HIV抗體及HIV-1p24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HIV抗體及HIV-1p24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒。該分析方法主要包括：制備同時包被有HIV重組抗原和HIV-1p24單克隆抗體的固相載體；制備生物素標(biāo)記的HIV-1p24單克隆抗體；制備鑭系元素1標(biāo)記的HIV重組抗原；制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素；在抗原和抗體固相載體中，加入含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV?p24標(biāo)準(zhǔn)抗原的校準(zhǔn)品或待測樣品，加入生物素標(biāo)記的HIV-1p24抗體，孵育、洗滌后，加入鑭系元素1標(biāo)記的HIV抗原和鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素，再次孵育、洗滌后，加入增強液進行熒光檢測。本發(fā)明的分析方法解決了現(xiàn)有HIV抗原抗體聯(lián)合檢測中抗體與抗原不能區(qū)分的難點，實現(xiàn)了同時定量檢測HIV抗體和HIV-1p24抗原，縮短了HIV檢測窗口期。
【專利說明】HIV抗體及HIV-1 p24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的分析檢測技術(shù)，尤其涉及一種HIV抗體及HIV-lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人類免疫缺陷病毒(HIV)于1981年在美國首次發(fā)現(xiàn)，是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞的慢病毒(lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，從而導(dǎo)致各種疾病及癌癥在人體中的發(fā)生，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合癥，acquired immuno deficiency syndrome, AIDS)。
[0003]HIV病毒基因組是兩條相同的正鏈RNA，每條RNA長約9.2-9.8kb，編碼了至少9個蛋白，可分為3類:結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)控蛋白、輔助蛋白。根據(jù)基因組序列和結(jié)構(gòu)，將HIV分為HIV-1與HIV-2，核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列僅40%相同。目前已發(fā)現(xiàn)HIV-1的主要抗原為gag基因編碼水解形成的P24核蛋白以及env基因編碼的gpl60、gpl20 ；HIV-10的主要抗原為env基因編碼的gp41，HIV-2的主要抗原為env基因編碼的gp360
[0004]目前用于HIV檢測方法有檢測HIV感染者體液中病毒抗原和/或抗體的方法，操作方便，易于普及應(yīng)用，其中抗體檢測尤普遍。但HIV-lp24抗原在HIV感染檢測中的地位和重要性也日益受到重視。HIV-1侵入機體后，核心抗原P24的水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，并在急性感染期即可出現(xiàn)，通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志，與病情發(fā)展密切相關(guān)。因此，血液及其它體液標(biāo)本中P24抗原的檢測可以縮短窗口期，有助于HIV-1的早期診斷、預(yù)后判斷及評價抗病毒治療的效果，具有良好的實際應(yīng)用價值。隨著P24抗原檢測技術(shù)的不斷進步，低成本的P24抗原檢測有望在一定程度上替代現(xiàn)有的昂貴的RNA測定法。目前，最新一代(第四代)HIV檢測試劑采用的是HIV-1/HIV-2抗體與HIV-10亞群抗體及HIV-1 p24抗原的聯(lián)合檢測方法，但該試劑只能用于定性檢測，難以實現(xiàn)精確定量，且不能區(qū)分HIV抗體和抗原。
[0005]目前，HIV常用的檢測方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescent immunoassay, CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(electro-chemiluminescence immunoassay, ECLI)等。RIA 由于放射性污染，對環(huán)境和操作者影響較大，批內(nèi)批間變異較大，難于自動化；ELISA采用大分子酶標(biāo)記，且酶容易失活，這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術(shù)所受的干擾因素太多(即使是優(yōu)秀的“管式ELISA”，其試管形狀的變化也會影響試驗的結(jié)果)，其靈敏度、線性和穩(wěn)定性未能高于RIA ；CLIA的化學(xué)發(fā)光通常是瞬間完成，發(fā)光峰值很快衰減，溫度和PH值對發(fā)光有很大影響，該類因素影響了該類方法的應(yīng)用；ECLI仍為非開放系統(tǒng)，試劑依賴進口，試劑昂貴，維修及檢測成本高，這也限制了其推廣應(yīng)用。
