用于進行結(jié)合測定的設備和方法【專利摘要】本文公開了用于進行結(jié)合測定的組合物、方法、設備和試劑盒。具體而言，本發(fā)明提供了用于插入到多孔裝置的孔中的插入物、插入物陣列和包含它們的試劑盒。本文還提供了使用本文公開的各種設備、裝置和試劑盒進行結(jié)合測定的方法?！緦＠f明】用于進行結(jié)合測定的設備和方法奪叉引用[0001]本申請要求提交于2012年5月25日的美國臨時申請第61/652,102號的權(quán)益，該申請通過引用并入于此?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]結(jié)合測定在生物和臨床應用中得到廣泛使用，用于檢測和測量樣品中存在的分析物的量。結(jié)合測定一般要求使用與感興趣的分析物結(jié)合的結(jié)合配偶體和與該結(jié)合配偶體結(jié)合的檢測試劑。在直接結(jié)合測定中，結(jié)合配偶體偶聯(lián)至檢測試劑，而間接結(jié)合測定涉及添加與結(jié)合配偶體相互作用的單獨的檢測試劑。一種廣泛使用的結(jié)合測定形式為連接免疫吸附測定（LISA)，其中結(jié)合劑固定在固相上。通常，免疫吸附測定涉及通過將感興趣的分析物與結(jié)合劑相結(jié)合而將該分析物捕捉到固相上。對能夠與分析物結(jié)合的檢測試劑的添加繼而導致檢測試劑到固相上的后續(xù)捕捉。通常在指示出感興趣的分析物的存在或量的試劑的檢測之前，在一系列一個或多個洗滌步驟中移除未結(jié)合的檢測試劑。試劑的檢測可以利用酶促反應（ELISA)或熒光檢測（FLISA)。[0003]ELISA和FLISA通常在用于高通量篩選用途的多孔板（諸如96孔反應板）中進行。使用多孔板和裝置使得能夠進行對多個樣品的并行處理，以供對一種或多種分析物的分析。例如，通常利用ELISA和FLISA來進行雜交瘤細胞系的抗體篩選。這些篩選測定一般涉及雜交瘤細胞培養(yǎng)基樣品在用感興趣的抗原包被的96孔板中的溫育。在溫育之后，必須在感興趣的抗體的檢測和陽性雜交瘤細胞系的鑒定之前進行涉及與二級和/或三級檢測試劑的另外溫育和洗滌步驟的多步過程。然而，這些多步測定是費時的，這限制了檢測通量。減少這些檢測所需的步驟并從而減少所需時間量的裝置和方法將會大大提高檢測通量和效率。【
發(fā)明內(nèi)容】[0004]因此，本發(fā)明提供將會允許具有更高通量和效率的更強健的結(jié)合測定的設備和方法。本文提供的是提供此類優(yōu)點和相關益處的組合物、方法、設備和試劑盒。在一方面，本發(fā)明提供了用于插入到多孔裝置的孔中的插入物。在一些實施方式中，所述插入物包含基本上不含微孔的內(nèi)表面和外表面；其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑；其中所述插入物的尺寸設置為小于所述孔，使得所述插入物可以插入到所述孔中。[0005]在另一實施方式中，所述插入物包含內(nèi)表面和外表面，其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑，其中所述外表面具有的直徑小于所述孔的直徑，使得所述插入物可以插入到所述孔中；其中所述插入物向多孔裝置的孔中的插入使得所述孔與所述裝置的相鄰孔在光學上隔離。[0006]在實施本發(fā)明的過程中，任何所述插入物可由不透明的材料制成，它們可以為圓柱形、中空的，或者可以包含多個空腔。[0007]在相關方面，本發(fā)明提供了用于插入到多孔裝置的多個孔中的插入物陣列。在一些實施方式中，所述陣列被配置成使得每個單獨的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設置為允許同時向所述多個孔的每個單獨的孔中插入和任選地移除每個單獨的插入物，其中所述單獨的插入物包含內(nèi)表面和外表面，該內(nèi)表面和外表面中的任一個或兩個在其上固定有結(jié)合劑，其中該內(nèi)表面和/或外表面基本上不含微孔。[0008]在備選的實施方式中，所述陣列被配置成使得每個單獨的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設置為允許同時向所述多個孔的每個單獨的孔中插入和任選地移除每個單獨的插入物，其中所述單獨的插入物包含內(nèi)表面和外表面，該內(nèi)表面和外表面中的任一個或兩個在其上固定有結(jié)合劑，其中所述單獨的插入物向所述單獨的孔中的插入使得所述孔與所述裝置上的其他相鄰孔在光學上隔離。[0009]在實施本發(fā)明的過程中，任何所述陣列可被塑造成使得所述框架的尺寸設置為允許同時向所述多孔裝置的每個單獨的孔中插入和移除所述每個單獨的插入物。[0010]在一些實施方式中，本發(fā)明的插入物或陣列的結(jié)合劑包括蛋白質(zhì)、抗體、單克隆抗體、抗原、配體、受體、親和素、生物素、鏈霉親和素或半抗原。[0011]在相關實施方式中，本發(fā)明提供了具有多個孔的多孔裝置，所述多個孔中的至少一個包含本文所述的插入物，或者所述多個孔包含本文所述的插入物陣列。在進一步的實施方式中，所述多孔裝置具有6、12、24、48、96、384、1536或3456個孔。[0012]相應地，本發(fā)明還提供了測量孔中液體樣品中存在的分析物的方法。在一些實施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使所述分析物和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離（sequestered)到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。[0013]在其他實施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，其中所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。[0014]在其他實施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使所述分析物和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的所述可檢測標記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。[0015]在其他實施方式中，所述方法包括向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含本發(fā)明的插入物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的所述可檢測標記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。[0016]在相關實施方式中，本發(fā)明提供了在多孔裝置中在分析物和包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物的混合物中進行結(jié)合測定的方法，該方法包括：向本發(fā)明的陣列的多個插入物上添加所述經(jīng)標記的示蹤物；使所述分析物和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量所述多個孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。[0017]在備選的實施方式中，本發(fā)明提供了在多孔裝置中在分析物和包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物的混合物中進行結(jié)合測定的方法，該方法包括：向本發(fā)明的陣列的多個插入物上添加所述經(jīng)標記的示蹤物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量所述多個孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。[0018]在另一實施方式中，本發(fā)明提供了鑒定表達分泌的異源多肽的細胞的方法，該方法包括：提供包含多個孔的多孔裝置，其中所述多個孔中的每個孔中插有本發(fā)明的插入物，并且其中所述多個孔中的每個孔包含細胞培養(yǎng)基，在該細胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達所述多肽的細胞；向所述包含細胞培養(yǎng)基的多個孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物；使所述多肽和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該多肽或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于所述細胞培養(yǎng)基中的所述多肽的量成比例，由此鑒定表達分泌的異源多肽的細胞。[0019]在備選的實施方式中，本發(fā)明提供了鑒定表達分泌的異源多肽的細胞的方法，該方法包括：提供包含多個孔的多孔裝置，其中所述多個孔中的每個孔中插有本發(fā)明的插入物，并且其中所述多個孔中的每個孔包含細胞培養(yǎng)基，在該細胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達所述多肽的細胞；向所述包含細胞培養(yǎng)基的多個孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物；使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述多肽上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一多肽上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及測量所述孔中保留在所述培養(yǎng)基中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該培養(yǎng)基中的所述多肽的量成反比；由此鑒定表達所述異源多肽的細胞。[0020]在實施本發(fā)明的任何方法的過程中存在多個實施方式。在實施本文所述任何方法的過程中，保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量可以在不將所述混合物轉(zhuǎn)移到孔外或調(diào)節(jié)所述混合物的內(nèi)容物的情況下進行測量，或者可以在從所述孔中移除插入物后進行測量，或者可以通過將光引向所述孔中的觀察體積來測量，其中所述觀察體積基本上被所述第一量的所述可檢測標記所占據(jù)，但基本上不含所述第二量的所述可檢測標記。[0021]在實施本發(fā)明任何方法的過程中，所述可檢測標記可以是放射性探針、光學可檢測的標記或熒光染料。在本發(fā)明的任何方法的進一步實施方式中，所述分析物是分泌的蛋白質(zhì)。[0022]在另一方面，本發(fā)明提供了用于測量孔中液體樣品中存在的分析物的設備，該設備包含：多孔裝置，其包含（i)其中插入一個或多個本發(fā)明的插入物的一個或多個孔，其中所述孔包含含有經(jīng)標記的示蹤物的混合物，該經(jīng)標記的示蹤物包含可檢測標記；讀板儀，其能夠（i)從所述一個或多個孔檢測所述標記。