Trim59蛋白對胃癌診斷治療的新用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及TRIM59蛋白的新用途，具體涉及TRIM59蛋白作為胃癌診斷標(biāo)志物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用以及TRIM59蛋白作為治療靶標(biāo)在制備胃癌治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明證明了TRIM59可以作為胃癌的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，通過檢測TRIM59的表達水平可以對胃癌進行早期診斷，通過抑制TRIM59的表達而由此將TRIM59作為藥物靶標(biāo)來輔助臨床手術(shù)治療提高胃癌病人的治愈率，改善病人的生活質(zhì)量。
【專利說明】TRIM59蛋白對胃癌診斷治療的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種胃癌診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0002]胃癌是世界范圍內(nèi)是第四大常見癌癥類型，并且引起人類死亡第二位的癌癥類型，在亞洲地區(qū)更為嚴重。胃癌是導(dǎo)致我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，并且占世界胃癌發(fā)生案例的很大比例，在胃的惡性腫瘤中，腺癌占95%也是最常見的惡性腫瘤，乃至名列人類所有惡性腫瘤之首。我國的胃癌發(fā)生率占世界范圍內(nèi)的很大比例。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀，當(dāng)癥狀明顯時，病變已屬晚期，對人類的生存健康構(gòu)成了極大的威脅。
[0003]目前，胃癌的診斷主要依靠胃鏡、X線、超聲等幾種手段，臨床上對胃癌的治療主要是通過外科手術(shù)切除術(shù)來對病變位置切除達到治療效果，找到及早診斷胃癌的有效方法，根據(jù)標(biāo)志物的表達水平分析病人的預(yù)后情況，據(jù)此對病人在外科手術(shù)的基礎(chǔ)上進行針對靶標(biāo)分子進行輔助治療顯得尤為重要。
[0004]胃癌早期沒有明顯癥狀，待到癥狀明顯得以診斷時，一般已到晚期。而以手術(shù)為主的胃癌后期治療，雖可以在很大程度上緩解病情，延緩病情的惡化，但對發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的胃癌的療效并不十分理想。
[0005]早期胃癌的手術(shù)療效雖較好，但對某些病例也可采取非手術(shù)的方法治愈，因此除了定期體檢外，還應(yīng)積極探索其他治療方法，或者以手術(shù)治療為主的綜合治療方案，以提聞療效。到目前為止，很多生物標(biāo)志物都不能很好的用來作為臨床診斷標(biāo)識，僅有助于判別腫瘤的預(yù)后及化療療效。所以還沒有很好的分子診斷標(biāo)識來輔助常規(guī)診斷檢查，以及作為治療靶標(biāo)輔助外科手術(shù)治療。
[0006]尋找腫瘤組織特異性高水平表達的蛋白標(biāo)志物，并以之作為診斷治療的靶點，是近來被認為是手術(shù)治療的積極有效的輔助手段。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與某些特意的信號通路激活、基因活化有關(guān)。某些膜蛋白的激活導(dǎo)致信號通路的活化，進一步導(dǎo)致某些基因的激活，維持腫瘤的發(fā)生發(fā)展。尋找這些差異性表達的(膜)蛋白，以此作為診斷腫瘤的標(biāo)志物。如果是有具體功能的蛋白標(biāo)志物，可以結(jié)合開發(fā)特異性的封閉/激活抗體(藥物)，定向的干擾/活化腫瘤組織中標(biāo)志物的活性，結(jié)合臨床手術(shù)治療達到更有效的治療腫瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是尋找一種新的胃癌診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)及其用途。