[0006]時間分辨突光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay, TRFIA)利用具有獨特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素，如銪(Eu)、鋱(Te)、釤(Sm)、鏑(Dy)等及其螯合物為示蹤劑，代替酶、同位素、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體、抗原、源素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細胞，待反應(yīng)體系完成后，用時間分辨熒光免疫分析檢測儀測定反應(yīng)物中的熒光強度，定量分析待測物質(zhì)的含量。由于鑭系元素?zé)晒鈺r間極長，為傳統(tǒng)熒光的IO3?IO6倍。激發(fā)光與發(fā)射光之間的stokes位移大,可達290nm,而普通突光素的stokes位移僅28nm,采用波長分辨和時間延遲的方法，可大大提高檢測靈敏度和特異性，目前已應(yīng)用于臨床微量物質(zhì)，如乙型肝炎病毒標(biāo)志物以及前列腺抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白等腫瘤標(biāo)志物的定量測定。TRFIA克服了 RIA放射性污染的不足、酶標(biāo)記物的不穩(wěn)定性和定量范圍窄的缺陷、化學(xué)發(fā)光僅能一次發(fā)光、一般熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾的難點和ECLI的非直接標(biāo)記等缺點，Eu標(biāo)記TRFIA的靈敏度可達10_19 mol/L，目前已實現(xiàn)了分析技術(shù)的自動化。然而由于TRFIA法是剛剛開發(fā)出來的方法，可檢測項目不多，許多項目亟待研究開發(fā)；而且在研發(fā)過程中需解決本方法穩(wěn)定性、可重復(fù)性的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題即是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種HIV抗體及HIV-lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法。通過本發(fā)明的方法，能解決現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于HIV檢測存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作繁瑣等技術(shù)問題，尤其可以定量區(qū)分出HIV抗體和抗原，縮短HIV檢測窗口期，還可用于短期抗病毒治療效果價值的評估。
[0008]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的HIV抗體及HIV_lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法，包括以下步驟:
[0009]①制備抗原和抗體固相載體:將HIV抗原和HIV_lp24單克隆抗體用包被緩沖液稀釋后作為包被液，包被固相載體，用封閉液封閉，形成抗原和抗體固相載體；
[0010]②制備生物素標(biāo)記抗體:用常規(guī)方法對Hiv-lp24單克隆抗體進行生物素標(biāo)記，形成生物素標(biāo)記抗體；
[0011]③制備鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原:參照鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒說明書，用鑭系元素I對Hiv抗原進行標(biāo)記,制備鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原；
[0012]④制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素:參照鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒說明書，用鑭系元素2對鏈霉親和素進行標(biāo)記，制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素；其中，鑭系元素I和鑭系元素2是不同的鑭系元素；
[0013]⑤測定方法:在步驟①制得的抗原和抗體固相載體中，加入含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的校準(zhǔn)品或待測樣品，加入步驟②制備的生物素標(biāo)記抗體，經(jīng)孵育、洗滌所述固相載體后，加入步驟③制備的鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原和步驟④制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素，再次孵育、洗滌所述固相載體后，加入增強液進行熒光檢測；其中，HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體中不含HIV-lp24抗體。
[0014]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，步驟①中，具體制備步驟如下:將HIV抗原和HIV-lp24單克隆抗體用包被緩沖液分別稀釋至0.1?10μ g/ml后作為包被液，包被固相載體，孵育、洗滌固相載體后，用封閉液進行封閉，晾干；其中，固相載體為微孔反應(yīng)條或微孔反應(yīng)板；包被緩沖液為PH9.6的50mmol/L碳酸鹽緩沖液、pH4.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl緩沖液或pH4.5的50mmol/L檸檬酸鹽緩沖液；封閉液為含 0.5% BSA、pH7.8 的 50mmol/L Tris-HCl 緩沖液。
[0015]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，步驟③中，具體制備步驟如下:將HIV抗原加入到截留分子量為10000超濾離心管中，8000r / min離心5?6min，用pH為8.0?9.8的50mmol/L碳酸鹽標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌后，將處理得到的HIV抗原加入到預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的鑭系元素I標(biāo)記試劑中，混勻，2?8°C振蕩孵育72±2h，反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8、50mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡的層析柱層析，在A28tl監(jiān)測收集第一洗脫峰；其中，HIV抗原和鑭系元素I標(biāo)記試劑的質(zhì)量比為1:1?10:1。