當期望時，所述讀板儀包含被編程為產(chǎn)生與所述檢測的標記相對應的信號的處理器。在一些實施方式中，所述讀板儀可操作地連接到計算機，該計算機被配置成（i)從所述讀板儀接收所述信號；并（ii)從所述信號生成定量測量數(shù)據(jù)；以及任選地（iii)將所述定量測量數(shù)據(jù)中繼到云服務器。在一些實施方式中，所述讀板儀能夠被配置成從基本不含所述一個或多個插入物的限制的體積中檢測所述標記。在一些實施方式中，所述讀板儀能夠檢測放射性標記、光學可檢測的標記、包含熒光染料的標記，或者發(fā)光標記。[0023]在另一方面，本發(fā)明提供了用于測量多孔裝置的一個或多個孔中的液體樣品中存在的分析物的試劑盒。在一些實施方式中，所述試劑盒包含一個或多個本發(fā)明的插入物；以及關于使用所述一個或多個插入物進行結(jié)合測定以測量所述分析物的說明書。在一些實施方式中，所述試劑盒進一步包含含有可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物。在一些實施方式中，所述經(jīng)標記的示蹤物能夠與所述分析物或所述結(jié)合劑形成復合物。在其他實施方式中，所述結(jié)合劑能夠與所述分析物在第一結(jié)合位點形成復合物。在其他實施方式中，所述經(jīng)標記的示蹤物能夠與所述分析物在第二結(jié)合位點形成復合物。援引并入[0024]本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用并入于此，程度猶如具體地和單獨地指定要通過引用而并入每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾?。【專利附圖】【附圖說明】[0025]本發(fā)明的新穎特征在隨附權(quán)利要求書中具體闡述。通過參考以下對其中利用到本發(fā)明原理的示例說明性實施方式加以詳細闡述和附圖，將會對本發(fā)明的特征和優(yōu)點獲得更好的理解，在附圖中：[0026]圖IA和圖IB描繪了成形為包括多個空腔的插入物的示例性實施方式的示意圖。[0027]圖2描繪了位于多孔板的孔中的插入物的示例性實施方式的示意圖，圖中示出向板和孔中的自頂向下示圖。[0028]圖3A描繪了利用本發(fā)明的插入物的示例性直接競爭性結(jié)合測定的示意圖。[0029]圖3B描繪了利用本發(fā)明的插入物的直接競爭性結(jié)合測定的備選的實施方式的示意圖。[0030]圖4A描繪了利用本發(fā)明的插入物的示例性夾心結(jié)合測定的示意圖。[0031]圖4B描繪了利用本發(fā)明的插入物的夾心結(jié)合測定的備選的實施方式的示意圖。[0032]圖5描繪了用于進行結(jié)合測定的示例性設備。[0033]圖6描繪了位于96孔多孔板中的本發(fā)明插入物的示例性實施方式的照片。[0034]圖7描繪了利用本發(fā)明的插入物的競爭性結(jié)合測定的結(jié)果。圖中描繪了熒光強度測量值相對于人γ球蛋白濃度的曲線圖，對利用本發(fā)明插入物的孔與無插入物的孔作出比較。[0035]圖8描繪了利用本發(fā)明的插入物的夾心結(jié)合測定的結(jié)果。圖中描繪了熒光強度測量值相對于人γ球蛋白濃度的曲線圖?！揪唧w實施方式】[0036]總體上，本發(fā)明提供了用于在多孔裝置中進行結(jié)合測定以供檢測感興趣的分析物的組合物、方法和試劑盒。插入物[0037]在一個方面，本發(fā)明提供了可插入至多孔裝置的孔中的插入物。在本發(fā)明的一些實施方式中，插入物的尺寸設置為允許插入多孔裝置的孔中并任選地從其中移除。在具體的實施方式中，插入物包含尺寸設置為小于允許插入和移除的孔而不使該孔變形或破裂的外表面。在更具體的實施方式中，插入物的外表面的尺寸為孔的尺寸的約99.9%或更小、約99.5%或更小、約99%或更小、約95%或更小、約90%或更小、約85%或更小、約80%或更小、約75%或更小、約70%或更小、約65%或更小、約60%或更小、約55%或更小、或約50%或更小。在其他更具體的實施方式中，插入物的外表面的尺寸為孔的尺寸的約50%-60%、55%-75%、60%-90%、75%-95%或80%-99.9%。[0038]在另一個實施方式中，插入物成形為具有底部以及另外的上唇部，該底部具有尺寸設置為小于孔以允許插入物的底部插入至孔中的外表面，該上唇部具有大于孔的尺寸的外尺寸以允許插入物位于孔內(nèi)而不接觸孔的底表面。在具體的實施方式中，插入物的底部具有尺寸為孔的尺寸的約99.9%或更小、約99.5%或更小、約99%或更小、約95%或更小、約90%或更小、約85%或更小、約80%或更小、約75%或更小、約70%或更小、約65%或更小、約60%或更小、約55%或更小、或約50%或更小的外表面。在其他更具體的實施方式中，插入物的底部的外表面具有為孔的尺寸的約50%-60%、55%-75%、60%-90%、75%-95%或80%-99.9%的尺寸。在一些實施方式中，插入物的上唇部具有為孔的直徑的約100.1%或更高、約100.5%或更高、約101%或更高、約102%或更高、約103%或更高、約104%或更高、約105%或更高、約110%或更高、約115%或更高、約120%或更高、約125%或更高、約130%或更高、約135%或更高、約140%或更高、約145%或更高或約150%的外尺寸。在具體的實施方式中，插入物的上唇部具有為孔的直徑的約100.1-110%、約101%-120%、約105%-130%、約110%-150%的尺寸。優(yōu)選地，插入物的上唇部的尺寸設置為允許多個插入物位于相鄰的孔內(nèi)而這些插入物的上唇部基本不重疊。[0039]在一些實施方式中，插入物具有包含內(nèi)表面和外表面的中空的形狀，該內(nèi)表面和外表面為將在液體溶液中進行的結(jié)合測定提供足夠的容積，并允許光從多孔裝置的孔中垂直地不受阻礙地通過到達檢測器。在一些實施方式中，插入物的內(nèi)表面具有為插入物的外表面尺寸的約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.5%、約99.9%的尺寸。插入物可采取多種形狀，包括但不限于圓柱形、正方形、橢圓形、卵形和多面體。在一些實施方式中，多面體形狀可具有3、4、5、6、7或8個或更多個側(cè)面。在一些實施方式中，多面體形狀為三角形、正方形、矩形、五邊形、六面體、七面體、八面體、十二面體。[0040]在一些實施方式中，插入物成形為提供多個空腔。對于本發(fā)明而言，術(shù)語"空腔"指中空結(jié)構(gòu)的內(nèi)部空間。空腔可布置成多種構(gòu)型。例如，插入物內(nèi)的空腔可被線性壁分割以形成分離但相鄰的隔室，或者被圓形壁分割以形成內(nèi)部和外部環(huán)隔室。圖IA和IB示出了具有多個空腔的示例性插入物的橫截面。[0041]在一些實施方式中，插入物可插入至多孔裝置的孔中并任選地從其中移除。多孔裝置是本領域公知的，并且應當理解，插入物可配置用于插入至任何多孔裝置中并從其中移除。然而，僅為了描述的目的，本文提供了可與本發(fā)明的插入物一起使用的多孔裝置配置的實例。在一些實施方式中，多孔裝置為多孔板，例如組織培養(yǎng)板或多孔測定板。在一些實施方式中，多孔裝置包含6個孔、12個孔、24個孔、48個孔、96個孔、384個孔、1536個孔或3456個孔。需要時，每個板的各個孔可具有均一的尺寸。在備選的實施方式中，插入物可成形為用于插入至用于進行結(jié)合測定的其他裝置（如單個小杯）中并任選地從其中移除。插入物的材料：[0042]術(shù)語"微孔"通常指在亞毫米范圍內(nèi)的孔洞。通常，用于多孔裝置中的多孔或微孔插入物可在加入或移除液體時促進孔中不需要的氣泡的形成，并因此可能對在該孔中進行的結(jié)合測定產(chǎn)生有害的影響。例如，這些氣泡可干擾結(jié)合測定或提供某種阻礙經(jīng)標記的結(jié)合劑的后續(xù)檢測的光學干涉。在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明的插入物基本上不含微孔。在一些實施方式中，插入物基本上不含直徑在亞毫米范圍內(nèi)的微孔。在一些實施方式中，插入物基本上不含直徑為約100微米或更小、90微米或更小、80微米或更小、70微米或更小、60微米或更小、50微米或更小、40微米或更小、30微米或更小、20微米或更小、10微米或更小、5微米或更小或1微米或更小的微孔。[0043]在具體的實施方式中，插入物基本上不含直徑在約0.001-30微米范圍內(nèi)的微孔。在其他具體的實施方式中，插入物基本上不含直徑在約〇.02-20微米范圍內(nèi)的微孔。在其他實施方式中，插入物基本上不含直徑在約〇.5-10微米范圍內(nèi)的微孔。[0044]通常，基本上不含微孔的插入物由非微孔材料制成。非微孔材料對于本領域技術(shù)人員是公知的，并且應理解，任何非微孔材料均可用于制備本發(fā)明的插入物。非微孔材料的非限制性實例包括塑料聚合物、玻璃、纖維素或硝化纖維素、金屬和半導電材料，諸如，例如，硅或鍺?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的插入物的塑料聚合物的非限制性實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚二甲基硅氧烷、聚氯乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰亞胺、聚酰胺、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚丁烯、聚己內(nèi)酰胺、聚三氟氯乙烯、聚乙烯聚四氟乙烯、聚對苯二甲酸二乙醋（polyethyleneterephathalate)、聚偏二氯乙稀、聚異丁稀、聚稀徑、聚合的聚異氰酸醋（polymericpolyisocyanate)、聚氟乙稀?？捎糜谥苽洳迦胛锏姆嵌嗫撞牧系钠渌窍拗菩詫嵗ū‰?丙稀酸劑-苯乙?。╝crylonitrile-acryloid-styrene)、丙稀腈-氯化乙稀-苯乙稀和丙稀腈-丁二稀-苯乙稀。在一些情況下，用于制備插入物的材料可被改性以包含交聯(lián)或其他用于固定結(jié)合劑的連接體部分。在一個具體的實施方式中，插入物由購自Graingers(目錄號2vdn6和2vdp4)的外徑為6mm且內(nèi)徑為4mm的塑料管制成。[0045]多孔裝置中結(jié)合測定的分析通常涉及對來自多個或相鄰孔的信號（例如，光）的檢測。阻止孔之間的串擾將會改善結(jié)合測定測量的精確度。在本發(fā)明的一些實施方式中，插入物基本上阻止光通過插入物材料的透射。在一些實施方式中，插入物基本上阻止可見光的透射。在其他實施方式中，插入物基本上阻止紫外線的透射。在其他實施方式中，插入物基本上阻止紅外線的透射。在更具體的實施方式中，插入物基本上阻止可見光、紫外線和紅外線的透射。需要時，在一些實施方式中，插入物是不透明的。[0046]在一些實施方式中，由于將一種或多種色素引入插入物材料中，因此插入物是不透明的?？赏ㄟ^將色素附著至插入物的任何已知的方法將一種或多種色素引入插入物材料中。色素的附著可為通過共價鍵、非共價相互作用，或者通過將一種或多種色素沉積到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上。在一些實施方式中，所述色素為染料。不透明的色素和染料是本領域技術(shù)人員已知的，可通過多個供應商商購獲得，諸如，例如，由Epolin，Inc.