專利名稱：有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備及應用。具體是基于有序介孔碳納米材料和離子液體，構(gòu)建的檢測多種婦科腫瘤標志物的無標記型電化學免疫傳感器，用于檢測血清中的婦科腫瘤標志物。屬于新型納米功能材料與生物傳感技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
腫瘤(tumor)是人體組織細胞由于內(nèi)在和外界致病因素長時間的作用，導致細胞的遺傳物質(zhì)一脫氧核糖核酸(DNA)產(chǎn)生突變， 使細胞的生長和分裂失去控制，從而發(fā)生異常增生和功能失調(diào)。腫瘤嚴重威脅人民健康，是近年來醫(yī)學領域中備受重視的重大研究課題。2010年中國深圳召開的國際抗癌聯(lián)盟大會預計到2020年全球每年將有1600萬新增癌癥患者，每年有1000萬人死于癌癥。其中乳腺癌、卵巢癌、多囊卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜癌、宮頸鱗癌、子宮頸癌等婦科腫瘤疾病嚴重影響了廣大女性的健康，引起了社會各界和醫(yī)學領域的廣泛關(guān)注。近30年來，癌癥發(fā)病率每年以3% 5%的速度增長，80%的新發(fā)腫瘤在中國、印度、巴西和墨西哥等發(fā)展中國家，在世界范圍內(nèi)腫瘤成為第一死亡原因，超過了艾滋病、結(jié)核、瘧疾加起來的死亡原因。以2007年為例，世界有790萬人口死于癌癥，世界衛(wèi)生組織指出，如果能早期進行診斷并及時治療，80% 85 %的腫瘤都可以治愈。腫瘤標志物(tumor marker)是指腫瘤組織及細胞所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的異常表達，并可以此診斷或監(jiān)測腫瘤的發(fā)展。腫瘤標志物在正常組織或良性疾病不產(chǎn)生或產(chǎn)量甚微，而腫瘤病人的組織、體液及排泄物中則有大量分泌，測得值異常升高。腫瘤標志物在腫瘤普查、診斷、治療、病情監(jiān)測、判斷預后、評價療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有很大的實用價值。多少年來婦科腫瘤學家致力于婦科腫瘤早期診斷方法的研究，期望找到一種簡易、敏感性特異性高的腫瘤標志物。近十余年來，這項工程得到了飛速地發(fā)展，特異性血清檢測物的發(fā)現(xiàn)，挽救了大量婦科惡性腫瘤患者的生命。在治療過程中，通過標志物作為病情監(jiān)測依據(jù)，避免了盲目性。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)包括蛋白質(zhì)組、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-T0F-MS)等的飛速發(fā)展，逐漸發(fā)現(xiàn)了許多有應用前景的腫瘤標志物。常用的婦科腫瘤標志物有以下幾種甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、糖類抗原CA12-5、糖類抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC)等，它們對臨床及病情監(jiān)測有重要參考價值。腫瘤標志物從發(fā)現(xiàn)、發(fā)展到現(xiàn)在，隨著檢測手段的不斷提高，有許多檢測方法。其中，具有推廣應用價值或已被廣泛應用的主要有放射免疫分析法(RIA)、酶標記免疫分析技術(shù)(EIA)、免疫放射分析法(IRMA)、免疫化學發(fā)光分析(CLIA)、時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TrFLA)、液體芯片檢測技術(shù)和SELDI-TOF-MS等。但這些技術(shù)一般需要復雜的監(jiān)測儀器，檢測時間長，普及性差，且有些試劑具有放射性，對人體有一定的危害。電化學免疫傳感器是一種將電化學分析方法與免疫學技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的生物傳 感器，其具有靈敏、特異、快速、成本低、操作簡單、易數(shù)字化和易實現(xiàn)實時輸出檢測等優(yōu)點，尤其適合于癌癥疾病的診斷。另外，電化學免疫傳感器結(jié)合了納米材料大的比表面積、較強的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性等特點，顯著改善了傳感器的性能，為電化學免疫傳感器的研究和應用開辟了一個新的天地。有序介孔碳(OMC)是一類新型的介孔材料,1999年合成方法首次被Ryoo等人報道。由于介孔碳具有較高的比表面積、有序的孔徑分布，同時具有較高的機械強度、較強的吸附能力，可應用于催化、儲氫、吸附等領域。有序介孔碳的酸堿穩(wěn)定性良好，合成方法簡單，易于制得，其本身是很好的良導體，具有較好的導電性。本發(fā)明采用有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料為電極基體材料，利用離子液體導電率高、電位窗口寬，以及蛋白質(zhì)可與離子液體通過離子間的相互作用，連接婦科腫瘤腫瘤標志物的抗體、抗原制得無標記電流型免疫傳感器。本發(fā)明免疫傳感器的檢出限低，對多種婦科腫瘤標志物的檢出限在O. 68 1.3 pg 之間。經(jīng)對現(xiàn)有婦科腫瘤標志物檢測學術(shù)研究成果和專利技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，Tang等研究了檢測CEA的電化學免疫傳感器，該傳感器的檢測限為I. 2 ng · mL—參見Tang，D. P.，Ren, J. J. Anal. Chem. 2010，80，8064-8070. ;CN200910212772. 0 公開了一種用于檢測甲胎蛋白的電化學發(fā)光免疫傳感器，該傳感器的檢測限達到O. 035 ng · mL'由此可以看出，本發(fā)明的方法靈敏度得到了顯著提高，靈敏度均優(yōu)于以上兩種方法，可以準確定量檢測多種腫瘤標志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是克服傳統(tǒng)檢測方法的缺點和不足，結(jié)合有序介孔碳納米材料和離子液體的優(yōu)勢，提供了一種識別快速、靈敏度高、成本低、便于操作的檢測多種婦科腫瘤標志物的電化學免疫傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是將該電化學免疫傳感器應用于多種婦科腫瘤標志物的靈敏、特異、快速、準確檢測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下