[0016]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，步驟④中，具體制備步驟如下:將鏈霉親和素加入到截留分子量為10000超濾離心管中，8000r / min離心5?6min，用pH為8.0?9.8的50mmol/L碳酸鹽標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌后，將處理得到的鏈霉親和素加入到預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的鑭系元素2標(biāo)記試劑中，混勻，2?8°C振蕩孵育72±2h，反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8、50mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的層析柱層析，在A28tl監(jiān)測收集第一洗脫峰；其中，鏈霉親和素和鑭系元素2標(biāo)記試劑的質(zhì)量比為1:1?10:1。
[0017]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，步驟⑤中含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV-1P24標(biāo)準(zhǔn)抗原的校準(zhǔn)品采用以下方式制備:用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液將HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體原料和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原原料稀釋成含有0、0.5、l、2、4、8NCU/ml的HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的O、10、40、160、640、1280U/ml的HIV_lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品；或者，用50%?55%的血細胞比容的全血將HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體原料和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原原料制備成含有0,0.5、l、2、4、8NCU/ml 的 HIV 標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的 O、10、40、160、640、1280U/ml 的 HIV_lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，用采血濾紙作為載體，將制備好的含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品滴加到所述采血濾紙的6個不同位置上，室溫自然干燥后得到的干濾紙片校準(zhǔn)品。
[0018]本發(fā)明的另一目的在于提供一種HIV抗體及HIV_lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫試劑盒。
[0019]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的HIV抗體及HIV_lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫試劑盒包括:同時包被有HIV抗原和HIV-lp24單克隆抗體的固相載體、校準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的HIV-lp24單克隆抗體、鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原、鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素、實驗緩沖液、濃縮洗液以及增強液；其中，校準(zhǔn)品為同時含有呈濃度梯度的HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和呈濃度梯度的HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體中不含HIV_lp24抗體；鑭系元素I和鑭系元素2是不同的鑭系元素。
[0020]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述HIV抗原包括HIV gpl20、gp41和/或gp36抗原。
[0021]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，校準(zhǔn)品為同時含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體原液配制而成的0、0.5、l、2、4、8NCU/ml的HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的HIV_lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原原液配制而成的O、10、40、160、640、1280U/ml的HIV_lp24HIV標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，所述HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體中不含HIV-lp24抗體。
[0022]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，鑭系元素I為Eu3+，鑭系元素2為Sm3+。[0023]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，實驗緩沖液為含100ml/L BSA、0.05g/L染料1、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30ppm Procline300 的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl 緩沖液;所述濃縮洗液為含有 4ml/L Tween20、30ppm 染料 2、30ppm Procline300 的 ρΗ7.8.50mmoI /L Tris-HCl緩沖液，其中所述染料I的顏色和所述染料2的顏色不一樣；所述增強液為含0.5ml/L曲拉通-100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸鈉、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/L3 -萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸鹽緩沖液。
