海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然藥物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明提供了一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，是基于磁珠鍵和高內(nèi)涵多靶標(biāo)蛋白集成的活性物質(zhì)篩選和評(píng)價(jià)方法，本發(fā)明的配置為：硬件系統(tǒng)為永久磁鐵、磁珠、靶標(biāo)；軟件系統(tǒng)負(fù)責(zé)液質(zhì)數(shù)據(jù)采集。本發(fā)明的篩選方法與傳統(tǒng)紫外篩選方法相比，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時(shí)間，并且能夠同時(shí)對(duì)多種生物活性進(jìn)行考察、發(fā)現(xiàn)化合物之間的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明的篩選方法快速、準(zhǔn)確、信息量大、重現(xiàn)性好，能夠用于大規(guī)模天然產(chǎn)物庫(kù)或組合化學(xué)庫(kù)的篩選。
【專利說(shuō)明】海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然藥物篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是指應(yīng)用磁性分離和化學(xué)信息采集技術(shù)篩選出海洋天然產(chǎn)物，用于抗腫瘤、降糖及降脂等藥物的研發(fā)。
【背景技術(shù)】
[0002]天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)活性成分是新藥創(chuàng)制的常規(guī)途徑之一，傳統(tǒng)的篩選方法包括提取、分離、純化出單體化合物，然后進(jìn)行活性篩選，這種方法繁瑣費(fèi)時(shí)效率低，無(wú)法揭示天然藥物中多種成分的協(xié)同作用，而且化合物在分離純化過(guò)程中可能降解變性失去活性，或者分離出非目標(biāo)化合物。目前，基于親和選擇-質(zhì)譜聯(lián)用的方法在藥用植物活性成分篩選中的應(yīng)用越來(lái)越多，該法通過(guò)分離多種靶標(biāo)結(jié)合物，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最后進(jìn)行活性驗(yàn)證，大大加速了篩選的過(guò)程、提高了活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的效率(參見(jiàn)文獻(xiàn)Zhou JL, Qian ZM, LuoYDjet al.Screening and mechanism study of components targeting DNA from theChinese herb Lonicera japonica by liquid chromatography/mass spectrometryand fluorescence spectroscopy.Biomedical Chromatography.2008，22 (10): 1164-1172.；Qing LS，Xue Y， Zheng Y， et al.Ligand fishing from Dioscorea nipponicaextract using human serum albumin functionalized magnetic nanoparticles.Journal of Chromatography A.2010，1217(28):4663-4668.；Guo LP，Jiang TFj Lv ZHj etal.Screening alpha-glucosidase inhibitors from traditional Chinese drugs bycapillary electrophoresis with electrophoreticalIy mediated microanalysis.JPharm Biomed Anal.2010，53(5):1250-1253.)。
[0003]DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一類廣泛存在于真核和原核細(xì)胞中，專門(mén)參與介導(dǎo)DNA拓?fù)錁?gòu)型改變的酶。其在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、重組和修復(fù)中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在腫瘤組織中高表達(dá)，通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性就有可能抑制腫瘤細(xì)胞的快速繁殖，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。目前DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶已成為公認(rèn)的抗癌藥物的作用革巴點(diǎn)(Liu LF.DNA Topoisomerase Poisons as Antitumor Drugs.Annual Review ofBiochemistry.1989, 58:351-375.)。a -葡萄糖苷酶可促進(jìn)糖的水解吸收，其抑制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制位于小腸的各種a -葡萄糖苷酶，使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。a -葡萄糖苷酶已成為降糖藥物研究的重要靶標(biāo)。甘油三酯酶的作用主要是促進(jìn)脂肪的吸收，其抑制劑能夠降低人體對(duì)脂肪的攝入，起到降脂減肥的效果。隨著人們生活水平的提高，食物中的脂肪攝入量正在迅速增加，肥胖已經(jīng)成為一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。
