早期確定前列腺癌治療后復(fù)發(fā)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及早期確定前列腺癌治療后復(fù)發(fā)的方法。本文具體描述了用于具有低功能靈敏度的PSA測定的組合物和方法，該P(yáng)SA測定可用于例如，測定接受治療后的前列腺疾病的早期復(fù)發(fā)和確定患者是否具有早期生化復(fù)發(fā)（ES-BCR）或病情穩(wěn)定。
【專利說明】早期確定前列腺癌治療后復(fù)發(fā)的方法
[0001]本申請是申請日為2009年2月19日的題為“早期確定前列腺癌治療后復(fù)發(fā)的方法”的中國專利申請?zhí)?00980113911.2的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于檢測治療后前列腺疾病早期復(fù)發(fā)的組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0003]在世界范圍內(nèi)，每年有大約670,000例前列腺癌的新病例。英國前列腺癌發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)參見 http://info, cancerresearchuk.0rg/cancerstats/types/prostate/incidence/ (2009年I月23日最后一次訪問)。在歐洲，2004年診斷了237，800個新病例，并且其中的85，200人死于前列腺癌。Boyle, P et al.Annals ofOnco 1gy 16:481-488 (2005)。除了如癌癥家族史、吸煙狀況、年齡和種族的臨床風(fēng)險(xiǎn)因素之外，前列腺癌的初始檢測一般是基于被稱為前列腺特異性抗原(PSA)(由正常的、良性的和惡性的前列腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的中性絲氨酸蛋白酶)的蛋白質(zhì)的循環(huán)濃度的提高這一發(fā)現(xiàn)。由前列腺細(xì)胞產(chǎn)生的PSA以游離或復(fù)合物形式存在于精液、血清、血漿和尿液中，并且可在這些液體中被測量。游離和復(fù)合物形式的同時測量被稱為“總PSA”測量，并且被稱為“tPSA”或“PSA”也是正確的。在各種前列腺疾病(尤其是前列腺癌)中，血液中的PSA濃度升高，并且這種濃度升高反映在PSA的血清測量中。Valsanen etal., Prostate Cancer and Prostatic Disease2:91-97 (1999)。因此，在過去的二十年里，如血清PSA的常規(guī)免疫測定之類的檢測方法已被用于前列腺癌的初期檢測。Yu et al.，J.Urologyl57:913-918(1997)。
[0004]一般來說，如果觀察到患者體內(nèi)的血清PSA濃度升高，就進(jìn)行前列腺活組織檢查以證實(shí)癌的存在并表征癌的病理學(xué)特征。一旦證實(shí)是前列腺癌，大約三分之二的患者會通過前列腺根治術(shù)(RP，通過外科手術(shù)完全切除前列腺)或通過各種方法的放療、激素治療或化療來進(jìn)行治療。但是，這些接受治療的患者中多達(dá)40%可能會發(fā)生病情復(fù)發(fā)。參見Moul, J.Urologyl63:1632-1642 (2000)。前列腺癌的復(fù)發(fā)與存活率的預(yù)后不良有關(guān)。但是，如果在早期階段檢測到復(fù)發(fā)，預(yù)后就能夠得到改善，從而可以開始進(jìn)行包括搶救性治療(salvage therapy)的合適的處理方法。遺憾的是，用于評價復(fù)發(fā)可能性的現(xiàn)有方法不足以進(jìn)行早期檢測。在RP之前或在RP時進(jìn)行的臨床病理觀察，如癌癥分期、Gleason評分、診斷時的年齡、手術(shù)切緣瘤累(margin involvement)(在手術(shù)切緣上存在癌)、癌對局部組織的浸潤、癌對前列腺包膜的浸潤、癌對精囊的浸潤、癌對膀胱頸的浸潤、癌對淋巴結(jié)的浸潤、以及腫瘤總體積在估計(jì)疾病復(fù)發(fā)的可能性上能夠提供一些的信息，但并不一定具有預(yù)測性，而且也不能被用于確定復(fù)發(fā)的確切時間?；罱M織檢查或各種類型的成像方法能夠用于證實(shí)疾病復(fù)發(fā)，但是這些方法的缺點(diǎn)是靈敏性差。一般來說，到了活組織檢查或成像研究檢測到新腫瘤時，復(fù)發(fā)已經(jīng)處于預(yù)后極度不良的后期。因此，這些方法不足以用于早期檢測和基于這些方法進(jìn)行有力治療。[0005]為了解決基于臨床病理學(xué)發(fā)現(xiàn)和活組織檢查或成像研究不足以確定疾病復(fù)發(fā)的問題，現(xiàn)在判斷疾病復(fù)發(fā)主要是基于治療后患者體內(nèi)的血清PSA濃度升高這一發(fā)現(xiàn)。例如，在無殘留的前列腺根治術(shù)之后，仍殘留有分泌PSA的前列腺組織并且生理學(xué)上清除手術(shù)前PSA水平的充足時間已經(jīng)過去了，PSA的血清濃度跌至最低。如果血清PSA濃度在最低點(diǎn)之后開始升高，則可表示疾病復(fù)發(fā)。這種類型的復(fù)發(fā)被稱為“生化復(fù)發(fā)”(BCR)，因?yàn)樵搹?fù)發(fā)只反映了 PSA循環(huán)水平的升高，而不是新發(fā)現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處腫瘤。PSA的生化復(fù)發(fā)已成為在如RP的治療之后的前列腺癌的醫(yī)學(xué)處置的現(xiàn)行檢測標(biāo)準(zhǔn)。