[0008]為了達到上述目的，本發(fā)明提供了 TRM59蛋白作為胃癌診斷標(biāo)志物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明還提供了 TRIM59蛋白作為治療靶標(biāo)在制備胃癌治療藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新的胃癌腫瘤的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)-TRM59。TRM59在胃癌組織中比配對的正常胃組織中的表達水平明顯升高，在胃癌細胞系相對于永生化胃粘膜上皮細胞-GES-1特異性高水平表達TRM59。TRM59有可能是一種可以從細胞膜穿梭到細胞核的蛋白，它的表達水平跟病人的臨床癥狀又有很直接的相關(guān)性，并且跟手術(shù)預(yù)后情況也有緊密的相關(guān)性。TRM59在胃腺癌中高表達，TRM59的高水平表達能夠促進胃腺癌發(fā)生發(fā)展，并且TRIM59的表達水平跟病人腫瘤的臨床分級，浸潤程度和預(yù)后生存情況有密切的關(guān)系。因此TRM59可以用來作為臨床診斷標(biāo)志物，并且可以作為藥物靶標(biāo)分子，通過抑制TRM59的活性，結(jié)合臨床手術(shù)來治療胃癌腫瘤。
[0011]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0012]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，TRM59可以作為胃癌的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，通過檢測TRIM59的表達水平可以對胃癌進行早期診斷，通過抑制TRM59的表達而由此將TRM59作為藥物靶標(biāo)來輔助臨床手術(shù)治療提高胃癌病人的治愈率，改善病人的生活質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1A是通過免疫組化檢測組織芯片中TRM59的表達情況圖；
[0014]圖1B是通過Image pro plus軟件分析TRM59染色單位面積內(nèi)的信號強度定量分析結(jié)果圖；
[0015]圖1C為病人的臨床分級情況整合組織中TRM59的表達強度分析結(jié)果圖。
[0016]圖1D為病人的腫瘤浸潤程度與TRM59的表達情況相關(guān)性分析結(jié)果圖。
[0017]圖1E為TRM59表達水平與病人預(yù)后生存情況的相關(guān)性分析結(jié)果圖。
[0018]圖1F是通過western blot, RT-PCR實驗檢測10個新鮮組織樣本中，成對的樣本(正常組織，腫瘤組織)中TRM59蛋白水平的表達量圖。
[0019]圖2A是RT-PCR檢測細胞系中TRM59相對于GES-1中mRNA的表達水平圖；
[0020]圖2B是western blot檢測細胞系中TRM59在蛋白水平上的表達量圖。
[0021]圖3A是在AGS中轉(zhuǎn)染干擾TRM59表達的慢病毒建立的穩(wěn)定細胞系通過MTS方法檢測細胞的增值情況結(jié)果圖；
[0022]圖3B是對TRM59低表達的細胞系MKN45轉(zhuǎn)染TRM59過表達病毒建立的穩(wěn)定細胞系通過MTS方法檢測細胞的增值情況結(jié)果圖。
[0023]圖4A是干擾TRM59AGS細胞遷移能力減弱圖；
[0024]圖4B是過表達TRM59MKN45細胞遷移能力增強圖；
[0025]圖5A是干擾TRM59AGS細胞克隆形成能力減弱圖；
[0026]圖5B是過表達TRM59MKN45細胞克隆形成能力增強圖；
[0027]圖6A是干擾TRM59AGS細胞體內(nèi)成瘤能力減弱圖；
[0028]圖6B是過表達TRM59MKN45細胞體內(nèi)成瘤能力增強圖；
[0029]圖7是AGS細胞瞬轉(zhuǎn)干擾TRM59表達的慢病毒后，利用Anexin-V/PI染色，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡比例結(jié)果圖。
[0030]以上各圖中，*表示 P < 0.05, ** 表示 P < 0.01, *** 表示 p < 0.001。
【具體實施方式】
[0031 ] 下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。
[0032]實施例1:免疫組化
[0033]1、實驗材料:[0034]10例新鮮組織樣本(配對正常胃組織、胃癌組織)，178點組織芯片(購自上海芯超生物科技有限公司，HStm-Adel78Sur-01);—抗為兔抗人TRM59抗體(Abcam，貨號ab69639)，后續(xù)染色采用GTVision III免疫組化試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?。
[0035]2、實驗方法:
[0036]組織芯片就是將許多不同個體組織標(biāo)本以規(guī)則陣列方式排布于同一載玻片上，借助免疫組織化學(xué)的方法進行同一指標(biāo)的原位組織學(xué)研究。具體步驟為:
