桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法。預(yù)處理方法的步驟：將桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻，再與甘氨酸混合均勻，過濾，即可；其中，所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液中的溶劑為體積百分比80%的甲醇溶液和/或體積百分比80%-100%的乙醇溶液；所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖液。所述的檢測方法包括如上所述的桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法。該預(yù)處理方法快速方便，分離度好，能精確得到目標(biāo)物，且穩(wěn)定性高，靈敏度高，誤差小，該檢測方法檢測結(jié)果精確方法，可以客觀的評價復(fù)方制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。
【專利說明】桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法及1-脫氧野尻霉素的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1_脫氧野尻霉素，中文別名:(2R, 3R, 4R, 5S) _2_輕甲基喊唳_3，4，5_ 二醇、1-去氧野究霉素、多輕基生物堿或1-脫氧氮雜-D-葡萄糖；英文名稱:1-Deoxynojirimycin,簡稱 1-DNJ 或 DNJ ;分子式=C6H13NO4 ;分子量:163.17 ；CAS 號:19130-96-2。
[0003]1-脫氧野尻霉素為白色粉末,可以從?？浦参锷Ｈ~(Mulberry Leaf)的枝、葉和根中提取得到，是一種α -葡萄干酶抑制劑，對降低人體血糖值有顯著的作用。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于1-脫氧野尻霉素的研究主要集中在1-脫氧野尻霉素的化學(xué)成分上。而對于1-脫氧野尻霉素的定性或定量的檢測方法的研究相對較少，因為制劑中1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理過程較為復(fù)雜，使得檢測方法操作復(fù)雜并且誤差較大。
[0005]楊海霞用衍生化-分光光度計來測定桑葉單方制劑中1-脫氧野尻霉素的含量(桑葉中DNJ分離純化及含量測定的研究，中國藥科，2003:1)。該方法的預(yù)處理過程造成1-脫氧野尻霉素的損失，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確；得到的桑葉提取物及純化物均為有色溶液，對吸光度的測定影響較大，測定結(jié)果準(zhǔn)確度低。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中，1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理，也僅僅局限于單方制劑中1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理的研究。對于復(fù)方制劑的研究則較少。復(fù)方制劑與單方制劑相比，成分及其含量更為復(fù)雜，各成分之間的相互作用使得復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理更為復(fù)雜，直接影響了對復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有針對復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理方法及其檢測方法的研究的缺陷，提供一種桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法及桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法，該預(yù)處理方法快速方便，分離度好，能精確得到目標(biāo)物，且穩(wěn)定性高，靈敏度高，誤差小，該檢測方法檢測結(jié)果精確方法，可以客觀的評價復(fù)方制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。
[0008]本發(fā)明的發(fā)明人，為了精密檢測復(fù)方制劑中的1-脫氧野尻霉素，對于桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法進(jìn)行了大量而深入的研究，在研究過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn):復(fù)方制劑與單方制劑相比，成分及其含量更為復(fù)雜，僅僅套用單方制劑中1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理方法，并不能準(zhǔn)確有效地提取且檢測復(fù)方制劑中的1-脫氧野尻霉素。例如，以鹽酸提取1-脫氧野尻霉素，衍生化后，HPLC分析，樣品分離度不好，峰形出現(xiàn)拖尾或肩峰，含量測定不準(zhǔn)確，且測量結(jié)果不穩(wěn)定。
[0009]在經(jīng)過了長久的研究后，發(fā)明人發(fā)現(xiàn):將復(fù)方制劑溶解于特定的溶劑中，以特定的衍生化試劑，在特定的緩沖液中進(jìn)行衍生化反應(yīng)，可生成具有紫外吸收的絡(luò)合物，再進(jìn)行分離處理，得到的物質(zhì)能夠通過高效液相色譜-紫外檢測得到，且檢測的準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性等效果優(yōu)異。
[0010]本發(fā)明的目的之一在于，提供一種桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法，所述的預(yù)處理方法包括以下步驟:
