一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明首先保護(hù)一種雙鏈DNA分子，為將CCPGCC標(biāo)簽的編碼基因插入腸道病毒71型的基因組DNA的3C蛋白酶編碼區(qū)中得到的DNA分子；所述CCPGCC標(biāo)簽為序列表的序列1所示的多肽片段。含有所述雙鏈DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種腸道病毒71型的重組病毒，其基因組RNA的編碼DNA如序列表的序列4所示。本發(fā)明所提供的腸道病毒71型可視化重組病毒在基礎(chǔ)研究方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】-種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應(yīng)用，特別涉及一種腸道病 毒71型3C蛋白可視化重組病毒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（EV71)是小RNA病毒科（Picornaviridae)腸道病毒屬 (Enterovirus)的重要成員。EV71感染主要引起手足口病（Hand-Foot-Mouse Disease)，可 導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)綜合癥，是手足口病重癥和死亡病例的主要原因。目前臨床上尚無(wú)針 對(duì)EV71的有效疫苗和特異抗病毒藥物。
[0003] EV71的基因組為單股正鏈RNA分子，包含一個(gè)單一讀碼框，編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和VP4蛋白）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（2A蛋白、2B蛋白、2C蛋 白、3A蛋白、3B蛋白、3C蛋白和3D蛋白XEV71病毒基因組的5'和3'端為非編碼區(qū) (untranslated regior^UTRXS' UTR內(nèi)含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)等復(fù)制翻譯調(diào)控 元件，3' UTR內(nèi)含有三個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)和PolyA元件。3C蛋白，又稱3C蛋白酶（3CPM)，是病毒 基因組編碼的兩個(gè)蛋白酶之一，主要負(fù)責(zé)除VP1-2A、VP2-VP4位點(diǎn)以外，病毒多聚蛋白其它 位點(diǎn)的切割。此外，3C PM還可對(duì)部分宿主蛋白進(jìn)行切割，是病毒-宿主相互作用過(guò)程中的關(guān) 鍵蛋白，但目前對(duì)于3CP?在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，及其與宿主因子相互作用的機(jī) 制尚不清楚。
[0004] 報(bào)告病毒是將熒光蛋白標(biāo)簽插入病毒基因組中得到的重組病毒，能夠?qū)崿F(xiàn)病毒基 因組翻譯表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)，以及病毒蛋白的示蹤。目前對(duì)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記最常用的手段 是傳統(tǒng)的免疫熒光技術(shù)，但是該技術(shù)無(wú)法對(duì)病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。EV71病毒基因組總長(zhǎng)只有 7. 4kb，3CpM基因長(zhǎng)度約500bp，將長(zhǎng)度約為Ikb的GFP、RFP或其它熒光素酶的編碼基因插 入病毒基因組具有較大難度，因此目前EV71的可視化報(bào)告病毒尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0005] 最近的研究報(bào)道了 一種新的成像技術(shù)即"雙砷-四半胱氨酸（biarsenical tetracysteine，TC)技術(shù)。該技術(shù)利用蛋白質(zhì)中CCPGCC結(jié)構(gòu)域作為標(biāo)簽，當(dāng)一種可以穿透 脂雙膜的雙砷染料共價(jià)結(jié)合上述結(jié)構(gòu)域上的兩對(duì)半胱氨酸時(shí)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)TC標(biāo)簽蛋白質(zhì) 的熒光成像。相對(duì)傳統(tǒng)的蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)=(I)CCPGCC標(biāo)簽只含 有6個(gè)氨基酸，對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)破壞甚為微小，因此可極大的提高獲得突變病毒的成功率； (2)具有TC標(biāo)簽的蛋白一旦翻譯產(chǎn)生，雙砷染料即刻能夠結(jié)合到蛋白實(shí)現(xiàn)成像，相比其它 需要折疊后才能夠?qū)崿F(xiàn)熒光成像的蛋白，其成像的速度快，在進(jìn)行蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān) 研究時(shí)，能夠更加真實(shí)的反應(yīng)靶蛋白本身的實(shí)際情況；（3)該染料能夠自由穿透核膜和質(zhì) 膜，在胞內(nèi)成像無(wú)死角。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種腸道病毒71型可視化重組病毒及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明首先保護(hù)一種雙鏈DNA分子，為將CCPGCC標(biāo)簽的編碼基因插入腸道病毒71 型的基因組DNA的3C蛋白酶編碼區(qū)中得到的DNA分子；所述CCPGCC標(biāo)簽為序列表的序列 1所示的多肽片段。