[0006]已公布了各種閾值從而確立認(rèn)為發(fā)生了生化復(fù)發(fā)的點(diǎn)。Cookson MS, et al.JUrologyl77:540-545 (2007)。通常，在 PSA 最低點(diǎn)之后的 200pg/mL(0.2ng/ml)的值被用于確定生化復(fù)發(fā)點(diǎn)。同樣，常規(guī)的PSA檢測具有功能靈敏度可能更高的范圍為100pg/ml的檢測限。使用檢測限為100pg/mL的常規(guī)PSA檢測對生化復(fù)發(fā)的平均檢測時間為超過38.4個月。Vassilikos et al., Clinical Biochemistry33 (2): 115-123 (2000)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明可用于根據(jù)臨床觀察和PSA值和本發(fā)明的PSA指標(biāo)，監(jiān)測接受前列腺疾病治療的患者、和檢測如列腺癌、以及治療后或在決定不進(jìn)彳丁 IU列腺切除術(shù)后治療后的癌癥復(fù)發(fā)或病情穩(wěn)定。通過提供對于PSA的檢出限(limit of detection)和功能靈敏度超過常規(guī)檢測的新型檢測，本發(fā)明對于確定前列腺癌生化復(fù)發(fā)具有超越常規(guī)血清PSA檢測的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明可用于監(jiān)測接受前列腺疾病治療的患者和檢測在如RP的基本治療后相對于病情穩(wěn)定(未復(fù)發(fā))的癌癥復(fù)發(fā)。
[0008]本文所描述的方法還可用于，例如檢測前列腺癌的早期復(fù)發(fā)或在前列腺癌的前列腺根治術(shù)之后早期確定患者情況穩(wěn)定。本發(fā)明的檢出限和功能靈敏度的提高能夠提早檢測到復(fù)發(fā)，并且在合適的情況下，能夠提早開始對復(fù)發(fā)癌癥進(jìn)行搶救性治療。
[0009]前列腺癌的治療可以是前列腺根治術(shù)、放射療法、化學(xué)療法或抗雄激素治療。穩(wěn)定病情的早期檢測能夠避免對切緣和Gleason分評分不良的相對較年輕患者實(shí)時輔助治療，否則如果未檢測到病情穩(wěn)定則會對這些患者進(jìn)行治療。另一方面，可對使用本發(fā)明的方法檢測到早期復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行早期治療。因此，能夠檢測低水平PSA的能力使得減少對某些因?yàn)榫哂懈邚?fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)而目前正在進(jìn)行治療的患者的治療，因?yàn)楝F(xiàn)在已知由于他們的PSA水平低因此他們不具有BR。BR的這種早期檢測還可以導(dǎo)致早期治療。Nilsson et.al.，ActaOncologica Vol.43，N0.4，pp316_381，2004。
[0010]在一種實(shí)施方式中，可在治療之后監(jiān)測患者體內(nèi)的總PSA(tPSA或PSA)水平濃度，通過從治療后的患者獲得一個或多個樣本并通過使用檢測限至少低至lpg/mL和功能靈敏度低于10pg/mL的PSA檢測來確定每一樣本中的PSA量。在另一種實(shí)施方式中，使用檢測限和功能靈敏度低于lpg/mL的PSA檢測通過確定PSA值是否超過其對應(yīng)的PSA指標(biāo)臨界值(cutoff)來確定治療后患者的前列腺癌的復(fù)發(fā)。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，PSA檢測具有的檢測限至少低至0.2pg/mL,功能靈敏度等于或低于0.5pg/mL。
[0011]本發(fā)明的方法中使用的PSA檢測的檢測限和功能靈敏度的改進(jìn)能夠進(jìn)行早期生化再度惡化或復(fù)發(fā)的檢測。當(dāng)癌細(xì)胞較少并且這樣的細(xì)胞對治療更敏感時，這種早期生化復(fù)發(fā)的檢測將會實(shí)現(xiàn)早期的搶救性治療。搶救性治療可以包括局部放射療法，并且可以通過與并發(fā)的雄激素阻斷(concurrent androgen deprivation) 一起進(jìn)行或不與其一起進(jìn)行。例如，已顯示當(dāng)用于治療PSA倍增時間少于6個月(當(dāng)發(fā)生血清PSA濃度倍增的時間，為天或月或年)的男性時，使用標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)檢測確定的生化復(fù)發(fā)之后的兩年內(nèi)提供治療時，搶救性放射療法具有良好的效果。Trock et al., ASC02008Urogenitary CancersSymposium, Abstract N0.85。此外，早期生化復(fù)發(fā)的檢測可消除對病情穩(wěn)定的患者進(jìn)行進(jìn)一步昂貴的治療的需要，或避免了對這些患者的不必要的輔助和搶救性治療的需要。
[0012]在本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式中，使用功能靈敏度至少小于lpg/mL的PSA檢測來檢測前列腺癌治療之后的早期復(fù)發(fā)?；赑SA測量的指標(biāo)被用于檢測早期生化復(fù)發(fā)。這些指標(biāo)包括監(jiān)測過程中觀察到的最高PSA水平、最低PSA水平、最低PSA水平的倍數(shù)、最高PSA觀察水平與最低PSA水平的比值、或倍增數(shù)目。還可以使用PSA速率指標(biāo)，如Ln[PSA]相對(vs.)時間的PSA升高斜坡的速度、第二連續(xù)升高(pg/mL/月)和倍增時間?？梢詥为?dú)或組合使用任意這些指標(biāo)來確定患者是否具有早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)或病情穩(wěn)定。