[0011]將桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻，再與甘氨酸混合均勻，過濾，即可；其中，所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液中的溶劑為體積百分比80%的甲醇溶液和/或體積百分比80%_100%的乙醇溶液；所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖液。
[0012]以下，針對上述預(yù)處理方法的進(jìn)一步優(yōu)選的條件，做如下說明:
[0013]本領(lǐng)域技術(shù)人員均理解:復(fù)方制劑是指兩種或兩種以上的藥物混合制劑。本發(fā)明的預(yù)處理方法適用于本領(lǐng)域常規(guī)的桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的預(yù)處理。所述的桑葉復(fù)方制劑較佳地包括40%-50%的桑葉提取物、25%-35%的苦瓜提取物、12%_17%的黃芪提取物和5%-9%的麥冬提取物，所述百分比為質(zhì)量百分比。所述的桑葉復(fù)方制劑更佳地為希爾牌復(fù)方桑葉膠囊。
[0014]本發(fā)明中，所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液的制備方法較佳地為:將所述的桑葉復(fù)方制劑溶解于所述的溶劑中，搖勻和/或超聲處理。所述的超聲處理較佳地為在功率100W和頻率40kHz條件下處理20min。
[0015]所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液中，所述的溶劑的添加量較佳地為每0.2-0.6g桑葉復(fù)方制劑添加25mL的溶劑，更佳地為每0.3g桑葉復(fù)方制劑添加25mL的溶劑。
[0016]所述的硼酸鹽緩沖液較佳地為硼酸-氯化鉀緩沖液。所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的濃度較佳地為0.2mol/L ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的pH值較佳地為pH8.5 ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的添加量較佳地為每克桑葉復(fù)方制劑加入1.67mL的硼酸-氯化鉀緩沖液。
[0017]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的添加量以芴甲氧羰酰氯計，較佳地為每1-3克待測樣品中較佳地添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯，更佳地為每1.5克桑葉復(fù)方制劑中較佳地添加IOmmol的荷甲氧羰酰氯。
[0018]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液中的芴甲氧羰酰氯的濃度為20mmol/L。
[0019]所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的溶劑較佳地為乙腈。
[0020]所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液的體積比較佳地為1:1:4。
[0021]所述的將桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻的方法和條件為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑混合的方法和條件。所述的將桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻較佳地為搖勻后進(jìn)行超聲處理。所述的超聲處理較佳地為在功率100W和頻率40kHz條件下處理20min。
[0022]所述的甘氨酸的添加量較佳地為每克桑葉復(fù)方制劑添加0.05-0.1mol的甘氨酸，更佳地為每克桑葉復(fù)方制劑添加0.08mol的甘氨酸。
[0023]所述的過濾較佳地為過0.45 μ m的有機系微孔濾膜。
[0024]本發(fā)明的目的之二在于，提供一種桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法，所述的檢測方法包括以下步驟:(I)將桑葉復(fù)方制劑進(jìn)行如上所述的桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法處理，得待測樣品溶液；(2)將所述的待測樣品溶液進(jìn)行檢測，即可。[0025]步驟(2)中，所述的檢測較佳地為高效液相色譜-紫外檢測。
[0026]所述的高效液相色譜的檢測的色譜柱較佳地為C18色譜柱，更佳地為Agilent20RBAX SB-C18 ;所述的 Agilent20RBAX SB-C18 的規(guī)格較佳地為 4.6*150mm*5 μ m或 4.6*250mm*5 μ m。
[0027]所述的高效液相色譜的檢測的流動相較佳地包括:流動相A:乙腈；流動相B:
0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；所述的流動相A和流動相B的體積比較佳地為(28-32 ):(72-68)，更佳地為32:68 ;所述百分比為質(zhì)量百分比。所述的醋酸的水溶液的濃度較佳地為0.2%，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0028]所述的高效液相色譜的檢測的柱溫較佳地為30°C。
[0029]所述的高效液相色譜的檢測的流速較佳地為1.0mL/min。
[0030]所述的高效液相色譜的檢測的波長較佳地為265nm。
[0031]所述的高效液相色譜-紫外檢測的進(jìn)樣量較佳地為10-20 μ L0
[0032]所述的檢測后較佳地按照本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算得到桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的含量。所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法的操作步驟較佳地為:用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成標(biāo)準(zhǔn)樣品，在與待測樣品相同的色譜條件下，等體積進(jìn)樣；測量各標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的各峰的峰面積，用峰面對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再根據(jù)測得的待測樣品的峰面積，計算待測樣品的濃度。