[0008] 所述CCPGCC標(biāo)簽的編碼基因可如序列表的序列2所不。
[0009] 所述3C蛋白酶可如序列表的序列5所示。
[0010] 所述3C蛋白酶編碼區(qū)可如序列表的序列3所示自5'末端第5387至5935位核苷 酸所示。
[0011] 所述腸道病毒71型具體可為AH/08/06株。
[0012] 所述AH/08/06株的基因組DNA如序列表的序列3所示。
[0013] 所述雙鏈DNA分子具體可如序列表的序列4所示。
[0014] 含有以上任一所述雙鏈DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒乙；所述重組質(zhì)粒乙與重組質(zhì)粒甲的差異僅在于 在序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子第5929位核苷酸和第5930位核苷酸之間插入了編 碼CCPGCC標(biāo)簽的核苷酸序列"tgctgcccaggatgctgc" ；所述重組質(zhì)粒甲具體可為將序列表 的序列3所示的雙鏈DNA分子插入pBR322質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)（如SnaBI和MluI酶切位點(diǎn) 之間）得到的重組質(zhì)粒。
[0016] 本發(fā)明還保護(hù)一種腸道病毒71型的重組病毒，其基因組RNA的編碼DNA如序列表 的序列4所示。
[0017] 所述重組病毒的制備方法具體如下：將以上任一所述的雙鏈DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄 體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到所述重組病毒。所述重組病毒的制備中，具體可將線性化 的所述重組質(zhì)粒乙的RNA轉(zhuǎn)錄體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并培養(yǎng)。線性化的所述重組質(zhì)粒乙具體 可為將所述重組質(zhì)粒乙用限制性內(nèi)切酶MluI單酶切后得到的線性DNA分子。所述哺乳動(dòng) 物細(xì)胞具體可為RD細(xì)胞或Vero細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明還保護(hù)一種監(jiān)測(cè)腸道病毒71型感染哺乳細(xì)胞過(guò)程的方法，包括如下步驟：
[0019] ( 1)將以上任一所述的重組病毒接種至哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
[0020] (2)加入FlAsH-EDT2染料，通過(guò)觀察熒光信號(hào)檢測(cè)腸道病毒71型感染哺乳細(xì)胞過(guò) 程。
[0021] 所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為RD細(xì)胞或Vero細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明還保護(hù)一種篩選在腸道病毒71型感染哺乳細(xì)胞過(guò)程與3CPM相互作用的宿 主因子的方法，依次包括如下步驟：
[0023] ( 1)將以上任一所述的重組病毒接種至哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
[0024] (2)加入FlAsH_EDT2染料，并觀察熒光信號(hào)；
[0025] (3)加入針對(duì)候選的宿主因子的單克隆抗體并孵育；
[0026] (4)加入針對(duì)所述單克隆抗體的酶標(biāo)二抗，顯色后觀察熒光信號(hào)；
[0027] (5)將步驟（2)的熒光信號(hào)和步驟（4)的熒光信號(hào)進(jìn)行共定位處理，從而確定待測(cè) 宿主因子是否為與3C PM結(jié)合的宿主因子。
[0028] 所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為RD細(xì)胞或Vero細(xì)胞。