I.有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備，其特征在于，包括以下步驟
(1)有序介孔碳納米材料的制備；
(2)有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備；
(3)婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的制備。(I)中所述的有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
I)取 O. 40 O. 50 g 苯酚，I. 4 I. 8 mL 37% 的甲醛溶液，10 13 mL O. I mo I · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應液O. 5 h ;2)預先將O.64 O. 80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 54 mL超純水中，攪拌溶解，加入I)反應液中，反應16 18 h，反應液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，當沉淀出現(xiàn)時，停止反應,反應液冷卻至室溫；
3)加173 217mL超純水于2)得到的反應液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應釜中，在馬弗爐中130 °C反應24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。(2)中所述的有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍溶液以體積比I : O. 5 I : 2混合，在室溫條件下攪拌24 30 h ;
2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料；
3)將2)中所制得的復合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的混合液A，室溫儲存下備用。(3)中所述的婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的制備，步驟如下
1)將直徑3 5mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將5 8PL混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將5 8PL濃度為10婦科腫瘤標志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4 °C濕潤條件下晾干；
4)將3 6PL濃度為100 Pg · mL—1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器。2.本發(fā)明所述的制備的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器，其特征在于，用于婦科腫瘤標志物的檢測，步驟如下
(1)工作曲線的繪制；
(2)婦科腫瘤標志物的檢測。(I)中所述工作曲線的繪制，步驟如下
I)本發(fā)明將所述的婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器作為工作電極，在該工作電極表面上滴涂不同濃度的婦科腫瘤標志物抗原標準溶液，4 1濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干，4 °C保存；
2)將參比電極一飽和甘汞電極、對電極一鉬柱電極和工作電極正確連接在電化學工作站上； 3)在pH=7.O 8. O磷酸鹽緩沖液中，通過方波伏安法，檢測婦科腫瘤標志物抗原標準溶液滴加前后電流響應值的變化；
4)根據(jù)所得電流響應值與婦科腫瘤標志物抗原標準溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。3.本發(fā)明所述的婦科腫瘤標志物免疫傳感器，其特征在于，所述的婦科腫瘤標志物選自下列之一原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(糖類抗原CA12-5、糖鏈抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、糖鏈抗原CA15-3、鱗狀上皮細胞癌抗原SCC、堿性磷酸酶ALP)，胎盤性及胚胎性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、組織多肽抗原TPA、人絨毛膜促性腺激素HCG)，癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物(乳腺癌易感基因BRCA1、乳腺癌易感基因BRCA2)。本發(fā)明的有益成果