[0004]目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道從海洋天然產(chǎn)物中快速篩選DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、a-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶等“靶標(biāo)蛋白”抑制劑的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法。[0006]本發(fā)明的篩選方法，基于磁珠鍵和高內(nèi)涵多靶標(biāo)蛋白(抗腫瘤、降糖、降脂)集成的活性物質(zhì)篩選和評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明所用配置為:硬件系統(tǒng)為永久磁鐵、磁珠、靶標(biāo)；軟件系統(tǒng)負(fù)責(zé)液質(zhì)數(shù)據(jù)采集。
[0007]本發(fā)明提供了一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，即從海洋天然產(chǎn)物中快速篩選靶標(biāo)蛋白抑制劑，包括以下步驟:
[0008]A、采用磁珠為載體，應(yīng)用化學(xué)鍵合技術(shù)在磁珠的表面鍵合靶標(biāo)蛋白，得到功能化磁珠；
[0009]B、常規(guī)方法制備海洋生物提取物，將功能化磁珠與海洋生物提取物一起孵育；
[0010]C、孵育I小時(shí)以上后，移除上清液，清洗磁珠，采用變性溶劑使酶變性，收集洗脫液；
[0011]D、配體活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定:洗脫液通過(guò)液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振技術(shù)鑒定分析，獲得靶標(biāo)蛋白的抑制劑；其中的液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用(液質(zhì))參數(shù)為=ESI正負(fù)離子模式。
[0012]所述的靶標(biāo)蛋白是指DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、α-葡萄糖苷酶或甘油三酯酶等。
[0013]所述的步驟A具體為:將磁珠清洗數(shù)次，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化磁珠表面，加入溶解的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶等藥物作用相關(guān)“靶標(biāo)蛋白”，孵育一段時(shí)間后，使酶鍵合在磁珠表面，清洗數(shù)次備用。
[0014]所述的步驟B中的常規(guī)方法制備海洋生物提取物，海洋生物提取物可以是海綿等無(wú)脊椎動(dòng)物提取物，也可以是海藻、紅樹(shù)林等海洋植物提取物或海洋微藻、海洋放線菌、海洋真菌等海洋來(lái)源微生物的提取物。常規(guī)方法是指有機(jī)試劑-水不同比例的均相混合液總浸提物，經(jīng)有機(jī)試劑/水兩相萃取得到的不同極性萃取物(參考《海洋藥物導(dǎo)論》第二版，張文主編,上海科學(xué)技術(shù)出版社,2012)。
[0015]步驟B具體為:取海洋產(chǎn)物提取物適量，用少量溶劑后用水溶解。較優(yōu)的，稱取海洋天然產(chǎn)物提取物lmg，加入少量二甲基亞砜(DMSO)溶解，后加入0.1mL的pH 6.8的IOmM磷酸緩沖液(PBS )，超聲溶解。
[0016]所述的步驟C:變性溶劑為乙腈或乙醇等。
[0017]所述的步驟D:其中的質(zhì)譜信息由Finnigan液質(zhì)聯(lián)用儀器獲取。
[0018]本發(fā)明的篩選方法的流程圖如圖5所示。
[0019]本發(fā)明的篩選方法具體步驟如下:
[0020]第一步:取出100 μ L磁珠，使用等體積25mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES，pH 6)溶液清洗兩次，每次IOmin ;在使用之前，把1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)快速溶解在冷的(O - 4°C)25mM的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) (pH 6)中至濃度為50mg/mL ;用25mM MES (pH 6)配置50mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液，在清洗后的磁珠上加入50 μ L的EDC溶液和50 μ L的NHS溶液，混合均勻，在室溫下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育30min。孵育后，將離心管放在磁鐵上吸附4min，移除上清液，使用300 μ L 25mM MES (pH6)清洗兩次。
[0021]第二步:在活化磁珠上，分別加入60 μ L溶解在25mM MES溶液(pH 6)中的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶，并分別加入40 μ L 25mM MES溶液(pH 6)至最終體積為lOOyL，震蕩混合均勻，在室溫孵育過(guò)夜，孵育后，將離心管放在磁鐵上吸附4min，移除上清液；使用300 μ L PBS沖洗包被的磁珠4次，掩蓋蛋白如牛血清蛋白(BSA)或脫脂奶粉濃度可以達(dá)到0.1-0.5%，把包被的磁珠重新分散在需要濃度的PBS和Tris緩沖液中；
[0022]第三步:使用透射電子顯微鏡對(duì)空白磁珠及鍵合的磁珠，進(jìn)行性狀表征；
[0023]第四步:稱取海洋天然產(chǎn)物提取物lmg，加入少量二甲基亞砜(DMSO)溶解，后加入
0.1mL磷酸緩沖液(PBS)溶液(pH 6.8，10mM)，超聲IOmin溶解，吸取上清液進(jìn)行液質(zhì)分析，得到HPLC及分子量信息。
[0024]第五步:再取第四步得到的海洋天然產(chǎn)物上清液40μ L，分別加到100μ L鍵合DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1、α_葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠分散的醋酸胺溶液和空白磁珠分散的PBS緩沖液中，放在振蕩器上混勻，孵育I小時(shí)；用PBS緩沖液清洗3次，每次的清洗液依次進(jìn)液相分析；
