右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法”，包括固相萃取及液相檢測(cè)兩個(gè)步驟，在液相分析前對(duì)注射液進(jìn)行了預(yù)處理，采用Waters?Oasis?HLB固相萃取小柱對(duì)糠醛進(jìn)行富集吸附，并將右旋糖酐40去除，收集到液相樣品；同時(shí)液相檢測(cè)中采用梯度洗脫的方式，流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0，延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。本發(fā)明方法靈敏度高，能同時(shí)檢測(cè)出右旋糖酐40注射液中的5-羥甲基糠醛和2-糠醛，注射液中2-糠醛的最低檢出濃度為0.00015μg/mL；重復(fù)性好，一批6份注射液測(cè)定結(jié)果，其含量平均值為0.0889μg/mL，RSD為0.6%；精密度RSD為0.4%，加樣回收率平均為93.1%，RSD為0.9%。
【專利說(shuō)明】右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物微量雜質(zhì)成分的HPLC的檢測(cè)方法，特別是涉及右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]右旋糖酐系蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌L.M-1226號(hào)菌(Leuconostocmesenteroides)發(fā)酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，經(jīng)處理精制而得，其分子式為(C6H1(l05)n。右旋糖酐按照分子量不同分為聞分子(10?20萬(wàn))、中分子量(6萬(wàn)?8萬(wàn))、低分子量(2?4萬(wàn))和小分子量(I?2萬(wàn))右旋糖酐。右旋糖酐40的重均分子量(Mw)為32000?42000，屬于低分子右旋糖酐。國(guó)內(nèi)于1952年研制成功，1957年開始應(yīng)用于臨床。右旋糖酐40主要用于增加血漿容量，維持血壓，以抗休克為主。廣泛應(yīng)用于各種休克、血栓性疾病、肢體再植和血管外科手術(shù)等。右旋糖酐能提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外的水分而補(bǔ)充血容量，維持血壓；使已經(jīng)聚集的紅細(xì)胞和血小板解聚，降低血液黏滯性，從而改善微循環(huán)，防止休克后期的血管內(nèi)凝血；抑制凝血因子II的激活，使凝血因子I和VDI活性降低以及其抗血小板作用均可阻止血栓形成。此外，還具滲透性利尿作用(黃勛，陳槐卿，王玲等.右旋糖酐40，70對(duì)紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，1998，15(3):240 ?242.)。
[0003]可能是由于蔗糖經(jīng)腸膜狀明串珠菌L.-M-1226號(hào)菌發(fā)酵后生成的右旋糖酐分子量較大，大分子右旋糖酐作為血漿代用品安全性較差，須用稀酸水解以獲得較低分子量的藥用右旋糖酐，但是水解的同時(shí)，也會(huì)使部分右旋糖酐分解成低聚糖，經(jīng)異麥芽三糖、異麥芽二糖，生成葡萄糖(李艷，陳學(xué)武，牟德華.右旋糖酐的生產(chǎn)及應(yīng)用.山西食品工業(yè)[J]，1998.3:36-37.)。己糖(葡萄糖、果糖等單糖)與氨基酸在高溫、酸性條件或微生物的作用下脫水發(fā)生美拉德(Maillard)反應(yīng)生成5-羥甲基糠醛及糠醛(楊朝霞，李梅，董建軍等.高效液相色譜同時(shí)測(cè)定啤酒中的5-羥甲基糠醛和糠醛[J].釀酒科技，2006，9:88-89.)?！吨袊?guó)藥典》2010年版二部中只采用紫外法對(duì)右旋糖酐40葡萄糖注射液中的5-羥甲基糠醛(以下簡(jiǎn)稱5-HMT)進(jìn)行了限度檢查，而對(duì)右旋糖酐40氯化鈉注射液未做控制?！癏PLC法檢查右旋糖酐40氯化鈉注射液中5-羥甲基糠醛的限量”，建立了用HPLC法測(cè)定右旋糖酐40氯化鈉注射液中5-HMT含量的方法，其結(jié)果在各批右旋糖酐40氯化鈉注射液中均檢測(cè)出了 5-HMT，因此有必要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。但是在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中均沒(méi)有報(bào)導(dǎo)右旋糖酐40氯化鈉注射液或葡萄糖注射液中有過(guò)檢測(cè)出糠醛的報(bào)導(dǎo)。
[0004]糠醛為有機(jī)化合物，是呋喃2位上的氫原子被醛基取代的衍生物，分子式C5H402，又稱2-呋喃甲醛?？啡僦械榷拘灶愇镔|(zhì)，其蒸氣具有強(qiáng)烈的刺激性，并有麻醉作用。動(dòng)物吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收均可引起急性中毒，表現(xiàn)有呼吸道刺激、肺水腫、肝損害、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害、呼吸中樞麻痹，以致死亡。其急性毒性=LD5tl為65mg/kg(大鼠經(jīng)口)，最小致死劑量500mg/kg (人經(jīng)口)，亞急性和慢性毒性:人吸入7.4?52.7mg/m3X3個(gè)月，發(fā)生粘膜刺激、結(jié)膜炎、流淚、頭痛。此外糠醛是染色體斷裂劑，具有誘發(fā)堿基對(duì)置換的突變作用，具有誘發(fā)精子畸形和精母細(xì)胞姊妹染色單體交換的遺傳毒性作用，具有誘發(fā)腦室擴(kuò)張的致畸作用等較大的潛在遺傳及生殖毒性(牛鳳云，王金山，王建剛，魏艷萍.糠醛對(duì)大鼠致畸效應(yīng)的研究，1992，6 (4):290;陳衛(wèi)平，王金山，宋霖.糠醛誘發(fā)小鼠精子畸形的實(shí)驗(yàn)研究.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1994,8(2): 129)。因此，美國(guó)政府工業(yè)衛(wèi)生專家學(xué)會(huì)(ACGIH)在1981年即通過(guò)了 2ppm的閾限值(TLV-TWA)的規(guī)定。
