專利名稱：蛋白c(pc)測定試劑盒(發(fā)色底物法)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種發(fā)色底物法檢測蛋白C活性的試劑盒。
背景技術(shù)：
蛋白C (簡稱PC)是ー種維生素K依賴性蛋白，在Ca2+存在的條件下，能被凝血酶-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白激活轉(zhuǎn)化成有活性的蛋白C (簡稱APC)。APC能通過蛋白水解作用滅活活化的凝血因子V a (簡稱F V a)和VDI a (簡稱F VDI a)，從而顯示出較強(qiáng)的抗凝活性；同時(shí)通過釋放血管血纖維蛋白溶酶原激活劑來促進(jìn)纖溶。PC的缺乏會(huì)使人體的凝血及纖溶平衡受影響，使凝血亢進(jìn)，從而發(fā)生血栓性疾病。血漿PC水平的降低易引起彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和肝臟疾病，如肝硬化和慢性肝炎。近年來，人們發(fā)現(xiàn)許多臨床疾病均可伴隨PC水平的改變，如腎功能衰竭、外科手木、 炎性反應(yīng)、ロ服抗維生素K類抗凝藥、缺血性心臟疾病、腦血管疾病、靜脈血栓形成以及白血病等。由此可見，很有必要建立一種能準(zhǔn)確檢測血漿中PC活性的簡便方法，用于上述各類疾病的輔助診斷。根據(jù)檢測原理，目前用于定量檢測蛋白C的方法可歸納為三大類(I)根據(jù)PC的抗原特性而形成的免疫學(xué)方法，包括雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析法、火箭免疫電泳法等，其中使用最為廣泛的是ELISA法，通過采用單抗或多抗進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)來檢測PC抗原含量。該方法能夠準(zhǔn)確檢測PC抗原含量，但是存在著一定的缺陷。首先，需要高度純化的PC來獲得特異性抗體，因?yàn)椴患兊目乖兴獫{蛋白雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致抗體的專ー性不強(qiáng)，這會(huì)使得檢測結(jié)果偏高；其次，該方法操作繁瑣，檢測時(shí)間很長，不能滿足急診和臨床病人及時(shí)診斷和治療的需要；最后，該方法還有ー定的局限性，它同時(shí)也檢測了 PC的病理形態(tài)，如與抑制劑連接的或滅活的PC，因此不能準(zhǔn)確判斷所檢測的PC是否有正?；钚浴?2)根據(jù)PC抗凝活性形成的APTT凝固法。該方法使用蛇毒激活PC后，加入到血漿凝固體系中，能夠延長血漿凝固時(shí)間，延長比例對應(yīng)著樣品中PC含量。該方法能專ー性檢測功能性PC，但是該方法的干擾因素多，檢測結(jié)果變數(shù)較大，其結(jié)果的判斷往往以檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)而定，直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。(3)采用APC專ー性的合成多肽作為底物的酶學(xué)方法，即發(fā)色底物法。早期采用凝血酶-凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(T-TM)作為激活劑。該方法不能直接檢測血漿中的PC活性，因?yàn)檠獫{中包含有PC抑制劑和其他干擾物質(zhì)，易在活性檢測過程中與合成肽底物反應(yīng)。因此，必須事先通過抗體柱或吸附將PC從血漿中分離出來，這ー過程不僅需要大量的血漿，而且也需要大量的時(shí)間及人力，該方法不適用于大批量樣品的快速處理。目前，國外已開發(fā)使用蛇毒激活劑代替T-TM，它能快速激活人和牛血漿PC，激活機(jī)制可能與凝血酶類似，但不受其它凝血因子的干擾，也不水解底物。它的快速激活作用使得PC抑制劑的作用降至最低，并因此排除了吸附分離PC的必要性，從而加速PC活化過程，克服了用T-TM作激活劑時(shí)激活時(shí)間太長，操作繁瑣的缺陷。
