乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒以及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，包括試劑M、試劑R1、試劑R2以及校準(zhǔn)品，試劑M中組分包括親和素包被磁微粒，親和素包被磁微粒經(jīng)診斷試劑防腐劑處理；試劑R1中的組分包括生物素化Anti-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；試劑R2中的組分包括吖啶酯標(biāo)記的Anti-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；對(duì)照組包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。本發(fā)明涉及的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，制備簡(jiǎn)單，使用方便，易于儲(chǔ)存，可用于定量測(cè)定人體血清（血漿）中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的濃度，HBsAg檢測(cè)可用于輔助診斷HBV感染和預(yù)防HBV通過(guò)血制品傳播，也可用于急性、慢性乙肝患者的病程監(jiān)測(cè)。
【專利說(shuō)明】乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒以及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及乙型肝炎診斷試劑盒，具有設(shè)計(jì)基于雙抗原化學(xué)發(fā)光原理的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病。HBV可以通過(guò)血液和體液直接傳播，常見的傳播方式包括輸血、注射、傷口接觸、母嬰傳播等；常見的臨床癥狀有不適、發(fā)熱、黃疸、無(wú)癥狀肝炎、暴發(fā)性肝炎以及慢性肝炎等，慢性感染易發(fā)展成為肝癌，因此，檢測(cè)乙型肝炎的工作至關(guān)重要。
[0003]目前，常用的檢測(cè)方法是免疫學(xué)檢測(cè)，免疫學(xué)檢測(cè)時(shí)基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)被檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。免疫學(xué)檢測(cè)經(jīng)理了放射免疫檢測(cè)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)以及光生物學(xué)標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)三個(gè)階段，使免疫學(xué)檢測(cè)向著敏感性、準(zhǔn)確性以及操作簡(jiǎn)捷性的方向發(fā)展。
[0004]化學(xué)發(fā)光免疫分析是近十年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測(cè)原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號(hào)放大系統(tǒng)并借助其發(fā)光強(qiáng)度直接測(cè)定免疫結(jié)合。該方法靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，是免疫學(xué)檢測(cè)重要的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種靈敏度高、誤差小、安全快速檢測(cè)的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒及檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，包括試劑M、試劑R1、試劑R2以及校準(zhǔn)品，所述試劑M中組分包括親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒經(jīng)診斷試劑防腐劑處理；所述試劑Rl中的組分包括生物素化Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述試劑R2中的組分包括吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述對(duì)照組包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述親和素包被磁微粒的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，試劑Rl和試劑R2中所述磷酸緩沖液的濃度均為0.01M，pH值為7.4。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300 防腐劑。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括,所述試劑Rl的量為6ml,所述試劑R2的量為12ml,所述試劑M的量為3ml。
[0011]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品I和校準(zhǔn)品2兩組，所述校準(zhǔn)品I的量為0.5ml，HBsAg濃度為0.1 IU/ml，所述校準(zhǔn)品2的量為0.5ml, HBsAg濃度為30IU/ml。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，一種使用該乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下幾步:
[0013](I)在將待測(cè)樣品和含有生物素化Ant1-HBs的試劑Rl進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗原-抗體復(fù)合體的反應(yīng)液I ;
[0014](2)在反應(yīng)液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M,反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相，得到了反應(yīng)液2 ；
[0015](3)反應(yīng)液2置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)其中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去，得到反應(yīng)液3 ；
[0016](4)在反應(yīng)液3中加入含有吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs的試劑R2，吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs與磁微粒上的HBsAg復(fù)合物反應(yīng)，得到反應(yīng)液4 ；
[0017](5)將反應(yīng)液4置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)中磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎表面抗原濃度成正比。