[0013]在一個方面，本發(fā)明中提出的PSA檢測被用于確定患者是否具有前列腺癌復(fù)發(fā)的早期風(fēng)險(xiǎn)，即，檢測早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)，或患者是否更可能表現(xiàn)為病情穩(wěn)定的特征，即，檢測病情穩(wěn)定。例如，如果所觀察到的最高[PSA]等于或超過[PSA]指標(biāo)，則確定為患者具有ES-BCR，如果所觀察到的最高[PSA]低于[PSA]指標(biāo)，則確定為患者病情穩(wěn)定。
[0014]作為另一個實(shí)施例，PSA檢測能夠被用于測量獲自接受了前列腺癌的前列腺根除術(shù)的患者的系列樣本中的PSA濃度水平。該測量可被用于確定PSA速率值。從而能夠通過確定PSA升高值的速率是否等于或超過PSA升高指標(biāo)的速率來確定患者是否具有ES-BCR或病情穩(wěn)定。如果PSA升高的速率等于或超過速率指標(biāo)，則確定患者具有ES-BCR，如果PSA升高的速率低于閾值，則確定患者的病情穩(wěn)定。當(dāng)PSA速率指標(biāo)為倍增時間時，當(dāng)倍增時間值至少低至倍增時間指標(biāo)時倍增時間值等于或超過倍增時間指標(biāo)，即，低倍增時間比高倍增時間與更為不良的預(yù)后相關(guān)。
[0015]在另外一個方面，基于一個或多個PSA指標(biāo)的其他分析可將患者分為其他的亞類型，從而使臨床醫(yī)生調(diào)整治療以適合該亞類型，并在比目前臨床操作更早期地進(jìn)行這些治療。早期開始搶救性治療能夠改善患`者的治療效果。
[0016]本文中通過參考附圖和實(shí)施例更充分地描述本發(fā)明，附圖和實(shí)施例要與
【發(fā)明內(nèi)容】
部分、【具體實(shí)施方式】部分和具體討論或公開的任意優(yōu)選的和/或特定的實(shí)施方式一起閱讀。但是，可以多種不同的形式來表現(xiàn)本發(fā)明，不應(yīng)理解為限于本文列出的實(shí)施方式；而是這些實(shí)施方式僅是以舉例說明的方式提供，從而本文所披露的內(nèi)容是完整的、充分的，并將本發(fā)明的完整范圍充分地傳達(dá)給所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1示出了本發(fā)明的一種實(shí)施方式的結(jié)果，特別示出了 11號復(fù)發(fā)患者的具有指數(shù)擬合的核酸檢測免疫分析ΝΛ?.)1Λ^ [PSA] (PSA濃度)pg/mL相對前列腺根除術(shù)后的天數(shù)的曲線圖。NADIA?檢測[PSA]是【具體實(shí)施方式】部分中描述的NADIA?檢測研究確定的[PSA]。
[0018]圖2示出了 31號復(fù)發(fā)患者的NADIA? [PSA]pg/mL相對前列腺根除術(shù)后天數(shù)的
曲線圖。[0019]圖3示出了 38號復(fù)發(fā)患者的NADIA? [PSA]pg/mL相對前列腺根除術(shù)后天數(shù)的曲線圖。
[0020]圖4示出了病情穩(wěn)定的86號患者的NADIA? [PSA]pg/mL相對前列腺根除術(shù)后天數(shù)的曲線圖。
[0021]圖5示出了病情穩(wěn)定的120號患者的ΥΛ1.:)丨./Vk.: [PSA]pg/mL相對前列腺根除術(shù)后天數(shù)的曲線圖。
[0022]圖6示出了病情穩(wěn)定的126號患者的NADIA? [PSA]pg/mL相對前列腺根除術(shù)后天數(shù)的曲線圖。
[0023]圖7示出了圖示的所有43位復(fù)發(fā)患者的pg/mL相對前列腺根除術(shù)后天數(shù)的曲線圖。
[0024]圖8示出了 43位復(fù)發(fā)患者的PSA水平范圍限制于1000pg/ml的[PSA]pg/ml相對前列腺切除術(shù)后時間的疊加圖。
[0025]圖9示出了前列腺切除術(shù)后第一總[PSA]相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定(O))的曲線圖。
[0026]圖10示出了最低總[PSA]相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定(O))的曲線圖。
[0027]圖11示出了所觀察到的最高[PSA]水平(pg/mL)相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(O或病情穩(wěn)定(O))的曲線圖。
[0028]圖12示出了最高[PSA]水平/最低[PSA]水平相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定(O))的曲線圖。
[0029]圖13示出了 [PSA]水平的第二連續(xù)上升(pg/mL/月)相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定(O))的曲線圖。
[0030]圖14示出了倍增時間數(shù)據(jù)(天)相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定(O))的曲線圖。
[0031]圖15A-圖15C示出了倍增時間分別〈150天、150-400天、或>400天的復(fù)發(fā)患者的
疊加圖。
