一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，涉及生物技術、材料化學、納米科學等多個領域。本發(fā)明基于利用圖案化模板制備的蜂窩狀多孔薄膜，將蜂窩狀多孔膜的圖案化與薄膜的表面功能化相結合，通過生物分子含有的氨基或巰基與蜂窩狀多孔膜表面聚多巴胺修飾層的共價連接實現(xiàn)生物分子的圖案化微陣列。該方法不僅操作簡單，成本低廉，尺度可控，解決了常規(guī)方法一般需要較昂貴的儀器設備或特殊的掩膜材料的問題，而且可以適用于多種生物分子微陣列的構筑，并且在蜂窩狀孔洞內實現(xiàn)了生物分子的三維定向排列，有望在生物芯片、組織工程材料和生物傳感器等領域得到廣泛的應用。
【專利說明】—種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術、材料化學、納米科學等多個領域，具體涉及一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法。
【背景技術】
[0002]生物分子的圖案化微陣列是由生命科學、材料科學、化學及納米科學等多個領域交叉發(fā)展而形成的一個新的研究方向。在微納尺度上構筑圖案化的生物分子微陣列，對于生物芯片、微反應器、化學和生物傳感器等生物科學技術的發(fā)展具有十分重要的意義。
[0003]生物分子微陣列的構筑依賴于圖案化基底的制備及微區(qū)的表面功能化。目前用于生物分子微陣列的制備方法主要包括光刻蝕技術、微接觸印刷及蘸筆納米平板印刷技術。
[0004]光刻蝕技術是利用高能量光束結合光掩膜來處理基底表面，以部分改變基底表面性質，獲得表面圖案的技術。利用光刻蝕技術制備生物分子微圖案受到光掩膜特征尺寸和所用光波長的限制，當光掩膜的特征尺寸與所用光波長相近時，很容易發(fā)生光的衍射，這就限制了光刻蝕技術在微圖案制備中的應用。
[0005]微接觸印刷技術利用高分子材料制作的印章，將待固定的生物分子作為“墨水”轉移到處理好的基底表面形成圖案。微接觸印刷技術雖然可以實現(xiàn)一次性在較大面積上轉移生物分子，但受到所用印章性質和尺寸的限制，其尺寸精度和可重復性不理想。
[0006]蘸筆納米平板印刷技術是通過功能分子覆蓋的掃描探針針尖直接沉積分子到目標基底表面來得到納米尺度的微陣列圖案。這些方法一般需要較昂貴復雜的儀器設備，特殊的掩膜或印章材料，同時主要用于特定的生物分子，并且局限于二維平面的圖案化。
[0007]生物分子在圖案化表面的固定主要通過物理吸附、共價鍵合和特異性識別等作用。物理吸附容易洗脫，定向性和可控性差。共價鍵合是利用材料表面活性基團和生物分子帶有的活性基團之間的反應，實現(xiàn)生物分子在表面的固定。特異性識別雖然可以實現(xiàn)特定生物分子的識別并保持其活性，但這種方式仍然需要通過共價鍵合預先固定主體分子，操作過程比較復雜。
[0008]因此，易于生物分子進行共價鍵合的表面功能化方法對生物分子的固定至關重要。聚多巴胺仿生修飾是一種非常簡單易行的表面功能化方法，可以對幾乎任何有機和無機材料表面進行功能化。在表面形成的聚多巴胺修飾層具有兒茶酚的反應特性，可以通過Michael加成或希夫堿反應與含有巰基或氨基的生物分子反應，將生物分子固定在基底表面上。本發(fā)明利用聚多巴胺仿生修飾對圖案化的基底進行功能化，實現(xiàn)生物分子的定向固定。
[0009]蜂窩狀有序多孔膜具有孔徑分布均一可調、孔排列高度有序等特點，在細胞培養(yǎng)、組織工程材料、生物傳感器等領域有良好的應用前景。
[0010]在眾多制備蜂窩狀結構的方法中，水滴模板法由于方法簡單、成本低、所得多孔結構質量較高等一系列優(yōu)點，成為制備蜂窩狀結構的一種非常重要的自組裝方法。由于所用的成膜材料以聚合物及其復合物為主，形成的多孔薄膜疏水性較強，表面活性基團少，功能化困難，限制了其在生物技術等領域的應用。
[0011]對于玻璃化溫度較低或彈性模量較高的聚合物體系，可以在非平面基底上形成連續(xù)均一的多孔薄膜，而對于玻璃化溫度較高或彈性模量較低的聚合物體系，在非平面基底上形成的多孔薄膜容易發(fā)生斷裂。
[0012]本發(fā)明所使用的聚合物聚苯乙烯具有較高的玻璃化溫度及較低的彈性模量，而金納米顆粒的加入使其玻璃化溫度進一步提高，因此在非平面基底上制備蜂窩狀多孔膜時，容易在模板邊緣處發(fā)生斷裂。
[0013]正是復合物薄膜彈性模量的降低，在將作為模板的載網(wǎng)與基底分離時，薄膜發(fā)生斷裂，位于載網(wǎng)孔內的多孔薄膜與位于載網(wǎng)上的薄膜分離，留在基底上的多孔薄膜形成了與載網(wǎng)網(wǎng)孔分布一致的微陣列。利用聚多巴胺仿生修飾對蜂窩狀多孔薄膜進行功能化，可以實現(xiàn)生物分子在薄膜表面及孔內的定向固定，得到生物分子的微陣列。
[0014]經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，CN1661114A公開了一種將生物分子高密度固定到表面具有活化羧基的固體基質上的方法及用該方法制備的微陣列。CN1821424A公開了一種將生物分子非共價地固定到固體基質上的方法。CN1405326A公開了一種生物分子微陣列的制備方法及定點裝置。CN1265049A公開了一種基于聚乙烯亞胺的生物分子陣列。以上技術文獻均未涉及蜂窩狀多孔膜及聚多巴胺仿生修飾。
