檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測定方法。所述的檢體前處理方法為免疫測定方法中的檢體前處理方法，其特征在于，所述檢體為來自于鼻涕的檢體，在實施所述免疫測定方法之前用蛋白酶對所述檢體進行處理，其中，所述蛋白酶為半堿性蛋白酶(EC3.4.21.63)，所述檢體中的測定對象物質為流感病毒；所述免疫測定方法為下述方法：使所述檢體中的測定對象物質與負載在不溶性載體粒子上且與所述測定對象物質發(fā)生免疫反應的免疫學物質發(fā)生免疫反應，測定此時產生的所述不溶性載體粒子的凝集程度，由此測定所述測定對象物質的濃度。
【專利說明】檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測定方法
[0001]本分案申請為申請?zhí)?00580042948.2 (國際申請?zhí)朠CT / JP2005 / 022883)、申請日2005年12月13日的發(fā)明專利的分案申請，該發(fā)明專利申請的發(fā)明名稱為“檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測定方法”。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測定方法。
【背景技術】
[0003]利用了抗原抗體反應的免疫測定方法由于能夠以高靈敏度檢測出檢體或試樣中的成分或者物質，因此在臨床檢查領域中，以血液(血漿、血清、全血)、尿、脊髓液、糞便等各種檢體等為對象而被利用。作為利用了抗原抗體反應的免疫測定方法，例如有酶免疫測定法(EIA法)、熒光免疫測定法(FIA)、化學發(fā)光免疫測定法(CLIA)、免疫層析法、免疫比濁法TIA法)、膠乳免疫比濁法(LTIA)等各種方法。
[0004]其中，免疫比濁法、膠乳免疫比濁法、在載玻片上的膠乳凝集法(以下有時將這3種方法統(tǒng)稱為“免疫凝集法”)由于其原理為不需要將抗原和未反應的抗體進行分離的B /F(結合/自由)分離的操作，因此稱為均相免疫測定。而且，作為簡便性和迅速性優(yōu)異的方法，適用在例如CRP (C反應性蛋白)、AS0(抗鏈球菌溶血素O)、RF(類風濕因子)、尿中微量白蛋白、彈性蛋白酶等多個項目的臨床檢查中。
[0005]這些免疫凝集法的測定對象檢體通常為血液(血清、血漿、全血)、尿、宮頸粘液等。另一方面，對于作為鼻腔擤出液、鼻腔吸引液、鼻腔洗滌液等采集的來自于鼻涕的檢體，作為其測定的項目，有時用于判定流感病毒、RS病毒等呼吸器官感染癥。但是，這些項自的測定方法的原理均為利用了免疫層析法或膜過濾器的EIA法，對于來自于鼻涕的檢體，利用免疫凝集法的測定方法目前還未實用化(例如參照非專利文獻I?4)。
[0006]另外，來自于鼻涕的檢體根據個別檢體的差別而有一定程度的不同，多為具有某種程度的粘性的檢體，由該情況也可知，除了目標的測定對象物質之外，還非常大量地含有糖蛋白等高分子物質。在利用了免疫層析法或膜過濾器的EIA法中，雖然原因物質還未確定，但已知有時會發(fā)生檢體中的共存物質發(fā)生非特異性反應、從而導致錯誤檢查結果的情況。由于錯誤的檢查結果導致假陽性時，會延誤真正病因的確定，而且有時還會發(fā)生由于不恰當的措施而加重病癥使其惡化的情況。因此，來自于鼻涕的檢體例如添加表面活性劑后使粘度降低、或者預先使用濾紙或濾器等將來自于鼻涕檢體中的固體物質(共存物質)除去后進行測定。但是，即便這樣，由于非特異性的反應，還是產生很多假陽性。
[0007]本發(fā)明人等對與利用了簡單的免疫層析法或膜過濾器的EIA法同樣地、利用簡單的免疫凝集法對來自于鼻涕的檢體也進行測定，對此進行了研究。但是，在僅添加表面活性齊U、或僅預先進行固體成分的除去處理的檢體前處理中，仍然發(fā)生了很多的非特異性反應，本來應該為陰性的檢體呈現陽性，即產生了假陽性。
[0008]非專利文獻1:日本小兒科學會雜志108卷3號406-411 (2004)[0009]非專利文獻2:感染癥學雜志第78卷9號865-871 (2004)
[0010]非專利文獻3:感染癥學雜志第77卷12號1007-1014(2003)
[0011]非專利文獻4:醫(yī)學檢查 VOL.52N0.2141-144(2003)