[0024]本發(fā)明的HIV抗體及HIV_lp24抗原時間分辨熒光免疫分析方法和試劑盒，聯(lián)合采用了雙抗原夾心、雙抗體夾心和生物素-親和素時間分辨熒光免疫原理，解決了現(xiàn)有HIV抗體和抗原聯(lián)合檢測中抗體(HIV-1/HIV-2型/HIV-10群)與抗原(HIV_lp24)不能區(qū)分的難點；實現(xiàn)了一個微孔能分別檢測出HIV抗體和抗原，也實現(xiàn)了一個微孔能同時定量檢測HIV抗體(HIV-1/HIV-2型/HIV-10群)和抗原(HIV_lp24);該分析方法溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)血清物質(zhì)，實現(xiàn)了 HIV抗體(HIV-1/HIV-2型/HIV-10群)和抗原(HIV_lp24)檢測結(jié)果的溯源性；使HIV檢測窗口期縮短，HIV-lp24抗原的定量檢測不僅可以將窗口期縮短4?5天，還有利于短期抗病毒治療效果價值的評估。還具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、檢測方法簡便、高效等特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明試劑盒一個實施例中HIV抗體的血清檢測劑量-反應(yīng)曲線。
[0026]圖2為本發(fā)明試劑盒一個實施例中HIV_lp24抗原的血清檢測劑量-反應(yīng)曲線。
[0027]圖3為本發(fā)明試劑盒一個實施例中HIV抗體的濾紙片檢測劑量-反應(yīng)曲線。
[0028]圖4為本發(fā)明試劑盒一個實施例中HIV_lp24抗原的濾紙片檢測劑量-反應(yīng)曲線。
【具體實施方式】
[0029]本發(fā)明分析方法的基本原理是:以HIV抗原和HIV_lp24單克隆抗體共同包被固相載體，在固相載體中加入校準(zhǔn)品或待測樣本，再加入生物素標(biāo)記HIV-lp24抗體，孵育后，校準(zhǔn)品或待測樣本中的HIV抗體或p24抗原分別與固相載體上的HIV抗原和HIV-lp24單克隆抗體結(jié)合，形成固相HIV抗原-HIV抗體或固相HIV p24抗體-HIV p24抗原-生物素標(biāo)記的HIVp24抗體；洗滌去除校準(zhǔn)品或?qū)Υ郎y樣本中未結(jié)合的抗體、抗原和雜質(zhì)，然后同時加入鑭系元素1-HIV抗原和鑭系元素2-鏈霉親和素,孵育后,形成固相HIV抗原-HIV抗體-鑭系元素1-HIV抗原和固相HIV p24抗體_HIVp24抗原-生物素標(biāo)記的HIV p24抗體-鑭系元素2-鏈霉親和素；洗滌去除未結(jié)合的標(biāo)記物和雜質(zhì)，利用時間分辨熒光免疫法的原理檢測熒光值，鑭系元素I標(biāo)記熒光檢測采用鑭系元素I標(biāo)記窗口檢測程序，鑭系元素2標(biāo)記熒光檢測采用鑭系元素2標(biāo)記窗口檢測程序，熒光值強度與校準(zhǔn)品或待測樣本中的抗體或抗原的含量成正比，根據(jù)熒光值比值，從而可以定量測定且區(qū)分出所測樣本中HIV抗體和p24抗原的值。
[0030]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0031]實施例中的HIV重組抗原、HIV p24單克隆抗體、生物素標(biāo)記HIV p24抗體、鏈霉親和素購于Sigma公司；固相載體96孔微孔空白板(8 X 12孔)購于深圳市金燦華實業(yè)有限公司；銪(Eu3+)與釤(Sm3+)標(biāo)記試劑盒購于芬蘭Wallac公司；瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B 購于瑞典 Pharmacia 公司；S&S903 濾紙購于芬蘭 Thermo Labsystems 公司；GBW(E)090052HIV-1抗體血清(液體)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和GBW(E) 090122HIV_lp24抗原血清(液體)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為中國衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供；HIV抗體參考品、HIV-lp24抗原的參考品為中國食品藥品檢定研究院提供；增強液、濃縮洗液、實驗緩沖液、FffZ-1型微量振蕩儀、DEM-1II型全自動酶標(biāo)洗板均由廣州市豐華生物工程有限公司提供。VictOrTM2D1420型TRFIA儀購于美國Perkin Elmer公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。
[0032]實施例1:試劑盒的制備
[0033]本實施例1的試劑盒包括:同時包被有HIV抗原和HIV_lp24單克隆抗體的固相載體、校準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的HIV-lp24單克隆抗體、鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原、鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素、實驗緩沖液、濃縮洗液以及增強液。其具體制備方法如下:
[0034]①制備抗原和抗體固相載體:將HIV重組抗原(含HIV gpl20、gp41、gp36表位，可檢測HIV-1型、HIV-2型、HIV-10亞群)和HIV_lp24單克隆抗體用包被緩沖液(可以使用pH9.6、50mmol/L的碳酸緩沖液；pH4.5的20mmol/L的磷酸鹽緩沖液；pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液或pH4.5、50mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液等)分別稀釋至0.1,0.5、1、2、5、10 μ g/mL的濃度作為包被液，在96孔微孔空白板加入HIV抗原包被液和HIV_lp24抗體包被液各100 μ I/孔，孵育過夜，將96孔板洗滌I次，然后再按250 μ I/孔加入0.5 % BSA、pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖封閉液，37±2°C條件下孵育2?3h ;將96孔板甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035]②制備校準(zhǔn)品:在本發(fā)明中校準(zhǔn)品可以是液態(tài)的也可以是濾紙干血片。(I)液態(tài)校準(zhǔn)品:分別以GBW(E)090052HIV-1型抗體血清(液體)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和GBW(E) 090122HIV-1型P24抗原血清(液體)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參比，將HIV單克隆抗體(不含HIV-lp24抗體)原料和HIV-lp24重組抗原原料用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋成含有 0,0.5、l、2、4、8NCU/ml HIV 標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的 O、10、40、160、640、1280U/mlHIV_lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，分裝成0.5ml/瓶。(2)濾紙干血片校準(zhǔn)品:以HIV-1抗體血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和HIV-lp24抗原血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參比，將HIV抗體(不含HIV_lp24抗體)原料和HIV-lp24抗原原料加入到50%-55%的血細胞比容的全血中充分混勻，制備成含有0、0.5、1、
2、4、8NCU/mlHIV 標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的 O、10、40、160、640、1280U/ml HIV_lp24 標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，用S&S903采血濾紙作為載體，將以50 μ L體積將各個不同濃度的校準(zhǔn)品點加至濾紙上，每套標(biāo)準(zhǔn)品共有6個血斑，并有低、中、高濃度的質(zhì)量控制品3個血斑，經(jīng)自然陰干后過塑。
[0036]③制備生物素標(biāo)記抗體:可以采用常規(guī)方法對HIV_lp24單克隆抗體進行生物素標(biāo)記，形成生物素標(biāo)記抗體，本實施例中直接采用商業(yè)化的生物素標(biāo)記的HIV-lp24抗體。采用棋盤方陣滴定法，選出生物素標(biāo)記HIV-lp24抗體的最適工作濃度，將生物素標(biāo)記HIVP24抗體用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液稀釋成最適工作濃度的1/20倍，使其實際使用時用實驗緩沖液再按1:20稀釋檢測效果最佳。
[0037]④制備鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原:按照Eu3+標(biāo)記試劑盒說明書操作，將1.0mg的HIV重組抗原加入Millipore公司的截留分子量為10000的超濾離心管中，8000r / min離心5~6min，再用標(biāo)記緩沖液(pH為8.0~9.8的50mmol/L碳酸鹽緩沖液)重復(fù)洗滌6次,將處理得到的200 μ L HIV重組抗原加入到1.0mg的預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的Eu3+標(biāo)記試劑充分混勻，2~8°C振蕩孵育(72±2)h。反應(yīng)液用pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(IcmX 40cm)層析,在A28c!監(jiān)測收集第一洗脫峰。采用棋盤滴定法確定Eu3+標(biāo)記HIV抗原濃度的最佳工作濃度，使其實際使用時用實驗緩沖液再按1:20稀釋檢測效果最佳。
[0038]⑤制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素:按照Sm3+標(biāo)記試劑盒說明書操作，將1.0mg的SA加入Millipore公司的截留分子量為10000的超濾離心管中，8000r / min離心5~6min,再用標(biāo)記緩沖液(pH為8.0~9.8的50mmol/L碳酸鹽緩沖液)重復(fù)洗滌6次，將處理得到的200 μ I SA加入到1.0mg的預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的Sm3+標(biāo)記試劑充分混勻，2~8°C振蕩孵育(72±2) h。反應(yīng)液經(jīng)分別用H7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(IcmX 40cm)層析,在A28c!監(jiān)測收集第一洗脫峰。采用棋盤滴定法確定Sm3+標(biāo)記鏈霉親和素的最佳工作濃度，使其實際使用時用實驗緩沖液再按1:20稀釋檢測效果最佳。
[0039]⑥制備實驗緩沖液、濃縮洗液和增強液:
[0040]實驗緩沖液:含100ml/L 小牛血清、0.05g/L 染料 l、6ml/L Tween20、0.01mg/LEDTA、30ppm Procline300 的 ρΗ7.8、50mmol/L Tris-HCl 緩沖液；
[0041]濃縮洗液:含有 4ml/L Tween20、30ppm 染料 2、30ppm Procline300 的 ρΗ7.8、50mmol/L Tris-HCl緩沖液，其中染料I和染料2的顏色不同，染料的選擇沒有限制，只要是有顏色的水溶性好、低吸附性的色素染料均可。