[0029] 本發(fā)明提供的腸道病毒71型可視化重組病毒具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)生物學(xué)特征與野 生型病毒一致，具有良好的代表性；（2)基因穩(wěn)定，回復(fù)為野生型病毒的可能性低；（3)能夠 直接觀察到病毒3CPM蛋白從表達(dá)至入核的全過(guò)程；（4)能夠進(jìn)行3CPM蛋白與宿主蛋白的 共定位研究，且無(wú)需利用3CP?單抗，操作簡(jiǎn)單，成本低；（5)能夠在病毒感染細(xì)胞后實(shí)時(shí)監(jiān) 測(cè)3C PM的表達(dá)與轉(zhuǎn)運(yùn)，根據(jù)肉眼監(jiān)測(cè)結(jié)果及具體研究需要，能夠?qū)?shí)驗(yàn)體系隨時(shí)固定在病 毒感染細(xì)胞后的任何階段，這在研究3C P?與宿主蛋白相互作用時(shí)具有巨大優(yōu)勢(shì)，目前其它 技術(shù)手段無(wú)法實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。本發(fā)明所提供的腸道病毒71型可視化重組病毒在基礎(chǔ)研究方 面具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為重組質(zhì)粒乙制備過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0031] 圖2為重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒乙的部分測(cè)序結(jié)果。
[0032] 圖3為間接免疫熒光分析的結(jié)果。
[0033] 圖4為免疫印跡分析的結(jié)果。
[0034] 圖5為蝕斑分析的結(jié)果。
[0035] 圖6為各代病毒液的部分測(cè)序結(jié)果。
[0036] 圖7為病毒的增殖特性。
[0037] 圖8為Vero細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果。
[0038] 圖9為RD細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果。
[0039] 圖10為3CPM與CstF-64的共定位分析

【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。RD細(xì)胞(人胚胎型橫紋肌肉瘤細(xì)胞）：購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCL-136。Vero細(xì)胞 (非洲綠猴腎細(xì)胞）：購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCL-81。如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)施例中所用的PBS 緩沖液均為pH7. 2、0. OlM的PBS緩沖液。針對(duì)腸道病毒71型的VPl蛋白的特異性單抗：購(gòu) 自Abcam公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為ab36367。突光標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體：購(gòu)自北京中杉金橋公 司，產(chǎn)品目錄號(hào)為ZF-0512。堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗：購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，產(chǎn)品 目錄號(hào)CW0110。FIAsH-EDT 2染料：購(gòu)自英濰捷基公司，產(chǎn)品目錄號(hào)T34561。anti-CstF-64 單抗：購(gòu)自圣克魯斯公司，產(chǎn)品目錄號(hào)sc-166647。Texas Red標(biāo)記山羊抗鼠 IgG抗體：購(gòu) 自北京康為世紀(jì)公司，產(chǎn)品目錄號(hào)CW0154。pBR322質(zhì)粒：參考文獻(xiàn)：Arita et al.，2005. J Gen Virol, 86:1391-1401。
[0041] 實(shí)施例I、重組EV71病毒的構(gòu)建
[0042] AH/08/06株為一種腸道病毒71型國(guó)內(nèi)分離株，其基因組RNA對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA如 序列表的序列3所示（自5'末端第5387至5935位核苷酸為3C PM基因，編碼序列表的序列 5所示的3CPM蛋白）。
[0043] 一、腸道病毒71型3CPM重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
[0044] 1、構(gòu)建EV71 AH/08/06株全長(zhǎng)感染性cDNA克隆A12的質(zhì)粒
[0045] 合成序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子，并插入pBR322質(zhì)粒的SnaBI和MluI 酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒甲（又稱攜帶EV71 AH/08/06株全長(zhǎng)感染性cDNA克隆A12的 質(zhì)粒，又稱腸道病毒71型重組質(zhì)粒)。
[0046] 2、分別設(shè)計(jì)并合成如下引物：
[0047] NruI-F ：5! -aagacagctctcgcgacttgctcgtgtcat-3'；
[0048] TC3C-SI-R :5' - - gcagcatcc tgggcagcai actagcaaagtaactccttttgagacccgcgc-?> ! #
[0049] TC3C-S2-F ：5 ' - tgctgcccaggatgctgc\ gaacaaggagagatccagtgggttaagcccaa t_3 ' ；
[0050] MluI-R -ggccctttcgtcttcaaacgcgtttttt-3' 〇
