專利名稱：血管緊張素Ⅰ磁微粒化學發(fā)光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明提供了一種血管緊張素I (Ang I ) 磁微粒化學發(fā)光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
血管緊張素I是由腎素作用于血管緊張素原轉(zhuǎn)變而來，因此可反映腎素活性。腎 素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)對維持血壓、水和電解質(zhì)平衡、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用。
血管緊張素I能刺激腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素，它直接收縮血管的作用不明顯； 可促進腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，醛固酮作用于腎小管，起保鈉、保水、排鉀作用，從而引起血 量增多，血壓升高，臨床上血管緊張素I對高血壓的診斷與分型，以及評估冠心病、心力衰 竭等疾病的嚴重程度和預后都有重要意義。
目前，測定血管緊張素I的方法有放射性免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光免疫分析 等，例如RIA存在放射性污染、標記物半衰期短、對操作者具有放射性損傷，且操作繁瑣，時 間長等缺點；而ELISA靈敏度低，檢測范圍窄；化學發(fā)光免疫分析(CLIA)是當今最為敏感 的微量免疫測定法，本試劑盒將化學發(fā)光免疫分析和磁微粒技術(shù)結(jié)合，與以微孔板為固相 載體的Ang I化學發(fā)光試劑盒相比，具有以下優(yōu)勢(1)以磁微粒為固相載體，大大增加了 抗體的有效包被量，節(jié)約了抗體的用量，從而節(jié)約了成本；(2)以磁微粒為固相載體包被抗 體，增加了抗原-抗體的接觸面積，及發(fā)光面積，提高了反應的靈敏度；(3)反應在液相中進 行，且利用旋轉(zhuǎn)磁場使磁微粒其攪拌作用，大大縮短了反應時間；(4)在反應過程中引入了 生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS),它是70年代末發(fā)展起來的一種新型 反應放大系統(tǒng)，由于具有與標記試劑高親和力的牢固結(jié)合、多級放大效應，使其具有靈敏度 高、特異性好、穩(wěn)定性高的特點，目前已成為廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位 觀察研究的新技術(shù)。現(xiàn)有國外化學發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發(fā)光測量系 統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷 和科研工作。尤其是還沒有關(guān)于血管緊張素I磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒廣泛用 于醫(yī)療領(lǐng)域。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供Ang I的磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒及其 制備方法，避免了放射性免疫分析的試劑有效期短、存在放射性污染、操作繁瑣等缺點，且 解決了靈敏度低，檢測范圍窄，成本高的缺陷。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是血管緊張素I磁微粒化學發(fā)光 免疫定量檢測試劑盒，包括=Ang I校準品，Ang I校準品的梯度農(nóng)素分別為0，0. 8,2,10， 20, 50ng/mL,稀釋液是50%牛血清；偶聯(lián)有鏈霉未和素的磁微粒懸浮液；生物素標記的Ang I抗體;Ang I酶結(jié)合物，所用的酶為辣根過氧化物酶,辣根過氧化物酶純度RZ > 3. 0，活性彡250U/mL ；Ang I質(zhì)控品；化學發(fā)光液A液和B液；20倍濃縮洗液；反應管。
進一步，所述的發(fā)光液A液的主要成分為魯米諾，B液的主要成分是過氧化脲。A 液為O. 7g/L魯米諾，O. 165g/L對碘酹，緩沖液為pH8. 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存； B液為O. 675g/L過氧化脲，用工藝用水配制。
進一步，所述的磁微粒是表面包裹帶有氨基或羧基活性基團的四氧化三鐵，粒徑 l-2um。
進一步，所述的Ang I質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品和聞值質(zhì)控品，低值質(zhì)控品和聞值質(zhì)控品的允許范圍分別為4. 16 6. 24ng/mL和11. 6 17. 4ng/mL。
進一步，所述的反應管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
試劑盒的制備方法，包括以下步驟
(I)Ang I校準品的配制
將Ang I純品用50%牛血 清稀釋成系列梯度，濃度分別為0，O. 8，2，10，20，50ng/ mL ；