目前，蛋白C活性定量檢測的方法主要采用發(fā)色底物法，該方法能準(zhǔn)確、特異地反映PC活性，不僅結(jié)果真實(shí)穩(wěn)定，而且操作簡便易行，具有快速的優(yōu)點(diǎn)，只需數(shù)分鐘就能完成檢測。但由于目前市售的此類試劑盒中所采用的激活劑絕大多數(shù)是從銅頭蝮蛇(Agkistrodon contortrix)毒中分離純化而得,該種類蛇多分布在美國東南部及墨西哥東北部，國內(nèi)對于該蛇毒的獲得比較困難，因此這種激活劑無法在國內(nèi)大批量生產(chǎn)和應(yīng)用。近期，有文獻(xiàn)報(bào)道從皖南蝮蛇蛇毒中分離提純的PC激活劑具有用于臨床PC活性檢測的前景，但實(shí)驗(yàn)證明該激活劑對血漿中其它凝血因子有部分激活，易受多種因素干擾，特異性相對較低，目前該激活劑還未能夠應(yīng)用到PC測定試劑盒中。以上種種弊端使得PC檢測難以在醫(yī)院推廣使用，從而限制了該檢測項(xiàng)目的常規(guī)開展。因此，迫切需要開發(fā)ー種新的PC激活劑用于PC活性測定試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種蛋白C活性檢測試劑盒，該試劑盒基于中國秦嶺蝮蛇 蛇毒激活劑，能有效定量檢測血漿蛋白C活性，其檢測特異性強(qiáng)；且原料易得、成本較低，適
合批量化生產(chǎn)。具體地，本發(fā)明提供了一種檢測蛋白C活性的試劑盒，該試劑盒包括Rl試劑和R2試劑；所述Rl試劑包含ー種蛋白C激活劑，所述蛋白C激活劑自中國秦嶺蝮蛇蛇毒中提取，其SDS-PAGE電泳呈一條帶，分子量在40-45KD之間；所述R2試劑為包含發(fā)色底物的試劑。上述試劑盒中，所述蛋白C激活劑自中國秦嶺蝮蛇蛇毒中提取的方法如下步驟I :中國秦嶺蝮蛇蛇毒干粉用磷酸鹽緩沖液溶解后，采用DEAE-瓊脂糖快流速陰離子交換柱進(jìn)行層析，用含O O. 5mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測波長為280nm，收集并合并活性峰洗脫液；步驟2 :將步驟I所得活性峰洗脫液經(jīng)透析除鹽后，采用SP-S^hadex C50陽離子交換柱進(jìn)行層析，用含O. I O. 6mol/L氯化鈉的醋酸鹽緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測波長為280nm，收集并合并活性峰洗脫液；步驟3 :步驟2所得活性峰洗脫液經(jīng)濃縮、透析除鹽后，采用S^hadex G-100柱進(jìn)行過濾層析，磷酸鹽緩沖液洗脫，收集活性峰洗脫液，即為所述蛋白C激活劑。上述提取方法中，步驟I所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7 8、濃度為10 25mM。步驟I所述中國秦嶺蝮蛇蛇毒干粉與用于溶解蛇毒干粉的磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量體積比以g/ml計(jì)為O. 5 I. 5:10。步驟2所述醋酸鹽緩沖液的pH值為5 6、濃度為30 60mM。步驟3所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7 8、濃度為10 30mM。上述試劑盒中，所述Rl試劑和R2試劑還分別包含緩沖液、穩(wěn)定劑、賦形劑和防腐齊 。上述試劑盒中，所述Rl試劑中所述蛋白C激活劑的工作濃度為O. 07 O. 36mg/ml ο所述R2試劑中發(fā)色底物為PyroGlu-Pro-Arg-pNA HCl，工作濃度為O. I O. 5mg/ml ο所述Rl試劑緩沖液為Tris緩沖液或HEPES緩沖液,為反應(yīng)提供適宜的反應(yīng)條件。
優(yōu)選地，所述Rl試劑緩沖液為pH值為7· 5 8· 5、濃度為4 6mmol/L的Tris-HCl緩沖液。所述R2試劑緩沖液為Tris-HCl緩沖液、Tris-CsCl緩沖液、Tris-NaCl緩沖液、咪唑緩沖液、HEPES緩沖液、巴比妥緩沖液中的ー種或多種。優(yōu)選地，所述R2試劑緩沖液為pH值為6. 9 8. 5的Tris-CsCl緩沖液，所述Tris終濃度為50 100mmol/L，所述Cs+終濃度為100 260mmol/L。作為優(yōu)選，所述R2試劑緩沖液中還含有Ca2+，可以加速底物反應(yīng)速率，所述Ca2+終濃度為4 6mmol/L。本發(fā)明試劑盒中，所述Rl試劑、R2試劑中的穩(wěn)定劑均為蛋白質(zhì)、氣基酸、表面活性齊U、助懸劑、抗氧劑中的ー種或多種；所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白或明膠，所述表面活性劑為 PEG-6000 或 PEG-8000。