(I)利用有序介孔碳納米材料大的比表面積、較大的孔體積、優(yōu)良的導電性能以及對甲苯胺藍的吸附能力等特點，用有序介孔碳納米材料作為本發(fā)明免疫傳感器的電極修飾材料，顯著改善了電極的性能。(2)將離子液體引入本發(fā)明免疫傳感器的制備中，利用離子液體導電率高，電位窗口寬等特點，及蛋白質(zhì)可以與離子液體通過離子間的相互作用，連接婦科腫瘤腫瘤標志物的抗體，可增加修飾電極上抗體的固定量，從而提高了婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的靈敏度。(3)本發(fā)明避免了酶的使用，克服了因酶的使用所造成的傳感器不穩(wěn)定，易失活的 缺點。(4)該傳感器利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，顯著提高了檢測方法的特異性。(5)本發(fā)明改變婦科腫瘤標志物種類即可實現(xiàn)多種婦科腫瘤標志物的高靈敏、特異性檢測，方法簡單、經(jīng)濟，有利于腫瘤標志物傳感器的商品化。(6)本發(fā)明所制備的電化學免疫傳感器，操作簡單，檢測速度快，3min即可完成樣品測定，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)批量樣品的測定。


下面結(jié)合

和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。圖I為有序介孔碳納米材料的掃描電鏡圖。圖2為婦科腫瘤標志物免疫傳感器的構(gòu)建過程。
具體實施例方式實施例I
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備，包括以下步驟
(I)有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
1)取O.4 g苯酚，I. 4 mL 37%的甲醛溶液，10 mL O. I mo I · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應液O. 5 h ；
2)預先將O.64 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 mL超純水中，攪拌溶解，加入
I)反應液中，反應16 h,反應液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色,當沉淀出現(xiàn)時,停止反應,反應液冷卻
至室溫；
3)加173mL超純水于2)得到的反應液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應釜中，在馬弗爐中130°C反應24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。納米材料的形貌見圖1，由圖I可以看出，有序介孔碳納米材料為球形介孔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為100 nm,顆粒均勻。(2)有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍溶液以體積比I : O. 5混合，在室溫條件下攪拌24 h ；2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料；
3)將2)中所制得的復合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的混合液A，室溫儲存下備用。(3)婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的制備，結(jié)合圖2進行制備，步驟如下
1)將直徑3mm的玻碳電極依次用1.0、0.3和0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將5μ 混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將5PL濃度為10 Pg 婦科腫瘤標志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干；
4)將3PL濃度為100μg · mL—1牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器。實施例2
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備，包括以下步驟
(I)有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
1)取O.45 g苯酚，I. 6 mL 37%的甲醛溶液，11 mL O. I mol · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應液O. 5 h ；
2)預先將O.72 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于49 mL超純水中，攪拌溶解，力口入I)反應液中，反應17 h,反應液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色,當沉淀出現(xiàn)時,停止反應,反應液冷
卻至室溫；
3)加195mL超純水于2)得到的反應液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應釜中，在馬弗爐中130°C反應24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。納米材料的形貌見圖1，由圖I可以看出，有序介孔碳納米材料為球形介孔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為100 nm,顆粒均勻。(2)有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍溶液以體積比I : I混合，在室溫條件下攪拌27 h ；
2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料；