提供的Epolight7276FVisibleOpaqeDye。常用的色素的其他非限制性實例包括提供白色色素沉著的二氧化鈦，以及提供黑色色素沉著的碳黑、炭黑、烏木、象牙黑和縞瑪瑙（onyx)。插入物的陣列[0047]多孔裝置通常用于對單個樣品進行的多個結(jié)合測定、或?qū)Χ鄠€樣品進行的單個結(jié)合測定、或?qū)Χ鄠€樣品進行的多個測定的平行處理。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的插入物的陣列，其可向多孔裝置的多個孔中同時插入并任選地從其中移除。在一些實施方式中，將陣列中的每個單獨的插入物安裝至連續(xù)的固體框架上。在一些實施方式中，該框架為具有與多孔裝置的外尺寸基本相同的外尺寸的、基本上是平的框架。在一些實施方式中，該框架包含尺寸設置為基本上與多孔裝置的孔的尺寸匹配的均勻的孔洞。在一些情況下，當框架正好位于多孔裝置的頂部時，該框架的均勻的孔洞與該裝置的孔對準。在一些情況下，插入物的尺寸設置為穩(wěn)定地適配于框架的孔洞中。例如，單獨的插入物將具有尺寸設置為適配通過框架的孔并插入至多孔裝置的孔中的底部，并且還將具有尺寸設置為大于框架的孔洞的尺寸以使插入物能夠位于框架內(nèi)的上唇部。在這種示例性的配置中，各個單獨的插入物可同時插入至孔中，并任選地從孔中移除。在一些情況下，插入物牢固地附接至框架，以使插入物和框架作為可插入至多孔裝置并任選地從其中移除的一個單元起作用。分析物[0048]在本發(fā)明的另一個方面，插入物具有固定于其上用于液體樣品中分析物的檢測的結(jié)合劑。該分析物可以是，但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽（包括其片段）、多糖、脂質(zhì)、核酸、生物顆粒、細胞區(qū)室、細胞、合金金屬或其他元件，或它們的任意組合。分析物還可以是，例如，藥物、前藥、藥劑、藥物代謝物、生物標志物（例如，表達的蛋白質(zhì)或細胞標志物、抗體或抗體片段、血清蛋白質(zhì)、細胞表面受體、受體配體或其功能性基序）。在一些實施方式中，分析物為分泌的蛋白質(zhì)。分泌的蛋白質(zhì)的非限制性實例包括激素、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)、抗體、分泌的酶、分泌的毒素或任何包含將蛋白質(zhì)靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列的分泌的蛋白質(zhì)。激素的非限制性實例包括褪黑激素、甲狀腺激素、腎上腺素、繆勒氏管抑制激素（antimullerianhormone)、脂聯(lián)素、促腎上腺皮質(zhì)激素、血管緊張素、抗利尿激素（加壓素）、心房鈉尿肽（atrial-natriureticpeptide)、降媽素、縮膽囊素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（cortocotropin-releasinghormone)、促紅細胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、生長素釋放肽（ghrelin)、胰高血糖素、促性腺激素釋放激素、生長激素、人絨毛膜促性腺激素、生長激素、人胎盤催乳素、抑制素、胰島素、胰島素樣生長因子、瘦素、黃體生成素(leutenizinghormone)、黑素細胞刺激激素、食欲肽（orexin)、催產(chǎn)素、甲狀旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素（secretin)、促生長素抑制素、血小板生成素、促甲狀腺激素、促甲狀腺激素釋放激素、皮質(zhì)醇、醛固酮、睪酮、脫氫表雄酮、雙氫睪酮、雌激素、孕酮、前列腺素、白三烯、內(nèi)皮素、腎素。生長因子的非限制性實例包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、肝細胞生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α或β、腫瘤壞死因子α、血管內(nèi)皮生長因子、胎盤生長因子、白細胞介素1-7等。分泌的酶的非限制性實施包括消化酶，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、糖酶、核酸酶、I型分泌的蛋白質(zhì)、II型分泌的蛋白質(zhì)、III型分泌的蛋白質(zhì)、IV型分泌的蛋白質(zhì)、V型分泌的蛋白質(zhì)、VI型分泌的蛋白質(zhì)、植物分泌的蛋白質(zhì)等。分泌的毒素的非限制性實例包括耐熱腸毒素（heat-stableenterotoxin)、溶血素、膽固醇依賴型溶細胞素、RTX毒素、白喉毒素、霍亂毒素、百日咳毒素、透明質(zhì)酸酶、膠原酶等。在具體的實施方式中，分泌的蛋白質(zhì)是分泌的抗體。在更具體的實施方式中，分泌的抗體是單克隆抗體。結(jié)合劑[0049]多種結(jié)合劑可用于本發(fā)明。結(jié)合劑的選擇可取決于所測定的分析物。結(jié)合劑可以是，但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、蛋白質(zhì)或肽片段、多糖、脂質(zhì)、核酸、生物顆粒、細胞區(qū)室、細胞或其任意組合。結(jié)合劑也可以是，例如，藥物、前藥、藥劑、藥物代謝物、生物標志物(例如，表達的蛋白質(zhì)或細胞標志物、抗體或抗體片段、血清蛋白質(zhì)、細胞表面受體、受體配體或其功能性基序）、配體、受體或半抗原。在一些情況下，結(jié)合劑包含親和素、生物素或鏈霉親和素。在一些實施方式中，結(jié)合劑是分泌的蛋白質(zhì)。本文提供了分泌的蛋白質(zhì)的非限制性實例。[0050]通常，結(jié)合劑的選擇將取決于用戶的需要和將要采用的結(jié)合測定的類型。一種常見的結(jié)合測定類型是夾心測定，其中結(jié)合劑與分析物結(jié)合，而分析物進一步與經(jīng)標記的示蹤物結(jié)合。在一些實施方式中，結(jié)合劑基于其選擇性結(jié)合所研宄的分析物的能力而被選擇。例如，如果分析物是抗體，則結(jié)合劑包含能夠與該抗體選擇性相互作用的抗原。對于另一個例子，如果分析物是分泌的蛋白質(zhì)（例如，胰島素），則結(jié)合劑是能夠與該分泌的蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體（例如，抗胰島素抗體）。[0051]另一種常見的結(jié)合測定類型是競爭性測定，其中結(jié)合劑與分析物競爭結(jié)合經(jīng)標記的示蹤物。因此，在一些實施方式中，結(jié)合劑被選擇為包含與分析物具有類似的結(jié)合經(jīng)標記的示蹤物的能力的基序、分子、生物顆粒、物質(zhì)或其他結(jié)構(gòu)。在其他實施方式中，示蹤物用作參考來指導比參考化合物更好地結(jié)合的化合物的選擇。在特定實施方式中，結(jié)合劑是與分析物相同的物質(zhì)。例如，如果分析物是抗體，則抗原包含相同的抗體。在其他實施方式中，結(jié)合劑是與分析物不同的物質(zhì)，但與分析物具有類似的針對經(jīng)標記的示蹤物的結(jié)合親和力。結(jié)合劑向插入物上的固定[0052]用于將結(jié)合劑固定在固體表面上的方法是本領域技術(shù)人員已知的。通常，任何合適的固定方法可以用于將結(jié)合劑固定至本發(fā)明的插入物上。例如，已知許多技術(shù)用于通過共價鍵、非共價鍵或吸附將核酸和/或肽固定至固體表面上，或固定至連接體部分，或固定至被固定的部分。這類技術(shù)在以下文獻中有描述，例如，Beier等人，NucleicAcidsRes.27:1970-1-977(1999)，Joos等人，Anal.Chem.247:96-101(1997)，Guschin等人，Anal.Biochem.250:203-211(1997)，Bhatia等人1998,AnalyticalBiochemistry,178408-13，Tedeschi等人2003,BiosensorsandBioelectronics，（19)85-93，MethodsMol.Biol.Vol.20(1993)，Tischer和Wedekind.,TopicsinCurrentChemistry200:95-126(1999)，所有這些文獻均通過引用并入本文。[0053]在一些實施方式中，通過交聯(lián)劑將結(jié)合劑固定到插入物上。在一些實施方式中，該交聯(lián)劑是具有至少兩個反應性末端以將結(jié)合劑連接至固體支持材料上的分子。通常，適當?shù)慕宦?lián)劑的選擇通過將交聯(lián)劑的反應性末端與固體支持材料的官能團并且與結(jié)合劑的官能團進行匹配來獲知。在一些情況下，交聯(lián)劑包含對蛋白質(zhì)上共同的官能團具有特異性的反應性基團，例如，羧基、胺、巰基或羥基。這些反應性基團可用來將蛋白質(zhì)性結(jié)合劑交聯(lián)至固體支持物，例如本發(fā)明的插入物。交聯(lián)劑反應性基團的非限制性實例包括η-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS酯）、亞氨酸酯、馬來酰亞胺、鹵代乙?；?、吡啶基二硫化物、五氟苯基酯、羥甲基膦、硫代磺酸酯、乙烯基磺酸酯、酰肼、烷氧基胺、芳基疊氮化物、異氰酸酯、二琥珀酰亞胺基辛二酸醋和雙B丫丙啶（diazirines)。[0054]在其他實施方式中，如果結(jié)合劑是糖蛋白，則可以使用為了固定目的利用碳水化合物基團將糖蛋白（即，包含碳水化合物側(cè)鏈的蛋白質(zhì)）固定到插入物上的方法。例如，凝集素在本領域中是已知的，并用來將碳水化合物基團固定到固體支持物上。在一個實施方式中，插入物由凝集素修飾的非微孔性材料制成，用于糖蛋白結(jié)合劑的固定。[0055]在另外其他的實施方式中，結(jié)合劑包含親和結(jié)合標簽。親和標簽的非限制性實例包括IgG結(jié)合域、組氨酸標簽、精氨酸標簽、纖維素結(jié)合域、鏈霉親和素、鏈霉親和素結(jié)合域、生物素、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)標簽等等。[0056]在其他實施方式中，通過將插入物與包被緩沖液和結(jié)合劑一起溫育而將結(jié)合劑固定到插入物上。在結(jié)合劑包含交聯(lián)劑或親和結(jié)合標簽的一些情況下，包被緩沖液包含對該交聯(lián)劑或結(jié)合標簽具有親和力的試劑。例如，如果親和結(jié)合標簽包含GST，則包被緩沖液中的試劑包含GST結(jié)合試劑，例如，抗-GST抗體或谷胱甘肽。在親和結(jié)合標簽包含鏈霉親和素的一些情況下，包被緩沖液中的試劑是生物素。在親和結(jié)合標簽是組氨酸標簽的其他情況下，包被緩沖液中的試劑是與組氨酸相互作用的金屬，例如，銅或鎳。對于另一個例子，如果結(jié)合劑包含交聯(lián)劑，則包被緩沖液包含與該交聯(lián)劑結(jié)合的試劑。例如，在交聯(lián)劑包含巰基的一些情況下，包被緩沖液包含與巰基形成穩(wěn)定的硫酯鍵的活化的馬來酰亞胺。[0057]用于將結(jié)合劑固定到固體表面上的非特異性包被緩沖液也是本領域已知的，并且包括，例如，堿性碳酸鹽緩沖液、堿性磷酸鹽緩沖液或基于tris的堿性緩沖液。