所述Rl試劑、R2試劑中的賦形劑均選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、海藻糖、乳糖中的ー種或兩種。所述Rl試劑、R2試劑中的防腐劑均為本領(lǐng)域的常規(guī)防腐剤，如疊氮鈉，含量為O. 02%-0. 2% (g/ml)吋，既可以有效殺菌，又不會(huì)產(chǎn)生副作用，可延長試劑盒的有效期；還可以是其它具有防腐作用的慶大霉素、環(huán)丙沙星或ProClin系列防腐劑中的任何ー種。本發(fā)明試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明試劑盒中的蛋白C激活劑來源于中國秦嶺蝮蛇蛇毒，原材料國內(nèi)易于獲得，制備方法簡便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；2、本發(fā)明試劑盒中的蛋白C激活劑對血漿中其它凝血因子沒有激活作用，具有較強(qiáng)的專一性，并因此不易受干擾，具有較強(qiáng)的特異性；3、本發(fā)明試劑盒試劑組成簡單，易于制備，生產(chǎn)成本較低；4、本發(fā)明試劑盒檢測蛋白C活性時(shí)操作簡單，適用于多種型號的半自動(dòng)或全自動(dòng)的凝血分析儀，便于在各級醫(yī)院、醫(yī)學(xué)生物科研単位等推廣使用，從而可促進(jìn)該檢測項(xiàng)目的常規(guī)開展。


圖I為本發(fā)明試劑盒的校準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有蛋白C檢測試劑盒的相關(guān)性分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了ー種蛋白C活性檢測試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)エ藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。實(shí)施例中所描述的具體的物料配比、エ藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I蛋白C激活劑的制備(I)取Ig秦嶺蝮蛇粗蛇毒干粉(購自陜西省寧東林業(yè)局蛇場)，溶于IOml 2OmM PBS緩沖液(pH7. 5)，靜置，取上清液加入到預(yù)先用相同緩沖液平衡的DEAE-S印harose FF陰離子交換柱中，上樣完成后，用上述緩沖液再次沖洗柱子至平衡，以便于除去未結(jié)合到柱子上的其余雜蛋白。再用含O O. 5mol/L NaCl的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為Iml/min，檢測波長為280nm。取O. Iml洗脫液，加入O. Iml正常混合血漿和37°C預(yù)溫的O. ImlAPTT試劑(腦磷脂-白陶土)，混勻后37 °C孵育5min，然后加入37°C預(yù)溫的O. 025mol/LCaCl2溶液O. Iml后，測定凝固時(shí)間，如發(fā)生延長，說明洗脫液含有能激活蛋白C的活性成分，收集并合并活性峰洗脫液。
(2)將步驟(I)收集到的活性峰洗脫液用pH 5. 8、50mM NaAc-HAc緩沖液透析除鹽，上樣到經(jīng)相同緩沖液平衡后的SPS印hadex C_50陽離子交換柱上，流速為lml/min。上樣完成后，用上述緩沖液再次沖洗柱子至平衡，然后采用含O. I O. 6mol/L NaCl的NaAc-HAc緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集并合并活性峰洗脫液。(3)將步驟(2)收集到的活性峰洗脫液用聚こニ醇-20000濃縮后，移至透析袋中再次進(jìn)行透析，透析液為濃度20mM、pH8. O的PBS緩沖液，充分透析后，上樣到經(jīng)相同緩沖液充分平衡后的Sephadex G-100層析柱上,流速為O. 4ml/min,用該平衡緩沖液以相同的流速進(jìn)行洗脫，收集到活性峰約10ml。最后，將所收集活性蛋白透析后濃縮，分裝凍干保存。用還原性和非還原性SDS-PAGE電泳檢測，均顯示為一條帶，分子量在4(T45kD之間。實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的制備本實(shí)施例中的蛋白C活性測定試劑盒為固體試劑，包括Rl試劑和R2試劑，分別按以下成分和用量配制A) Rl 試劑
