一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法。即以有機(jī)醇做萃取劑，利用液液微萃取技術(shù)分離富集動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素，結(jié)合高效液相色譜測(cè)定，方法檢出限為0.008ng/mL。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高，檢測(cè)時(shí)間短，能有效地與干擾物質(zhì)分離，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的分析方法，具有實(shí)際的應(yīng)用意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種有效的新型渦旋輔助-液液微萃取高效液相色譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法，屬于分析化學(xué)中痕量大分子的分離富集和分析測(cè)定【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]研究背景:
雌二醇、雌酮、己烯雌酚、睪酮、炔雌醇和黃體酮等都屬于類(lèi)固醇類(lèi)激素，可用于治療女性性功能疾病、更年期綜合征、骨質(zhì)疏松，作為口服避孕藥以及對(duì)預(yù)防放射線、對(duì)脂質(zhì)的代謝都有十分有利的作用。有關(guān)研究早已證明了殘留在動(dòng)物源食品中的雌激素能擾亂激素平衡，導(dǎo)致婦女的更年期紊亂、生育能力下降，女童性早熟，男性女性化，并具有強(qiáng)致癌、致畸作用，誘發(fā)女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，對(duì)人體健康極為不利。
[0003]2002年3月，我國(guó)農(nóng)業(yè)部公布《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》，并將8種同化性激素(去甲雄三烯醇酮、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、醋酸甲羥孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚和玉米赤霉醇)列為禁用獸藥。日本規(guī)定牛肉中雌三醇、孕酮的MRL為0.01mg/kg ;美國(guó)規(guī)定牛肉、羊肉中孕酮MRL為0.003mg/kg ;韓國(guó)規(guī)定牛肉中孕酮的MRL也為0.003mg/kg ;歐盟性激素類(lèi)獸藥規(guī)定:雌酮、雌二醇及雌三醇MRLs ( I μ g/kg，炔雌醇MRLs ( 0.7 μ g/kg,己烯雌酚其鹽、酯及制劑在所有動(dòng)物組織中不得檢出。
[0004]目前，比較經(jīng)典的分析檢測(cè)激素的處理方法主要有比色法、免疫分析法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。主要的分離富集方法有分散液液萃取(DLLME)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等。本研究組之前利用分散液液微萃取(DLLME)對(duì)生物樣品中腎上腺激素的檢測(cè)進(jìn)行過(guò)較深入的研究，已經(jīng)取得了不錯(cuò)的效果，并申請(qǐng)了發(fā)明專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)朇N201210107015.9。但經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DLLME對(duì)被測(cè)目標(biāo)物的極性要求很高，若萃取劑選擇不當(dāng)則回收率下降且存在多種激素檢測(cè)受限的問(wèn)題。通過(guò)渦旋輔助-液液微萃取(VA-LLME)，選用有機(jī)醇類(lèi)物質(zhì)做萃取劑，通過(guò)渦旋乳化，對(duì)目標(biāo)物可以達(dá)到更高的萃取率且可以直接稀釋進(jìn)樣，具有有機(jī)溶劑種類(lèi)及用量減少、操作簡(jiǎn)單、環(huán)保，富集倍數(shù)高。較分散液液微萃取(DLLME)具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)新方法，該方法對(duì)基體復(fù)雜的動(dòng)物源食品采用渦旋輔助-液液微萃取對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行前處理和富集，結(jié)合高效液相色譜同時(shí)測(cè)定多種痕量類(lèi)固醇激素，具有操作簡(jiǎn)單，富集倍數(shù)高，結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明是利用渦旋液液微萃取高效液相色譜法檢測(cè)動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的方法，包括以下步驟:
(I)工作曲線的制作:配制一系列不同濃度的類(lèi)固醇激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定色譜條件下，注入高效液相色譜進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積與類(lèi)固醇激素的線性范圍、回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢測(cè)限及工作曲線的線性回歸方程。一般采用的配制濃度為5.00、20.00、50.00、100.00,200.00,400.00,600.00,800.00、1000 ng/mL。[0007](2)樣品處理
I、奶制品:取1.0~5.0g奶樣,加入l-3g無(wú)水硫酸鈉和1~2mL乙腈、或者1~2mL
0.1%-1%的乙酸，渦旋20-60S，在轉(zhuǎn)速3000~10000r/min條件下離心分離5~20min，取上
清液備用；
II、肉制品:取0.5-2.0g剁碎的肉樣，加入1~2mL甲醇、無(wú)水乙醇或者乙腈中的一種，超聲5~15min,,在3000~1000Or / min條件下離心分離5~20min,取上清液備用；
II1、蛋制品:取去殼后的蛋樣1.0-3.0g，攪勻，加入1~2mL甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈或者二氯甲燒中的一種，超聲5~15min,在3000~10000r / min條件下離心分離5~20min,
取上清液備用。
[0008](3)渦旋輔助-液液微萃取:將100-1000 μ I萃取劑，加入備用樣品中，用蒸餾水定容到5mL,潤(rùn)旋,形成乳池體系,然后在2000-5000 r/min下離心3~10 min ；
(4)樣品測(cè)定:棄去步驟(3)中的下層水相，吸取剩余離心管底部的有機(jī)相，過(guò)濾，在與步驟(1)相同色譜條件進(jìn)行HPLC分析，并對(duì)照步驟(1)所得的線性回歸方程，計(jì)算出樣品中類(lèi)固醇激素的含量。
[0009]本發(fā)明中類(lèi)固醇激素為雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮中一種或幾種。
[0010]色譜流動(dòng)相為:乙腈-水，梯度洗脫:0~4.5 min,乙腈35% ；4.5~6.0 min,乙臆 55% ；6.0 ~15 min,乙臆 35%。
[0011]本發(fā)明中萃取劑為正丁醇、異丁醇、正辛醇、異辛醇中一種。
[0012]本發(fā)明方法的最低定量限為0.008ng/mL。
[0013]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
1、本方法能夠?qū)?dòng)物源食品進(jìn)行凈化，減少了其他物質(zhì)的干擾；
2、本發(fā)明提供了一種新的液液微萃取體系，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明方法能有效地富集類(lèi)固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮)，并且該方法安全，簡(jiǎn)便，快捷和高效，有機(jī)溶劑用量少，富集倍數(shù)高，檢測(cè)時(shí)間短，能有效地與干擾物質(zhì)分離，集采樣、萃取、濃縮為一體，是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的分析方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0014]3、本發(fā)明選用有機(jī)醇類(lèi)作為萃取劑，通過(guò)渦旋乳化形成勻相，再離心破乳，萃取率高，與高效液相色譜法結(jié)合，大大提高該儀器的測(cè)定靈敏度，動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素濃度≥ 0.008ng/mL均能檢出。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0016]實(shí)施例1:本檢測(cè)類(lèi)固醇激素含量的方法，檢測(cè)肉制品中類(lèi)固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮)的含量，具體操作如下:
1)工作曲線制作-M lgg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液按比例配制成5.00,20.00,50.00、100.00、200.00,400.00,600.00,800.00、1000 ng/mL等不同濃度的雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮混合標(biāo)樣，進(jìn)行色譜分析，回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)等見(jiàn)表1 ;
色譜條件為以乙腈-水作為流動(dòng)相，梯度洗脫為質(zhì)量百分比濃度35%乙腈洗脫O~4.5min，質(zhì)量百分比濃度55%乙腈洗脫4.5~6.0 min，質(zhì)量百分比濃度35%乙腈洗脫6.0~15 min ；
2)取2.0g奶樣，加入Ig無(wú)水硫酸鈉和1.5mL乙腈,潤(rùn)旋30s,在轉(zhuǎn)速5000r/min條件下離心分離15min,取上清液,備用；
3)將300μI正丁醇，加入2)所得上清液中，用蒸餾水定容到5mL，渦旋10s，形成乳濁體系；
4)將步驟3)的離心管在4000r/min離心4 min ；
5)棄去步驟4)中的下層水相，吸取剩余離心管底部的有機(jī)相，過(guò)濾，然后進(jìn)行HPLC分析，色譜條件同步驟I);