[0037]1、將放置于4°C冰箱中的178點組織芯片，取出室溫放置恢復(fù)室溫，置于56°C孵箱中烘烤20分鐘。將組織芯片浸于二甲苯中三次，每次5分鐘。取出后置于100%無水乙醇中兩次，每次3分鐘；依次置入90% -70%各級酒精各3分鐘。用PBS沖洗3次，每次3分鐘。
[0038]2、將組織芯片用(4% )多聚甲醛固定液固定15分鐘，用PBS緩沖液洗3次，每次5分鐘。
[0039]3、抗原修復(fù):用0.0lM檸檬酸鹽溶液暴露抗原決定簇，具體步驟為:使用微波爐高火加熱0.0lM檸檬酸鹽溶液3分鐘至沸騰，4分鐘后，放入組織芯片再低火微波兩次，每次I分鐘(及時補充修復(fù)液防止修復(fù)液沸騰溢出)。冷卻至室溫，用PBS緩沖液洗5分鐘。用含
0.5% Triton的PBS緩沖液(pH = 7.4)破膜15分鐘，用PBS緩沖液(pH = 7.4)洗3次，每次5分鐘。
[0040]4、封閉非特異性蛋白
[0041]1)3% H2O2-甲醇(30% H2O2IOml+甲醇90ml)室溫浸泡30分鐘，消除內(nèi)源性氧化
還原酶。
[0042]2)自來水沖洗10分鐘，PBS緩沖液浸泡3次，每次3分鐘，用無塵紙吸去多余液體(勿碰到組織)。
[0043]3)用PBS緩沖液(pH = 7.4)配制10%山羊血清。
[0044]4)向組織芯片上滴加10%山羊血清(用PBS緩沖液配制)，放置于濕盒中封閉非特異性抗原(200微升/組織芯片)，室溫I小時；
[0045]5、一抗孵育
[0046]用PBS緩沖液配制I %山羊血清，用PBS緩沖液配制的I %山羊血清按照比例I: 400稀釋兔抗人TRM59抗體，甩去組織芯片上的10%山羊血清封閉液，用無塵紙擦干組織周圍，直接加入已稀釋的兔抗人的TRM59抗體(約100 μ 1)，置于濕盒中4°C過夜。第二天從冰箱中取出需37°C復(fù)溫I小時。
[0047]6、二抗孵育
[0048]I)將一抗洗掉，將組織芯片插入塑料玻片架，然后整個放入塑料盒中，加PBS緩沖液浸泡洗15分鐘3次。
[0049]2)用無塵紙將組織芯片周圍的PBS緩沖液吸去，加入二抗(GTVisionTM III型聚合物)于室溫孵育30分鐘。孵育完畢，將組織芯片置入PBS緩沖液中，沖洗3次，每次3分鐘，取出組織芯片，甩掉并擦干組織周圍的液體(組織切勿干燥)，平放于濕盒中。
[0050]3)滴加預(yù)備好的顯色劑DAB工作液80微升，室溫孵育10分鐘，自來水沖洗終止顯色。
[0051]7、用蘇木精復(fù)染細胞核，室溫30秒，用自來水沖洗I小時復(fù)染。[0052]8、封片:各級酒精(70^-100%)脫水，每級3分鐘。取出組織芯片置入二甲苯中三次，每次5分鐘。在組織芯片上用滴管滴加中性樹脂，然后蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕擠壓，并趕走氣泡，通風(fēng)櫥中靜置吹干，顯微鏡觀察，比較成對的腫瘤組織與相鄰的癌旁組織中TRIM59的表達水平，結(jié)果如圖1A所示，(左側(cè)是癌旁組織，右側(cè)是腫瘤組織)通過Image proplus軟件分析TRM59染色單位面積內(nèi)的信號強度定量分析，通過t檢驗結(jié)果p = 0.0204，結(jié)果如圖1B所示。從圖1A和圖1B中可以看出，胃癌組織中TRM59的表達量高于配對的癌旁組織。
[0053]對病人的臨床分級情況整合組織中TRM59的表達強度進行分析，結(jié)果如圖1C所示，TRM59的表達水平與臨床分級的相關(guān)性，P = 0.0287。對病人的腫瘤浸潤程度與TRM59的表達情況相關(guān)性進行分析，結(jié)果如圖1D所示，p = 0.0044，對TRM59表達水平與病人預(yù)后生存情況的相關(guān)性進行分析，P = 0.0223，圖1C-圖1E說明，TRM59的表達水平與病人的臨床分級，腫瘤浸潤程度，病人的預(yù)后都有一定的相關(guān)性。
[0054]通過western blot, RT-PCR實驗檢測10個新鮮組織樣本中，成對的樣本(正常組織，腫瘤組織)中TRIM59蛋白水平的表達量。液氮研磨組織，分別通過TRIzol (Invitrogen)提取組織RNA和RIPA (Thermo，89901)，添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Thermo，78410, thermo, 78420)提取組織蛋白。利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser (Takara)進行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,通過 SYBR Green PCR Master Mix kit (TakaraRR420A)定量試劑，在ABI7900HT上以GAPDH的表達量做內(nèi)參Λ Λ ct方法進行qRT-PCR檢測基因的表達水平；利用BCA(Thermo，23227)對蛋白進行定量，通過WB染色對信號強度比對GAPDH的表達量分析目的蛋白的表達水平。實驗結(jié)果如圖1F所示，TRM59在癌組織中的表達量高于在正常組織中的表達，并且與臨床癥狀有緊密的相關(guān)性。 [0055]實施例2:Real_time PCR