[0032]圖15A示出了倍增時間〈150天的復(fù)發(fā)患者的范圍限制于1000pg/mL的[PSA]pg/ml相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。
[0033]圖15B示出了倍增時間為150-400天的復(fù)發(fā)患者的范圍限制于1000pg/mL的[PSA]pg/ml相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。
[0034]圖15C示出了倍增時間>400天的復(fù)發(fā)患者的范圍限制于1000pg/mL的[PSA]pg/ml相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。
[0035]圖16A-圖16D分別示出了以倍增時間分類的復(fù)發(fā)患者亞類的疊加圖，范圍限制于1000pg/mL。倍增時間>400天的復(fù)發(fā)患者被進(jìn)一步細(xì)分為所觀察到的最高PSA是否超過或低于 200pg/mL。
[0036]圖16A示出了倍增時間〈150天的復(fù)發(fā)患者的[PSA]pg/ml相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。
[0037]圖16B示出了倍增時間為150-400天的復(fù)發(fā)患者的[PSA]pg/ml相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。[0038]圖16C示出了倍增時間>400天的復(fù)發(fā)患者的[PSA] >200pg/mL相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。
[0039]圖16D示出了復(fù)發(fā)患者的[PSA]pg/mL相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖。
[0040]圖17示出了 [PSA]pg/mL相對手術(shù)后天數(shù)的疊加圖，幾乎無例外，病情穩(wěn)定的患者的最高PSA通常不超過15pg/mL。
[0041]圖18示出了顯示監(jiān)測過程中的倍增數(shù)目數(shù)據(jù)相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定(O))的馬賽克圖。
[0042]圖19示出了顯示連續(xù)倍增數(shù)目數(shù)據(jù)相對患者亞群(前列腺癌復(fù)發(fā)(I)或病情穩(wěn)定
(O))的馬賽克圖。
[0043]圖20A和圖20B示出了多變量ROC曲線與NADIA?所觀察到的最高[PSA]水平的單變量ROC曲線對比。圖20A示出了多變量ROC曲線。圖20B示出了NADIA?所觀察到的最高[PSA]水平的單變量ROC曲線(黑線)相對多變量ROC曲線(虛線)。
[0044]圖21A和圖21B示出了多變量ROC曲線與NADIA?最高總[PSA]/最低[PSA]水平的單變量ROC曲線的對比。圖21A示出了多變量ROC曲線。圖21B示出了NADIA?最高總[PSA]/最低[PSA]水平的單變量ROC曲線(黑線)相對多變量ROC曲線(虛線)。
[0045]圖22A和圖22B示出了多變量ROC曲線與[PSA]第二升高(pg/mL/月)的單變量ROC曲線的對比。圖22B示出了多變量ROC曲線。圖22A示出了 [PSA] (pg/mL/month)的第二升高的單變量ROC曲線(黑線)對多變量曲線(虛線)。表22示出了邏輯回歸和ROC計(jì)算的結(jié)果。
[0046]圖23A-圖23C示出了最高總[PSA]、第二升高(pg/mL/月)指標(biāo)和最高總[PSA]/最低總[PSA]的單變量分析。
[0047]圖24示出了對于病情穩(wěn)定的患者經(jīng)過大約8年時間的[PSA]水平(pg/mL)相對時間(月)的線性擬合曲線。
[0048]圖25示出了對于復(fù)發(fā)患者經(jīng)過大約5年時間的[PSA]水平(pg/mL)相對時間(月)的線性擬合曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0049]根據(jù)本發(fā)明，使用檢測限至少低至lpg/mL且功能靈敏度低于10pg/mL的總血清PSA檢測(總血清PSA是同時測量血清中的游離的和復(fù)合物形式的PSA)來監(jiān)測前列腺癌治療之后的患者，并且其能夠被用于檢測治療后相對于術(shù)后病情穩(wěn)定的早期生化復(fù)發(fā)。
[0050]但是，當(dāng)使用常規(guī)的PSA檢測時，即使對作為前列腺癌復(fù)發(fā)指標(biāo)的生化復(fù)發(fā)的應(yīng)用也是有限制的。當(dāng)使用常規(guī)檢測來測量PSA時，前列腺根除術(shù)之后的血清PSA的最低值經(jīng)常低于檢出限。參見 unker et al., Anticancer Researchl9:2625-2658 (1999)。因此，當(dāng)循環(huán)中并不是確實(shí)不存在PSA時，常規(guī)檢測得到的RP后的血清PSA值會顯示為零納克/毫升(ng/ml)。參見Stamey，Clin.Chem.42(6):849-852。即使PSA值高于常規(guī)檢測的檢測限，但濃度也會低于該檢測的“功能靈敏度”(以精確性和準(zhǔn)確性定量低水平血清PSA濃度的能力)。這表示血清PSA的真實(shí)最低濃度不能通過常規(guī)檢測來檢測或精確且準(zhǔn)確地得到。這是令人遺憾的，因?yàn)樽畹蜐舛缺旧砜梢允菑?fù)發(fā)的預(yù)報(bào)信號，較低的最低濃度與較低的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。此外，當(dāng)PSA水平開始升高時，這不能被常規(guī)檢測檢測到，直到復(fù)發(fā)到了預(yù)后再次成為不良的階段才能被常規(guī)檢測檢測到。