[0042]增強液:0.5ml/L曲拉通_100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸鈉、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/L0 -萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸鹽緩沖液。
[0043]⑦分裝上述水劑校準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體、制備鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原、制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素、實驗緩沖液(30ml/瓶)、濃縮洗液(40ml/瓶)和增強液(40ml/瓶)。
[0044]⑧貼標(biāo)簽，組裝為成品。
[0045]實施例2:檢測分析HIV抗體和HIV_lp24抗原
[0046]①試劑準(zhǔn)備
[0047]抗原和抗體固相載體:將實施例1制備的所需數(shù)量的抗原和抗體固相載體平衡至室溫(20~25°C)。余下的抗原和抗體固相載體及時置入自封袋密閉并于2~8°C保存。
[0048]洗滌液:將實施例1中40ml濃縮洗液和960ml純化水在干凈的容器中混合，作為工作洗滌液備用。
[0049]標(biāo)記物工作液:將實施例1中制備的Eu3+標(biāo)記HIV重組抗原和Sm3+標(biāo)記鏈霉親和素分別與實驗緩沖液按體積比1:1:20加進潔凈的同一個一次性容器中并混勻，使用前30min內(nèi)配制，當(dāng)次實驗用完。
[0050]生物素標(biāo)記抗體工作液:將生物素標(biāo)記HIV_lp24抗體與實驗緩沖液按體積比1:20加進潔凈的一次性容器中并混勻，使用前30min內(nèi)配制，當(dāng)次試驗用完。
[0051]②試驗操作
[0052]血清樣本檢測法:(I)吸取75 μ I的HIV抗體和HIV_lp24校準(zhǔn)品或?qū)φ掌?、待測樣本加入抗原和抗體固相載體各個反應(yīng)孔中；(2)每個孔中加入25 μ I生物素標(biāo)記抗體工作液；(3)抗原和抗體固相載體在室溫下，用振蕩孵育40min ;(4)第一步孵育結(jié)束后，用洗滌液洗滌4次；(5)向每個反應(yīng)位中加入100 μ I已配好的標(biāo)記物工作液；(6)在室溫下，振蕩孵育40min ;(7)第二步孵育結(jié)束后，洗滌液洗滌6次；(8)向每個反應(yīng)位中加入增強液100 μ I ; (9)抗原和抗體固相載體于室溫下緩慢振蕩5min后檢測，在30min內(nèi)完成檢測并進行分析，檢測在TRFIA儀上自動完成，軟件中的參數(shù)根據(jù)實施例中的條件進行相應(yīng)設(shè)置，Eu3+標(biāo)記熒光檢測采用銪標(biāo)記窗口檢測程序，Sm3+標(biāo)記熒光檢測采用釤標(biāo)記窗口檢測程序。其檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，圖1中在0、0.5、l、2、4、8NCU/ml范圍內(nèi)，曲線的線性線性回歸方程為Y=6904.26Χ+2798，相關(guān)系數(shù)r為0.998，表明曲線線性趨勢良好，采用雙對數(shù)LOG-LOG_B，SPLINE數(shù)學(xué)擬合模型的劑量-反應(yīng)曲線擬合程度高；圖2中在0、10、40、160、640、1280U/ml范圍內(nèi)，曲線的線性回歸方程為Υ=3268.34Χ+2397,相關(guān)系數(shù)r為0.999，表明曲線線性趨勢良好，采用雙對數(shù)LOG-LOG_B，SPLINE數(shù)學(xué)擬合模型的劑量-反應(yīng)曲線擬合程度高。
[0053]濾紙干血片樣本檢測法:(I)將校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或待測樣本用打孔器打下直徑約
3.0mm樣品盤，將各樣品盤放入抗原和抗體固相載體中；(2)向反應(yīng)板每孔中加入200 μ I已配好的生物素標(biāo)記抗體工作液；(3)抗原和抗體固相載體在室溫下，用振蕩孵育60min ；
(4)第一步孵育結(jié)束后，甩板，洗滌4次；(5)向每個反應(yīng)位中加入200 μ I已配好的標(biāo)記物工作液；(6)在室溫下，振蕩孵育60min ;(7)第二步孵育結(jié)束后，洗滌6次；(8)向每個反應(yīng)位中加入增強液200 μ I ; (9)抗原和抗體固相載體于室溫下緩慢振蕩5min后檢測，在30min內(nèi)完成檢測并進行分析，檢測在TRFIA儀上自動完成，軟件中的參數(shù)根據(jù)實施例中的條件進行相應(yīng)設(shè)置，Eu3+標(biāo)記熒光檢測采用銪標(biāo)記窗口檢測程序，Sm3+標(biāo)記熒光檢測采用釤標(biāo)記窗口檢測程序。其檢測結(jié)果如圖3和圖4所示，圖3中在0、0.5、l、2、4、8NCU/ml范圍內(nèi)，曲線的線性線性回歸方程為Y=69.3Χ+213，相關(guān)系數(shù)r為1，表明曲線線性趨勢良好，采用雙對數(shù)L0G-L0G_B，SPLINE數(shù)學(xué)擬合模型的劑量-反應(yīng)曲線擬合程度高；圖2中在O、10、40、160、640、1280U/ml范圍內(nèi)，曲線的線性回歸方程為Y=29.71Χ+329，相關(guān)系數(shù)r為0.999，表明曲線線性趨勢良好，采用 雙對數(shù)L0G-L0G_B，SPLINE數(shù)學(xué)擬合模型的劑量-反應(yīng)曲線擬合程度聞。
[0054]實施例3:檢測結(jié)果分析
[0055](I)HIV抗體的檢測性能
[0056]①陰性參考品符合率:檢測HIV抗體國家陰性參考品20支，陽性反應(yīng)不多于2份(≤18/20)。
[0057]②陽性參考品符合率:檢測國家HIVl型抗體陽性參考品18支，均為陽性反應(yīng)(18/18)，且P11、P12號樣品的檢測熒光值P12≤Pll ;2支HIV2型抗體陽性參考品，均為陽性反應(yīng)(2/2)。
[0058]③最低檢出限:檢測國家最低檢出限參考品6份，陽性反應(yīng)不少于3份且基質(zhì)血清Si為陰性反應(yīng)。
[0059]④線性:檢測企業(yè)參考品，LI~L5共5個樣品測定值統(tǒng)計分析后，實測值與理論值的線性相關(guān)系數(shù)r大于0.98。