[0015]CN102912343A公開了一種在金片表面制備生物分子圖案的方法，該方法利用貫通型聚合物蜂窩狀有序多孔膜作為掩膜，利用巰基與基底的作用在金片表面形成圖案化的單分子層，而本發(fā)明是利用模板將蜂窩狀有序多孔膜圖案化，并利用聚多巴胺仿生修飾制備生物分子的微陣列。

【發(fā)明內容】

[0016]本發(fā)明的目的之一是提供簡單易行的蜂窩狀多孔膜的圖案化及表面功能化方法，解決其在生物技術等領域的應用限制。
[0017]本發(fā)明的目的之二是提供快速、低成本、通用的生物分子微陣列制備方法，為生物芯片、生物微器件和生物傳感器等提供技術基礎。
[0018]一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，步驟如下:
(1)用透射電鏡載網(wǎng)作為圖案化模板置于固體基底上，用聚苯乙烯和金納米顆粒的氯仿溶液為成膜液，在65%?85%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在載網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將步驟(I)制得的載有蜂窩狀薄膜的固體基底浸入鹽酸多巴胺溶液中，振蕩反應12?24小時，然后用水沖洗3?5次，用氮氣吹干；
(3)將步驟(2)制得的覆蓋有蜂窩狀多孔膜的載網(wǎng)從基底上剝離下來，載網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將步驟(3)制得的圖案化的基底浸入生物分子的水溶液中，振蕩反應12?20小時，然后用水沖洗3?5次，用氮氣吹干，在基底上形成生物分子的微陣列。
[0019]步驟(I)中，所述的透射電鏡載網(wǎng)選自下列一種:方孔100目銅網(wǎng)、方孔200目銅網(wǎng)、方孔300目銅網(wǎng)、方孔400目銅網(wǎng)、圓孔100目銅網(wǎng)、圓孔200目銅網(wǎng)、圓孔300目銅網(wǎng)、圓孔400目銅網(wǎng)、方孔100目鎳網(wǎng)、方孔200目鎳網(wǎng)、方孔300目鎳網(wǎng)、方孔400目鎳網(wǎng)、圓孔100目鎳網(wǎng)、圓孔200目鎳網(wǎng)、圓孔300目鎳網(wǎng)、圓孔400目鎳網(wǎng)。
[0020]步驟(I)中，所述的固體基底為硅片、玻璃片、石英片及PET (聚對苯二甲酸乙二醇酯)薄片中的一種。
[0021]步驟(I)中，所述的成膜液，聚苯乙烯分子量為150000~500000，聚苯乙烯濃度為
1.5~5.0 mg.mL—1,金納米顆粒為十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為3~20 nm的金納米顆粒，金納米顆粒濃度為0.5~1.5 mg.mL'
[0022]步驟(2)中，所述的鹽酸多巴胺溶液，濃度為1.0~2.5 mg.mL—1，溶劑為pH=8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液。
[0023]步驟(4)中，所述的生物分子為巰基乙酸、巰基丙酸、甘氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、癌胚抗原抗體中的一種。
[0024]步驟(4)中，所述的生物分子的水溶液，濃度為0.05~20 mg 溶劑為磷酸鹽緩沖溶液，PH為7.0~8.5。
[0025]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
(I)本發(fā)明中生物分子微陣列微區(qū)的大小可以通過選用不同目數(shù)的載網(wǎng)來控制，可重復性好。同時可通過改變聚合物濃度、金納米顆粒濃度、相對濕度等條件來控制蜂窩狀多孔結構孔徑的大小，實現(xiàn)在一個微區(qū)上的形貌調控。
[0026](2)該方法不僅操作簡單，成本低廉，尺度可控，解決了常規(guī)方法一般需要較昂貴的儀器設備，特殊的掩膜或印章材料的問題。
[0027](3)將聚多巴胺仿生修飾用于蜂窩狀多孔膜的表面功能化，擴大了蜂窩狀多孔膜的應用領域。
[0028](4)實現(xiàn)了在蜂窩狀薄膜圖案化區(qū)域及有序多孔結構內部進行不同層次的定向修飾及微陣列制備。
[0029](5)該方法可以適用于不同基底、多種生物分子微陣列的構筑，有望在生物芯片、組織工程材料和生物傳感器等領域得到廣泛的應用。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0031]實施例1
(1)將方孔400目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為250000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為3 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為1.5 mg.ml/1,金納米顆粒濃度為0.5 mg.πι1)為成膜液，在65%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(1.0 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應12小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入賴氨酸的水溶液中(0.3 mg 振蕩反應13小時,然后用水沖洗3次,用氮氣吹干,在玻璃片上形成賴氨酸的微陣列。