[0018]本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例中，進(jìn)一步包括，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過(guò)氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0019]本發(fā)明的解決了現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，具有以下有益效果:
[0020]1.本發(fā)明涉及的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，制備簡(jiǎn)單，使用方便，易于儲(chǔ)存，可用于定量測(cè)定人體血清(血漿)中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的濃度，HBsAg檢測(cè)可用于輔助診斷HBV感染和預(yù)防HBV通過(guò)血制品傳播，也可用于急性、慢性乙肝患者的病程監(jiān)測(cè)。使用該試劑盒來(lái)的檢測(cè)方法是基于雙抗原化學(xué)發(fā)光原理，該方法靈敏度高、誤差小、安全快速。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 為了使本【技術(shù)領(lǐng)域】的人員更好地理解本發(fā)明，并使本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0022]本發(fā)明一種乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，組要組成成分如下:
[0023]試劑Rl:每瓶6ml，內(nèi)含有生物素化Ant1-HBs，0.0lMpH值7.4磷酸鹽緩沖液，
0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；
[0024]試劑R2:每瓶12ml，內(nèi)含有吖啶酯標(biāo)記的Anti_HBs，0.0lMpH值7.4磷酸鹽緩沖液,0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；其中，吖唳酯標(biāo)記的Ant1-HBs以吖唳酯通過(guò)偶聯(lián)劑偶聯(lián)Ant1-HBs，偶聯(lián)劑可以選擇二甲基亞胺或戊二醛或者其他業(yè)內(nèi)常用的偶聯(lián)劑；
[0025]試劑M:每瓶3.0ml,內(nèi)含親和素包被的磁微粒,經(jīng)0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑防腐處理；其中，親和素包被磁微粒的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
[0026]校準(zhǔn)品(Cal):本發(fā)明實(shí)施例中的校準(zhǔn)品分為I和2兩組，均內(nèi)含人源性的乙肝表面抗原(HBsAg),新生牛血清,0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；校準(zhǔn)品濃度如下:Call的近似濃度為0.10IU/ml, Cal2的近似濃度為30.00IU/ml。
[0027]本發(fā)明的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒用于測(cè)定人血清(血漿)中乙型肝炎表面抗原的濃度，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒顆粒的外殼成分，是乙肝病毒HBV感染的首選免疫學(xué)標(biāo)志物。HBsAg檢測(cè)可用于輔助診斷HBV感染和預(yù)防HBV通過(guò)血制品傳播，也可用于急、慢性乙肝患者的病程監(jiān)測(cè)。
[0028]本發(fā)明使用該試劑盒的檢測(cè)原理是采用雙抗原化學(xué)發(fā)光原理，步驟如下:
[0029]第一步反應(yīng):將樣本和生物素化乙肝病毒表面抗體(Ant1-HBs)(試劑Rl)進(jìn)行反應(yīng)，如果標(biāo)本中含有HBsAg，將形成抗原-抗體復(fù)合體。
[0030]第二步反應(yīng):加入親和素包被的微粒(試劑M)，復(fù)合體在生物素和親和素相互作用下形成固相。
[0031]第三步反應(yīng):將反應(yīng)液置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去。
[0032]第四步反應(yīng):加入卩丫唳酯標(biāo)記的Ant1-HBs (試劑R2),與磁顆粒上的HBsAg復(fù)合物反應(yīng)。
[0033]將反應(yīng)液置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)HBsAg濃度成正比。樣本內(nèi)分析物的量由所儲(chǔ)存的多點(diǎn)校準(zhǔn)曲線來(lái)確定。
[0034]實(shí)施例1
[0035]本發(fā)明具體實(shí)施例中的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0036]首先，要獲得待測(cè)樣品，即血清，按照常規(guī)應(yīng)用技術(shù)采集全血標(biāo)本，放置半小時(shí)以上使凝集，在3000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘以上，使血清分離完全，血清中不含細(xì)胞成分；血漿用肝素鈉、EDTA-K3、枸櫞酸鈉或氟化鈉/草酸鉀抗凝。
[0037]然后，對(duì)該待測(cè)樣品使用乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè):
[0038](I)在將待測(cè)樣品和含有生物素化Ant1-HBs的試劑Rl進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗原-抗體復(fù)合體的反應(yīng)液I ;
[0039](2)在反應(yīng)液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M,反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相，得到了反應(yīng)液2 ；
[0040](3)反應(yīng)液2置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)其中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去，得到反應(yīng)液3 ；
[0041](4)在反應(yīng)液3中加入含有吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs的試劑R2，吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs與磁微粒上的HBsAg復(fù)合物反應(yīng)，得到反應(yīng)液4 ；
[0042](5)將反應(yīng)液4置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)中磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎表面抗原濃度成正比。
[0043]其中，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過(guò)氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0044]在本發(fā)明的實(shí)施例中如果待測(cè)樣品是在24小時(shí)之內(nèi)使用，可于2_8°C下保存，如果需要超過(guò)24小時(shí)的長(zhǎng)期存放應(yīng)該保存在_20°C以下，并且避免樣品反復(fù)凍融。
