一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法及測(cè)定藥物蛋白結(jié)合率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，采用溶劑棒中空纖維液相微萃取技術(shù)，通過利用反萃過程中濃度曲線法來(lái)測(cè)得溶劑棒中空纖維液相微萃取的時(shí)間常數(shù)，進(jìn)而通過測(cè)定預(yù)平衡溶劑棒中空纖維液相微萃取所獲得的分析物的預(yù)平衡濃度來(lái)計(jì)算實(shí)際樣品中游離分析物的濃度。在含有蛋白的生物樣品中，根據(jù)游離藥物濃度可以進(jìn)而計(jì)算出藥物蛋白結(jié)合率。本方法樣品前處理裝置簡(jiǎn)單、操作方便，無(wú)須使用氘代物，不改變生物樣品的性質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定生物樣品中游離分析物的含量。
【專利說明】一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法及測(cè)定藥物蛋白結(jié)合率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)分析方法，特別涉及一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法及測(cè)定藥物蛋白結(jié)合率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)游離型藥物受到越來(lái)越多的關(guān)注和重視，并已成為藥動(dòng)學(xué)和治療藥物監(jiān)測(cè)的研究熱點(diǎn)之一。藥物進(jìn)入機(jī)體血液后有兩種存在形式。一種是結(jié)合型藥物；弱酸性藥物與白蛋白結(jié)合，弱堿性藥物與1-酸性糖蛋白(AGP)結(jié)合。另一種為游離型藥物。血漿中的游離型藥物是產(chǎn)生藥理效應(yīng)的部分，游離藥物濃度與受體部位藥物平衡，因而其與藥效或藥物不良反應(yīng)密切相關(guān)，也只有游離型藥物才能被機(jī)體轉(zhuǎn)化和排泄。
[0003]中空纖維液相微萃取對(duì)復(fù)雜樣品中微量組分的提取、分離、富集和濃縮起重要作用。中空纖維具有能使藥物分子通過，生物大分子或結(jié)合藥物的生物大分子不能通過的特殊結(jié)構(gòu)。利用中空纖維的結(jié)構(gòu)特性測(cè)定游離藥物濃度及藥物蛋白結(jié)合率的研究已有報(bào)道，上述所有工作都是采用平衡萃取法。而相對(duì)較長(zhǎng)的平衡萃取時(shí)間正是中空纖維液相微萃取最主要的方法缺陷。對(duì)于藥物分析而言，過長(zhǎng)的萃取時(shí)間會(huì)影響游離藥物和結(jié)合藥物的平衡，進(jìn)而會(huì)在生物樣品的分析中產(chǎn)生一些假象而影響結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。此外，過長(zhǎng)的分析時(shí)間可能導(dǎo)致萃取溶劑的損失；而生物樣品如血漿等也會(huì)由于酶的代謝等因素而導(dǎo)致基質(zhì)的改變。
[0004]對(duì)樣品進(jìn)行振蕩或攪拌，對(duì)血漿等粘度高的樣品進(jìn)行稀釋，在萃取相上施加電壓等均可以縮短中空纖維液相微萃取的萃取時(shí)間。這些處理方法一方面對(duì)萃取速率的影響有限，另一方面增加了儀器的難度和操作參數(shù)。此外，這些方法都是為了提高傳質(zhì)速率，但對(duì)于分配系數(shù)低的分析物，傳質(zhì)并不是中空纖維液相微萃取的限速步驟。
[0005]微萃取中的動(dòng)力學(xué)校正最早由Chen等在固相微萃取中提出，是一種利用內(nèi)標(biāo)物脫附來(lái)校正分析物吸附的微萃取定量技術(shù)，在環(huán)境分析、動(dòng)植物活體檢測(cè)和藥物分析等方面有著廣闊的應(yīng)用前景?；陬A(yù)平衡的動(dòng)力學(xué)校正對(duì)如下樣品的分析具有突出的優(yōu)點(diǎn):1.平衡時(shí)間非常長(zhǎng)的樣品；2.樣品濃度過聞；3.基質(zhì)組成不穩(wěn)定，如生物樣品等。Ouyang等曾經(jīng)把動(dòng)力學(xué)校正的概念引進(jìn)到液相微萃取中。上述建立的動(dòng)力學(xué)校正方法都需要氘代物作為反萃過程的內(nèi)標(biāo)物。氘代物價(jià)格昂貴，分析儀器需要質(zhì)譜這類高分離效率的儀器(能夠分離分析待測(cè)分析物及其氘代物)。這些因素限制了預(yù)平衡動(dòng)力學(xué)校正方法在微萃取技術(shù)中的應(yīng)用，也限制了預(yù)平衡動(dòng)力學(xué)校正中空纖維液相微萃取方法在游離藥物快速分析方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，以克服現(xiàn)有游離分析物樣品前處理的難點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法。
[0007]本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題在于提供一種測(cè)定藥物蛋白結(jié)合率的方法，以提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例提出了一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，是利用預(yù)平衡溶劑棒中空纖維液相微萃取技術(shù)，包括以下步驟:
步驟一:制作溶劑棒中空纖維膜微萃取裝置；
步驟二:以不同濃度分析物標(biāo)準(zhǔn)品的利用步驟一的萃取裝置進(jìn)行反萃過程，通過濃度曲線法獲得溶劑棒中空纖維液相微萃取的時(shí)間常數(shù)；所述濃度曲線法使用公式(I):
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，是利用預(yù)平衡溶劑棒中空纖維液相微萃取技術(shù)，包括以下步驟: 步驟一:制作溶劑棒中空纖維膜微萃取裝置； 步驟二:以不同濃度分析物標(biāo)準(zhǔn)品的利用步驟一的萃取裝置進(jìn)行反萃過程，通過濃度曲線法獲得溶劑棒中空纖維液相微萃取的時(shí)間常數(shù)；所述濃度曲線法使用公式(I):
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟三中游離分析物濃度計(jì)算公式如下公式(2):
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟一是把聚偏氟乙烯中空纖維膜剪成合適的小段，清洗后晾干，并封閉中空纖維膜的一端口。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟二中，將含有分析物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為qO且體積為Ve的萃取劑注入溶劑棒并將溶劑棒兩端封口 ；再將溶劑棒完全浸沒于體積為Vs的空白生物樣品溶液；振蕩萃取一段時(shí)間t后；取出溶劑棒，靜置后剪開溶劑棒的一端，抽取萃取溶劑進(jìn)行儀器分析獲得Q值；根據(jù)公式(I )，以Q為縱坐標(biāo)，qO為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，曲線的斜率即:
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟二進(jìn)一步包括以下步驟: (A)把50-80μ L的含有不同濃度分析物標(biāo)準(zhǔn)品的萃取溶劑加到一端已封閉的溶劑棒中空纖維膜的內(nèi)腔中，靜置； (B)封閉溶劑棒的另一端； (C)把所述中空纖維膜放到樣品瓶中，樣品瓶中加有1.8-3.8 mL的空白生物樣品溶液，渦旋振蕩，進(jìn)行萃取，在萃取過程中，分析物標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)反萃到樣品溶液中，萃取時(shí)間t根據(jù)濃度曲線的相關(guān)系數(shù)和儀器分析的靈敏度來(lái)決定；(D)萃取完成后，取出中空纖維膜溶劑棒，取纖維膜內(nèi)腔中的萃取溶劑25-40 μ L，注入儀器進(jìn)行含量測(cè)定，獲取公式(I)中的Q值，Q是反萃取時(shí)間為t時(shí)目標(biāo)分析物在溶劑棒中的剩余量，根據(jù)公式(I)進(jìn)行線性回歸并計(jì)算出時(shí)間常數(shù)a。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟三進(jìn)一步包括以下步驟: (A)把50-80μ L的空白萃取溶劑加到一端已封閉的溶劑棒中空纖維膜的內(nèi)腔中，靜置； (B)封閉溶劑棒的另一端； (C)把上述中空纖維膜放到樣品瓶中，樣品瓶中加有1.8-3.8 ml的含有待測(cè)分析物的生物樣品，渦旋振蕩，進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間根據(jù)儀器分析的靈敏度來(lái)決定； (D)萃取完成后，取出中空纖維膜溶劑棒，取纖維膜內(nèi)腔中的萃取溶劑25-40μ L進(jìn)行含量測(cè)定，獲取公式(2)中的η值，根據(jù)公式(2)，即可以求出實(shí)際生物樣品中游離分析物的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述萃取溶劑是選自正辛醇、對(duì)二甲苯、正己醚中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述步驟二或步驟三中所述預(yù)平衡萃取的分析物或分析物標(biāo)準(zhǔn)品的量是由色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定；Kes是指分析物在萃取溶劑和樣品溶液間的分配系數(shù)，查閱文獻(xiàn)或搖瓶法測(cè)定獲得。`
9.一種測(cè)定測(cè)定藥物蛋白結(jié)合率的方法，包括根據(jù)下述公式(3)計(jì)算藥物血漿蛋白結(jié)合率: PB(%) =X 100 (3) 其中，ΡΒ(%)是藥物蛋白結(jié)合率；Ct是加入血漿樣品中的藥物總濃度；Cf是樣品溶液中游離藥物的濃度，是按權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法所計(jì)算出來(lái)的游離分析物的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的測(cè)定生物樣品中游離分析物的方法，其特征在于:所述游離物是選自鹽酸利多卡因、鹽酸布比卡因或鹽酸丁卡因中的至少一種；所述生物樣品溶液為磷酸鹽緩沖溶液或牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液。
【文檔編號(hào)】G01N30/00GK103512961SQ201310414492
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】崔淑芬, 張英雪, 陳敏, 侯金星 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院