[0056]實驗材料:新鮮胃癌組織樣本，胃癌細胞系，MKN45, SGC7901,823, snu5，N87, AGS,Snul以及永生化的胃粘膜上皮細胞系GES-1。MKN45(上海拜力生物科技有限公司，MKN45)，snu-5 ( ATCC? CRL-5973?)，snu-1 ( \TCCm CRL-5971?) ；SGC7901,823, N87, AGS 購自中科院細胞庫(貨號分別TChu46，TChull, TChu130, TChu7 ;GES_1購自上海復(fù)祥生物科技有限公司(GES-1)。
[0057]實驗步驟:
[0058]1，利用傳統(tǒng)的Trizol-氯仿-異丙醇抽提RNA的方法，通過組織冰凍碾磨，細胞裂解等手段，抽提組織和細胞中的RNA。運用PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser (Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA,進一步通過SYBR Green實時定量RT-PCR技術(shù)(Takara RR420A)，檢測組織，細胞水平上TRM59基因的表達水平。在ABI7900HT定量PCR上實時定量檢測PCR結(jié)果。
[0059]2，用Λ Λ ct方法以內(nèi)參GAPDH的表達水平標(biāo)準(zhǔn)化TRM59基因的表達水平。用正常的永生化的胃上皮細胞GES-1作為對照，量化TRM59的表達水平，結(jié)果如圖2Α所示。
[0060]通過western blot檢測細胞系中TRM59在蛋白水平上的表達量，將GAPDH表達量作為內(nèi)參，通過Bio-Rad Quantity One.version4.1軟件進行對信號強度分析，比較TRIM59在蛋白水平上的表達量變化，結(jié)果如圖2B所示。
[0061]通過western blot，RT-PCR發(fā)現(xiàn)，隨著細胞的惡性程度升高，TRM59的mRNA，蛋白水平都有一定程度的升高。
[0062]實施例3細胞增殖實驗
[0063]實驗材料:
[0064]細胞增殖檢測試劑盒CellTiter96AQueous(MTS) (Promega, G358A) ；Matrigel (BD,貨號:356234)。
[0065]通過實施例2中的RT-PCR基因水平及WB蛋白水平檢測，篩選出高/低表達的細胞株AGS/MKN45cell，對選取的細胞系A(chǔ)GS/MKN45細胞分別進行干擾/過表達實驗檢測TRIM59對細胞的增殖、遷移，克隆形成以及體內(nèi)腫瘤所產(chǎn)生的影響。
[0066]細胞系的建立方法:
[0067]AGS/MKN45細胞系的來源同實施例2。
[0068](I)設(shè)計干擾shRNA,干擾shRNA的對照scramble、過表達TRIM59及過表達TRIM59的對照Vector慢病毒質(zhì)粒，分別用于包裝慢病毒分別轉(zhuǎn)染AGS/MKN45cell建立sh_TRM59細胞系(shRNA細胞系)、scramble細胞系、以及MKN45過表達TRM59的TRM59細胞系、Vector細胞系。
[0069]干擾慢病毒構(gòu)建:將兩段sh-TRM59 序列(sh_TRM59#l，sh-TRIM59#2)，scramble對照序列克隆構(gòu)建到慢病毒表達載體PUCP上，利用HEK293T慢病毒包裝系統(tǒng)包裝成慢病毒，經(jīng)后續(xù)實驗驗證發(fā)現(xiàn)sh-TRM59#l的干擾效率最高，所以最終選用sh-TRM59#l慢病毒用來轉(zhuǎn)染AGS細胞來建立細胞系，后邊均將sh-TRM59#l寫作sh_TRM59。干擾慢病毒sh-TRIM59由上海思路迪生物技術(shù)有限公司合成。sh-TRM59干擾序列以及scramble對照序列如下:
[0070]過表達慢病毒構(gòu)建:將TRM59cDNA克隆構(gòu)建到慢病毒表達載體pLV.Des2d.P/PU1X)上，利用HEK293T慢病毒包裝系統(tǒng)，包裝成慢病毒用于后續(xù)細胞實驗。另外我們選用空載體病毒表達載體質(zhì)粒作對照，同樣利用HEK293T包裝系統(tǒng)包裝病毒用于后續(xù)對照實驗。