[0033]其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品的預(yù)處理方法與上述步驟(I)中的桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法相同。
[0034]在進(jìn)行定量檢測時，待測樣品溶液按照本領(lǐng)域常規(guī)，先定容后再過濾。所述的定容較佳地為用醋酸定容。所述的醋酸的濃度較佳地為0.1%-0.2%，更佳地為0.1%，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0035]在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。
[0036]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0037]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明的預(yù)處理方法快速方便，分離度好，能精確得到目標(biāo)物，且穩(wěn)定性高，靈敏度高，誤差小，該檢測方法檢測結(jié)果精確方法，可以客觀的評價復(fù)方制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為實施例1制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039]圖2為專屬性實驗結(jié)果圖；其中，A:陰性樣品(去除了桑葉成分的希爾牌復(fù)方桑葉膠囊)溶液的色譜圖；Β:待測樣品(希爾牌復(fù)方桑葉膠囊)溶液的色譜圖；C:1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的色譜圖。
【具體實施方式】
[0040]下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。[0041]以下實施例中，使用的儀器、材料和試劑如下所示:
[0042]液相色譜儀:美國安捷倫公司生產(chǎn)，型號:1260，該液相色譜儀包括二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器、工作站；
[0043]KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司；
[0044]pH調(diào)節(jié)計:上海儀電科學(xué)儀器有限公司，型號:PHS_3C ；
[0045]天平:METTLER200型電子天平、BP21ID電子分析天平(SartoriusC0.)。
[0046]標(biāo)準(zhǔn)樣品:1-脫氧野尻霉素，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；
[0047]待測樣品:希爾牌復(fù)方桑葉膠囊，湖南希爾天然藥業(yè)。
[0048]除乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。
[0049]實施例1
[0050]桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法，包括以下步驟:
[0051]取希爾牌復(fù)方桑葉膠囊0.2907g置于25mL的量瓶中，加入體積百分比100%乙醇2mL，超聲處理lOmin，乙醇定容至刻度，即為儲備液；取ImL儲備液置于25mL的量瓶中，力口Λ 0.2mol/L的硼酸-氯化鉀緩沖液(pH8.5) ImL,再加入20mmol/L的荷甲基羰酰氯的乙腈溶液4mL,搖勻,超聲處理(功率IOOw,頻率40kHz) 20min,再加入0.05mol/L的甘氨酸2mL,搖勻；用0.1%的醋酸溶液定容至刻度，搖勻，過0.45 μ m濾膜，即可。
[0052]實施例2
[0053]桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法
[0054]( I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
[0055]取1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品置于25mL的量瓶中，加80 %的甲醇溶液溶解，配成
0.2mg/mL的1-脫氧野尻霉素的溶液,為儲備液；
[0056]將ImL儲備液置于25mL的量瓶中，加入0.2mol/L的硼酸-氯化鉀緩沖液(pH8.5)ImL,再加入20mmol/L的荷甲基羰酰氯的乙腈溶液4mL,搖勻，超聲處理(功率IOOw,頻率40kHz) 20min，再加入0.05mol/L的甘氨酸2mL，搖勻；用0.1%的醋酸溶液定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液；
[0057]將標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液按照體積4μ L、8y L、10y L、12y L、14y L、18y L、20y L分別進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜-紫外檢測；
[0058]所述的高效液相色譜-紫外檢測的檢測條件為:
[0059]色譜柱:20RBAXSB-C18 (Agilent)(規(guī)格 4.6*150mm*5 μ m)
[0060]流動相:流動相A:乙腈；流動相B:質(zhì)量百分比0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；流動相A和流動相B的體積比為32:68 ；
[0061]柱溫:30°C;
[0062]流速:1.0mL/min ；
[0063]波長:265nm；
[0064]峰面積的測定結(jié)果如表I所示；