(2) Ang I質(zhì)控品的配制
將Ang I抗原用含有50%牛血清配制低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其允許范圍分別為 4. 16 6. 24ng/mL 和 11. 6 17. 4ng/mL ；
(3)磁性顆粒_鏈霉未和素懸浮液的制備
取IOOmLO. lmol/L 2-嗎啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性顆粒和 3mg鏈酶親和素(SA),攪拌30min,然后加入10mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽溶液(1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基，EDC) 3. 5uL，反應Ih后，使用磁力架吸附，靜止lOmin，移去液體，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重復上述過程，共洗滌3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可。
(4)生物素標記的Ang I抗體的制備
取0. 5mg Ang I抗體，用硼酸鹽緩沖液在2 8°C下透析I 3h ;將透析后的抗體加入25ug生物素，同時加入二甲基亞砜，最終濃度為10%，避光反應3h，緩慢振蕩；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化銨溶液，常溫避光反應30 60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期間換液3 5次；
(5) Ang I酶結(jié)合物的制備
采用高碘酸鈉氧化法將Ang I與辣根過氧化物酶進行偶聯(lián)后，用酶稀釋液將其稀釋至工作濃度1:8000，并加入5-20%酶穩(wěn)定劑，儲存于2 8°C ;酶穩(wěn)定劑是一種可以保持蛋白質(zhì)在凍干或溶液下保持天然折疊構(gòu)想的試劑，有利于抗原或抗體的保存，避免外界因素如溫度、pH、鹽、金屬離子及其他污染物影響其穩(wěn)定性。
(6) 20倍濃縮洗液的配制
20濃縮洗液包括58g/L磷酸氫二鈉，5. 92g/L磷酸二氫鈉，180g/L NaCl, IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；
(7)化學發(fā)光液A液和B液的配制
A 液為 O. 7g/L 魯米諾，0. 165g/L 對碘酚，緩沖液為 5mmol/L Tris · HCl (ρΗ8· 6)； B液為0. 675g/L過氧化脲，用工藝用水配制。
(8)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C。
(9)對采用該方法制備的試劑盒的進行物理檢查，準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測定值和穩(wěn)定性進行測定。
本發(fā)明的原理是，本試劑盒采用競爭法原理測定血清或血漿中的Ang I，在親和 素-磁微粒懸浮液中加入生物素-Ang I抗體結(jié)合物，通過親和素和生物素的親和反應，形 成磁微粒-親和素-生物素-Ang I抗體復合物，加入樣本和酶結(jié)合物后，酶結(jié)合物與樣本 中的Ang I競爭結(jié)合磁微粒表面的Ang I抗體，形成磁微粒-親和素-生物素-Ang I抗 體-Ang1-Ang I抗體-HRP復合物，用磁場將復合物吸附在試管底部，清洗掉游離的成 分，加入底物工作液，在氧化劑作用下，HRP催化魯米諾生成處于激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲酸 離子，其恢復到基態(tài)時，釋放出425nm的光子，于第5分鐘測定各加樣孔的發(fā)光值(RLU)。樣 本的發(fā)光值與樣本中Ang I濃度呈負相關(guān)。樣本中的Ang I濃度依據(jù)由校準品Ang I濃 度和對應的RLU建立的Log (X)-Logit (Y)數(shù)學模型進行定量，從而檢測人血清、血漿中的 Ang I含量。
本專利發(fā)明的血管緊張素I (Ang I)磁微粒化學發(fā)光免疫定量測定試劑盒，具有 以下優(yōu)點(I)反應快速，可在40分鐘內(nèi)判斷檢測結(jié)果；操作簡便，無污染。(2)靈敏度高， 本試劑盒的分析靈敏度不高于O. 05ng/mL。(3)特異性強，本產(chǎn)品對血管緊張素I1、血管緊張 素1-7的交叉特異性均小于O. 1%。(4)精密度良好，精密度不高于10%。(5)穩(wěn)定性良好， 本產(chǎn)品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年。(6)成本低，與市場上同類產(chǎn)品比 較，本試劑盒性能良好，成本低，具有臨床應用價值。(7)本試劑盒與管式化學發(fā)光儀配套使 用，在樣本測定過程中靈活性更好。


圖1是本發(fā)明的博奧賽斯化學發(fā)光試劑盒測定Ang I與放免試劑盒測定Ang I 的測定結(jié)果比較圖，其中縱坐標為博奧賽斯測得的Ang I值，橫坐標為放免試劑盒測定 Ang I值，兩種方法相關(guān)系數(shù)(r) =0. 9891，直線方程y=0. 9993x+0. 00具體實施方式