shRNASequence
sh-TRIM59#lACATTACAGGCAACCATTAAA
[0071]
sh-TRIM59#2TTGCACTAAGGGCTATTATTG
ScrambleAACAGTCGCGTTTGCGACTGG
[0072]TRIM59cDNA 序列:
[0073]atgcacaattttgaggaagagttaacttgtcccatatgttatagtatttttgaagatcctcgtgtactgccatgctctcatacatttt gtagaaattgtttggaaaacattcttcaggcatctggtaacttttatatatggagacctttacgaattccactcaagtgccctaatt gcagaagtattactgaaattgctccaactggcattgaatctttacctgttaattttgcactaagggctattattgaaaagtaccag caagaagaccatccagatattgtcacctgccctgaacattacaggcaaccattaaatgtttactgtctattagataaaaaattag tttgtggtcattgccttaccataggtcaacatcatggtcatcctatagatgaccttcaaagtgcctatttgaaagaaaaggacac tcctcaaaaactgcttgaacagttgactgacacacactggacagatcttacccatcttattgaaaagctgaaagaacaaaaat ctcattctgagaaaatgatccaaggcgataaggaagctgttctccagtattttaaggagcttaatgatacattagaacagaaaa aaaaaagtttcctaacggctctctgtgatgttggcaatctaattaatcaagaatatactccacaaattgaaagaatgaaggaaa tacgagagcagcagcttgaattaatggcactgacaatatctttacaagaagagtctccacttaaatttcttgaaaaagttgatg atgtacgccagcatgtacagatcttgaaacaaagaccacttcctgaggttcaacccgttgaaatttatcctcgagtaagcaaa atattgaaagaagaatggagcagaacagaaattggacaaattaagaacgttctcattcccaaaatgaaaatttctccaaaaa ggatgtcatgttcctggcctggtaaggatgaaaaggaagttgaatttttaaaaattttaaacattgttgtagttacattaatttcag taatactgatgtcgatactctttttcaaccaacacatcataacctttttaagtgaaatcactttaatatggttttctgaagcctctcta tctgtttaccaaagtttatctaacagtctgcataaggtaaagaatatactgtgtcacattttctatttgttgaaggaatttgtgtggaaaatagtttcccatatg
[0074]注:HEK293T三質(zhì)粒包裝系統(tǒng):將目的質(zhì)粒與病毒包裝輔助質(zhì)粒pCMV_dR8.74，pMD2.G (Addgene).按照3: 2: I的量混合，利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染預(yù)處理(轉(zhuǎn)染前一小時加入含有終濃度25uM氯喹)低代數(shù)HEK293T，轉(zhuǎn)染24小時更換含有1% Penicillin/streptomycin(Gibcol5140-122), I % Sodium Pyruvate(Gibcol13600-70), I % SodiumButyrate ((IOOx solution, 0.5M, sigma, 19364)不含血清的超級培養(yǎng)液(Lonzal2_725F)。等到48小時后收集細胞上清液，0.45μπι filter(Millipore)過濾除掉細胞碎片，4度22000rpm高速離心2小時分離上清用PBS溶解病毒沉淀，獲取病毒液用于后續(xù)細胞轉(zhuǎn)染。
[0075]取PBS緩沖液(pH = 7.4)用于制備Non-transfected細胞系。