[0065]表1:1_脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
[0066]
【權(quán)利要求】
1.桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法，其特征在于:所述的預(yù)處理方法包括以下步驟: 將桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻，再與甘氨酸混合均勻，過濾，即可；其中，所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液中的溶劑為體積百分比80%的甲醇溶液和/或體積百分比80%-100%的乙醇溶液；所述的緩沖溶液為硼酸鹽緩沖液。
2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于:所述的硼酸鹽緩沖液為硼酸-氯化鉀緩沖液；所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的濃度較佳地為0.2mol/L ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的PH值較佳地為pH8.5 ;所述的硼酸-氯化鉀緩沖液的添加量較佳地為每克桑葉復(fù)方制劑加入1.67mL的硼酸-氯化鉀緩沖液； 所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的溶劑為乙腈。
3.如權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于:所述的芴甲氧羰酰氯的溶液的添加量以芴甲氧羰酰氯計為每1-3克待測樣品中添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯，較佳地為每1.5克桑葉復(fù)方制劑中較佳地添加IOmmol的芴甲氧羰酰氯；所述的芴甲氧羰酰氯的溶液中的芴甲氧羰酰氯的濃度較佳地為20mmol/L。
4.如權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于:所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液的體積比為1:1:4。
5.如權(quán)利要求1所述的預(yù)處理方法，其特征在于:所述的桑葉復(fù)方制劑包括40%-50%的桑葉提取物、25%-35%的苦瓜提取物、12%-17%的黃芪提取物和5%_9%的麥冬提取物，所述百分比為質(zhì)量百分比；所述的桑葉復(fù)方制劑較佳地為希爾牌復(fù)方桑葉膠囊； 所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液的制備方法較佳地為:將所述的桑葉復(fù)方制劑溶解于所述的溶劑中，搖勻和/或超聲處`理；所述的超聲處理較佳地為在功率IOOW和頻率40kHz條件下處理20min ； 所述的桑葉復(fù)方制劑的溶液中，所述的溶劑的添加量較佳地為每0.2-0.6g桑葉復(fù)方制劑添加25mL的溶劑，更佳地為每0.3g桑葉復(fù)方制劑添加25mL的溶劑； 所述的將桑葉復(fù)方制劑的溶液、緩沖溶液和芴甲氧羰酰氯的溶液混合均勻的方法為搖勻后進(jìn)行超聲處理；所述的超聲處理較佳地為在功率IOOW和頻率40kHz條件下處理20mino
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的預(yù)處理方法，其特征在于:所述的甘氨酸的添加量為每克桑葉復(fù)方制劑添加0.05-0.1mol的甘氨酸，較佳地為每克桑葉復(fù)方制劑添加0.08mol的甘氨酸； 所述的過濾較佳地為過0.45 μ m的有機系微孔濾膜。
7.一種桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的檢測方法，其特征在于:所述的檢測方法包括以下步驟:(1)將桑葉復(fù)方制劑進(jìn)行如權(quán)利要求1-6中任一項所述的桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法處理，得待測樣品溶液；(2)將所述的待測樣品溶液進(jìn)行檢測，即可。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的檢測為高效液相色譜_紫外檢測。
9.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于:所述的高效液相色譜的檢測的色譜柱為C18色譜柱，較佳地為Agilent20RBAX SB-C18 ;所述的Agilent20RBAX SB-C18的規(guī)格較佳地為 4.6*150mm*5 μ m 或 4.6*250mm*5 μ m ； 所述的高效液相色譜的檢測的流動相包括:流動相A:乙腈；流動相B:0.1%-0.2%的醋酸的水溶液；所述的流動相A和流動相B的體積比較佳地為(28-32): (72-68)，更佳地為32:68 ;所述百分比為質(zhì)量百分比；所述的醋酸的水溶液的濃度較佳地為0.2%，所述百分比為質(zhì)量百分比； 所述的高效液相色譜的檢測的柱溫為30°C ;所述的高效液相色譜的檢測的流速為.1.0mL/min ;所述的高效液相色譜的檢測的波長為265nm ;所述的高效液相色譜-紫外檢測的進(jìn)樣量為10-20 μ L。
10.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于:所述的檢測后按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算得到桑葉復(fù)方制劑中1-脫氧野尻霉素的含量；所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法中標(biāo)準(zhǔn)樣品的預(yù)處理方法與所述的步驟(1)中的桑葉復(fù)方制劑的預(yù)處理方法相同。
【文檔編號】G01N30/02GK103869026SQ201410108293
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】劉湘榮, 易躍能, 鄧義德, 朱亞文, 蔣靈嬌 申請人:湖南希爾天然藥業(yè)有限公司