mL ；
實施例1:制備血管緊張素I (Ang I )磁微粒化學發(fā)光免疫定量測定試劑盒I(I)Ang I校準品的配制將Ang I純品用50%牛血清稀釋成系列梯度，濃度分別為0，O. 8，2，10，20，50ng/(2)Ang I質(zhì)控品的配制將Ang I抗原用含有50%牛血清配制低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其濃度分別為4.16ng/mL 和 17. 4ng/mL ；
(3)磁性顆粒-鏈霉親和素懸浮液的制備
取IOOmLO. lmol/L 2_嗎啉乙磺酸溶液(MES溶液)，依次加入IOmg磁性顆粒和 3mg鏈酶親和素(SA),攪拌30min,然后加入10mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽溶液(1-乙基-(3- 二 甲基氨基丙基，EDC) 3. 5uL，反應Ih后，使用磁力架吸附，靜止lOmin，移去液體，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重復上述過程，共洗滌3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可。
(4)生物素標記的Ang I抗體的制備
取0. 5mg Ang I抗體，用硼酸鹽緩沖液在2 8°C下透析3h ;將透析后的抗體加入25ug生物素，同時加入二甲基亞砜，最終濃度為10%，避光反應3h，緩慢振蕩；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化銨溶液，常溫避光反應30min ;用O. 01mol/L PBS溶液在2 8°C 下透析2天，期間換液3次；
(5) Ang I酶結(jié)合物的制備
采用高碘酸鈉氧化法將Ang I與辣根過氧化物酶進行偶聯(lián)后，用酶稀釋液將其稀釋至工作濃度1:8000，并加入5%酶穩(wěn)定劑，儲存于2 8°C ;酶穩(wěn)定劑使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白穩(wěn)定劑產(chǎn)品。
(6) 20倍濃縮洗液的配制
20濃縮洗液包括58g/L磷酸氫二鈉，5. 92g/L磷酸二氫鈉，180g/L NaCl, IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；
(7)化學發(fā)光液A液和B液的配制
A 液為 O. 7g/L 魯米諾，O. 165g/L 對碘酚，緩沖液為 ρΗ8· 6 的 5mmol/L Tris · HCl， 避光保存液為O. 675g/L過氧化脲，用工藝用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
(8)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C ；
(9)對采用該方法制的的試劑盒的進行物理檢查，準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測定值和穩(wěn)定性進行測定。
說明
I)物理檢查液體組分應澄清，無沉淀或絮狀物；其他組分應無包裝破損。
2)準確性試劑盒校準品與企業(yè)標準品系列同時進行分析測定，用雙對數(shù)數(shù)學模型擬合，要求兩條劑量-反應曲線不明顯偏離平行(t檢驗，|t|〈2.447);以Ang I企業(yè)標準品為對照品，用雙對數(shù)數(shù)學模型擬合，試劑盒校準品的實測值與標示值比值的平均值應在O. 9(Tl. 10范圍內(nèi)。
3)劑量-反應曲線的線性用雙讀數(shù)數(shù)學模型擬合，劑量-反應曲線在0_50ng/mL 濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r絕對值不低于O. 9900。
4)分析靈敏度試劑盒分析靈敏度不高于O. 05ng/mL。
5)精密度精密度(CV%)應不高于10%。
6)質(zhì)控品的測定值平行測定10孔高值和低值的質(zhì)控品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學模型擬合，質(zhì)控品測值應在允許范圍內(nèi)，QcL和QcH的允許范圍分別為4. 16 6. 24ng/mL 和 11. 6 17. 4ng/mL。
7)特異性
交叉反應符合下表要求
權(quán)利要求
1.血管緊張素I磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括DAng I校準品，Ang I校準品梯度濃度分別為0，0. 8,2,10，20，50ng/mL，校準品稀釋液是50%牛血清；2)偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁微粒懸浮液；3)生物素標記的AngI抗體；4)AngI抗體酶結(jié)合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ > 3. 0， 活性彡250U/mL ；5)Ang I質(zhì)控品；7)20倍濃縮洗液；8)反應管。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素I磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光液A液的主要成分為魯米諾，B液的主要成分是過氧化脲。