[0076](2)將 AGS/MKN45 培養(yǎng)于 RPMI1640 (Gibco，c22400500Bt)完全培養(yǎng)基中(添加 1%Penicillin/streptomycin, Gibcol5140_122,1 % L-Glutamine, Gibco25030_081)，待 AGS/MKN45cell貼壁率達到80%時更換新鮮培養(yǎng)液，按照MOI = I: 20分別添加步驟I中得到的干擾shRNA,干擾shRNA的對照scramble、過表達TRIM59、過表達TRIM59的對照Vector慢病毒，按照添加干擾病毒的體積等量添加相同體積的PBS (pH = 7.4)到Non-transfected實驗組中，混合搖勻，最后按照終濃度為8ug/ml加入輔助轉(zhuǎn)染試劑polybrene (millipore,TR-1003-G)混合搖勻。轉(zhuǎn)染72小時后，觀測熒光表達情況，此時添加針對表達載體所需抗生素 puromycin (購自前塵生物，gene operation, ISY1130-025MG),終濃度為 5ug/ml。
[0077](3)低密度接種細胞:將步驟⑵中得到的細胞100個接種到6孔板的一個孔中，仍然培養(yǎng)在含有puromycin(5ug/ml)的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，待到細胞長出克隆，在顯微鏡下觀察具有熒光的細胞集落，在6孔板的蓋子上用記號筆標(biāo)記位置，于超凈臺中按照標(biāo)記滴加少量(能夠覆蓋細胞集落即可)0.25%胰酶(Gibco，25200-072)，置于細胞培養(yǎng)箱中消化，細胞消化來之后用200ul移液槍吸出細胞單獨培養(yǎng)，一直lug/mi抗生素(puromycin)維持三周，之后抗生素(puromycin)濃度減半(2ug/ml)維持兩個月，由此得來AGS/MKN45對應(yīng)的sh_TRM59細胞系(shRNA細胞系，干擾細胞系)、scramble細胞系、TRIM59細胞系(過表達細胞系)、Vector細胞系，即用來進行后續(xù)體內(nèi)體外實驗。。
[0078]實驗步驟:
[0079]1、體外細胞增殖實驗:
[0080]取AGS/MKN45以及對應(yīng)建立的干擾/過表達細胞系，用完全培養(yǎng)基(Gibico，RPMI1640)配成細胞懸液，取96孔板，分別加入上述的細胞系，每孔3，000個細胞，體積100 μ 1，每種細胞系平行做10個孔，取平均值，待到細胞貼壁后(大約四個小時)加入20 μ I MTS反應(yīng)液(作為起始時間Ohr，此后選取24、48、72、96hrs時間點)，在37°C孵育3小時，然后在酶標(biāo)儀(BioTek)上檢測490nm處的吸光度，結(jié)果如圖3A和3B所示。由于吸光度與細胞數(shù)目和活力是成正比的，所以能夠線性直觀反映細胞數(shù)目大小。如圖3A所示，通過干擾TRM59高表達細胞系A(chǔ)GS中的TRM59的表達，可以減緩AGS的增殖速率，如圖3B所示，在TRM59相對低表達的MKN45細胞中過表達TRM59可以加快細胞的增值速率。
[0081]2、體內(nèi)成瘤實驗:
[0082]將AGS或MKN45以及相應(yīng)的干擾/過表達細胞系細胞懸浮于不含血清的基本培養(yǎng)基(Gibico，RPMI1640)中，將50微升基本培養(yǎng)基含有1，000, 000個腫瘤細胞的懸浮液與等體積的基質(zhì)膠(BD，貨號356234)混合均勻，然后注射入小鼠的皮下，注入量為100微升/只。每十天測量腫瘤的大小，計算的方法是V = a2*b (其中V是體積，a是最短邊的長度，b是最長邊的長度)，稱量裸鼠的體重。如圖6A所示，通過干擾TRM59高表達細胞系A(chǔ)GS中的TRM59的表達，可以減弱體內(nèi)成瘤能力，如圖6B所示，在TRM59相對低表達的MKN45細胞中過表達TRIM59可以提高體內(nèi)成瘤能力。
[0083]實施例4腫瘤遷移實驗
[0084]實驗材料:
[0085]8 μ m 的 transwell 小室(Coming, 3422),按照說明用 matrigel 包被。
[0086]細胞系的建立方法同實施例3。
[0087]實驗步驟:
[0088]做transwell實驗前，先將各細胞在無血清培養(yǎng)基(Gibco，RPMI1640)中饑餓24小時，再加入tanswell小室。
[0089]用I % BSA(sigma, A6003-25G)活化transwell小室上面的基質(zhì)膠半小時，在transwell小室的上面加入100 μ I細胞懸液(采用上述的無血清培養(yǎng)基配制，含有細胞10，000個)。下面加入500微升的10%血清的完全培養(yǎng)液(Gibco，C11875500CP)。在37。。細胞培養(yǎng)箱中過夜。第二天，用4%多聚甲醛固定液固定10分鐘，置于PBS緩沖液(pH =