【發(fā)明內容】

[0012]因此，本發(fā)明的目的在于提供在免疫測定方法中防止非特異性反應、同時能夠對來自于鼻涕的檢體進行測定的檢體前處理方法和使用了該方法的免疫測定方法。
[0013]為了實現上述目的，本發(fā)明的檢體前處理方法為免疫測定方法中的檢體前處理方法，上述檢體為來自于鼻涕的檢體，是在實施上述免疫測定方法之前利用蛋白酶對上述檢體進行處理的檢體前處理方法。
[0014]另外，本發(fā)明的免疫測定方法為利用了免疫反應的免疫測定方法，檢體為來自于鼻涕的檢體，是對該檢體通過上述本發(fā)明的檢體前處理方法進行前處理之后，實施上述免疫反應的免疫測定方法。
[0015]這樣，如果利用蛋白酶預先對來自于鼻涕的檢體進行處理，則即便是免疫測定方法，也能夠進行防止了非特異性反應的測定。結果，通過本發(fā)明，可以實現簡便性和迅速性優(yōu)異的來自于鼻涕的檢體的測定。
【具體實施方式】
[0016]下面，詳細地說明本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明中，上述免疫測定方法沒有特別限定，例如有下述方法:使上述檢體中的測定對象物質與負載在不溶性載體上且與上述測定對象物質發(fā)生免疫反應的免疫學物質發(fā)生免疫反應，測定此時所產生的上述不溶性載體的凝集程度，由此對上述測定對象物質的濃度進行測定(所謂的“免疫凝集法”)。本發(fā)明的檢體前處理方法優(yōu)選用于上述免疫凝集法中。
[0018]本發(fā)明中適用的蛋白酶沒有特別限定，例如除了來自于動物、植物的蛋白酶之外，還可以列舉出曲霉菌屬、桿菌屬、鏈霉菌屬、根霉屬、青霉屬等來自于微生物的蛋白酶。作為具體的酶的名稱，例如可以列舉出半堿性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等。蛋白酶并非僅可使用I種，還可以并用2種以上。
[0019]來自于鼻涕的檢體例如可以使用作為鼻腔擤出液、鼻腔吸引液、鼻腔洗滌液而獲得的物質。
[0020]另外，本發(fā)明中，當測定對象物質為流感病毒時，可以優(yōu)選使用。此時,如果使用本發(fā)明，則通過對上述不溶性載體的凝集程度進行定量，可以定量地測定病毒量。通過對應于臨床癥狀進行判斷，當檢體中的病毒量多時，則可以預想該患者的重病程度達到某種程度，另外，可以預想該患者對周圍人的傳染力較強。當隨著發(fā)病時間的推移病毒量減少時，也可以容易地判斷為感染末期，可以有助于治療方針和對患者進行說明。
[0021]利用蛋白酶進行的來自于鼻涕的檢體的處理除了使用蛋白酶之外，沒有特別限定，例如與測定蛋白酶的酶活性的情況相同，在酶活性有效的P H范圍內，可以在一般的條件下進行。當蛋白酶為半堿性蛋白酶時，例如將酶溶解在50mM的CHES (N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液(pH為9.8、含有I重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.1重量％的EDTA *2Na、0.9重量％的NaCl、0.09重量％的疊氮化鈉)中，將該溶液作為檢體提取液，使其與來自于鼻涕的檢體發(fā)生反應。另外，上述檢體提取液的緩沖液并非限定于上述CHES緩沖液，例如也可以優(yōu)選使用磷酸緩沖液、Tris-鹽酸(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)緩沖液、CAPS (N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)緩沖液等。另外，緩沖液的pH例如優(yōu)選為pH5?11，在該PH范圍的情況下，例如緩沖劑的種類也沒有特別限定。當蛋白酶為胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶時，例如可以溶解在50mM的Tris-鹽酸緩沖液(pH為8.4、含有4.1重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.03重量％的0&(:12、0.9重量％的似(:1、
0.09重量％的疊氮化鈉)，然后與來自于鼻涕的檢體發(fā)生反應。