[0060]⑤準(zhǔn)確度:檢測企業(yè)參考品，LI~L5共5個樣品的實測值與理論值相對偏倚均在±20.0% 內(nèi)。
[0061]⑥穩(wěn)定性:試劑盒自成品生產(chǎn)之日起于37°C放置6天(有效期為12個月)成品剩余效期內(nèi)，則按37°C放置6天有效期為12個月推算37°C放置的時間進行檢測，結(jié)果符合各項目規(guī)定的要求。
[0062](2) HIVl型p24抗原的檢測性能
[0063]①陰性參考品符合率:檢測HIVl型p24抗原國家陰性參考品20支，均為陰性反應(yīng)(20/20)。
[0064]②陽性參考品符合率:檢測HIVl型p24抗原國家陽性參考品10支，均為陽性反應(yīng)(10/10)。
[0065]③重復(fù)性:平行測定HIVl型p24抗原及抗體聯(lián)合檢測試劑用國家精密度參考品10孔，熒光值的精密度(CV值)(15%。
[0066]④最低檢出限:檢測國家靈敏度參考品10支:Ll(20U/ml)、L2(10U/ml)、L3(5U/ml)、L4(2.5U/ml)、L5(l.25U/ml)……LlO (稀釋用基質(zhì)血漿);最低檢出量不得高于IOU/ml，LlO不得出現(xiàn)陽性反應(yīng)。
[0067]⑤線性:檢測國家參考品，LI~L5共5個樣品測定值統(tǒng)計分析后，實測值與理論值的線性相關(guān)系數(shù)r大于0.98。
[0068]⑥準(zhǔn)確度:檢測 國家參考品，LI~L5共5個樣品的實測值與理論值相對偏倚均在±20.0% 內(nèi)。
[0069]⑦穩(wěn)定性:試劑盒自成品生產(chǎn)之日起于37°C放置6天(有效期為12個月);成品剩余效期內(nèi)，則按37°C放置6天有效期為12個月推算37°C放置的時間進行檢測，結(jié)果符合各項目規(guī)定的要求。
[0070]實施例4:干擾試驗評價
[0071]以上實施例1制備的試劑盒的分析特異性評價如下:血樣本中膽紅素818 μ mol/L、血紅蛋白180g/L、甘油三酯21.54mmol/L對本試劑盒的檢測結(jié)果無干擾作用。不受血樣本中檸檬酸鈉(1.088mol/L)、乙二胺四乙酸二鉀(0.2744mol/L)、草酸鉀(0.5428mol/L)、氟化鈉(0.4878mol/L)、肝素鈉(150U/L)等抗凝劑的干擾。檢測甲型肝炎病毒抗體、乙型肝炎病毒表面抗體、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗原、重組乙型肝炎病毒核心抗原、重組丙型肝炎病毒核心抗原均無交叉反應(yīng)。
[0072]實施例5:實施例1的試劑盒與參比試劑盒的等效性評價
[0073]用實施例1的試劑盒和參比試劑盒分別檢測1020例正常人血清樣本，其臨床比對結(jié)果如表1所示。
[0074]表1
【權(quán)利要求】
1.一種HIV抗體及HIV-lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于，包括以下步驟: ①制備抗原和抗體固相載體:將HIV抗原和HIV-lp24單克隆抗體用包被緩沖液稀釋后作為包被液，包被固相載體，用封閉液封閉，形成抗原和抗體固相載體； ②制備生物素標(biāo)記抗體:用常規(guī)方法對HIV-lp24單克隆抗體進行生物素標(biāo)記，形成生物素標(biāo)記抗體； ③制備鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原:參照鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒說明書，用鑭系元素I對HIV抗原進行標(biāo)記,制備鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原； ④制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素:參照鑭系元素離子標(biāo)記試劑盒說明書，用鑭系元素2對鏈霉親和素進行標(biāo)記，制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素；其中，所述鑭系元素I和鑭系元素2是不同的鑭系元素； ⑤測定方法:在步驟①制得的抗原和抗體固相載體中，加入含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的校準(zhǔn)品或待測樣品，加入步驟②制備的生物素標(biāo)記抗體，經(jīng)孵育、洗滌所述固相載體后，加入步驟③制備的鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原和步驟④制備鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素，再次孵育、洗滌所述固相載體后，加入增強液進行熒光檢測；其中，所述HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體中不含HIV-lp24抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步驟①中，具體制備步驟如下:將HIV抗原和HIV-lp24單克隆抗體用包被緩沖液分別稀釋至0.1~10 μ g/ml后作為包被液，包被固相載體，孵育、洗漆固相載體后，用封閉液進行封閉，晾干；其中，所述固相載體為微孔反應(yīng)條或微孔反應(yīng)板；所述包被緩沖液為pH9.6的50mmol/L碳酸鹽緩沖液、pH4.5的20mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl緩沖液或pH4.5的50mmol/L檸檬酸鹽緩沖液；所述封閉液為含0.5% BSA、pH7.8的50mmol/L Tris-HCl緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的分析法，其特征在于，所述步驟③中，具體制備步驟如下^fHIV抗原加入到截留分子量為10000的超濾離心管中，8000r / min離心5~6min,用pH8.0~9.8、50mmol/L碳酸鹽標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌后，將處理得到的HIV抗原加入到預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的鑭系元素I標(biāo)記試劑中，混勻，2~8°C振蕩孵育72±2h，反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8、50mmol/LTris-HCl緩沖液平衡的層析柱層析，在A28tl監(jiān)測收集第一洗脫峰；其中，所述HIV抗原和所述鑭系元素I標(biāo)記試劑的質(zhì)量比為1:1~10:1。