[0051]侵襲性癌可能會復(fù)發(fā)地更快，但是由于其檢出限和功能靈敏度不夠，常規(guī)檢測不能檢測到這些復(fù)發(fā)。甚至非侵襲性癌也開始顯示出常規(guī)檢測不可檢測的血清PSA升高。因此，常規(guī)的血清PSA檢測不能輔助醫(yī)生早期檢測前列腺癌復(fù)發(fā)。
[0052]目前FDA批準(zhǔn)的大多數(shù)常規(guī)PSA檢測測量低至約100pg/mL，在美國泌尿外科協(xié)會前列腺癌指導(dǎo)小組(American Urological Association Prostate CancerGuideline Panel)近期推薦的生化復(fù)發(fā)的定義中反映了該檢出限(大于0.2ng/mL(200pg/mL)的[PSA],大于 0.2ng/mL 的 PSA 第二確認(rèn)水平)。參見 Cookson, et al., J.Urologyl77:540-545 (2007)。由于功能靈敏度的限制，常規(guī)PSA檢測顯示在具有低于該檢測的功能靈敏度的[PSA]的樣本中不存在PSA。例如Stamey(1996) ;Vassilikos etal., Clinical Biochemistry33(2):115-123(2000)。
[0053]對于治療后早期復(fù)發(fā)的檢測，了解治療后樣本中的PSA是否在檢測的功能靈敏度內(nèi)在臨床上是很重要的。否則，臨床醫(yī)生和患者就不知道陰性結(jié)果是反映了“不存在”PSA還是盡管存在產(chǎn)生PSA的細(xì)胞但檢測具有檢出限。
[0054]在本發(fā)明的方法中，具有如本文所述的低的功能靈敏度限制的檢測已被用于測量女性血清樣本中低至0.2-0.5pg/mL范圍的PSA水平。檢測的0.5pg/mL功能靈敏度能夠確定女性血清中的PSA水平是在0.5pg/mL至3pg/mL的范圍內(nèi)，而不是通常認(rèn)為的零。預(yù)期在前列腺根除術(shù)之后，男性具有的PSA水平至少等于在女性中發(fā)現(xiàn)的水平。因此，功能靈敏度低至0.5pg/mL的檢測能夠測量接受前列腺根除術(shù)后的男性中的可預(yù)期的最低PSA水平。
[0055]使用功能靈敏度低于0.5pg/mL的PSA檢測測量PSA水平能夠準(zhǔn)確測量治療后前列腺癌患者體內(nèi)的低PSA水平。使用Nucleic Acid Detection Immunoassay (核酸檢測免疫測定)(NADIA?測試)的[PSA]測量顯示，在前列腺根除術(shù)后，許多患者具有穩(wěn)定的低PSA水平，這表明這些患者的癌生長非常緩慢或已被治愈。對于血清PSA水平隨時間升高的患者，PSA水平是精確的?；颊逷SA血清水平的精確性足以確定PSA升高的斜率，并產(chǎn)生PSA水平先前低于目前檢測的功能靈敏度的樣本的可重復(fù)數(shù)據(jù)。測量PSA水平是指測量總PSA或tPSA的水平。
[0056]使用更靈敏的PSA檢測確定了在RP后的最低點(diǎn)之后PSA水平的指數(shù)升高。NADIA? PSA檢測結(jié)果顯示，在[PSA]水平達(dá)到200pg/mL之前，癌細(xì)胞存在并且指數(shù)生長很長時間。數(shù)據(jù)組的回顧性分析結(jié)果顯示，在血清水平達(dá)到目前的生化復(fù)發(fā)點(diǎn)200pg/mL之前，前列腺癌細(xì)胞存在并且生長了相當(dāng)長的時間。
[0057]在本發(fā)明的一個方面，具有至少低至0.5pg/mL的功能靈敏度和/或0.2pg/mL的檢測限的PSA檢測被用于確定早期前列腺癌的復(fù)發(fā)。它還降低了檢測早期復(fù)發(fā)所需的時間，達(dá)到例如比常規(guī)檢測提前30個月。使用這些PSA檢測，在0.5至100pg/mL范圍內(nèi)PSA的準(zhǔn)確測量能夠識別早期生化復(fù)發(fā)并比基于目前的臨床操作更早開始治療。
[0058]提早檢測到需要進(jìn)行早期復(fù)發(fā)前列腺癌的搶救性治療減少了開始對患者實(shí)施持續(xù)治療所需的時間，目前這樣的治療通常只在PSA水平超過200pg/mL之后才進(jìn)行。如本文所述，使用功能靈敏度為0.5pg/mL的PSA檢測來監(jiān)測患者可使對進(jìn)一步治療的評價比使用目前的生化復(fù)發(fā)測量提前了多達(dá)30個月。當(dāng)細(xì)胞可能還是更局部化和/或?qū)χ委熋舾袝r，這將有助于提供提前治療。[0059]在一個方面，本發(fā)明的方法能夠更早地和更精確地識別具有病情惡化的風(fēng)險(xiǎn)的男性和早期治療失敗的患者。本發(fā)明的方法還可用于較早地確定患者未復(fù)發(fā)。由此，通過可以更早地將患者分為病情穩(wěn)定或具有早期生化復(fù)發(fā)，使用更靈敏的PSA檢測降低了系統(tǒng)成本和患者的焦慮。
[0060]在某些方面，本發(fā)明的高度靈敏的、早期檢測方法能夠用于評價前列腺根除術(shù)之后的治療選擇。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于檢測患者的病情是否穩(wěn)定、是否應(yīng)該監(jiān)測和多長時間一次監(jiān)測患者的復(fù)發(fā)、是否和什么時候進(jìn)行搶救性治療(如抗雄激素治療、放射療法和化學(xué)療法)。