6)將步驟(5)所得到的色譜峰面積代入表I工作曲線，測(cè)出牛奶中雌酮15ng/mL，己烯雌酌.5ng/mL。
[0017]表1:類(lèi)固醇激素的線性方程 實(shí)施例2:
本檢測(cè)類(lèi)固醇激素含量的方法，檢測(cè)肉制品中類(lèi)固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮)的含量，具體操作如下:
1)工作曲線制作方法同實(shí)施例1中步驟I);
2)取3.0g剁碎的牛肉樣,加入2mL甲醇,超聲15min,在6000r / min條件下離心分離lOmin，取上清液，備用；
3)將400μ I異丁醇，加入2)所得上清液中，用蒸餾水定容到5mL，渦旋20s，形成乳濁體系；
4)將步驟3)的離心管在5000r/min離心8 min ；
5)棄去步驟4)中的下層水相，吸取剩余離心管底部的有機(jī)相，過(guò)濾，然后進(jìn)行HPLC分析，色譜條件同步驟I);
6)將步驟5)所得到的色譜保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間對(duì)比，沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，牛肉樣中未檢出類(lèi)固醇激素。
[0018]實(shí)施例3:
本檢測(cè)類(lèi)固醇激素含量的方法，檢測(cè)肉制品中類(lèi)固醇激素(雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮)的含量，具體操作如下:
1)工作曲線制作方法同實(shí)施例1中步驟I);
2)取去殼后的雞蛋樣4.0g，加入1.0mL 二氯甲烷，超聲lOmin，在6000r / min條件下離心分離15min，取上清液，備用；
3)將200μI異辛醇，加入2)所得上清液中，用蒸餾水定容到5mL，渦旋15s，形成乳濁體系；
4)將步驟3)的離心管在3500r/min離心10 min ；
5)棄去步驟4)中的下層水相，吸取剩余離心管底部的有機(jī)相，過(guò)濾，然后進(jìn)行HPLC分析，色譜條件同步驟I);
6)將步驟5)所得到的所得到的色譜峰面積代入表I工作曲線，檢出雞蛋樣中雌二醇含量為5ng/mL，雌酮含量為15ng/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟: (I)工作曲線的制作:配制5-1000 ng/mL類(lèi)固醇激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在一定色譜條件下，進(jìn)行高效液相色譜分析，制作工作曲線，得到類(lèi)固醇激素的檢出限和線性回歸方程；(2)樣品處理:1、奶制品:取1.0?5.0g奶樣,加入I?3g無(wú)水硫酸鈉和I?2mL乙腈、或者I?2mL 0.1%-1%的乙酸，渦旋20?60s，在轉(zhuǎn)速3000?10000r/min條件下離心分離5?20min，取上清液備用;11、肉制品:取0.5-2.0g剁碎的肉樣，加入I?2mL甲醇、無(wú)水乙醇或者乙腈中的一種,超聲5?15min,在3000?IOOOOr / min條件下離心分離5?20min,取上清液備用JI1、蛋制品:取去殼后的蛋樣1.0-3.0g,攪勻,加入I?2mL甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈或者二氯甲燒中的一種，超聲5?15min,在3000?IOOOOr / min條件下離心分離5?20min，取上清液備用。(3)液液微萃取:將100-1000 μ I萃取劑，加入備用樣品中，潤(rùn)旋10?30s,形成乳池體系,在2000-5000 r/min下離心3?10 min; (4)樣品測(cè)定:棄去步驟(3)中的下層水相，吸取剩余離心管底部的有機(jī)相，過(guò)濾，在與步驟(I)相同色譜條件進(jìn)行HPLC分析，并對(duì)照步驟(I)所得的線性回歸方程，計(jì)算出樣品中類(lèi)固醇激素的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:類(lèi)固醇激素為雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮、睪酮、己烯雌酚、黃體酮中一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:色譜條件為以乙腈-水作為流動(dòng)相，梯度洗脫為體積百分比濃度35%乙腈洗脫O?4.5min,體積百分比濃度55%乙腈洗脫4.5?6.0 min,體積百分比濃度35%乙腈洗脫6.0?15 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:動(dòng)物源食品包括奶制品，肉制品和蛋制品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物源食品中類(lèi)固醇激素殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:萃取劑為正丁醇、異丁醇、正辛醇、異辛醇中一種。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103869001SQ201210527492
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月10日
【發(fā)明者】楊亞玲, 王佩瑾 申請(qǐng)人:昆明冷木捷商貿(mào)有限公司, 云南健牛生物科技有限公司