3)將2)中所制得的復合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的混合液A，室溫儲存下備用。(3)婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的制備，結(jié)合圖2進行制備，步驟如下
1)將直徑4mm的玻碳電極依次用I. 0,0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將6μ 混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將6PL濃度為10 Pg 婦科腫瘤標志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干；
4)將5PL濃度為100 Pg 牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器。實施例3
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器的制備，包括以下步驟。( I)有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下
1)取O.50 g苯酚，I. 8 mL 37%的甲醛溶液，13 mL O. I mol · Γ1的NaOH分別加入三口瓶中，70°C攪拌反應液O. 5 h ；
2)預先將O.80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于54 mL超純水中，攪拌溶解，力口入I)反應液中，反應18 h，反應液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，當沉淀出現(xiàn)時，停止反應，冷卻至室溫；
3)加217mL超純水于2)得到的反應液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應釜中，在馬弗爐中130°C反應24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體；
4)將3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。納米材料的形貌見圖1，由圖I可以看出，有序介孔碳納米材料為球形介孔結(jié)構(gòu)，其粒徑約為100 nm,顆粒均勻。(2)有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備，步驟如下
O將濃度為2 mg · mL—1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL—1的甲苯胺藍溶液以體積比I : 2混合，在室溫條件下攪拌30 h ；
2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料；
3)將2)中所制得的復合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的混合液A，室溫儲存下備用。(3)婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的制備，結(jié)合圖2進行制備，步驟如下
1)將直徑5mm的玻碳電極依次用I.0、0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面；
2)將8μ 混合液A滴涂到步驟I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥；
3)將8PL濃度為10婦科腫瘤標志物抗體滴涂到步驟2)得到的電極表面，4°〇濕潤條件下晾干；
4)將6PL濃度為100 Pg 牛血清白蛋白滴涂到步驟3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，制得婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器。實施例4
實施例I 3制備的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器，分別用于婦科腫瘤標志物檢測，包括以下步驟
I)本發(fā)明將所述的婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器作為工作電極，在該工作電極表面上滴涂不同濃度的婦科腫瘤標志物抗原標準溶液，4 1濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干，4 °C保存；
2)將參比電極一飽和甘汞電極、對電極一鉬柱電極和工作電極正確連接在電化學工作站上；
3)在pH=7. O 8. O磷酸鹽緩沖液中，通過方波伏安法檢測婦科腫瘤標志物抗原標準溶液滴加前后電流響應值的變化；4)根據(jù)所得電流響應值與婦科腫瘤標志物抗原標準溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。實施例5原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)CA12_5、CA 15-3或CA19-9
一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備及應用，包括以下步驟
(1)選擇原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)，按照實施例Γ3所述的步驟制備電化學免疫傳感器；
(2)按照實施例4所述的步驟繪制工作曲線；
(3)原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)的檢測技術(shù)指標見表I。表I原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)的檢測技術(shù)指標_
權(quán)利要求