[0051] 方框標(biāo)注編碼CCPGCC標(biāo)簽的序列，下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。
[0052] 3、以重組質(zhì)粒甲為模板，用NruI-F和TC3C-S1-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至Ij PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約2519bp)。
[0053] 4、以重組質(zhì)粒甲為模板，用TC3C-S2-F和MluI-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 至Ij PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約1542bp)。
[0054] 5、同時(shí)將步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，用NruI-F和 MluI-R組成的引物對(duì)進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約4043bp )。
[0055] 6、用限制性內(nèi)切酶NruI和MluI雙酶切步驟5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0056] 7、用限制性內(nèi)切酶NruI和MluI雙酶切重組質(zhì)粒甲，回收載體骨架(約6kb)。
[0057] 8、將步驟6的酶切產(chǎn)物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙(又稱腸道病毒 71型3CP?重組質(zhì)粒)。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒乙與重組質(zhì)粒甲的差異僅在于在序列表的 序列3所示的雙鏈DNA分子第5929位核苷酸和第5930位核苷酸之間插入了編碼CCPGCC 標(biāo)簽的核苷酸序列" tgctgcccaggatgctgc"。
[0058] 重組質(zhì)粒乙制備過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1，其中圖IA中的泳道2為步驟 3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖IA中的泳道1為步驟4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖IB的泳道1為步驟5的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，圖IA和圖IB中的泳道M均為分子量標(biāo)記。
[0059] 重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒乙的部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0060] 二、腸道病毒71型3CPM重組病毒的拯救
[0061] 1、體外轉(zhuǎn)錄
[0062] (1)用限制性內(nèi)切酶MluI單酶切重組質(zhì)粒乙，回收線性化的質(zhì)粒。
[0063] (2)取步驟（1)得到的線性化的質(zhì)粒作為體外轉(zhuǎn)錄模板，用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 (購(gòu)自普洛麥格公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為P1280)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到RNA轉(zhuǎn)錄體，-80°C保存。
[0064] 2、轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞
[0065] 利用脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000)將RNA轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。步驟如下：（1)首 先將RD細(xì)胞接種6孔板，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、lOOU/ml青霉素和100 μ g/ ml鏈霉素）培養(yǎng)至90%單層；（2)將6 μ 1脂質(zhì)體與125 μ I OPTI-MEM培養(yǎng)基混合并室溫靜 置5min，同時(shí)將20 μ I RNA轉(zhuǎn)錄體與125 μ I OPTI-MEM培養(yǎng)基混合，將上述兩種混合物充分 混勻，室溫靜置20min ;(3)用500 μ I OPTI-MEM培養(yǎng)基洗滌步驟（1)中的單層細(xì)胞兩次，然 后每孔加入800 μ I OPTI-MEM培養(yǎng)基；（4)將步驟（2)得到的混合物加入完成步驟（3)的6 孔板并搖勻，其中步驟（2)得到的混合物為加入1個(gè)孔的劑量，置于37°C 5% CO2的培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)6h (期間搖動(dòng)一次);吸棄上清，加入2ml DMEM維持培養(yǎng)基(含2%胎牛血清、lOOU/ml 青霉素和100 μ g/ml鏈霉素）并培養(yǎng)48h。