在一些實施方式中，包被緩沖液是具有摩爾濃度為約0.05M、0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.IM或0.2M碳酸鈉的碳酸鹽緩沖液。在一些實施方式中，該碳酸鹽緩沖液是碳酸鈉緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液或碳酸氫鈉緩沖液。在一些實施方式中，包被緩沖液具有約7.5或更高、約8.O或更高、約8.5或更高或者約9.O或更高的pH。在其他實施方式中，包被緩沖液具有約7.5-9、約8-9.5或約9-10的pH。在特定實施方式中，包被緩沖液是pH約9-10的碳酸鈉緩沖液。在其他實施方式中，包被緩沖液是磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水、基于tris的緩沖液或tris-緩沖鹽水。包被緩沖液的非限制性實例包括0.2M碳酸氫鈉，pH9.4;PBS-50mM磷酸鹽，pH0,0·15MNaCl;碳酸鹽-碳酸氫鹽；含有L7mMNaH2P04、98mMNa2HPO4.7H20、0·1%NaN3的磷酸鹽緩沖液，pH8·5;TBS-50mMTRIS，pH8·0,0·15MNaCl。[0058]圖2描繪了用于插入到多孔裝置（200)的孔中的插入物的特定實施方式的示意圖。該插入物可用于進行結(jié)合測定。插入物210的尺寸設置為用于插入并任選地從孔（220)中移除，并且進一步在內(nèi)表面和外表面上已固定有結(jié)合劑（230)。液體樣品[0059]在本發(fā)明的另一方面，利用插入物在含有液體樣品的孔中進行結(jié)合測定。通常，該液體樣品可以是被懷疑含有感興趣的分析物的任何液體。在一些實施方式中，該液體樣品是體液樣品，例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、羊水、房水、玻璃體液、膽汁、乳汁、腦脊髓液、耵聹、內(nèi)淋巴、外淋巴、精液、女性射出液、胃液、粘液、腹膜液、胸膜液、皮脂、汗液、淚液、陰道分泌物或嘔吐物。在其他實施方式中，該液體樣品是蛋白質(zhì)樣品或DNA樣品。在其他實施方式中，該液體樣品是裂解的細胞樣品。在特定的實施方式中，該液體樣品是被懷疑攜帶分析物的細胞培養(yǎng)基。經(jīng)標記的示蹤物[0060]進行結(jié)合測定的一般方法利用包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物。對于本發(fā)明而言，術(shù)語"經(jīng)標記的示蹤物"被定義為能夠在結(jié)合測定中用于檢測分析物的實體，其中示蹤物另外包含可檢測標記。對標記的檢測和測量可用來確定分析物的存在、不存在或量。在結(jié)合測定是競爭性測定的一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物能夠與分析物結(jié)合或與結(jié)合劑結(jié)合。在特定實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物能夠以類似的親和力與分析物或結(jié)合劑結(jié)合。僅舉例來說，如果分析物和結(jié)合劑是特定的抗體，則示蹤物包含能夠結(jié)合該抗體的標記的抗原。舉另一個例子，如果分析物和結(jié)合劑是特定的抗原，則示蹤物包含能夠結(jié)合該抗原的標記的抗體。[0061]在結(jié)合測定是夾心測定的一些實施方式中，如果結(jié)合劑能夠在第一位點結(jié)合分析物，則選擇經(jīng)標記的示蹤物以使其能夠與分析物在第二位點結(jié)合。在其他實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物能夠與分析物在第二位點結(jié)合，并且對結(jié)合劑沒有或幾乎沒有親和力。僅舉例來說，如果分析物是抗原，并且結(jié)合劑是能夠在特定表位處結(jié)合該抗原的抗體，則經(jīng)標記的示蹤物是能夠在不同的表位處結(jié)合該抗原的第二抗體。在任一種情況下，經(jīng)標記的示蹤物均可包含但不限于蛋白質(zhì)、糖蛋白、多肽、多糖、脂質(zhì)、核酸或其任意組合。經(jīng)標記的示蹤物還可包含，例如，藥物、前藥、藥劑、藥物代謝物、生物標志物（例如，表達的蛋白質(zhì)或細胞標志物、抗體或抗體片段、血清蛋白質(zhì)、細胞表面受體、受體配體或其功能性基序）。在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物是分泌的蛋白質(zhì)。在本文中描述了分泌的蛋白質(zhì)的例子。[0062]在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物是偶聯(lián)至可檢測標記的分子。有多種標記可用于本發(fā)明，標記的選擇取決于所需的靈敏度、偶聯(lián)的難易程度、穩(wěn)定性需要、可獲得的儀器和檢測方法以及處置的提供。[0063]在一些實施方式中，可檢測標記包含熒光染料。通常，熒光染料包含吸收第一波長范圍的光能并且重新發(fā)射第二波長范圍內(nèi)的光的熒光團。在一些實施方式中，該熒光染料是氧雜蒽類衍生物，諸如，例如，熒光素、若丹明、TRITC、X_若丹明、麗絲胺若丹明B、俄勒岡綠或德克薩斯紅。在其他實施方式中，該熒光染料是花菁衍生物，諸如，例如，花菁、吲哚羰花菁、氧雜羰花菁、硫雜羰花菁（thiacarbocyanine)或部花青。在另外其他的實施方式中，該熒光染料是萘衍生物，諸如，例如，丹?；騞rodan衍生物。在其他實施方式中，該熒光染料是香豆素衍生物。在其他實施方式中，該熒光染料是噁二唑衍生物，諸如，例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑或苯并噁二唑。在其他實施方式中，該熒光染料是噁嗪衍生物，諸如，例如，尼羅紅、尼羅藍或噁嗪170。熒光染料的其他例子包括，例如，CF染料（Biotium-參見，例如，美國專利號8148518、8092784、7803943、7601498、7776567,均通過引用而并入）、BODIPY(Invitrogen)、DyLightFluor(Thermoscientific)、Atto和Tracy(SigmaAldrich)、FluoProbes(Interchim)、DY和MegaStokes染料（Dyomics)、Seatau和Square染料（SETABioMedicals)、Quasar和CalFluor染料（BiosearchTechnologies)、太平洋藍（PacificBlue)、太平洋橙（PacificOrange)、螢光黃或別藻藍蛋白。[0064]在另外其他的實施方式中，所述熒光染料包含吲哚鑰環(huán)體系，其中吲哚鑰環(huán)的3-碳上的取代基包含化學反應性基團或偶聯(lián)的物質(zhì)。在更具體的實施方式中，該熒光染料是AlexaFluor染料，諸如，例如，AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor635、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor.700、AlexaFluor750或AlexaFluor790〇[0065]在其他實施方式中，可檢測標記包含熒光蛋白。熒光蛋白是本領域公知的。熒光蛋白的非限制性實例包括Y66H、Y66F、EGFP、EGFP2、Azurite、GFP、T-Sapphire、Cerulean、CFP、TagCFP、TurboCFP、ECFP、CyPet、Y66W、mKeima-Red、AmCyanl、TFPl、Midori-ishiCyan、GFP、TurboGFP、TagGFP、EGFP、S65C、S65L、Emerald、S65T、AzamiGreen、ZsGreenl、YFP、TagYFP、EYFP、TurboYFP、Topaz、Venus、mCitrine、m0range、RFP、TagRFP、TurboRFP、DsRecUmStrawberry、R-藻紅蛋白、B-藻紅蛋白、mCherry、Pe;ridininChlorophyll(PerCP)、mPlum、mOrange或mRaspberry。[0066]在其他實施方式中，可檢測標記包含發(fā)光或化學發(fā)光標簽。常見的發(fā)光/化學發(fā)光標簽包括但不限于過氧化物酶，如辣根過氧化物酶（HRP)、大豆過氧化物酶（SP)、堿性磷酸酶和螢光素酶。只要給予適當?shù)牡孜铮ɡ?，氧化試劑加化學發(fā)光化合物），這些蛋白質(zhì)標簽能夠催化化學發(fā)光反應。已知許多化合物家族在多種條件下提供化學發(fā)光?；瘜W發(fā)光化合物家族的非限制性實例包括2,3-二氫-1，4-酞嗪二酮魯米諾，5-氨基-6,7,8-三甲氧基-和二甲基氨基[ca]苯并類似物。這些化合物在堿性過氧化氫或次氯酸媽和堿的存在下能夠發(fā)光?；瘜W發(fā)光化合物家族的其他實例包括，例如，2,4,5-三苯基咪唑，對二甲基氨基和-甲氧基取代基，草酸酯，如草?；钚怎?，對硝基苯基，N-烷基吖啶酯，螢光素，光澤精(Iucigenins)，或吖啶酯?；瘜W發(fā)光蛋白質(zhì)標簽的許多底物是本領域公知且可商購獲得的，并且應當理解，化學發(fā)光反應的任何合適的底物都可以在本發(fā)明中使用。[0067]用于將可檢測標記偶聯(lián)或耦合到分子上的方法是本領域技術(shù)人員熟知的，并且可用來制備經(jīng)標記的示蹤物。在一些實施方式中，標記通過間接手段連接。在特定實施方式中，標記通過以下步驟連接：（1)配體分子與聚合物共價結(jié)合。（2)配體與抗配體分子結(jié)合，該抗配體分子可以是本身可檢測的，或者可以共價地結(jié)合至信號系統(tǒng)。許多配體/抗配體組合是本領域中已知并可獲得的，例如，生物素/鏈霉親和素、甲狀腺素/甲狀腺素結(jié)合球蛋白、半抗原/抗體或抗原/抗體。信號系統(tǒng)的例子包括，例如，可檢測的酶或化學發(fā)光化合物。在其他實施方式中，可檢測標記與分子的偶聯(lián)涉及分子克隆，例如，重組DNA技術(shù)。進行結(jié)合測定的方法[0068]在另一方面，本發(fā)明提供了使用本文所述的單獨的插入物或插入物陣列來測量存在于多孔裝置的一個孔或多個孔中的液體樣品中的分析物的方法。在一個方面，本發(fā)明提供了一種在競爭性結(jié)合測定中使用插入物或插入物陣列的方法。圖3A提供了使用本發(fā)明的插入物或插入物陣列（300)的示例性競爭性結(jié)合測定的示意圖。在一些實施方式中，該方法包括向包含液體樣品320的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物310。在使用插入物陣列的一些實施方式中，該方法包括向包含多個液體樣品320的多個孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物310。在一些實施方式中，液體樣品被懷疑含有分析物330，分析物330以淺灰色圓形示出。在一些實施方式中，所述孔包含其上固定有結(jié)合劑350的插入物340。在使用插入物陣列的一些實施方式中，所述多個孔包含其上固定有結(jié)合劑350的插入物340的陣列。在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物能夠與分析物結(jié)合并且另外能夠與結(jié)合劑結(jié)合。