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素I磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的磁微粒是表面包裹帶有氨基或羧基活性基團的四氧化三鐵，粒徑l-2um。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素I磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的Ang I質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品的允許范圍分別為4. 16 6. 24ng/mL和11. 6 17. 4ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素I磁微粒化學發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，其特征在于，所述的反應管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
6.一種制備所述權(quán)利要求1的試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟(1)AngI校準品的配制將Ang I純品用50%牛血清稀釋成系列梯度，濃度分別為0,0.8,2,10，20，50ng/mL ；(2)Ang I質(zhì)控品的配制將Ang I抗原用含有50%牛血清配制低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品允許范圍分別為4. 16 6. 24ng/mL和11. 6 17. 4ng/mL ；(3)磁性顆粒-鏈霉親和素懸浮液的制備取IOOmLO. lmol/L 2-嗎啉乙磺酸溶液，依次加入IOmg磁性顆粒和3mg鏈酶親和素，攪拌30min，然后加入10mg/mL碳二亞胺鹽酸鹽溶液3. 5uL，反應Ih后，使用磁力架吸附，靜止 lOmin，移去液體，加入IOmL O. 01mol/L PBS，重復上述過程，共洗滌3次，最后用0. 01mol/L PBS定溶至IL即可；(4)生物素標記的AngI抗體的制備取0. 5mg Ang I抗體,用硼酸鹽緩沖液在2 8°C下透析I 3h ;將透析后的抗體加入 25ug生物素，同時加入二甲基亞砜，最終濃度為10%，避光反應3h，緩慢振蕩；在上述溶液中加入250uLlmol/L氯化銨溶液，常溫避光反應30 60min ;用0. 01mol/L PBS溶液在2 8°C下透析2天，期間換液3 5次；(5)Ang I酶結(jié)合物的制備采用高碘酸鈉氧化法將Ang I與辣根過氧化物酶進行偶聯(lián)后，用酶稀釋液將其稀釋至工作濃度1:8000，并加入5-20%酶穩(wěn)定劑，儲存于2 8°C ；(6)20倍濃縮洗液的配制20濃縮洗液包括58g/L磷酸氫二鈉，5. 92g/L磷酸二氫鈉，180g/L NaCl，IOmL/ LTween-20 和 1%。Proclin300 ；(7)化學發(fā)光液A液和B液的配制A液為 O. 7g/L魯米諾，O. 165g/L對碘酚，緩沖液為ρΗ8· 6的5mmol/L Tris · HCl，避光保存液為O. 675g/L過氧化脲，用工藝用水配制；A液和B液在使用前5min混合；(8)組裝將上述試劑組裝成盒，儲存于2 8°C；(9)對采用該方法制的的試劑盒的進行物理檢查，準確度、劑量-反應曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測定值和穩(wěn)定性進行測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血管緊張素Ⅰ磁微?；瘜W發(fā)光免疫定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括Ang Ⅰ校準品；偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁微粒懸浮液；生物素標記的Ang Ⅰ抗體；Ang Ⅰ酶結(jié)合物，所用的酶為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶純度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；Ang Ⅰ質(zhì)控品；化學發(fā)光液A液和B液；20倍濃縮洗液；反應管。另外本發(fā)明還公開了本發(fā)明試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有試劑盒相比操作簡便，安全無環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測樣品的濃度范圍寬、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/531GK102998465SQ20121047247
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者劉萍, 張影, 宋啟超, 范利花 申請人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司