[0022]在這些優(yōu)選的蛋白酶中，例如從最不易受到檢體的影響、且與上述不溶性載體的相容性特別良好的觀點出發(fā)，特別優(yōu)選使用半堿性蛋白酶(EC3.4.21.63)作為本發(fā)明的蛋白酶。
[0023]本發(fā)明中，上述免疫測定方法如上所述，優(yōu)選為利用使用了不溶性載體的免疫凝集法的方法。作為上述不溶性載體，沒有特別限定，可以列舉出不溶性載體粒子。作為上述不溶性載體粒子，例如通常為聚苯乙烯制的膠乳粒子，但并不限定于聚苯乙烯，還可以使用聚丙烯制粒子、聚乙烯制粒子、明膠粒子、金屬膠體等能夠致敏抗體或抗原的粒子。粒子與抗原或抗體的結合例如可以適用利用了物理吸附力的物理吸附法，另外，例如還可以是使上述粒子上的羧基與抗原或抗體的氨基發(fā)生共價鍵合等的化學結合法。凝集程度的檢測方法例如可以使用用于測定濁度的分光光度計等自動控制的光學測定裝置，還可以是使用目測確認在載玻片上等有無凝集的方法。
[0024]本發(fā)明中，當測定對象物質為流感病毒時，優(yōu)選鑒別流感病毒的A型和B型。此時，例如優(yōu)選使用對流感病毒的核蛋白特異性的抗體。作為流感病毒表面蛋白的血細胞凝集素等，由于抗原性逐漸變異，因此當使用一定的抗血細胞凝集素抗體時，根據流行的病毒的亞型不同而反應性有所不同，有些情況下有可能不發(fā)生反應。但是，如果使用針對核蛋白的抗體，則由于核蛋白維持將A型和B型分類時的基本的抗原性，顯示出與亞型種類無關的恒定的反應性，因此適于鑒別A型和B型。
[0025]核蛋白由于局部存在于由病毒粒子的脂質雙層膜構成的包膜內部、且不存在于病毒表面，因此有必要用某些方法將核蛋白提取出來。作為該方法，例如有超聲波處理或反復進行冷凍融化的物理的病毒粒子破壞或者利用表面活性劑等的化學處理方法。在化學處理方法中，一般來說有利用TWeen20(商品名，常用名為聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)之類的非離子性表面活性劑等的提取劑進行提取的方法。在EIA法或免疫層析法等以往的方法中，在抗原的提取中使用作為表面活性劑的TWeen20，但如果將TWeen20直接用于膠乳免疫比濁法中，則對抗原的反應性顯著降低。此時，如果使用正-辛酰基-N-甲基葡萄糖酰胺(商品名:MEGA-8)作為表面活性劑，則很少影響到膠乳免疫比濁反應的反應性，且還具有提取效果，因此優(yōu)選。
[0026]下面說明本發(fā)明的實施例。但本發(fā)明并不限定于下述實施例。
[0027]實施例1
[0028](實驗I)抗流感A型抗體致敏膠乳的制備
[0029]將0.5mL的按照抗流感A型小鼠單克隆抗體的濃度達到0.8mg / mL的方式制備的抗體液(50mM磷酸緩沖液，pH為7.4)和0.5mL的1% (w / v)的聚苯乙烯膠乳粒子(積水化學公司生產，平均粒徑為0.5 μ m)進行混合，在37°C下培養(yǎng)I小時，使抗體致敏于膠乳。在其中添加BSA(Sigma公司生產、牛血清白蛋白)，使其達到I重量％，在37°C下培養(yǎng)I小時后進行封閉。利用50mM磷酸緩沖液(pH為7.4)洗滌封閉了的抗體致敏膠乳后，在膠乳分散緩沖液(50mM的Tris-HCl緩沖液，pH為8.4,0.1重量％的BSA、0.I重量％的NaN3)中分散，使其達到0.1% (w / V)，從而制成抗流感A型抗體致敏膠乳試液。
[0030](實驗2)抗流感B型抗體致敏膠乳的制備
[0031]將0.5mL的按照抗流感B型小鼠單克隆抗體的濃度達到0.6mg / mL的方式制備的抗體液(50mM磷酸緩沖液，pH為7.4)和0.5mL的1% (w / v)的聚苯乙烯膠乳粒子(積水化學公司生產，平均粒徑為0.6 μ m)進行混合，在37°C下培養(yǎng)I小時，使抗體致敏于膠乳。封閉之后的操作與(實驗I)同樣地進行，從而制成抗流感B型抗體致敏膠乳試液。
[0032]以下的一系列實驗為使用半堿性蛋白酶作為蛋白酶所進行的實驗。
[0033](實驗3)檢體提取液的制備
[0034]將0.4mg的半喊性蛋白酶(來自于蜂蜜曲霉(Aspergillus me Ileus) > AmanoEnzyme公司生產的半堿性蛋白酶)溶解在ImL的含有I重量％的正-辛酰基-N-甲基葡萄糖酰胺(商品名MEGA-8、以下相同)、0.I重量％的EDTA.2Na、0.9重量％的NaCl、0.09重量％的疊氮化鈉的50mMCHES (N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液(pH為9.8)中，制成檢體提取液A。