7.4)中放置10分鐘，然后用0.1 %的結(jié)晶紫(阿拉丁，C110702-25g)染色10分鐘，PBS緩沖液(pH = 7.4)清洗干凈，用棉簽將上面的細胞輕輕擦掉(不要影響小室下層細胞)，將小室放于置有500微升PBS緩沖液(pH = 7.4)的24孔板中，于倒置顯微鏡下觀察、拍照，結(jié)果如圖4A和圖4B所示。如圖4A所示，通過干擾TRM59高表達細胞系A(chǔ)GS中的TRM59的表達，可以減弱遷移，如圖4B所示，在TRM59相對低表達的MKN45細胞中過表達TRM59可以提聞遷移。
[0090]實施例5克隆形成實驗
[0091]實驗材料:2XRPMI1640基本培養(yǎng)液(吉諾，GNM31802)，低熔點瓊脂糖(Lonza，50101)，六孔板，0.2微米濾器。
[0092]細胞系的建立方法同實施例3。
[0093]實驗步驟:
[0094]1、用雙蒸水配制1.2%低熔點瓊脂糖溶液，等體積比例混合2X1640培養(yǎng)基，待到溫度降到60°C左右，經(jīng)過0.2微米濾器過濾于6孔板中(1.5ml/well)，置于室溫冷卻凝固，得到瓊脂板。
[0095]2、用雙蒸水配制0.6%低熔點瓊脂糖溶液，等體積比例混合2X RMPI1640培養(yǎng)基，
0.2微米濾器過濾除菌，混入細胞，使細胞濃度為1500或2000個/ml。
[0096]3、將步驟2中混勻的細胞在37°C加入到步驟I中制備好的瓊脂板上，室溫放置半小時，然后放入4°C冰箱中半小時，等待瓊脂凝固。
[0097]4、瓊脂板凝固后，將六孔板轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)箱中。一天后每孔補加I毫升含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液(Gibco，C11875500CP和10%青鏈霉素(hyclone))。
[0098]5、等到細胞克隆長到一定大小，將培養(yǎng)板取出，用4%多聚甲醛固定，PBS緩沖液(pH = 7.4)浸泡半小時，取出，用0.05%結(jié)晶紫染色2小時，拍照。如圖5A所示，通過干擾TRIM59高表達細胞系A(chǔ)GS中的TRM59的表達，可以減弱克隆形成能力。如圖5B所示，在TRIM59相對低表達的MKN45細胞中過表達TRM59，可以提高克隆形成能力。
[0099]實施例6細胞凋亡實驗
[0100]實驗材料:BDpharmingen FITC anexin-V apoptosis Detection Kit(貨號556547)
[0101]細胞系的建立方法同實施例3。
[0102]實驗步驟:
[0103]1、取建立的AGS-scramble、AGS_shRNA細胞系，把細胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，用PBS緩沖液(pH = 7.4)洗滌貼壁細胞一次，加入(濃度0.25%,pH = 7.4)胰酶消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。
[0104]2、加入步驟I中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，在離心力為IOOOg的條件下離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS緩沖液(pH = 7.4)輕輕重懸細胞并計數(shù)。取10萬重懸的細胞，在離心力為IOOOg的條件下離心5分鐘，棄上清，加入195 μ IAnnexin V-FITC 結(jié)合液(BD，貨號 556547)輕輕重懸細胞，加入 5 μ IAnnexinV-FITC (BD，貨號556547)，輕輕混勻。
[0105]3、室溫避光孵育10分鐘，在離心力為IOOOg的條件下離心5分鐘，棄上清，加入190 μ IAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入10 μ I (lmg/ml)碘化丙唳染色液,輕輕混勻，冰浴避光放置。
[0106]4、隨即進行流式細胞儀檢測分析，結(jié)果如圖7所示，在體外干擾AGS中TRM59的表達發(fā)現(xiàn)，細胞的凋亡數(shù)目明顯增多，也就是說干擾TRIM59的表達細胞的抗凋亡能力減弱(圖 7)。
【權(quán)利要求】
1.TRIM59蛋白作為胃癌診斷標(biāo)志物在制備胃癌診斷試劑中的應(yīng)用。
2.TRIM59蛋白作為治療靶標(biāo)在制備胃癌治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK103954767SQ201410131478
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】高維強, 周志誠, 朱鶴 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院