[0025]第六步:將清洗液棄去，每個(gè)連通容器中加入10%乙腈-水(IOmL)進(jìn)行清洗，洗脫液進(jìn)行液-質(zhì)聯(lián)用分析；
[0026]第七步:通過(guò)對(duì)比第四步和第六步得到的液質(zhì)分析圖譜，可以得到分別與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠結(jié)合的海洋天然產(chǎn)物的保留時(shí)間和分子
量信息。
[0027]第八步:通過(guò)核磁數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)鑒定海洋天然產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0028]第九步:對(duì)得到的化合物進(jìn)行活性復(fù)篩，確認(rèn)活性結(jié)構(gòu)。
[0029]本發(fā)明還提供了上述方法用于海洋產(chǎn)物中抗腫瘤、降糖及降脂成分的篩選。
[0030]本發(fā)明可同時(shí)篩選和評(píng)價(jià)復(fù)雜體系中(天然產(chǎn)物以及化學(xué)合成藥物)降糖、降脂及抗腫瘤作用物質(zhì)。與傳統(tǒng)紫外篩選方法相比，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時(shí)間，并且能夠同時(shí)對(duì)多種生物活性進(jìn)行考察、發(fā)現(xiàn)化合物之間的協(xié)同效應(yīng)。本篩選方法具有快速、準(zhǔn)確、信息量大、重現(xiàn)性好等特征。
[0031]本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，提供的篩選和評(píng)價(jià)系統(tǒng)效率高、結(jié)構(gòu)完善，能夠用于大規(guī)模天然產(chǎn)物庫(kù)或組合化學(xué)庫(kù)的篩選，而且設(shè)備簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，適合于在早期開(kāi)展對(duì)于抗腫瘤藥物(包括化學(xué)合成藥以及天然產(chǎn)物)的篩選和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1是磁珠透射電鏡圖(25000倍)
[0033]其中(A)為空白磁珠；(B)為結(jié)合了甘油三酯酶的磁珠。
[0034]圖2是海洋產(chǎn)物提取物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果以及與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶鍵合的磁珠作用后洗脫液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果，
[0035]其中A為海洋天然產(chǎn)物提取物正離子模式離子流圖，B為海洋天然產(chǎn)物提取物與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I鍵合磁珠作用后洗脫物正離子模式離子流圖。
[0036]圖3是海洋產(chǎn)物提取物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果以及與α-葡萄糖苷酶鍵合的磁珠作用后洗脫液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果，
[0037]其中A為海洋天然產(chǎn)物提取物正離子模式離子流圖，B為海洋天然產(chǎn)物提取物與α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠作用后洗脫物正離子模式離子流圖。[0038]圖4是海洋產(chǎn)物提取物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果以及與甘油三酯酶鍵合的磁珠作用后洗脫液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果，
[0039]其中A為海洋天然產(chǎn)物提取物正離子模式離子流圖，B為海洋天然產(chǎn)物提取物與甘油三酯酶鍵合磁珠作用后洗脫物正離子模式離子流圖。
[0040]圖5是本發(fā)明篩選方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0042]實(shí)施例所用試劑:
[0043]DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I購(gòu)自吳江近岸蛋白質(zhì)科技有限公司(大腸桿菌，EC 5.99.1.2)；α -葡萄糖苷酶、甘油三酯酶(提自豬胰酶)均購(gòu)自Simga公司；羧基磁珠Dynabeads&regMyOne Carboxylic Acid (invitrogen)、1-乙基 _3_ (3_ 二甲氨丙基)碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC, sigma) >2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES, sigma)、N-輕基琥拍酰亞胺(NHS, sigma)、氣代DMSO。
[0044]實(shí)施例所用儀器:
[0045]Agilent 1100高效液相色譜串聯(lián)Finnigan LCQ Deca XPplus離子阱質(zhì)譜，色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 column (4.6X 250mm, 5 μ m) ；Agilent 1200 制備液相(XDB-C18column, 30 X 250mm, 5 μ m);恒溫振蕩孵育器、ELx800酶標(biāo)儀。核磁共振儀(Bruker AvanceIII 500M NMR)ο
[0046]實(shí)施例1:基于磁珠鍵和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、α -葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的高內(nèi)涵篩選方法