[0061]前列腺切除術(shù)后的治療主要是根據(jù)臨床觀察確定的，如Gleason評分、診斷時的年齡、手術(shù)切緣、腫瘤分期(T-stage)、組織浸潤、包膜浸潤、精囊浸潤、膀胱頸浸潤、淋巴結(jié)浸潤和腫瘤體積。對復(fù)發(fā)具有預(yù)測性的臨床參數(shù)包括高Gleason評分、使用目前檢測方法檢測到的高PSA(以目前的檢測方法測量的高于200ng/mL)、pT3病、陽性手術(shù)切緣和精囊浸潤。參見Nilsson,第346頁。
[0062]較高比例的前列腺癌患者未通過RP被治愈，并且27%_53%會在十年內(nèi)顯示出[PSA]升高。Nilsson et al.，“A systematic overview of radiation therapy effectsin prostate cancer, ^Acta Oncologica, 43 (4): 316-381 (2004)。但是，30% 至 70% 目前在進(jìn)行輔助治療的患者不會復(fù)發(fā)。因此，只根據(jù)如年齡、Gleason評分和手術(shù)切緣的臨床觀察來對前列腺切除術(shù)之后的患者進(jìn)行輔助治療會使很大一部分病情穩(wěn)定的患者遭受不必要的昂貴治療和可能的并發(fā)癥。
[0063]作為一個實(shí)例，可對表現(xiàn)出不良臨床征兆的患者進(jìn)行輔助治療。這些患者包括具有不良切緣和Gleason評分的較年輕的患者。例如，具有不良切緣和Gleason評分>7的五十歲年齡段的患者通常 會接受如外部放射治療(RT)的治療。對pT3病程的患者以外部束放射治療進(jìn)行前列腺切除術(shù)后治療可延長無生化疾病生存期，當(dāng)提早實(shí)施治療時，未經(jīng)RP治愈的患者實(shí)現(xiàn)病情穩(wěn)定的可能性要高于延遲搶救性治療。參見Nilsson et al.，at316。
[0064]但是，本發(fā)明的高靈敏檢測以及[PSA]值和指標(biāo)的應(yīng)用可以單獨(dú)使用或與臨床觀察組合使用，以提供穩(wěn)定病情的早期檢測，從而能夠避免目前進(jìn)行的不必要的輔助治療。例如，相對年輕患者的病情穩(wěn)定的早期檢測(否則會進(jìn)行治療)可避免對不必要的治療的需要和隨之而來的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。前列腺切除術(shù)后治療的副作用包括失禁、尿頻、夜尿、膀胱炎、腹瀉、直腸出血、性欲降低和/或陽痿。因此，在某些方面，使用本發(fā)明的檢測方法在早期檢測病情穩(wěn)定可避免在目前根據(jù)臨床觀察常規(guī)進(jìn)行輔助治療的患者中實(shí)施不必要的輔助治療。另外，直到使用常規(guī)方法得到的[PSA]達(dá)到200pg/mL的延遲實(shí)施搶救性治療降低了實(shí)現(xiàn)病情穩(wěn)定的可能性。參見Nilsson, 345。
[0065]因此，在某些方面，本發(fā)明的PSA值和PSA指標(biāo)可與臨床觀察結(jié)果組合使用從而確定是否進(jìn)行輔助和/或搶救性治療。例如，如果通常根據(jù)臨床觀察對患者進(jìn)行輔助和/或搶救性治療，但是多個PSA值之一未超過PSA指標(biāo)，則檢測到病情穩(wěn)定，可以避免進(jìn)行不必要的治療。詳細(xì)描述了可用于這些方法的PSA值和指標(biāo)。例如，當(dāng)[PSA]低于15pg/mL且Ln[PSA]對時間的斜率低于Ln[PSA]對時間的斜率指標(biāo)時，則即使相對較年輕的患者具有不良的切緣并且Gleason評分>7，也可以避免進(jìn)行輔助治療，并監(jiān)測患者直到一個或多個[PSA]值超過[PSA]指標(biāo)。[0066]在其他方面，當(dāng)本發(fā)明的方法和臨床觀察結(jié)果組合使用來檢測早期復(fù)發(fā)時，可對具有ES-BCR的患者進(jìn)行提前治療，從而提高預(yù)后。可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和治療方案進(jìn)行放射療法和化學(xué)療法。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的藥物或生物藥物組合物、組合、劑型和劑量進(jìn)行抗雄激素治療以用于治療前列腺切除術(shù)后患者的輔助或搶救性治療。
[0067]本發(fā)明的一個實(shí)施例是功能靈敏度為約0.5pg/mL且檢測限為0.2pg/mL的PSA檢測，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生信號的夾心免疫測定。在下文中描述了在本發(fā)明的方法中用于檢測血清或血漿樣本中的PSA的這樣的檢測的實(shí)例。在美國專利第5，665，539號中描述了蛋白質(zhì)的免疫PCR形式的檢測，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于本文作為參考。至少低至規(guī)定的PSA檢測的任意功能靈敏度可用于本發(fā)明的方法。檢測蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)檢測中信號生成的方法對于本領(lǐng)域的人員而言是已知的。例如，本發(fā)明的方法可使用能夠提供用于本發(fā)明的方法所需的功能靈敏度的檢測方式(包括夾心免疫測定)并產(chǎn)生信號的任何其他方法。例如，產(chǎn)生信號的方法可包括脫氧核糖核酸(DNA)芯片、生物發(fā)光、放射性、化學(xué)熒光、納米顆粒或寡核苷酸-納米顆粒，可以單獨(dú)使用或組合使用。