[0066] 完成步驟2時(shí)，細(xì)胞病變（CPE)達(dá)到++++ (90-100%)。
[0067] 3、恢復(fù)病毒的傳代鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)
[0068] (1)將完成步驟2的培養(yǎng)體系凍融一次，然后IOOOOrpm離心3min，收集上清（即為 腸道病毒71型3C P?重組病毒的病毒種子液)。
[0069] (2)病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)
[0070] 取500 μ 1步驟（1)得到的病毒種子液，接種于長(zhǎng)滿90%的單層RD細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng) 于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶)，37°C吸附lh，然后補(bǔ)加含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，置37°C 5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)到++++時(shí)，凍融一次，然后IOOOOrpm離心3min，收取上清液 (即為腸道病毒71型3C P?重組病毒的病毒培養(yǎng)液)。
[0071] 4、恢復(fù)病毒基因組的RT-PCR鑒定
[0072] 提取步驟3得到的病毒培養(yǎng)液的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序 結(jié)果如序列表的序列4所示。
[0073] 三、腸道病毒71型野生病毒的拯救
[0074] 用重組質(zhì)粒甲代替重組質(zhì)粒乙進(jìn)行步驟二，得到腸道病毒71型野生病毒的病毒 培養(yǎng)液。
[0075] 后續(xù)實(shí)施例中的腸道病毒71型均是由實(shí)施例1制備的腸道病毒71型3CP?重組病 毒的病毒培養(yǎng)液或腸道病毒71型野生病毒的病毒培養(yǎng)液提供的。腸道病毒71型3C PM重 組病毒用TC3C表示，腸道病毒71型野生病毒用A12表示。
[0076] 實(shí)施例2、間接免疫熒光分析 [0077] 1、抗原片的制備
[0078] 利用8孔滅菌細(xì)胞培養(yǎng)載玻片培養(yǎng)RD細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿90%后，接種腸道病毒71 型，37°C吸附lh，吸棄上清，補(bǔ)加含2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱 進(jìn)行培養(yǎng)。分別于接種病毒6、12、24h后取樣，用PBS緩沖液洗三遍細(xì)胞，加入預(yù)冷的丙酮 (500 μ 1/孔）并-20°C固定過(guò)夜。取出載玻片后室溫干燥，_20°C保存。
[0079] 2、間接免疫熒光分析
[0080] 取出步驟1制備的抗原片，平衡至室溫，每孔滴加 100μ 1 1 :200倍稀釋的針對(duì)腸 道病毒71型的VPl蛋白的特異性單抗，置于37°C濕盒中孵育lh，取出抗原片并用PBS緩沖 液震蕩漂洗3次；室溫晾干后每孔加入20μ I I :800倍稀釋的熒光標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗體， 置于37°C濕盒中孵育30min ;取出抗原片，先用蒸餾水漂洗1次，再置于PBS緩沖液中振蕩 漂洗3次；加入DAPI核染劑，室溫孵育5min，然后用PBS緩沖液漂洗三遍；室溫晾干后置于 突光顯微鏡下觀察。
[0081] 照片見(jiàn)圖3。腸道病毒71型3CP?重組病毒和腸道病毒71型野生病毒均可以有效 表達(dá)VPl蛋白。
[0082] 實(shí)施例3、免疫印跡分析
[0083] 將RD細(xì)胞接種48孔板，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，接種腸道病毒71型，37°C 5% CO2培養(yǎng) 箱培養(yǎng)6h，然后用PBS緩沖液洗細(xì)胞三遍，加入0. 25%的胰酶將細(xì)胞消化至圓縮，棄凈胰酶 后用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，加入蛋白上樣緩沖液，水煮沸10分鐘后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE(5% 堆積膠、80V，12%分離膠、120V，電泳時(shí)間共計(jì)lh)和免疫印跡。免疫印跡中，采用I :1000倍 稀釋的針對(duì)腸道病毒71型的VPl蛋白的特異性單抗或1 :100倍稀釋的anti-3CpM單抗，采 用I :1000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。設(shè)置不接種腸道病毒71型的空白對(duì)照 (Neg)0
[0084] 照片見(jiàn)圖4,其中圖A為采用針對(duì)腸道病毒71型的3CPM蛋白的特異性單抗的結(jié)果 (3C PM蛋白的分子量為20KD)，圖B為采用針對(duì)腸道病毒71型的VPl蛋白的特異性單抗的 結(jié)果（VP1蛋白的分子量為33KD)。兩種單抗均可以識(shí)別腸道病毒71型3C P?重組病毒和腸 道病毒71型野生病毒。
[0085] 實(shí)施例4、感染性、基因組穩(wěn)定性分析及蝕斑分析
[0086] 1、蝕斑分析