在特定實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物能夠以類似的親和力與分析物和結(jié)合劑結(jié)合。在特定實施方式中，結(jié)合劑與分析物是相同類型的分子，因此，經(jīng)標記的示蹤物能夠與兩者以基本相等的親和力結(jié)合。在更具體的實施方式中，分析物本身不具有對結(jié)合劑的顯著的結(jié)合親和力。在一些實施方式中，向液體樣品中加入經(jīng)標記的示蹤物形成了包含液體樣品320、分析物330和經(jīng)標記的示蹤物310的混合物。[0069]在一些實施方式中，所述方法進一步包括將混合物溫育足夠的一段時間，從而允許分析物和結(jié)合劑競爭經(jīng)標記的示蹤物的結(jié)合。在一些實施方式中，該溫育步驟包括溫育約0、0·5、1、1·5、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小時或更長。在需要時，該溫育步驟包括溫育約24小時或更長。該溫育步驟也可進行不到約24小時、不到約20小時、不到約16小時、不到約12小時、不到約8小時、不到約4小時、不到約2小時、不到約1.5小時、不到約1小時、不到約0.5小時。在另外其他的實施方式中，該溫育步驟包括溫育約0.5-2小時、約1-4小時、約2-8小時、約4-12小時、約8-24小時或更長。溫育可在任何適合于給定測定的溫度，例如約37攝氏度、約室溫或約20-25攝氏度下進行。在另外其他的實施方式中，該溫育步驟包括在約4攝氏度下溫育。在一些實施方式中，該溫育步驟包括振蕩和/或搖動。在其他實施方式中，該溫育步驟不需要振蕩或搖動。在特定的實施方式中，該溫育步驟包括在進行或不進行振蕩和/或搖動的情況下，在約37攝氏度下溫育0.5-2小時。在另一個特定的實施方式中，該溫育步驟包括在進行或不進行振蕩和/或搖動的情況下，在室溫（例如，20-25攝氏度）下溫育約1-12小時。在另一個特定的實施方式中，該溫育步驟包括在進行或不進行振蕩和/或搖動的情況下，在約4攝氏度下溫育約8-24小時或更長。在一些實施方式中，所述競爭導致形成一個或多個包含經(jīng)標記的示蹤物和分析物的復合物360。在其他實施方式中，所述競爭導致形成一個或多個包含經(jīng)標記的示蹤物和結(jié)合劑的復合物370。在另外其他的實施方式中，所述競爭導致形成一個或多個復合物360和一個或多個復合物370。在一些實施方式中，一個或多個復合物370被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上，而一個或多個復合物360保留在混合物中。對于本發(fā)明而言，短語"保持在混合物中"或"保留在混合物中"是指在混合物中基本保持自由漂浮并且未結(jié)合到插入物上。[0070]在一些實施方式中，所述方法進一步包括測量孔中保留在混合物中的可檢測標記的量。在一些情況下，保留在混合物中的可檢測標記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成比例。在特定實施方式中，對保留在混合物中的可檢測標記的量的測量基本上排除了測量被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的可檢測標記的量。在更具體的實施方式中，通過在不含插入物的檢測區(qū)380中進行測量而排除了測量被隔離到插入物上的標記的量。在另外其他的【具體實施方式】中，通過在測量步驟之前移除插入物而排除了測量被隔離到插入物上的標記的量。[0071]在圖3B所示的備選的實施方式301中，所述方法與如上描述的方法基本相同，不同之處在于，該方法并非測量保留在溶液中的可檢測標記的量，而是包括通過在包含插入物的檢測區(qū)390中進行測量而測量孔中被隔離到插入物上的可檢測標記的量。在特定的備選的實施方式中，在檢測區(qū)390中進行測量基本上排除了保留在混合物中的可檢測標記的量。在這些備選的實施方式中，被隔離到插入物上的可檢測標記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成反比。在一些實施方式中，在溫育步驟后，包含孔的裝置在約4攝氏度下儲存任意合適的一段時間，之后進行分析物的測量。[0072]在另一方面，本發(fā)明提供了在夾心型測定中使用單獨的插入物或插入物陣列的方法。圖4A提供了使用本發(fā)明的插入物或插入物陣列（400)的示例性夾心型結(jié)合測定的示意圖。在一些實施方式中，該方法包括向包含液體樣品420的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物410。在使用插入物陣列的實施方式中，該方法包括向包含多個液體樣品420的多個孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物410。在一些實施方式中，液體樣品被懷疑含有分析物430,分析物430以淺灰色新月形示出。在一些實施方式中，所述孔包含其上固定有結(jié)合劑450的插入物440。在使用插入物陣列的一些實施方式中，所述多個孔包含其上固定有結(jié)合劑450的插入物440的陣列。在一些實施方式中，向液體樣品中加入經(jīng)標記的示蹤物形成了包含液體樣品420、分析物430和經(jīng)標記的示蹤物410的混合物。在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物410能夠與分析物430在第一位點結(jié)合。在一些實施方式中，結(jié)合劑450能夠與分析物430在第二位點結(jié)合。在特定實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物不具有對結(jié)合劑450的顯著的結(jié)合親和力。在一些實施方式中，向液體樣品中加入經(jīng)標記的示蹤物形成了包含液體樣品420、分析物430和經(jīng)標記的示蹤物410的混合物。[0073]在一些實施方式中，所述方法進一步包括將混合物溫育足夠的一段時間，從而允許形成包含經(jīng)標記的示蹤物、分析物和結(jié)合劑的復合物，其中經(jīng)標記的示蹤物與分析物在第一位點結(jié)合而結(jié)合劑與分析物在第二位點結(jié)合。本文中描述了溫育步驟的各種實施方式。在一些實施方式中，所述溫育導致一定量的未復合的經(jīng)標記的示蹤物460保留在混合物中。在其他實施方式中，所述溫育導致形成一個或多個復合物470,該復合物470包含經(jīng)標記的示蹤物410、分析物430和結(jié)合劑450。在另外其他的實施方式中，所述競爭產(chǎn)生一定量的未復合的經(jīng)標記的示蹤物460和一個或多個復合物470。在一些實施方式中，一個或多個復合物470被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上，而未復合的經(jīng)標記的示蹤物460保留在混合物中。[0074]在一些實施方式中，所述方法進一步包括測量孔中保留在混合物中的可檢測標記的量。在一些情況下，保留在混合物中的可檢測標記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成反比。在特定實施方式中，對保留在混合物中的可檢測標記的量的測量基本上排除了測量被隔離到或結(jié)合到插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的可檢測標記的量。在更具體的實施方式中，通過在不含插入物的檢測區(qū)480中進行測量而排除了測量被隔離到插入物上的標記的量。在另外其他的【具體實施方式】中，通過在測量步驟之前移除插入物而排除了測量被隔離到插入物上的標記的量。在圖4B所示的備選的實施方式401中，所述方法與以上描述的方法基本相同，不同之處在于，該方法并非測量保留在溶液中的可檢測標記的量，而是包括通過在包含插入物的檢測區(qū)490中進行測量而測量孔中被隔離到插入物上的可檢測標記的量。在特定的備選的實施方式中，在檢測區(qū)490中進行測量基本上排除了保留在混合物中的可檢測標記的量。在這些備選的實施方式中，被隔離到插入物上的可檢測標記的量與存在于液體樣品中的分析物的量成正比。在一些實施方式中，包含孔的裝置可以在溫育步驟后、在測量前在4攝氏度下儲存不定的一段時間。[0075]本文公開的方法特別適合于以線性檢測測量大范圍的分析物濃度。在一些實施方式中，所述方法可以測量約0-100μg/ml的分析物、約0-90μg/ml的分析物、約0-80μg/ml的分析物、約0-70μg/ml的分析物、約0-60μg/ml的分析物、約0-50μg/ml的分析物、約0-40μg/ml的分析物、約0-30μg/ml的分析物、約0-20μg/ml的分析物、約0-10μg/ml的分析物、約0-5μg/ml的分析物或約0-2.5μg/ml的分析物。[0076]在實施上述方法時，可以調(diào)節(jié)經(jīng)標記的示蹤物、結(jié)合劑和/或分析物的相對量以提高結(jié)合測定的效率和/或準確度。在一些實施方式中，相對于結(jié)合劑的結(jié)合容量調(diào)節(jié)經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度。在特定實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為結(jié)合劑的相對結(jié)合容量的約100%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%或約5%。在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為結(jié)合劑的相對結(jié)合容量的約10-90%、約20-80%、約30-70%、約40%-60%或約45%-55%。在特定的實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為結(jié)合劑的相對結(jié)合容量的約50%。[0077]在其他實施方式中，相對于分析物的結(jié)合容量調(diào)節(jié)經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度。在特定實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為分析物的相對結(jié)合容量的約100%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%或約5%。在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為分析物的相對結(jié)合容量的約10-90%、約20-80%、約30-70%、約40%-60%或約45%-55%。在特定的實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為分析物的相對結(jié)合容量的約50%。[0078]在另外其他的實施方式中，相對于分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量調(diào)節(jié)經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度。