[0047]取出100 μ L磁珠，使用等體積25mM MES (pH 6)溶液清洗兩次，需要lOmin，要混合均勻。在使用之前，把EDC快速溶解在冷的25mM的MES (pH 6)中至濃度為50mg/mL。用25mM MES (pH 6)配置50mg/mL的NHS溶液，在清洗后的磁珠上加入50 μ L的EDC溶液和50 μ L的NHS溶液，混合均勻，在室溫下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)孵育30min。孵育后，把管子放在磁鐵上4min，移除上清液，使用300 μ L 25mM MES (pH 6)清洗兩次。
[0048]在活化磁珠上，分別加入60 μ L溶解在25mM MES溶液(pH 6)中的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ka-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶，并分別加入40 μ L 25mM MES溶液(pH 6)至最終體積為100 μ L,震蕩混合均勻,在室溫孵育過(guò)夜,孵育后,把管子放在磁鐵上4min，移除上清液。使用300 μ L PBS沖洗包被的磁珠4次，掩蓋蛋白如BSA或脫脂奶粉濃度可以達(dá)到0.1-0.5%，把包被的磁珠重新分散在需要濃度的PBS和Tris緩沖液中。
[0049]使用透射電子顯微鏡對(duì)空白磁珠及鍵合的磁珠，進(jìn)行性狀表征，從圖1可以看出，空白磁珠(A)透射電鏡下十分的清晰，而結(jié)合了甘油三酯酶的磁珠(B)表面則非常模糊，這說(shuō)明已有蛋白黏附在磁珠表面。
[0050]實(shí)施例2:本發(fā)明的篩選系統(tǒng)在海洋天然產(chǎn)物中的應(yīng)用
[0051]稱取海綿提取物Img (海綿提取物制備方法參見(jiàn)《海洋藥物導(dǎo)論》第二版，張文主編，上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012)，加入少量DMSO溶解，后加入0.1mL PBS溶液(pH 6.8，10mM)，超聲IOmin溶解，吸取上清液進(jìn)行液質(zhì)分析，根據(jù)分子量信息，與文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)照進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。
[0052]取40 μ L上清液，分別加到100 μ L鍵合DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1、α -葡萄糖苷酶及甘油三酯酶的磁珠分散的醋酸胺溶液和空白磁珠分散的PBS緩沖液中，放在振蕩器上混勻，孵育lh。用PBS緩沖液清洗3次，每次的清洗液依次進(jìn)液相分析。將清洗液棄去，每個(gè)連通容器中加入10%乙腈-水(IOmL)進(jìn)行清洗，洗脫液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。平行操作三份。洗脫液進(jìn)行液質(zhì)分析。
[0053]液質(zhì)分析的結(jié)果如下:
[0054]1、海洋產(chǎn)物提取物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果以及與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶鍵合磁珠作用后洗脫液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果。
[0055]圖2B為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I鍵合磁珠洗脫物，洗脫物總共有有2個(gè)峰；其中峰I是保留時(shí)間為8.97min的微量成分，分子量為360 ;峰2是保留時(shí)間為25.24min的主要成分，分子量為421。
[0056]2、海洋產(chǎn)物提取物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果以及與α -葡萄糖苷酶鍵合的磁珠作用后洗脫液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果。
[0057]圖3Β為α-葡萄糖苷酶鍵合磁珠洗脫物，洗脫物只有I個(gè)峰，保留時(shí)間為25.24min，分子量為 421。
[0058]3、海洋產(chǎn)物提取物液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果以及與甘油三酯酶鍵合的磁珠作用后洗脫液液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果。
[0059]圖4B為甘油三酯酶鍵`合磁珠洗脫物，洗脫物只有I個(gè)峰，保留時(shí)間為25.24min,分子量為421。
[0060]上述三種磁珠鍵合受體測(cè)試的測(cè)試結(jié)果均顯示保留時(shí)間為25.24min、ESI離子質(zhì)譜為421的化學(xué)成分是該海綿的主要活性成分。運(yùn)用優(yōu)化的法相制備高效液相色譜(XDB-C18 column, 30 X 250mm, 5 μ m ；35%CH3CN, 18mL/min)可以發(fā)現(xiàn)該部分實(shí)際上包括兩種成分(化合物1:30.5mg, 20min ;化合物2:18.5mg, 19.3min),其離子質(zhì)譜均為421。這兩種成分均表現(xiàn)為具有旋光活性的白色粉末?；衔颕的1H及13C NMR表現(xiàn)為典型的9-甲基嘌呤信號(hào)，包括 NH2 ( δ 6.84，br s’ 2H,)，N-CH3 (δΗ 4.10, s; 5C 32.4，CH3)，及 6 個(gè)芳香基團(tuán)(δ Η