[0032]實施例2
(1)將圓孔400目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為300000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為5 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為2.0 mg.ml/1,金納米顆粒濃度為0.65 mg.mL-1)為成膜液，在68%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(1.2 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應13小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入半胱氨酸的水溶液中(0.6 mg 1171),振蕩反應14小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干，在玻璃片上形成半胱氨酸的微陣列。
[0033]實施例3
(1)將方孔400目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為350000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為8 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為2.5 mg.ml/1,金納米顆粒濃度為0.8 mg.mL—1)為成膜液，在71%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(1.4 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應14小時,然后用水沖洗3次,用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入牛血清白蛋白的水溶液中(0.9 mg.ml/1)，振蕩反應15小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干，在玻璃片上形成牛血清白蛋白的微陣列。
[0034]實施例4
(1)將圓孔400目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為450000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為11 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為3.0 mg ?ml/1,金納米顆粒濃度為0.95 mg.mL-1)為成膜液，在74%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(1.6 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應16小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入葡萄糖氧化酶的水溶液中(1.2 mg.ml/1)，振蕩反應17小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干，在玻璃片上形成葡萄糖氧化酶的微陣列。
[0035]實施例5
(I)將方孔200目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為500000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為14 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為3.5 mg ?ml/1,金納米顆粒濃度為1.1 mg.mL-1)為成膜液，在77%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(1.9 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應19小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入巰基乙酸的水溶液中(1.5 mg 1171),振蕩反應18小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干，在玻璃片上形成巰基乙酸的微陣列。
[0036]實施例6