在特定實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量的約100%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%或約5%。在一些實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量的約10-90%、約20-80%、約30-70%、約40%-60%或約45%-55%。在特定的實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物的相對濃度為分析物和結(jié)合劑的總結(jié)合容量的約50%。檢測方法[0079]通常，以上描述的方法包括涉及標記的檢測的測量步驟。檢測方法是本領域技術(shù)人員所熟知的，并且任何合適的檢測方法均可用于本發(fā)明。本領域技術(shù)人員將會理解，檢測方法的選擇取決于用戶的需求和所使用的可檢測標記的類型。[0080]在可檢測標記是熒光染料或熒光蛋白質(zhì)的一些實施方式中，測量步驟包括熒光檢測方法的使用。熒光檢測方法是本領域技術(shù)人員所熟知的。在一些實施方式中，熒光檢測包括通過用源光照射目標區(qū)域來激發(fā)熒光染料或蛋白質(zhì)，該源光的波長范圍足以激發(fā)染料或蛋白質(zhì)中的熒光團。源光可以由許多合適的光源提供，該光源包括，例如，激光、激光二極管和高強度燈，如氙弧燈或汞蒸汽燈。源光的波長范圍可以使用例如光濾波器或單色儀系統(tǒng)來選擇。[0081]通常，熒光團的激發(fā)導致響應光的發(fā)射。在一些實施方式中，響應光的波長范圍比激發(fā)波長范圍具有更高的波長。在一些實施方式中，熒光檢測包括響應光的檢測。例如，可以使用數(shù)碼相機、電荷耦合器件（CCD)、光電倍增管、光電管或CMOS圖像傳感器來完成檢測。[0082]熒光偏振代表一種熒光檢測方法，其能夠進一步區(qū)分結(jié)合的或未結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物。通常，熒光偏振使用分子的翻滾動作來定量結(jié)合事件。例如，如果小熒光染料或蛋白質(zhì)與大得多的分子結(jié)合（例如，在經(jīng)標記的示蹤物與分析物、結(jié)合劑，或者結(jié)合劑和分析物形成復合物的情況下），則與未結(jié)合的小熒光染料或蛋白質(zhì)（例如，如果經(jīng)標記的示蹤物仍未結(jié)合）相比，熒光染料或蛋白質(zhì)的翻滾速度將會下降。熒光染料或蛋白質(zhì)分子的翻滾速度可通過用平面偏振光激發(fā)熒光團來測定。如果熒光團具有較低的翻滾速度（例如，在經(jīng)標記的示蹤物已與另一種結(jié)合配偶體形成復合物的情況下），則發(fā)射的響應光將傾向于在同一平面中保持偏振，相反，具有更高翻滾速度的熒光團（例如，在經(jīng)標記的示蹤物仍未結(jié)合的情況下）將傾向于在激發(fā)步驟中失去偏振，并因此發(fā)射相對于激發(fā)光平面具有更低偏振的響應光。在特定實施方式中，測量步驟包括熒光偏振方法的使用。在更具體的實施方式中，測量保留在混合物中的可檢測標記的量采用熒光偏振方法，該熒光偏振方法使得用戶能夠區(qū)分已與分析物形成復合物的經(jīng)標記的示蹤物以及未結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物。[0083]在可檢測標記包含發(fā)光或化學發(fā)光標簽的一些實施方式中，測量步驟包括發(fā)光檢測方法。發(fā)光檢測方法是本領域技術(shù)人員已知的（參見，例如，BiomedicalChromatography17:83-95(2003)，ComplementaryImmunoAssays，Ch.14,1988年版，CanadianJournalofChemistry,1987,65(6):1392-1396)、美國專利RE39047,所有這些均通過引用并入本文）。在一些實施方式中，測量步驟包括加入化學發(fā)光化合物和活化劑，其中化學發(fā)光標簽催化該反應?；瘜W發(fā)光化合物是本領域公知的，并且在上述參考文獻中描述。在化學發(fā)光化合物選自2,3-二氫-1，4-酞嗪二酮魯米諾，5-氨基-6,7,8_三甲氧基-和二甲基氨基[ca]苯并類似物的一些實施方式中，測量步驟包括加入堿性過氧化氫或次氯酸鈣和堿，它們誘導標記發(fā)光。在化學發(fā)光化合物為2,4,5-三苯基咪唑族或草酸酯族化合物（例如，草酰活性酯）的其他實施方式中，測量步驟包括加入含有氧化試劑的堿性緩沖液，其誘導該化合物發(fā)出綠光。在發(fā)光標簽包含螢光素酶的另外其他的實施方式中，測量步驟包括加入螢光素以誘導發(fā)光。在化學發(fā)光化合物是吖啶酯族化合物的再進一步的實施方式中，測量步驟包括在中性-堿性條件下加入超氧陰離子。[0084]在本文所述方法的一些實施方式中，分開測量保留在混合物中的可檢測標記與被隔離到插入物上的可檢測標記使得用戶能夠在溫育步驟后立即進行該測量步驟，而不需要任何對混合物的中間調(diào)節(jié)或?qū)⒒旌衔镛D(zhuǎn)移到孔外（例如，不需要中間洗滌步驟）。在一些實施方式中，在不調(diào)節(jié)混合物的內(nèi)容物或?qū)⒒旌衔镛D(zhuǎn)移到孔外的情況下測量可檢測標記的量。在特定實施方式中，分開測量保留在混合物中的標記與被隔離到插入物上的標記包括將插入物移至新的孔。在更具體的實施方式中，測量原始孔中保留在混合物中的可檢測標記的量可以與測量新的孔中被隔離到插入物上的標記的量的相結(jié)合，以指示液體樣品中的分析物的量（例如，通過比率測量分析）。[0085]使用本文所述的插入物陣列的方法可以用于眾多的高通量、多重分析。例如，插入物陣列可用于測量多個液體樣品中的感興趣的分析物，或者用于測量分配到多個孔中的液體樣品中的多種分析物，或者測量多個液體樣品中的多種分析物。在特定實施方式中，插入物陣列用于高通量細胞篩選目的。在更具體的實施方式中，插入物陣列用于利用以上描述的方法鑒定表達分泌的多肽的細胞。在更具體的實施方式中，該分泌的多肽是異源多肽。在這些實施方式中，該一種或多種液體樣品包含細胞培養(yǎng)基，在該細胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達所述多肽的細胞。設備[0086]在另一方面，本發(fā)明提供適合用于進行本文所述的結(jié)合測定的設備。在一些實施方式中，該設備包括讀板儀器械，所述讀板儀器械能夠檢測和/或測量來自含有本發(fā)明的插入物的多孔板的一個或多個孔的信號。在一些實施方式中，讀板儀器械可配置用于檢測和/或測量來自6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板或3456孔板的信號。讀板儀是本領域技術(shù)人員所熟知的，并且很容易購得。例如，市售讀板儀的實例包括例如Perkin-ElmerLS55發(fā)光光譜儀、LJLBiosystemsAnalystPlateReader(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)、CytoFluor.TM.2300機器（Millipore)〇[0087]在一些實施方式中，讀板儀器械包括光源、檢測器以及光中繼結(jié)構(gòu)，所述光中繼結(jié)構(gòu)被配置用于將光從光源引向與多孔裝置的孔相對應的目標區(qū)域。[0088]合適的光源包括例如高強度燈、白熾燈、焚光燈、電致發(fā)光器件、激光器、激光二極管以及發(fā)光二極管（LED)等。在一些實施方式中，光源被配置用于提供連續(xù)照射。在其他實施方式中，光源被配置用于提供時變照射，例如，脈沖激光器。光源可被配置用于產(chǎn)生相干和/或非相干光。光源還可被配置用于提供偏振和/或非偏振光。示例性光源包括Q開關YAG激光器、Nd:V04激光器、Nd:玻璃激光器、Nd:YAG激光器、氮激光器、Q開關氬激光器、Ti:藍寶石激光器、光纖激光器，或者任何合適的激光器或單色光源。[0089]在一些實施方式中，讀板儀包括光導引器，所述光導引器將源光引向與多孔裝置的一個或多個孔相對應的一個或多個目標區(qū)域。在特定實施方式中，光導引器被配置用于向與單個孔相對應的單個目標區(qū)域提供源光，以及在孔與孔之間移動，并且在每個孔處存在停留時間，在此期間光導引器將源光引向孔的目標區(qū)域。在這些情況下，將會一次一個地照射多孔裝置的孔。[0090]在其他實施方式中，光導引器包括光圖案發(fā)生器，該光圖案發(fā)生器能夠?qū)⒃垂庖蚺c多孔裝置的多個孔相對應的多個目標區(qū)域。光圖案發(fā)生器通常包括能夠?qū)⒐獠倏v成預選光圖案的任何機制。該圖案可以使用衍射、折射、反射和/或其他機制，或者它們的組合來創(chuàng)建。光圖案發(fā)生器可用于生成光的任何期望的圖案，包括一維或二維圖案（或陣列）。例如，光圖案發(fā)生器可被配置用于創(chuàng)建任何尺寸的規(guī)則形狀的子束陣列。例如，所期望的圖案可以是被定位成與多孔裝置的一個或多個目標孔的間距相對應的基本上相等的目標區(qū)域的陣列。在一些情況下，光圖案發(fā)生器提供跨每個目標區(qū)域的均一的光強度。在其他實施方式中，所期望的圖案對應于多孔裝置的孔內(nèi)的多個目標區(qū)域（例如，對應于多個空腔）。在一些實施方式中，所期望的圖案對應于基本上包括混合物體積但不包括插入物的孔的區(qū)域，或反之亦然。[0091]在一些實施方式中，讀板儀附加地包括檢測器設備，該檢測器設備檢測來自多孔裝置的多個孔的響應光，并由所述響應光生成與可檢測標記有關的信號。在【具體實施方式】中，檢測器設備包括單個檢測器，該單個檢測器被配置用于檢測來自與多孔裝置的單個孔相對應的單個目標區(qū)域的光。在更具體的實施方式中，在孔與孔之間移動所述單個檢測器，并且在每個孔處存在停留時間，在此期間來自響應光的信號被數(shù)字化并存儲到存儲器中。[0092]在其他實施方式中，檢測器設備包括光中繼結(jié)構(gòu)，該光中繼結(jié)構(gòu)被配置用于將來自多個孔的響應光引向與所述多個孔中的單獨的孔相對應的多個光檢測器。在具體實施方式中，多個光檢測器同時檢測來自所述多個孔的響應光。在更具體的實施方式中，檢測器設備通過使用CCD相機或其他成像設備（例如，基于CMOS芯片的相機）拍攝整個板的快照來同時檢測來自所述多個孔的響應光。[0093]在一些實施方式中，該設備可任選地包括處理器，該處理器適于與讀板儀通信和處理來自讀板儀的數(shù)據(jù)。在一些實施方式中，讀板儀向處理器通信由檢測器設備所生成的信號。處理器可以將該信號轉(zhuǎn)換成指示出可檢測標記在目標區(qū)域中的存在或量的測量值。在一些實施方式中，處理器還被配置用于向讀板儀通信用戶定義的實驗設置。例如，用戶可以設定讀板儀是進行對板的頂部讀取還是底部讀取，可以選擇他/她希望從中獲得數(shù)據(jù)的孔，可以設定測定的類型（例如，熒光測定還是發(fā)光測定），可以定義熒光測定的激發(fā)/發(fā)射設置，或者可以定義用于將源光引向特定孔中的特定目標區(qū)域的預選光圖案。本文所描述的處理器可以集成到讀板儀或作為體現(xiàn)在可操作地連接至讀板儀的計算機中的單獨的組件。在優(yōu)選實施方式中，由于孔的底部表面可能提供降低測量精確度的光學干涉，因此用戶選擇頂部讀取。[0094]在一些實施方式中，讀板儀能夠檢測來自單個孔內(nèi)的多個限定的目標子區(qū)域（掃描點）的信號。在一些實施方式中，讀板儀能夠從來自多孔板的多個孔的相同的多個限定的目標子區(qū)域檢測信號。