10.89，s and 8.50，s; δ c 142.5and 156.2，each CHj and 152.5，149.8，and 110.0，eachC).分子中剩余的NMR信號(hào)與clerodane型二萜極為吻合。該化合物的1H、13C NMR信號(hào)及旋光符號(hào)([a]€ -17.1°, c 1.0, in MeOH)與從日本同屬海綿中分離得到的agelasine B完全一致(參見(jiàn)文獻(xiàn) H Wu, H.Nakamura, J.Kobayashi, M.Kobayashi, M.Kobayashi, Y.0hizumi, Y.Hirata, Bulletin of the chemical society of Japan, 59 (1986) 2495-2504.),該化合物結(jié)構(gòu)因而定位agelasine B?；衔?的NMR譜圖與I的極為相似，其9_甲基嘌呤部分的信號(hào)完全一樣，只是二萜母核的信號(hào)稍有不同，該化合物的1HJ3C NMR信號(hào)及旋光符號(hào)-12.3°, c 1.0, in MeOH)與從印度尼西亞同屬海綿中分離得到的(-)-agelasineD 完全一致，其結(jié)構(gòu)因而得以確定(T.Hertiani, R.Edrada-Ebel, S.0rtlepp, Κ-?.Μ.van Soest, N.J.de Voogd, V.Wray, U.Hentschel, S.Kozytska, ff.E.G.Milller, P.Proksch, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 18 (2010) 1297 - 1311)。文獻(xiàn)報(bào)道AgelasineB及(_) -agelasine D具有抑菌、抑制平滑肌收縮及Na+，K+-ATP酶抑制作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)該類化合物具有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1、α-葡萄糖苷酶及甘油三酯酶抑制活性。該活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的正確性及可靠性。
[0061]本法建立了基于磁珠鍵合的多靶標(biāo)蛋白的高內(nèi)涵篩選降脂、降糖及抗腫瘤藥物的方法。與傳統(tǒng)紫外篩選方法相比，顯著提高了篩選效率、縮短了篩選時(shí)間，并且能夠同時(shí)對(duì)多種生物活性進(jìn)行考察、發(fā)現(xiàn)化合物之間的協(xié)同效應(yīng)。本篩選方法具有快速、準(zhǔn)確、信息量大、重現(xiàn)性好等特征。
[0062]與傳統(tǒng)方法相比，該篩選系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)在于能夠快速地發(fā)現(xiàn)具有多種活性的化合物或同一化合物的多種活性，方法獲得的信息量大、效率高、工作量少，對(duì)于復(fù)雜成分中活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。由于海洋活性物質(zhì)的研究缺乏文獻(xiàn)記載及臨床應(yīng)用，而主要依賴于于現(xiàn)代篩選技術(shù)，因此這一方法對(duì)海洋活性物質(zhì)的快速發(fā)現(xiàn)尤其具有重要的推動(dòng)價(jià)值。
[0063]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，即從海洋天然產(chǎn)物中快速篩選靶標(biāo)蛋白抑制劑，包括以下步驟: A、采用磁珠為載體，應(yīng)用化學(xué)鍵合技術(shù)在磁珠的表面鍵合靶標(biāo)蛋白，得到功能化磁珠; B、常規(guī)方法制備海洋生物提取物，將功能化磁珠與海洋生物提取物一起孵育； C、孵育I小時(shí)以上后，移除上清液，清洗磁珠，采用變性溶劑使酶變性，收集洗脫液； D、配體活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定:洗脫液通過(guò)液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振技術(shù)鑒定分析，獲得靶標(biāo)蛋白的抑制劑；其中的液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用(液質(zhì))參數(shù)為:ESI正負(fù)離子模式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的靶標(biāo)蛋白是指DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、α-葡萄糖苷酶或甘油三酯酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟A具體為:將磁珠清洗數(shù)次，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺活化磁珠表面，加入溶解的靶標(biāo)蛋白，孵育一段時(shí)間后，使酶鍵合在磁珠表面，清洗數(shù)次備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟B中的海洋生物提取物是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物提取物、海洋植物提取物或海洋來(lái)源微生物提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟B中的常規(guī)方法是指有機(jī)試劑-水不同比例的均相混合液總浸提物，經(jīng)有機(jī)試劑/水兩相萃取得到的不同極性萃取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟B中的海洋生物提取物是海綿提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟B中具體為:稱取海洋天然產(chǎn)物提取物lmg，加入少量二甲基亞砜溶解，后加入0.1mL的pH 6.8的IOmM磷酸緩沖液，超聲溶解。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟C中的變性溶劑為乙腈或乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種海洋天然活性物質(zhì)磁珠高內(nèi)涵快速篩選方法，其特征在于，所述的步驟D中的質(zhì)譜信息由Finnigan液質(zhì)聯(lián)用儀器獲取。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103675115SQ201210567347
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】張文, 王毅, 程翼宇 申請(qǐng)人:張文, 王毅, 程翼宇