Tris-HCi 緩沖液(ρΗ8·0 )5mmol/L;
蝮蛇蛇毒激活劑0.2 5 mg/ml;
甘露醇5% ( g/ml);
BSA0.1% ( g/ml);
NaN30.02% ( g/ml );上述試劑全部溶解完全后，以Iml/瓶分裝入瓶，制成凍干粉后使用。B) R2 試劑
Tris-HCl 緩沖液(pH8.4 )70mmo]/L;氯化銫150m inol/L; P y r ο GI u - P r ο - A rg - P N A · H CI3 .m g/m I; :氮イ匕4丐5mmoi/L; PEG-6000I % ( g/m!); 甘露醇40mg/ml; NaN30.02% ( g/ml );上述試劑全部溶解完全后，以Iml/瓶分裝入瓶，制成凍干粉后使用。實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒檢測蛋白C活性的方法取蛋白C校準(zhǔn)品(購自美國ANIARA公司，貨號A222101)，用生理鹽水配制成6個(gè)不同活性的校準(zhǔn)品溶液，活性分別為150%、100%、75%、50%、25%、0%。將實(shí)施例2所制備試劑盒中的固體Rl試劑用Iml蒸餾水溶解，R2試劑用Iml蒸餾水溶解。以日本東亞CA530全自動(dòng)血凝儀操作為例設(shè)定反應(yīng)溫度37°C，測定波長為405nm，分別取不同濃度的校準(zhǔn)品溶液 20 μ 1，預(yù)熱60s后，加入Rl試劑125 μ 1，反應(yīng)300s后加入R2試劑30 μ 1，測定反應(yīng)第Ils與第IOOs時(shí)的吸光度差值(Λ 0D)，每管重復(fù)測定3次，將各校準(zhǔn)管3次測得的吸光度Λ OD的均值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的活性為橫坐標(biāo)，制作“活性-吸光度差值”校準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖I。取待測樣品，同上方法測定樣品的吸光度Λ OD值，代入校準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出待測樣品中蛋白C的活性。如果樣品中蛋白C的檢測活性超出校準(zhǔn)曲線的范圍，為了保證檢測的準(zhǔn)確性，需要用生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再行檢測。本試劑盒不僅適用于日本東亞CA530血凝儀，而且還適用于其它品牌、型號的凝血分析儀，如美國貝克曼庫爾特ACL 7000全自動(dòng)血凝儀、美國太平洋ThromboScreen 400C半自動(dòng)血凝儀、北京賽科希德SF-8000全自動(dòng)血凝儀等，具體參數(shù)可根據(jù)儀器不同進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒的特異性分析為了考察本發(fā)明試劑盒的特異性，本實(shí)施例針對本發(fā)明試劑盒所用蛇毒PC激活劑采用了以下三種不同的實(shí)驗(yàn)來共同說明。I、蛇毒蛋白C激活劑(簡稱PCA)對人血漿PT和APTT的影響蛇毒激活劑有些可影響凝血系統(tǒng)的內(nèi)源途徑或(和)外源途徑，而理想的蛋白C激活劑應(yīng)能抑制凝血系統(tǒng)內(nèi)源途徑，對外源途徑?jīng)]有影響。本實(shí)驗(yàn)通過研究本發(fā)明所用秦嶺蝮蛇蛇毒PCA對人正常血漿APTT和PT的影響來進(jìn)行分析。以不同濃度的上述蛇毒PCA進(jìn)行PT和APTT考察，測定方法如下(I)取O. Iml正?；旌涎獫{，加入O. Iml蛇毒PCA，37°C孵育5min，然后加入37°C預(yù)溫PT試劑O. 2ml，記錄凝固時(shí)間，即為PT值。(2)取O. Iml正?；旌涎獫{，加入37°C預(yù)溫的O. Iml APTT試劑(腦磷脂-白陶土)，以及O. Iml蛇毒PCA混勻后，37°C孵育5min，然后加入37°C預(yù)溫的O. 025mol/L CaCl2溶液O. Iml后，記錄凝固時(shí)間，即為APTT值。測定結(jié)果如表I所示。表I本發(fā)明所用蛇毒PCA對PT、APTT的影響