4.如權(quán)利要求1所述的分析法，其特征在于，所述步驟④中，具體制備步驟如下:將鏈霉親和素加入到截留分子量為10000的超濾離心管中，8000r / min離心5~6min，用pH8.0~9.8、50mmol/L碳酸鹽標(biāo)記緩沖液重復(fù)洗滌后，將處理得到的鏈霉親和素加入到預(yù)先用標(biāo)記緩沖液溶解的鑭系元素2標(biāo)記試劑中，混勻，2~8°C振蕩孵育72 ± 2h，反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8、50mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡的層析柱層析，在A280監(jiān)測收集第一洗脫峰；其中，所述鏈霉親和素和所述鑭系元素2標(biāo)記試劑的質(zhì)量比為1:1~10:1。
5.如權(quán)利要求1所述的分析法，其特征在于，所述步驟⑤中含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的校準(zhǔn)品采用以下方式制備: 用含有10g/L BSA的pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl緩沖液將HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體原料和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原原料稀釋成含有0、0.5、l、2、4、8NCU/ml的HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的O、10、40、160、640、1280U/ml的HIV_lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品；或者，用50%~55%的血細胞比容的全血將HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體原料和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原原料制備成含有 0,0.5、l、2、4、8NCU/ml 的 HIV 標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的 O、10、40、160、640、1280U/ml 的HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，用采血濾紙作為載體，將制備好的含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品滴加到所述采血濾紙的6個不同位置上，室溫自然干燥后得到的干濾紙片校準(zhǔn)品。
6.一種HIV抗體及HIV-lp24抗原雙標(biāo)記時間分辨熒光免疫試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:同時包被有HIV抗原和HIV-lp24單克隆抗體的固相載體、校準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的HIV-lp24單克隆抗體、鑭系元素I標(biāo)記的HIV抗原、鑭系元素2標(biāo)記的鏈霉親和素、實驗緩沖液、濃縮洗液以及增強液； 其中，所述校準(zhǔn)品為同時含有呈濃度梯度的HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和呈濃度梯度的HIV-lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，所述HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體中不含HIV-lp24抗體； 所述鑭系元素I和鑭系元素2是不同的鑭系元素。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述HIV抗原包括HIVgpl20、gp41和/或gp36抗原。
8.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述校準(zhǔn)品為同時含有HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體原液配制而成的0、0.5、l、2、4、8NCU/ml的HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體和對應(yīng)的HIV_lp24標(biāo)準(zhǔn)抗原原液配制而成的O、10、40、160、640、1280U/ml的HIV_lp24HIV標(biāo)準(zhǔn)抗原的混合校準(zhǔn)品，所述HIV標(biāo)準(zhǔn)抗體中不含HIV-lp24抗體。
9.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述鑭系元素I為Eu3+，所述鑭系元素2為 Sm3+。
10.如權(quán)利要求6所述的`試劑盒，其特征在于:所述實驗緩沖液為含100ml/LBSA、`0.05g/L 染料 l、6ml/L Tween20、0.01mg/L EDTA、30ppmProcline300 的 ρΗ7.8、50mmol/LTris-HCl 緩沖液；所述濃縮洗液為含有 4ml/L Tween20、30ppm 染料 2、30ppm Procline300的pH7.8,50mmol/LTris-HCl緩沖液，其中所述染料I的顏色和所述染料2的顏色不一樣；所述增強液為含0.5ml/L曲拉通-100、0.8ml/L冰乙酸、0.5g/L乙酸鈉、24mg/L三正辛基氧化磷、3mg/L0 -萘甲酰三氟丙酮的pH3.4、6mmol/L醋酸鹽緩沖液。
【文檔編號】G01N33/577GK103869073SQ201410129830
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月1日
【發(fā)明者】譚玉華, 李奕輝, 陳建起, 范主橋 申請人:廣州市豐華生物工程有限公司