(1)將圓孔200目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為150000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為17 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為4.0 mg ?ml/1,金納米顆粒濃度為1.3 mg.mL-1)為成膜液，在80%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(2.1 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應21小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入谷胱甘肽的水溶液中(1.8 mg 1171),振蕩反應19小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干，在玻璃片上形成谷胱甘肽的微陣列。
[0037]實施例7
(1)將方孔200目銅網(wǎng)置于玻璃片上，用分子量為200000的聚苯乙烯和十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為20 nm的金納米顆粒的氯仿溶液(聚苯乙烯濃度為4.5 mg ?ml/1,金納米顆粒濃度為1.5 mg.mL-1)為成膜液，在85%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在銅網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜；
(2)將載有蜂窩狀薄膜的玻璃片浸入鹽酸多巴胺水溶液(2.5 mg.mL—1，pH為8.5)中，振蕩反應24小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干；
(3)將覆蓋有蜂窩狀多孔膜的銅網(wǎng)從玻璃片上剝離下來，銅網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列；
(4)將圖案化的玻璃片浸入癌胚抗原抗體的水溶液中(2.0 mg.ml/1)，振蕩反應20小時，然后用水沖洗3次，用氮氣吹干，在玻璃片上形成癌胚抗原抗體的微陣列。
【權利要求】
1.一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用透射電鏡載網(wǎng)作為圖案化模板置于固體基底上，用聚苯乙烯和金納米顆粒的氯仿溶液為成膜液，在65%~85%的相對濕度條件下，利用水滴模板法在載網(wǎng)上制備蜂窩狀多孔薄膜； (2)將步驟(I)制得的載有蜂窩狀薄膜的固體基底浸入鹽酸多巴胺溶液中，振蕩反應12~24小時，然后用水沖洗3~5次，用氮氣吹干； (3)將步驟(2)制得的覆蓋有蜂窩狀多孔膜的載網(wǎng)從基底上剝離下來，載網(wǎng)網(wǎng)孔中間的蜂窩狀多孔薄膜留在基底上，形成圖案化的蜂窩狀多孔膜微陣列； (4)將步驟(3)制得的圖案化的基底浸入生物分子的水溶液中，振蕩反應12~20小時，然后用水沖洗3~5次，用氮氣吹干，在基底上形成生物分子的微陣列。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的透射電鏡載網(wǎng)選自下列一種:方孔100目銅網(wǎng)、方孔200目銅網(wǎng)、方孔300目銅網(wǎng)、方孔400目銅網(wǎng)、圓孔100目銅網(wǎng)、圓孔200目銅網(wǎng)、圓孔300目銅網(wǎng)、圓孔400目銅網(wǎng)、方孔100目鎳網(wǎng)、方孔200目鎳網(wǎng)、方孔300目鎳網(wǎng)、方孔400目鎳網(wǎng)、圓孔100目鎳網(wǎng)、圓孔200目鎳網(wǎng)、圓孔300目鎳網(wǎng)、圓孔400目鎳網(wǎng)。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的固體基底為硅片、玻璃片、石英片及PET (聚對苯二甲酸乙二醇酯)薄片中的一種。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述的成膜液，聚苯乙烯分子量為150000~500000，聚苯乙烯濃度為1.5~5.0 mg.mL—1,金納米顆粒為十二烷基硫醇穩(wěn)定的粒徑為3~20 nm的金納米顆粒，金納米顆粒濃度為0.5~1.5 mg.mL'
5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的鹽酸多巴胺溶液，濃度為1.0~2.5 !111171，溶劑為？!1=8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的生物分子為巰基乙酸、巰基丙酸、甘氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、癌胚抗原抗體中的一種。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種基于蜂窩狀多孔膜的生物分子微陣列的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述的生物分子的水溶液，濃度為0.05~20 mg.mL—1，溶劑為磷酸鹽緩沖溶液，PH為7.0~8.5。
【文檔編號】G01N33/574GK103454430SQ201310380671
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權日:2013年8月28日
【發(fā)明者】馬洪敏, 魏琴, 朱寶存, 高丕成, 范大偉, 吳丹, 張勇 申請人:濟南大學