在其他實施方式中，該設備包括軟件，該軟件能夠圖形地顯示來自每個目標子區(qū)域的信號以創(chuàng)建每個孔的圖譜（map)。在其他實施方式中，該設備包括處理器，該處理器能夠使用戶能夠選擇或移除孔的單獨的目標子區(qū)域或整個部分以便進行分析，從而限定孔的檢測區(qū)。在一些實施方式中，用戶選擇基本上不包括插入物的檢測區(qū)。在其他實施方式中，用戶選擇通過基本上排除插入物的空腔而選擇包括插入物的檢測區(qū)。能夠以本文所述的方式對孔進行掃描的讀板儀是本領域已知的，并且可商購自多個供應商，例如，PHERAstarFS(BMGLabtech)、EnSpireMultimodePlateReader(PerkinElmer)、GeminiEMFluorescenceMicroplateReader(MolecularDevices)等。[0095]在一些實施方式中，計算機附加地包括接口，該接口通信地耦合至云，該云可以包括用于數(shù)據(jù)存儲和/或進一步處理的一個或多個外部服務器。[0096]圖5提供了本發(fā)明的示例性設備（500)的示意圖。該設備包括：多孔設備，其具有一個或多個孔，所述一個或多個孔在其中插入有本發(fā)明的插入物（510);讀板儀（520)，其能夠檢測與可檢測標記有關的信號并將所述信號通信至計算機（530)，該計算機能夠?qū)⑺鲂盘栟D(zhuǎn)換成指示出可檢測標記的存在或量的測量數(shù)據(jù)，并且任選地能夠?qū)?shù)據(jù)中繼到云(540)。當需要時，讀板儀本身或者可操作地連接的計算機包含被檢測的給定分析物的參考或標準圖表，以實現(xiàn)對測試樣品中該分析物的定量分析。試劑盒[0097]在另一方面，本發(fā)明提供用于測量多孔裝置的孔中的液體樣品中存在的分析物的試劑盒。在一些實施方式中，試劑盒包括一個或多個本文所述的插入物，其中所述插入物在其上固定有結(jié)合劑。在一些實施方式中，試劑盒還包括關于使用該插入物進行結(jié)合測定以測量分析物的說明書。[0098]在其他實施方式中，試劑盒包括經(jīng)標記的示蹤物。在一些實施方式中，選擇經(jīng)標記的示蹤物和結(jié)合劑，使得經(jīng)標記的示蹤物對分析物和對結(jié)合劑具有相似的結(jié)合親和力。在進一步的實施方式中，選擇結(jié)合劑使得其不具有明顯的對分析物的結(jié)合親和力。在進一步的實施方式中，使用說明書指導用戶測量保留在混合物中的可檢測標記的量，其中所述量與液體樣品中的分析物的量成正比。在其他實施方式中，使用說明書指導用戶測量被隔離到所述一個或多個插入物上的可檢測標記的量，其中所述量與液體樣品中分析物的量成反比。[0099]在備選的實施方式中，選擇經(jīng)標記的示蹤物和結(jié)合劑，使得所述結(jié)合劑能夠與分析物在第一位點結(jié)合，并且經(jīng)標記的示蹤物能夠與分析物在第二位點結(jié)合。在進一步的實施方式中，經(jīng)標記的示蹤物不具有明顯的對結(jié)合劑的結(jié)合親和力。在進一步的實施方式中，使用說明書指導用戶測量保留在混合物中的可檢測標記的量，其中所述量與液體樣品中分析物的量成反比。在其他實施方式中，使用說明書指導用戶測量被隔離到所述一個或多個插入物上的可檢測標記的量，其中所述量直接與液體樣品中分析物的量成正比。[0100]在一些實施方式中，試劑盒進一步包括標準，例如，用于在本發(fā)明的測定中使用的標準。標準的實例例如包括包含已知濃度的分析物的儲備溶液，其中所述儲備溶液可以連續(xù)稀釋以產(chǎn)生標準曲線。[0101]本文提供了本發(fā)明的插入物和方法的其他示例性實施方式。實施例1:利用本發(fā)明的插入物的競爭性FLISA測定[0102]為了制備插入物，外徑為6mm且內(nèi)徑為4mm的塑料管購自Graingers(目錄號2vdn6和2vdp4)并切成約6mm高的、具有鋒利刀片的圓柱體。將這些圓柱體在INNaHCCV^液中煮沸約10分鐘，用去離子水漂洗5遍，并風干。然后將這些圓柱體浸沒于在包被緩沖液(0·INNaHCO3,pH9.0)中制備的5微克/ml山羊抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號109-005-003)中，并在約4-9°C下溫育過夜。將包被的環(huán)在PBS中漂洗3遍，備用。包被的漂洗物可以風干并貯存以供以后使用。將制備的免疫吸附性插入物插入到96孔板的孔中。圖6描繪了插入到96孔板中的插入物的示例性照片。[0103]將人γ球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號009-000-002)和AlexaFluor⑧488偶聯(lián)的ChromoPure人IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號009-540-003)在FLISA緩沖液（含有0·I%吐溫20和I%BSA的PBS)中稀釋。以1:2的比例從5微克/ml的起始濃度制備人γ球蛋白的一系列稀釋液。一式兩份，將人γ球蛋白溶液以100微升/孔添加到具有免疫吸附性插入物的96孔板中，或者添加到已用5微克/ml山羊抗-人IgG(H+L)包被的96孔板中。然后，除了只接受150微升FLISA緩沖液的空白對照孔外，向各孔添加50微升的45微克/mlAlexaFluor⑧488偶聯(lián)的ChromoPure人IgG。然后將板在振蕩器上短時混合，并在37°C下溫育2小時或在約4-9°C下溫育過夜，之后用PerkinElmerEnvision讀板儀讀取。使用493nm的激發(fā)光照射各孔，并從各孔檢測519nm的發(fā)射光。將數(shù)據(jù)作為重復試驗的平均值來作圖，并通過曲線擬合進行分析。圖7描繪了作為人γ球蛋白濃度的函數(shù)的熒光強度的圖。數(shù)據(jù)表明，在具有插入物（包被的環(huán)）的孔中，熒光強度隨人γ球蛋白濃度的增加（其范圍為0.08至2.5微克/ml)而線性增加。相反，不同的人γ球蛋白組的熒光強度在直接用抗體包被的板中保持為平線。實施例2:利用本發(fā)明的插入物的夾心FLISA測定[0104]為了制備插入物，外徑為1/4"的尼龍管購自Graingers(目錄號2vdn6和2ν4)并切成約3mm高的、具有鋒利刀片的圓柱體。將這些圓柱體在IMNaHCO3溶液中煮沸10分鐘，用去離子水漂洗5遍，并風干。然后將這些圓柱體浸沒于在包被緩沖液（0.INNaHCO3,pH9.0)中制備的5微克/1111山羊抗人]^61〇輕鏈（5〇111:1161'1113;[(^6(311，目錄號2060-01)中，并在4-9°C下溫育過夜。包被的環(huán)在PBS中漂洗3遍，通過在PBS中與0.5%牛白蛋白一起溫育而封閉，備用。將制備的環(huán)插入到96孔板（E&KScientific，EK-25076)的孔中。[0105]將人γ球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號009-000-002)在樣品緩沖液（含有0.I%吐溫20和I%BSA的PBS)中稀釋。從1微克/ml的濃度開始，以稀釋倍數(shù)2制備人γ球蛋白的一系列稀釋液。一式兩份，將人γ球蛋白溶液以100微升/孔添加到96孔板的孔中，該96孔板具有用上述抗-人κ輕鏈抗體包被的圓柱形插入物。在室溫下溫育60分鐘后，采用洗板器，用300微升/孔含有0.1%吐溫20的PBS洗板3次。然后，除了只接受100微升Probe緩沖液（含有0.1%吐溫20和0.1%BSA的PBS)的空白對照孔外，以100ng/ml的濃度添加（100微升/孔）在Probe緩沖液中稀釋的AlexaFlu〇?488偶聯(lián)的AffiniPure抗-人IgGFc特異性抗體（JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc.，目錄號109-545-098)。將板在室溫下在輕輕振搖下溫育45分鐘，之后用PerkinElmerEnvisionMultipurpose讀板儀讀?。ぐl(fā)493nm，發(fā)射519nm)。將數(shù)據(jù)作為重復試驗的平均值來作圖，并采用MicrosoftExcel通過曲線擬合進行分析。如圖8所示，熒光強度隨人γ球蛋白濃度的增加而線性降低。[0106]雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但本領域技術(shù)人員將會明白，這些實施方式僅以實例的方式提供。在不背離本發(fā)明的情況下，本領域技術(shù)人員現(xiàn)在將會想到許多變更、變化和替換。應當理解，本文描述的本發(fā)明實施方式的各種備選的方式可用于實施本發(fā)明。下面的權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，因此由此涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。【權(quán)利要求】1.一種用于插入到多孔裝置的孔中的插入物，所述插入物包含基本上不含微孔的內(nèi)表面和外表面；其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑；其中所述插入物的尺寸設置為小于所述孔，使得所述插入物可以插入到所述孔中。2.-種用于插入到多孔裝置的孔中的插入物，所述插入物包含內(nèi)表面和外表面，其中所述內(nèi)表面和/或外表面在其上固定有結(jié)合劑，其中所述外表面具有的直徑小于所述孔的直徑，使得所述插入物可以插入到所述孔中；其中所述插入物向多孔裝置的孔中的所述插入使得所述孔與所述裝置的相鄰孔在光學上隔離。3.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物由不透明的材料制成。4.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物在形狀上為圓柱形。5.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物是中空的。6.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物包含多個空腔。7.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述插入物的尺寸設置為可從所述孔中移除。8.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述結(jié)合劑包含抗體。9.如權(quán)利要求1或2所述的插入物，其中所述結(jié)合劑包含抗原。10.-種用于插入到多孔裝置的多個孔中的插入物陣列，其中每個單獨的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設置為允許同時向所述多個孔的每個單獨的孔中插入和任選地移除每個單獨的插入物，其中所述單獨的插入物包含內(nèi)表面和外表面，所述內(nèi)表面和外表面中的任一個或兩個在其上固定有結(jié)合劑，其中所述內(nèi)表面和/或外表面基本上不含微孔。11.一種用于插入到多孔裝置的多個孔中的插入物陣列，其中每個單獨的插入物被安裝在連續(xù)的固體框架上，所述框架的尺寸設置為允許同時向所述多個孔的每個單獨的孔中插入和任選地移除每個單獨的插入物，其中所述單獨的插入物包含內(nèi)表面和外表面，所述內(nèi)表面和外表面中的任一個或兩個在其上固定有結(jié)合劑，其中所述單獨的插入物向所述單獨的孔中的插入使得所述孔與所述裝置上的其他相鄰孔在光學上隔離。