權(quán)利要求
1.一種檢測蛋白C活性的試劑盒，其特征在于，包括Rl試劑和R2試劑；所述Rl試劑包含ー種蛋白C激活劑，所述蛋白C激活劑自中國秦嶺蝮蛇蛇毒中提取，其SDS-PAGE電泳呈一條帯，分子量在40-45KD之間；所述R2試劑為包含發(fā)色底物的試劑。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述蛋白C激活劑自中國秦嶺蝮蛇蛇毒中提取的方法如下 步驟I :中國秦嶺蝮蛇蛇毒干粉用磷酸鹽緩沖液溶解后，采用DEAE-瓊脂糖快流速陰離子交換柱進(jìn)行層析，用含O O. 5mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測波長為280nm，收集并合并活性峰洗脫液； 步驟2 :將步驟I所得活性峰洗脫液經(jīng)透析除鹽后，采用SP-Sephadex C50陽離子交換柱進(jìn)行層析，用含O. I O. 6mol/L氯化鈉的醋酸鹽緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，檢測波長為280nm,收集并合并活性峰洗脫液； 步驟3 :步驟2所得活性峰洗脫液經(jīng)濃縮、透析除鹽后，采用Sephadex G-IOO柱進(jìn)行過濾層析，磷酸鹽緩沖液洗脫，收集活性峰洗脫液，即為所述蛋白C激活劑。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟I所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7 8、濃度為10 25mM。
4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在干，步驟I所述中國秦嶺蝮蛇蛇毒干粉與用于溶解蛇毒干粉的磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量體積比以g/ml計(jì)為O. 5 I. 5:10。
5.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟2所述醋酸鹽緩沖液的pH值為5 6、濃度為30 60mM。
6.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟3所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7 8、濃度為10 30mM。
7.如權(quán)利要求1-6任ー項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述Rl試劑和R2試劑還分別包含緩沖液、穩(wěn)定劑、賦形劑和防腐剤。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述Rl試劑中所述蛋白C激活劑的工作濃度為 O. 07 O. 36mg/ml。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述R2試劑中發(fā)色底物為PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl,工作濃度為 O. I O. 5mg/ml。
10.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述Rl試劑緩沖液為Tris緩沖液或HEPES緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測蛋白C活性的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測蛋白C活性的試劑盒，包括一種由中國秦嶺蝮蛇蛇毒分離純化的蛋白C激活劑和發(fā)色底物試劑，屬于發(fā)色底物法檢測。本發(fā)明所述試劑盒檢測特異性好、不易受干擾，且原材料易于獲得、制備簡便，檢測時(shí)操作簡單、快速，儀器適用范圍廣，便于在各級醫(yī)院、衛(wèi)生部門等推廣使用。
文檔編號G01N33/68GK102692511SQ20121018957
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者謝永華 申請人:上海太陽生物技術(shù)有限公司