[0005]從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)來(lái)看，對(duì)于右旋糖酐40氯化鈉注射液或葡萄糖注射液中糠醛的存在是有可能的，即使其含量非常的低，為保證用藥安全，對(duì)于糠醛檢測(cè)及限量是必須的。
[0006]按照“HPLC法檢查右旋糖酐40氯化鈉注射液中5_羥甲基糠醛的限量”建立的HPLC法測(cè)定右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛，由于2-糠醛與5-羥甲基糠醛的結(jié)構(gòu)有差異，而且2-糠醛的含量很低，上述檢測(cè)方法要同時(shí)檢測(cè)出兩種雜質(zhì)難度較大。前期研究結(jié)果表明，采用液相色譜進(jìn)行測(cè)定時(shí)，液相色譜對(duì)糠醛的最低檢出限為0.003μ g/mL，即注射液中2-糠醛可檢出的最低濃度為0.003 μ g/mL，糠醛在其氯化鈉注射液中含量較低，約為0.008?0.17μ g/mL，最低含量接近于最低檢出濃度，不便于準(zhǔn)確檢測(cè)。此外，由于該樣品中右旋糖酐40的濃度較高，采用文獻(xiàn)中流動(dòng)相等度洗脫方式進(jìn)行洗脫，將會(huì)使右旋糖酐40殘留在色譜柱柱頭，影響色譜柱的壽命。因此采用檢測(cè)5-羥甲基糠醛的條件及方法，還不能檢測(cè)出右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的存在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)上述領(lǐng)域中的不足，本發(fā)明提供一種右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法，通過(guò)優(yōu)化的液相檢測(cè)條件，檢測(cè)出右旋糖酐40氯化鈉注射液中確有2-糠醛存在，該HPLC檢測(cè)方法重復(fù)性好，且采用梯度洗脫方法，右旋糖酐40的殘留少，對(duì)色譜柱的使用壽命影響較小。
[0008]一種右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法，包括固相萃取及液相檢測(cè)兩個(gè)步驟，其特征在于:所述固相萃取為采用經(jīng)活化后的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化鈉注射液上柱，用水洗滌，去除右旋糖酐及氯化鈉，再加甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，真空離心揮干，用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0) (50:50)溶解，0.45 μ m微孔濾膜濾過(guò)，作為液相檢測(cè)的供試品溶液；所述液相檢測(cè)中的洗脫程序采用梯度洗脫，所述流動(dòng)相A:甲醇，流動(dòng)相B:0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0)，O?3.0Omin采用100%的水相，迅速去除樣品中殘留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin采用A-B體積比為30:70的混合流動(dòng)相，18.10?21.0Omin采用A-B體積比為50:50的混合流動(dòng)相，21.10?28.0Omin采用100%的水相平衡色譜柱。
[0009]所述固相萃取小柱為Waters Oasis HLB固相萃取小柱。
[0010]所述固相萃取中，用水洗滌至少三次。
[0011 ] 所述液相檢測(cè)中的色譜柱為MACHEREY-NAGEL C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m)，檢測(cè)波長(zhǎng):275nm。
[0012]所述洗脫過(guò)程中，柱溫為40°C，流動(dòng)相流速:1.0mL/min。
[0013]由于右旋糖酐40氯化鈉注射液中糠醛濃度太低，不便于檢測(cè)，因此本發(fā)明在進(jìn)行液相檢測(cè)前，進(jìn)行了預(yù)處理，使用固相萃取法將注射液中氯化鈉和右旋糖酐去除，同時(shí)將糠醛富集吸附，提高其檢測(cè)濃度。右旋糖酐40氯化鈉注射液中右旋糖酐濃度為6%，氯化鈉濃度為0.9%，使用固相萃取小柱萃取過(guò)程中，需用水洗脫3次，每次3mL，用以去除右旋糖酐及氯化鈉，然后用甲醇洗脫糠醛，收集甲醇洗脫液，揮干甲醇，加流動(dòng)相甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)PH為3.0) (50:50)溶解，用于液相分析。由于右旋糖酐40易于在色譜柱的柱頭殘留，從而影響色譜柱的使用壽命，本發(fā)明采用了梯度洗脫的方式，O?3.0Omin采用100%的水相，柱溫40°C，迅速去除樣品中殘留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0) (30:70)對(duì)樣品中的糠醛進(jìn)行分析測(cè)定；18.10?21.0Omin采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0) (50:50)，增加流動(dòng)相中有機(jī)相的比例，洗脫樣品中的極性較弱的雜質(zhì)；21.10?28.0Omin采用100%的水相平衡色譜柱。