12.如權(quán)利要求10或11所述的插入物陣列，其中所述框架的尺寸設置為允許同時向所述多孔裝置的每個單獨的孔中插入和移除所述每個單獨的插入物。13.-種多孔裝置，其包含如權(quán)利要求10或11所述的插入物陣列。14.如權(quán)利要求13所述的多孔裝置，其中所述多孔裝置是具有6、12、24、96、384、1536或3456個孔的多孔板。15.-種包含多個孔的多孔裝置，所述多個孔中的至少一個孔包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物。16.如權(quán)利要求15所述的多孔裝置，其中所述多孔裝置是具有6、12、24、96、384、1536或3456個孔的多孔板。17.-種測量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使所述分析物和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(C)測量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。18.-種測量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中在不將所述混合物轉(zhuǎn)移到孔外或調(diào)節(jié)所述混合物的內(nèi)容物的情況下測量保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量。20.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中在從所述孔中移除插入物后測量保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量。21.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述方法能夠以3.9至1000ng/ml的線性檢測范圍測量所述分析物。22.-種測量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使所述分析物和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的所述可檢測標記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。23.-種測量孔中液體樣品中存在的分析物的方法，其包括：(a)向含有液體樣品的孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物，其中所述孔中包含如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測量被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上的可檢測標記的所述第二量，其中所述第二量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中在不將所述混合物轉(zhuǎn)移到孔外或調(diào)節(jié)所述混合物的內(nèi)容物的情況下測量保留在所述混合物中的所述可檢測標記的第二量。25.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中在從所述孔中移除插入物后測量所述可檢測標記的所述第二量。26.-種在多孔裝置中在分析物和包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物的混合物中進行結(jié)合測定的方法，該方法包括：(a)向如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的陣列的多個插入物上添加所述經(jīng)標記的示蹤物；(b)使所述分析物和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該分析物或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測量所述多個孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成比例。27.-種在多孔裝置中在分析物和包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物的混合物中進行結(jié)合測定的方法，該方法包括：(a)向如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的陣列的多個插入物上添加所述經(jīng)標記的示蹤物；(b)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述分析物上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一分析物上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述混合物中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(c)測量所述多個孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該混合物中的所述分析物的量成反比。28.-種鑒定表達分泌的異源多肽的細胞的方法，其包括：(a)提供包含多個孔的多孔裝置，其中所述多個孔中的每個孔中插有如權(quán)利要求1或2所述的插入物，并且其中所述多個孔中的每個孔包含細胞培養(yǎng)基，在該細胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達所述多肽的細胞；(b)向所述包含細胞培養(yǎng)基的多個孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物；(c)使所述多肽和所述結(jié)合劑競爭所述示蹤物的結(jié)合一段充足的時間，以實現(xiàn)復合物的形成，該復合物包含在混合物中的該示蹤物以及該多肽或該結(jié)合劑中之一，其中所述競爭導致第一量的所述可檢測標記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(d)測量所述孔中保留在所述混合物中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于所述細胞培養(yǎng)基中的所述多肽的量成比例，由此鑒定表達分泌的異源多肽的細胞。29.-種鑒定表達分泌的異源多肽的細胞的方法，該方法包括：(a)提供包含多個孔的多孔裝置，其中所述多個孔中的每個孔中插有如權(quán)利要求1或2所述的插入物，并且其中所述多個孔中的每個孔包含細胞培養(yǎng)基，在該細胞培養(yǎng)基中已培養(yǎng)有被懷疑表達所述多肽的細胞；(b)向所述包含細胞培養(yǎng)基的多個孔中加入包含可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物以形成混合物；(C)使得在所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上形成復合物，其中該復合物包含（1)與所述多肽上的第一結(jié)合位點結(jié)合的經(jīng)標記的示蹤物，和（2)與同一多肽上的第二結(jié)合位點結(jié)合的結(jié)合劑，所述形成導致第一量的所述可檢測標記保留在所述培養(yǎng)基中而第二量的所述可檢測標記被隔離到所述插入物的內(nèi)表面和/或外表面上；以及(d)測量所述孔中保留在所述培養(yǎng)基中的所述可檢測標記的所述第一量，其中所述第一量與存在于該培養(yǎng)基中的所述多肽的量成反比；由此鑒定表達所述異源多肽的細胞。30.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述可檢測標記是放射性探針。31.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述可檢測標記是光學可檢測的標記。32.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述可檢測標記包含熒光染料。33.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述分析物是分泌的蛋白質(zhì)。34.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述測量包括將光引向所述孔中的觀察體積，其中所述觀察體積基本上被所述第一量的所述可檢測標記所占據(jù)，但基本上不含所述第二量的所述可檢測標記。35.-種用于測量孔中液體樣品中存在的分析物的設備，其包含：(a)多孔裝置，其包含（i)其中插入一個或多個如權(quán)利要求1或2所述的插入物的一個或多個孔，其中所述孔包含含有經(jīng)標記的示蹤物的混合物，該經(jīng)標記的示蹤物包含可檢測標記；(b)讀板儀，其能夠（i)從所述一個或多個孔檢測所述標記。36.如權(quán)利要求35所述的設備，其中所述讀板儀包含被編程為產(chǎn)生與所述檢測的標記相對應的信號的處理器，并且其中所述讀板儀可操作地連接到計算機，該計算機被配置成（i)從所述讀板儀接收所述信號；并（ii)從所述信號生成定量測量數(shù)據(jù)；以及任選地(iii)將所述定量測量數(shù)據(jù)中繼到云服務器。37.如權(quán)利要求35所述的設備，其中所述讀板儀能夠被配置成從基本不含所述一個或多個插入物的限制的體積中檢測所述標記。38.如權(quán)利要求35所述的設備，其中所述讀板儀能夠檢測放射性標記。39.如權(quán)利要求35所述的設備，其中所述讀板儀能夠檢測光學可檢測的標記。40.如權(quán)利要求39所述的設備，其中所述光學可檢測的標記包含熒光染料。41.如權(quán)利要求40所述的設備，其中所述光學可檢測的標記包含發(fā)光標記。42.-種用于測量多孔裝置的一個或多個孔中液體樣品中存在的分析物的試劑盒，其包含：(a)-個或多個如權(quán)利要求1或2所述的插入物；(b)關于使用所述一個或多個插入物進行結(jié)合測定以測量所述分析物的說明書。43.如權(quán)利要求42所述的試劑盒，其進一步包含含有可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物，其中所述經(jīng)標記的示蹤物能夠與所述分析物或所述結(jié)合劑形成復合物。44.如權(quán)利要求43所述的試劑盒，其中所述結(jié)合劑能夠與所述分析物在第一結(jié)合位點形成復合物。45.如權(quán)利要求43所述的試劑盒，其進一步包含含有可檢測標記的經(jīng)標記的示蹤物，其中所述經(jīng)標記的示蹤物能夠與所述分析物在第二結(jié)合位點形成復合物?！疚臋n編號】G01N1/36GK104520690SQ201380039736【公開日】2015年4月15日申請日期:2013年3月13日優(yōu)先權(quán)日:2012年5月25日【發(fā)明者】李榮皓申請人:珠海愷瑞生物科技有限公司(中國)