[0035]另夕卜，將0.4mg的半堿性蛋白酶(來自于蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、AmanoEnzyme公司生產的半堿性蛋白酶)溶解在ImL的含有I重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.5重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA.2Na的50mM Tris-HCl緩沖液(pH為8.4)中，制成檢體提取液B。
[0036](實驗4)利用膠乳免疫比濁法測定流感A型抗原標準液
[0037]使用精制流感A型病毒A / Kiev / 301 / 94(H3N2)作為抗原，將其利用檢體稀釋液(含有I重量％的BSA和0.1重量％的疊氮化鈉的PBS，pH為7.4)進行稀釋，使其達到規(guī)定的病毒濃度(4yg / mL和20yg / mL),從而制備了兩種病毒溶液。另外,在剛要測定前，利用檢體提取液B(含有0.4mg / mL的半堿性蛋白酶、I重量％的正-辛?；?N-甲基葡萄糖酰胺、0.5重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA *2Na的50MmTris_HCl緩沖液，PH為8.4)將各濃度的病毒液稀釋10倍，將其作為檢體用于膠乳免疫比濁法的測定中。作為病毒濃度為零的檢體，使用利用上述檢體提取液B將上述檢體稀釋液稀釋10倍后獲得的溶液。
[0038]作為反應用緩沖液，使用含有2.1重量％的聚乙二醇20000 (Nacalai Tesque公司生產)、1重量％的BSA、0.9重量％的NaCl、0.1重量％的EDTA.2Na和0.1重量％的疊氮化鈉的200mM的Tris-HCl (pH為8.4)緩沖液。在吸光度的測定中，使用免疫反應測定裝置SPOTCHEM IM (愛科來株式會社生產)，按照以下比例在比色杯內混合各試劑和檢體，測定在37°C下處理5分鐘時的5分鐘的吸光度(測定波長為660nm)變化量。所得結果示于下述表I中。
[0039]S (檢體):28 μ L
[0040]Rl (反應用緩沖液):56 μ L[0041 ] R2 (抗體致敏膠乳試液):56 μ L
[0042]表1
[0043]
【權利要求】
1.檢體前處理方法，其為免疫測定方法中的檢體前處理方法，其特征在于， 所述檢體為來自于鼻涕的檢體，在實施所述免疫測定方法之前用蛋白酶對所述檢體進行處理，其中，所述蛋白酶為半堿性蛋白酶(EC3.4.21.63)，所述檢體中的測定對象物質為流感病毒；所述免疫測定方法為下述方法:使所述檢體中的測定對象物質與負載在不溶性載體粒子上且與所述測定對象物質發(fā)生免疫反應的免疫學物質發(fā)生免疫反應,測定此時產生的所述不溶性載體粒子的凝集程度，由此測定所述測定對象物質的濃度。
2.權利要求1所述的檢體前處理方法，其中，所述負載在不溶性載體粒子上的免疫學物質為所述流感病毒的抗體。
3.權利要求1所述的檢體前處理方法，其中，蛋白酶處理的pH條件為5?11的范圍。
4.免疫測定方法，其為利用了免疫反應的免疫測定方法，其特征在于，檢體為來自于鼻涕的檢體，所述檢體中的測定對象物質為流感病毒，所述方法包括: 對該檢體通過權利要求1所述的檢體前處理方法進行前處理之后，實施免疫測定； 所述免疫測定包括使檢體中的測定對象物質與負載在不溶性載體粒子上且與所述測定對象物質發(fā)生免疫反應的免疫學物質發(fā)生免疫反應，測定此時產生的所述不溶性載體粒子的凝集程度，由此測定所述測定對象物質的濃度。
5.權利要求4所述的免疫測定方法，其中，所述負載在不溶性載體粒子上的免疫學物質為所述流感病毒的抗體。
【文檔編號】G01N33/569GK103926402SQ201410100668
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2005年12月13日 優(yōu)先權日:2004年12月14日
【發(fā)明者】大代京一, 大宮一紘, 泉井直子 申請人:愛科來株式會社