìn)樣，色譜柱DB-5ms，進(jìn)樣口溫度250°C，柱溫箱初溫100。。，保持4分鐘，以40C /min速率升溫至250°C保持16分鐘；He氣流速1. lml/min ;溶齊IJ延遲5分鐘；離子源模式+El ;離子源溫度200°C ;四極桿溫度150°C ;調(diào)諧模式自動調(diào)諧Auto tune ;質(zhì)荷比范圍30m/z到600m/z,掃描周期0. 4s,樣本分析時間60min ;計算機(jī)系統(tǒng)記錄色譜和質(zhì)譜圖形，應(yīng)用之前各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品建立的客戶定性譜庫做定性匹配，并采用已有參比鑒定的定量曲線校正方法進(jìn)行定量。
3.如權(quán)利要求I所述的氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，其特征在于步驟2中所述的內(nèi)標(biāo)品含有十七烷酸(MGA)，托品酸(IS-2)，二十四烷酸(C24)，重量比例如下十七烷酸(MGA) 35 45%;托品酸(IS-2) 15 25% ;二十四烷酸(C24) 35 40%，混合為濃度為I. 2-1. 8mg/ml的水溶液。
4.如權(quán)利要求I所述的氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，其特征在于步驟4中的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸包括甲基琥珀酸，尿嘧啶，3-甲基戊二酸，5-氧合脯氨酸，2-羥基馬尿酸，2-羥基異己酸，癸二酸，馬尿酸，其濃度均為0. 6-1. Omg/mlo
5.如權(quán)利要求I所述的氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，其特征在于檢測結(jié)束后用質(zhì)控品重復(fù)步驟1、2、3、5，從而校正標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的參比曲線，所述的質(zhì)控品中包括如下重量比的成分甲基琥珀酸10 20%，尿嘧啶8 12%，3-甲基戊二酸10 20%，5-氧合脯氨酸15 25%, 2-輕基馬尿酸10 20, 2-輕基異己酸5 10%,癸二酸5 10%,馬尿酸8 12% ;將各標(biāo)準(zhǔn)品混合后制成凍干粉而得，使用時復(fù)溶為濃度為0. 7-1. Omg/ml的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氣相色譜－質(zhì)譜檢測尿有機(jī)酸的方法，包括如下步驟1，對待檢尿液樣本完成尿酶處理；2，加入內(nèi)標(biāo)品，采用冷凍乙醇進(jìn)行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；3，對上述樣本進(jìn)行甲基硅烷化衍生處理；4，采用上述1-3的步驟處理標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸，得到標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本；5，采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀對標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本和待檢尿液樣本進(jìn)行檢測；6，以標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸樣本的檢測結(jié)果作為參比曲線，用常規(guī)算法對待檢尿液樣本的有機(jī)酸進(jìn)行定量。本發(fā)明前處理過程快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
文檔編號G01N30/88GK102621262SQ20121004695
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者張民, 王軍娟, 黃成剛 申請人:杭州博圣生物技術(shù)有限公司