[0087] 將濃度為I X 107PFU/ml的腸道病毒71型進(jìn)行10倍梯度(稀釋度依次為10' 10' 10_4、10_5、10_6、KT7和10_ 8)，各個(gè)稀釋液分別接種于6孔板單層RD細(xì)胞，置于37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱中吸附Ih ;吸棄上清，加入瓊脂蓋(含1%瓊脂和2%FBS的DMEM培養(yǎng)基)，置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d ;加入4%甲醛溶液室溫固定3h，甩掉瓊脂蓋后加入結(jié)晶紫染色液， 37°C染色30min，用水洗去染色液，觀察蝕斑形態(tài)。設(shè)置不接種腸道病毒71型的空白對(duì)照 (Neg) 0
[0088] 照片見(jiàn)圖5,腸道病毒71型3CPM重組病毒和腸道病毒71型野生病毒均可觀察到 蝕斑，且噬斑形態(tài)一致。
[0089] 2、感染性、基因組穩(wěn)定性分析
[0090] 將腸道病毒71型3CP?重組病毒接種至長(zhǎng)滿50%RD細(xì)胞的12孔板中，置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附lh，吸棄上清，補(bǔ)加含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，置于37°C 5% 0)2培 養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，細(xì)胞發(fā)生CPE后收集培養(yǎng)上清，作為第1代病毒液。將 第1代病毒液接種RD細(xì)胞，重復(fù)進(jìn)行上述培養(yǎng)，得到第2代病毒液。重復(fù)進(jìn)行上述培養(yǎng)，依 次得到第3代病毒液、第4代病毒液和第5代病毒液。分別將第1代病毒液至第5代病毒 液提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后進(jìn)行測(cè)序。
[0091] 部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖6。各代病毒液的測(cè)序結(jié)果均如序列表的序列4所示，即插入的 CCPGCC標(biāo)簽序列很穩(wěn)定。
[0092] 實(shí)施例5、增殖特性
[0093] MOI 即感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection)。
[0094] 將腸道病毒71型按照MOI=O. 01的劑量接種RD細(xì)胞，在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中吸附 2h，然后加入含2%FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，分別在接種后第6、12、24、36、48h收取上清液， 采用實(shí)施例4的步驟1的方法進(jìn)行蝕斑分析并統(tǒng)計(jì)PFU，計(jì)算上清液的病毒滴度（PFU/mL)， 根據(jù)病毒滴度繪制一步生長(zhǎng)曲線。
[0095] 結(jié)果見(jiàn)圖7。腸道病毒71型3CP?重組病毒和腸道病毒71型野生病毒的生長(zhǎng)曲線 基本一致，即CCPGCC標(biāo)簽基本沒(méi)有對(duì)病毒的增殖特性產(chǎn)生影響。
[0096] 實(shí)施例6、腸道病毒71型3CP?重組病毒的應(yīng)用
[0097] 1、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腸道病毒71型3CPM重組病毒感染哺乳細(xì)胞的過(guò)程
[0098] 將哺乳動(dòng)物細(xì)胞（RD細(xì)胞或Vero細(xì)胞）在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后更 換為無(wú)血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)16h，以MOI=I的劑量接種腸道病毒71型并繼續(xù) 培養(yǎng)lh，吸棄上清，用OPTI-MEM培養(yǎng)基洗兩遍，加入濃度為0. 3 μ M的FlAsH-EDT2染料，從 加入染料開(kāi)始，每隔30min在熒光顯微鏡下觀察一次，持續(xù)觀察6h。
[0099] 采用腸道病毒71型3CPM重組病毒接種時(shí)，Vero細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8 ('代 表min)，RD細(xì)胞的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9 ('代表min)。結(jié)果表明，可以通過(guò)熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 腸道病毒71型3CP?重組病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的過(guò)程。
[0100] 采用腸道病毒71型野生病毒接種時(shí)，Vero細(xì)胞和RD細(xì)胞均沒(méi)有熒光顯示。
[0101] 2、3CPM與CstF-64的共定位分析
[0102] 依次進(jìn)行以下步驟：
[0103] (1)將Vero細(xì)胞接種于有孔的玻片，在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h (鋪滿30%);