1.一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器的制備，其特征在于，包括以下步驟 (1)有序介孔碳納米材料的制備； (2)有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備； (3)婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器的制備。
2.如權(quán)利要求I所述的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述有序介孔碳納米材料的制備，步驟如下(1)取O. 40 O. 50 g 苯酚，I. 4 1.8 mL 37% 的甲醛溶液，10 13 mL O. I mo I *L_1的NaOH分別加入三口瓶中，70 °C攪拌反應液O. 5 h ; (2)預先將O.64 O. 80 g聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物F127溶于44 54 mL超純水中，攪拌溶解，加入(I)反應液中，反應16 18 h，反應液由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，當沉淀出現(xiàn)時，停止反應，反應液冷卻至室溫； (3)加173 217mL超純水于(2)得到的反應液中，混合均勻，轉(zhuǎn)移至反應釜中，在馬弗爐中130 °C反應24 h，冷卻至室溫，離心洗滌，室溫真空干燥，得粉末狀固體； (4)將(3)中粉末狀固體放入管式爐，700°C保持3 h，即得到有序介孔碳納米材料。
3.如權(quán)利要求I中所述的有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備，步驟如下 (1)將濃度為2mg · mL-1的有序介孔碳溶液與濃度為2 mg · mL-1的甲苯胺藍溶液以體積比I : O. 5 I : 2混合，在室溫條件下震蕩24 30 h ; (2)離心，用超純水清洗，采用透析法除去材料中游離的甲苯胺藍，即制得有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料； (3)將(2)中制得的復合材料重新分散于超純水中，配制成有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的混合液A，室溫儲存下備用。
4.如權(quán)利要求I中所述的婦科腫瘤標志物免疫傳感器的制備，其特征在于，所述電化學免疫傳感器的制備步驟如下 (1)將直徑3 5mm的玻碳電極依次用I. 0、0. 3和O. 05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，超純水沖洗干凈，使電極表面呈鏡面； (2)將5 8PL混合液A滴涂到步驟(I)處理好的玻碳電極表面，室溫干燥； (3)將5 8PL濃度為10 Pg · ml/1婦科腫瘤標志物抗體滴涂到步驟(2)得到的電極表面，4 °C濕潤條件下晾干； (4)將3 6PL濃度為100 Pg .mr1牛血清白蛋白滴涂到步驟(3)得到的電極表面，4 °〇濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干成膜，4 °C保存，電化學免疫傳感器制備完成。
5.如權(quán)利要求Γ4所述的制備的婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器，其特征在于，用于婦科腫瘤標志物的檢測，方法如下 (1)工作曲線的繪制； (2)婦科腫瘤標志物的檢測； (O中所述的工作曲線的繪制，步驟如下 I)本發(fā)明將所述的婦科腫瘤標志物電化學免疫傳感器作為工作電極，在該工作電極表面上滴涂不同濃度的婦科腫瘤標志物抗原標準溶液，4 1濕潤條件下晾干，超純水清洗，晾干，4 °C保存； 2)將參比電極一飽和甘汞電極、對電極一鉬柱電極和工作電極正確連接在電化學工作站上； 3)在pH=7.O 8. O磷酸鹽緩沖液中，通過方波伏安法檢測婦科腫瘤標志物抗原標準溶液滴加前后電流響應值的變化； 4)根據(jù)所得電流響應值與婦科腫瘤標志物抗原標準溶液濃度的關(guān)系，繪制工作曲線。
6.如權(quán)利要求I 5所述的婦科腫瘤標志物免疫傳感器，其特征在于，所述的婦科腫瘤標志物選自下列之一原位性腫瘤相關(guān)物質(zhì)(糖類抗原CA12-5、糖鏈抗原CA19-9、糖類抗原CA72-4、糖鏈抗原CA15-3、鱗狀上皮細胞癌抗原SCC、堿性磷酸酶ALP)，胎盤性及胚胎性 腫瘤相關(guān)物質(zhì)(甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、組織多肽抗原TPA、人絨毛膜促性腺激素HCG)，癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物(乳腺癌易感基因BRCA1、乳腺癌易感基因BRCA2)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有序介孔碳構(gòu)建的婦科腫瘤標志物免疫傳感器制備及應用，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領域。其特征在于(1)有序介孔碳納米材料的制備；(2)有序介孔碳-甲苯胺藍復合材料的制備；(3)婦科腫瘤標志物免疫傳感器的制備。本發(fā)明的優(yōu)點在于識別快速、靈敏度高、檢測限低、成本低、便于操作，能實現(xiàn)多種婦科腫瘤標志物的高靈敏、特異性、快速準確檢測，3min即可完成樣品測定，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)批量樣品的測定。
文檔編號G01N27/327GK102854235SQ20121034081
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月15日
發(fā)明者魏琴, 范海霞, 李賀, 張勇, 吳丹, 杜斌, 于海琴, 馬洪敏, 龐雪輝, 王志玲, 羅川南, 李慧芝, 范大偉, 曹偉, 朱沛華, 張永芳 申請人:濟南大學