[0068]此外，如下文更詳細(xì)的討論的，如倍增時間和/或所觀察到的最大PSA濃度的PSA值可用于進(jìn)一步將早期復(fù)發(fā)患者分為多個組。這些分類可能可被用于對不同亞群的患者推薦不同的治療方法。因此，使用本發(fā)明能夠?yàn)榕R床醫(yī)生和患者提供對治療失敗或早期生化復(fù)發(fā)的精確指示，并能夠更及時和更適當(dāng)?shù)剡x擇治療方法以控制病情。此外，作為早期檢測結(jié)果的提前治療可改善患者的治療結(jié)果，并避免使病情穩(wěn)定的患者接受更昂貴的治療。
[0069]在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種檢測患者是否具有早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR, early stage biochemical recurrence)的方法，包括
[0070]a)從前列腺癌治療后的患者獲得樣本；
[0071]b)使用功能靈敏度至少低至20pg/mL的PSA檢測測量樣本的PSA水平，
[0072]c)使用一個或多個樣本的PSA水平來確定PSA值，其中如果一個或多個樣本的PSA值超過PSA指標(biāo)，則檢測到了 ES-BCR。
[0073]PSA檢測可用于確定從前列腺癌治療之后的患者獲得的樣本中的PSA水平。PSA水平可包括樣本中的PSA量或濃度。該樣本可以為血漿或血清樣本。PSA水平測量可用于監(jiān)測和評價前列腺癌治療是否使該病癥得到了有效治療。優(yōu)選地，PSA檢測具有的功能靈敏度至少低至0.5pg/mL，檢測限低至0.2pg/mL。
[0074]“PSA值”是一種參數(shù)，它是觀察到的PSA水平的函數(shù)。PSA值可以包括，例如，PSA最低水平之后測量的觀察到的PSA水平、觀察到的PSA水平或所觀察到的最大PSA水平與最低PSA水平的比值，Ln[PSA]相對時間的斜率、PSA水平升高的速率、PSA水平的倍增時間、或PSA水平的第二連續(xù)升高。所觀察的PSA水平可以為濃度或量。
[0075]“PSA指標(biāo)”是預(yù)定的邊界值、閾值或數(shù)目，其以統(tǒng)計(jì)顯著性來區(qū)分病情穩(wěn)定的患者和具有或?qū)⒕哂猩瘡?fù)發(fā)和/或疾病復(fù)發(fā)的患者的亞群。
[0076]當(dāng)使用功能靈敏度至少低至lpg/mL的PSA檢測獲得的PSA值超過對應(yīng)的PSA指標(biāo)時，就檢測到“早期生化復(fù)發(fā)(early stage biochemical recurrence)”?？蓡为?dú)或組合使用該值和對應(yīng)的指標(biāo)來確定患者是否具有ES-BCR或病情穩(wěn)定。
[0077]可以使用生物化學(xué)方法來確定疾病復(fù)發(fā)，或根據(jù)臨床觀察如成像或活組織檢查來確定，盡管這些方法具有對復(fù)發(fā)靈敏度較差的缺點(diǎn)。使用本發(fā)明的方法獲得的一個或多個PSA值和PSA指標(biāo)還可與臨床觀察結(jié)果組合來協(xié)助或確定患者的治療選擇。例如，使用本發(fā)明的方法檢測ES-BCR可導(dǎo)致進(jìn)一步的治療，這些治療包括放射療法、化學(xué)療法或抗雄激素治療。在某些實(shí)例中，如果[PSA]值早期快速升高和/或早期測量的PSA速率超過了 PSA速率指標(biāo)，則可以許可進(jìn)行進(jìn)一步的治療。作為另外一個實(shí)例，根據(jù)其他的包括臨床觀察結(jié)果的患者參數(shù)，早期不是那么快的[PSA]速率升高會導(dǎo)致或不會導(dǎo)致進(jìn)一步的治療。臨床觀察結(jié)果可包括Gleason評分、診斷時的年齡、切緣、腫瘤分期(T-stage)、組織浸潤、包膜浸潤、精囊浸潤、膀胱頸浸潤、淋巴結(jié)浸潤、活組織檢查或腫瘤體積。在某些實(shí)施方式中，支持進(jìn)一步治療的參數(shù)包括小于年齡邊界值(age cutoff )的年齡、超過Gleason評分邊界值的Gleason評分、使用本發(fā)明方法的高PSA、陽性切緣和精囊浸潤。年齡邊界值可以為，例如 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59 或 60、65、70、75 或 80。Gleason 評分邊界值可以為，例如 4、5、6、7、8、9、10。
[0078]作為另外一個實(shí)例，如果還存在未復(fù)發(fā)的臨床觀察指征，如低Gleason評分、或高齡(如超過70或80歲)，則[PSA]速率值的緩慢升高可能不會導(dǎo)致進(jìn)一步治療。此外，如果本發(fā)明的方法檢測到病情穩(wěn)定，則不進(jìn)行進(jìn)一步的治療。在未進(jìn)行進(jìn)一步治療的情況下，理想的是繼續(xù)使用本發(fā)明的方法監(jiān)測一個或多個PSA值，單獨(dú)使用或與臨床觀察結(jié)果組合使用從而確定在后期是否要進(jìn)行進(jìn)一步治療。
[0079]PSA指標(biāo)可以是所觀察到的最大PSA水平的預(yù)定邊界值或閾值、最低PSA水平的倍數(shù)(multiplier)、最大觀察PSA水平、最低PSA水平、Ln[PSA]相對(vs.)時間的斜率、PSA升高的速率或PSA的倍增時間。倍增時間是(Ln (2)/K)，其中K是PSA水平對時間的曲線圖的指數(shù)擬合的斜率。在倍增時間的情況下，當(dāng)倍增時間值小于或等于PSA指標(biāo)時，PSA值“超過” PSA指標(biāo)。使用如本文描述的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定PSA指標(biāo)。例如，PSA水平指標(biāo)可以為至少約 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60pg/mL的[PSA]指標(biāo)。更優(yōu)選地，PSA水平指標(biāo)為至少約15pg/mL、20pg/mL或25pg/mL的[PSA]指標(biāo)。還可以規(guī)定PSA水平指標(biāo)的范圍。[PSA]指標(biāo)范圍可以為，例如15-25pg/mL、15_22pg/mL或20_25pg/mL?？蓡为?dú)使用PSA或與其他的PSA指標(biāo)或臨床指標(biāo)組合使用從而確定患者病情穩(wěn)定或具有ES-BCR。