[0104] (2)將細(xì)胞用PBS緩沖液洗三次，加入無(wú)血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)16h ;
[0105] (3)以MOI=I的劑量接種腸道病毒71型，分別于接種病毒感染330min和390min 后取樣；
[0106] (4)用0?11-1^1培養(yǎng)基洗兩遍細(xì)胞，加入濃度為2.5以1的？148^0了2染料，室溫 避光孵育30min。
[0107] (5)加入二倍體積的BAL洗液(購(gòu)自英濰捷基公司，產(chǎn)品目錄號(hào)T34561 )，洗細(xì)胞兩 次，棄去洗液；
[0108] (6)加入無(wú)血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察，并記下每個(gè)觀察點(diǎn)的 坐標(biāo)參數(shù)。
[0109] (7)觀察完畢后，利用預(yù)冷的丙酮將玻片在-20°c固定過(guò)夜。
[0110] (8)取出玻片，向目標(biāo)孔內(nèi)滴加 I :100倍稀釋的anti-CstF-64單抗（100μ 1/孔)， 并置于37°C濕盒中孵育lh。
[0111] (9)取出玻片，用PBS緩沖液震蕩漂洗3次，每次5min，室溫晾干。
[0112] (10)加入1:500倍稀釋的Texas Red標(biāo)記山羊抗鼠 IgG抗體（100 μ 1/孔)，置于 37°C濕盒中孵育30min。
[0113] (11)置于PBS緩沖液中振蕩漂洗3次，每次漂洗lOmin。
[0114] (12)加入DAPI核染劑，室溫孵育5min，然后用PBS緩沖液漂洗三遍。
[0115] (13)室溫晚干后直于滅光顯微鏡下觀察結(jié)果，記錄結(jié)果后，將CCPGCC標(biāo)簽滅光成 像圖像與免疫熒光成像圖像、DAPI進(jìn)行共定位處理。
[0116] 如圖IOA所示，在采用腸道病毒71型3CPM重組病毒感染330min后，能夠在細(xì)胞核 中同時(shí)檢測(cè)到3C P?的綠色熒光信號(hào)與CstF-64的紅色熒光信號(hào)，顯示在感染后330min兩 者均存在于在細(xì)胞核內(nèi)。如圖IOB所示，在采用腸道病毒71型3C P?重組病毒感染390min 后，細(xì)胞核內(nèi)能夠檢測(cè)到3CPM的綠色熒光信號(hào)，但無(wú)法檢測(cè)到CstF-64的紅色熒光信號(hào)，顯 示在感染后390min CstF-64被消化。
【權(quán)利要求】
1. 一種雙鏈DNA分子，為將CCPGCC標(biāo)簽的編碼基因插入腸道病毒71型的基因組DNA 的3C蛋白酶編碼區(qū)中得到的DNA分子；所述CCPGCC標(biāo)簽為序列表的序列1所示的多肽片 段。
2. 如權(quán)利要求1所述的雙鏈DNA分子，其特征在于：所述CCPGCC標(biāo)簽的編碼基因如序 列表的序列2所示。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的雙鏈DNA分子，其特征在于：所述腸道病毒71型為 AH/08/06 株。
4. 如權(quán)利要求3所述的雙鏈DNA分子，其特征在于：所述AH/08/06株的基因組DNA如 序列表的序列3所示。
5. 如權(quán)利要求4所述的雙鏈DNA分子，其特征在于：所述雙鏈DNA分子如序列表的序 列4所示。
6. 含有權(quán)利要求1至5中任一所述雙鏈DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或 重組菌。
7. -種腸道病毒71型的重組病毒，其特征在于：其基因組RNA的編碼DNA如序列表的 序列4所示。
8. 如權(quán)利要求7所述的重組病毒，其特征在于：所述重組病毒的制備方法如下：將權(quán)利 要求1至5中任一所述雙鏈DNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并培養(yǎng)，得到所述重 組病毒。
9. 一種監(jiān)測(cè)腸道病毒71型感染哺乳細(xì)胞過(guò)程的方法，包括如下步驟： (1) 將權(quán)利要求7或8所述的重組病毒接種至哺乳動(dòng)物細(xì)胞； (2) 加入FlAsH-EDT2染料，通過(guò)觀察熒光信號(hào)檢測(cè)腸道病毒71型感染哺乳細(xì)胞過(guò)程。
10. -種篩選在腸道病毒71型感染哺乳細(xì)胞過(guò)程與3(^°相互作用的宿主因子的方法， 依次包括如下步驟： (1) 將權(quán)利要求7或8所述的重組病毒接種至哺乳動(dòng)物細(xì)胞； (2) 加入FlAsH-EDT2染料，并觀察熒光信號(hào)； (3) 加入針對(duì)候選的宿主因子的單克隆抗體并孵育； (4) 加入針對(duì)所述單克隆抗體的酶標(biāo)二抗，顯色后觀察熒光信號(hào)； (5) 將步驟（2)的熒光信號(hào)和步驟（4)的熒光信號(hào)進(jìn)行共定位處理，從而確定待測(cè)宿主 因子是否為與3CP?結(jié)合的宿主因子。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK104419712SQ201310363321
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】秦成峰, 曹瑞源, 秦鄂德, 韓劍峰, 李曉峰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所