[0045]本發(fā)明實(shí)施例中的化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀是EVERESYSA1800 I類，在檢測(cè)時(shí)，將試劑裝載到化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀試劑倉(cāng)上，并在軟件操作系統(tǒng)上確定裝載就試劑的名稱；試劑在裝載前，應(yīng)輕輕混勻，但禁止上下顛倒已打開的試劑；將檢測(cè)樣本裝載在樣本倉(cāng)中，并在軟件操作系統(tǒng)上確定樣本檢測(cè)項(xiàng)目；將反應(yīng)杯裝載滿，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況裝載相應(yīng)數(shù)量反應(yīng)杯；每次檢測(cè)樣本量需要50ul，考慮檢測(cè)系統(tǒng)死體積因素，應(yīng)確保樣本量在200ul以上，同時(shí)應(yīng)考慮樣本容器的死腔因素。
[0046]結(jié)果計(jì)算
[0047]測(cè)定儀自動(dòng)計(jì)算得出每份標(biāo)本的測(cè)定濃度(單位為IU/mL)。標(biāo)本的HBsAg含量< 0.lIU/mL判斷為HBsAg無(wú)反應(yīng)性；標(biāo)本的HBsAg含量≤0.lIU/mL判斷為HBsAg反應(yīng)性。
[0048]最低檢測(cè)限
[0049]使用上述方法檢測(cè)，測(cè)得試劑的靈敏度< 0.03IU/mL ;檢測(cè)3種亞型國(guó)家系列靈敏度參考品，符合標(biāo)準(zhǔn)；檢測(cè)3份國(guó)家陽(yáng)性參考品，符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0050]檢測(cè)范圍
[0051]本檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為0.1~150IU/mL。
[0052]精密度
[0053]精密度依照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS) EP5-A方案制定，對(duì)5份HBsAg質(zhì)控品(其中三份血清，二份為校準(zhǔn)品)，采用同一批次試劑，每天不同時(shí)間各檢測(cè)一次，每次雙孔，共進(jìn)行20天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。
[0054]表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，包括試劑Μ、試劑R1、試劑R2以及校準(zhǔn)品，所述試劑M中組分包括親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒經(jīng)診斷試劑防腐劑處理；所述試劑Rl中的組分包括生物素化Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述試劑R2中的組分包括吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐齊IJ;所述對(duì)照組包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述親和素包被磁微粒的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內(nèi)核表面包裹活性基團(tuán)的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，試劑Rl和試劑R2中所述磷酸緩沖液的濃度均為0.0lM, pH值為7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300防腐劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl的量為6ml,所述試劑R2的量為12ml,所述試劑M的量為3ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品I和校準(zhǔn)品2兩組，所述校準(zhǔn)品I的量為0.5ml，HBsAg濃度為0.1 IU/ml，所述校準(zhǔn)品2的量為0.5ml, HBsAg濃度為30 IU/ml。
7.一種使用權(quán)利要求1-6所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下幾步: (1)在將待測(cè)樣品和含有生物素化Ant1-HBs的試劑Rl進(jìn)行反應(yīng)，形成含有抗原-抗體復(fù)合體的反應(yīng)液I ; (2)在反應(yīng)液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M，反應(yīng)液I中的復(fù)合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相，得到了反應(yīng)液2 ； (3)反應(yīng)液2置于一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)，檢測(cè)其中的磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去，得到反應(yīng)液3; (4)在反應(yīng)液3中加入含有吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs的試劑R2，吖啶酯標(biāo)記的Ant1-HBs與磁微粒上的HBsAg復(fù)合物反應(yīng)，得到反應(yīng)液4 ； (5)將反應(yīng)液4置于化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上進(jìn)行檢測(cè)，在磁場(chǎng)中磁微粒將被吸附，通過(guò)洗滌液洗滌，將未結(jié)合物沖洗除去；然后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I及化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2，檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光光子強(qiáng)度；產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣本內(nèi)乙型肝炎表面抗原濃度成正比。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙型肝炎表面抗原測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液I中含有過(guò)氧化氫，所述化學(xué)發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103630531SQ201310652173
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】陳秀發(fā), 胡慶鋒, 常立峻, 徐海偉, 李勇 申請(qǐng)人:蘇州長(zhǎng)光華醫(yī)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司