[0014]本發(fā)明方法在采用液相分析前對(duì)樣品溶液進(jìn)行了預(yù)處理,采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱對(duì)糠醛進(jìn)行富集吸附，并將右旋糖酐40去除，收集到液相樣品溶液；同時(shí)液相檢測(cè)中采用梯度洗脫的方式，去除殘留，延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。采用本發(fā)明的方法，能同時(shí)檢測(cè)出右旋糖酐40注射液中的5-羥甲基糠醛和2-糠醛，對(duì)于該注射劑安全性評(píng)價(jià)有重要依據(jù)。本發(fā)明方法靈敏度高，注射液中2-糠醛的最低檢出量為0.00015μ g/mL，特別適用于注射液中2-糠醛含量較低樣品的檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確；重復(fù)性好，一批6份注射液測(cè)定結(jié)果，其含量平均值為0.0889 μ g/mL, RSD為0.6% ;精密度RSD為0.4%，加樣回收率平均為 93.1%，RSD 為 0.9%ο
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1空白色譜圖，
[0016]圖22-糠醛對(duì)照品色譜圖，
[0017]其中峰I為2-糠醛，
[0018]圖3右旋糖酐40氯化鈉注射液色譜圖，
[0019]其中峰I為5-羥甲基糠醛，峰2為2-糠醛
[0020]圖4右旋糖酐40氯化鈉注射液色譜圖，
[0021]其中峰I為5-羥甲基糠醛，峰2為2-糠醛。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0023]實(shí)施例1
[0024]1.儀器與試藥
[0025]儀器:Waters Alliance HT系統(tǒng)；檢測(cè)器:Waters2487紫外檢測(cè)器。
[0026]固相萃取柱:0asis HLB, 60mg, 3cc,使用時(shí)依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。
[0027]試藥:糠醛為分析純，甲醇為色譜純，水為高純水。
[0028]2.方法與結(jié)果
[0029]2.1色譜條件:Waters Alliance HT系統(tǒng)；檢測(cè)器:Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱:MACHEREY-NAGEL C18 (250 X 4.6mm, 5 μ m);洗脫程序采用梯度洗脫，流動(dòng)相A:甲醇，流動(dòng)相B:0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0);梯度洗脫程序見(jiàn)表I。柱溫:40 0C ;流速:1.0mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng):275nm ;進(jìn)樣量 20 μ L。
[0030]表1注射液梯度洗脫程序
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種右旋糖酐40氯化鈉注射液中2-糠醛的測(cè)定方法，包括固相萃取及液相檢測(cè)兩個(gè)步驟，其特征在于:所述固相萃取為采用經(jīng)活化后的固相萃取小柱，量取右旋糖酐40氯化鈉注射液上柱，用水洗滌，去除右旋糖酐及氯化鈉，再加甲醇洗脫，收集洗脫液，揮干甲醇，用混合溶劑溶解，0.45 μ m微孔濾膜濾過(guò)，作為液相檢測(cè)的制劑供試品溶液；所述液相檢測(cè)中的洗脫程序采用梯度洗脫，所述流動(dòng)相A:甲醇，流動(dòng)相B:0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0，0?3.0Omin采用100%的水相，迅速去除樣品中殘留的右旋糖酐；3.10?18.0Omin采用A-B體積比為30:70的混合流動(dòng)相，18.10?21.0Omin采用A-B體積比為50:50的混合流動(dòng)相，21.10?28.0Omin采用100%的水相平衡色譜柱，所述混合溶劑為甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液，用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0，甲醇與0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液的體積比為50:50。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測(cè)定方法，所述固相萃取小柱為WatersOasis HLB固相萃取小柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，所述固相萃取中，用水洗滌至少三次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，所述液相檢測(cè)中的色譜柱為MACHEREY-NAGELC18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng):275nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，所述洗脫過(guò)程中，柱溫為40°C，流動(dòng)相流速:.1.0mT,/mi n.
【文檔編號(hào)】G01N30/34GK103575835SQ201310545294
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】劉海靜, 王嫦鶴, 王發(fā), 張秉華, 耿慶光, 劉雪峰, 由亞寧, 馬鵬飛 申請(qǐng)人:陜西省食品藥品檢驗(yàn)所