[0080]“PSA最低點(diǎn)”表示從例如接受前列腺根除術(shù)治療后的患者獲得的樣本測量的最低PSA量。PSA最低點(diǎn)是由于通過治療去除或殺死增生的前列腺組織造成的PSA清除。PSA的半衰期為2.2天至3.5天，并且將其從血管清除需要耗費(fèi)3至4周或達(dá)6-8周的時間。Ellis et al.，Adult Urology, 50 (4)，573-579，(1997)。在例如前列腺根除術(shù)治療后，在去除或殺死增生前列腺細(xì)胞的治療之后的血清PSA水平降至最低點(diǎn)。在病情穩(wěn)定的患者中，PSA水平會在降至最低點(diǎn)后保持平穩(wěn)。樣本可以是一系列血清樣本以用來測量其PSA水平。一系列的血清樣本是從接受了例如前列腺根除術(shù)或搶救性治療的治療后的同一患者在不同的時間點(diǎn)獲得的兩個或多個樣本。
[0081]治療是指前列腺疾病的醫(yī)療處置中的一種或多種治療。前列腺疾病的治療優(yōu)選是前列腺癌的治療。前列腺癌的治療優(yōu)選是前列腺根除術(shù)。前列腺癌的治療還可包括放射療法，其包括搶救性放射療法、以及激素療法或化學(xué)療法。
[0082]總PSA檢測優(yōu)選具有至少低至10pg/mL的檢測限和至少低至20pg/mL的功能靈敏度。PSA 檢測優(yōu)選具有至少低至 15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9,0.8,0.7、
0.6或0.5pg/mL的功能靈敏度。PSA檢測優(yōu)選具有低至0.2pg/mL的檢測限和/或約0.5pg/mL的功能靈敏度?？商娲兀诒疚闹?，檢測限是指功能檢測限或檢出限。檢出限(limitof detection, LOD)設(shè)定為5%的I型或II型誤差率檢測的樣本中的分析物的最低量。
[0083]在某些實(shí)施方式中，檢出限可以為至少低至15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、
2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5或0.2pg/mL。PSA檢測也可具有低至0.5pg/mL的檢測限，而功能靈敏度低至1、2、3、4或5pg/mL。在某些實(shí)施方式中，PSA檢測可具有0.2pg/mL的功能檢測限和0.5pg/mL的功能靈敏度，并且還包含使樣本與包含非核酸PSA結(jié)合體和能夠用于產(chǎn)生PCR信號的核酸標(biāo)記的結(jié)合物接觸。
[0084]近年來，對于生化復(fù)發(fā)的最普遍定義是[PSA]超過0.2ng/mL (200pg/mL),然而使用的是 100pg/mL 至 2000pg/mL 的水平范圍。Doherty et al., J.Cancer83 (11): 1432-1436 (2000)。用功能靈敏度至少低至1.0pg/mL的PSA檢測來確定早期生化復(fù)發(fā)是否發(fā)生是可能的。早期生化復(fù)發(fā)的檢測在使用常規(guī)PSA檢測確定的生化復(fù)發(fā)檢測之前進(jìn)行。
[0085]在本發(fā)明的一個方面，可通過比較所觀察到的最大PSA水平與PSA水平指標(biāo)來檢測基于PSA水平的ES-BCR。PSA水平為10pg/mL至60pg/mL之間的至少任意水平，優(yōu)選10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55 或60pg/mL,更優(yōu)選10、15、20、25或30pg/mL的PSA水平可用作PSA指標(biāo)來確定ES-BCR。例如，如果所觀察到的最大PSA水平指標(biāo)是15pg/mL,則將超過15pg/mL的所觀察到的最大PSA水平與PSA指標(biāo)進(jìn)行比較來檢測ES-BCR。
[0086]在另外一個方面，可利用所觀察到的最大PSA與最低PSA之比作為PSA指標(biāo)來確定是否發(fā)生ES-BCR。例如，所觀察到的最大PSA/最低PSA可以為3至11之間的任意值，優(yōu)選3、4、5、6、7、8、9、10或11，更優(yōu)選6。最低PSA水平的倍數(shù)可以為2X、4X或8X，優(yōu)選4X。
[0087]在本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式中，PSA檢測可用于確定從治療后患者獲得的系列樣本的PSA。隨時間取得的系列樣本的PSA測量可用于計(jì)算PSA速率值，包括PSA改變的速率、Ln[PSA]相對時間的斜率、或PSA增加的倍增時間。將一個或多個這些PSA速率值與其對應(yīng)的速率指標(biāo)進(jìn)行比較可以確定是否發(fā)生ES-BCR。
[0088]在該實(shí)施方式中，本發(fā)明可包含，例如，確定患者是否具有早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR, early stage biochemical relapse)的方法，包含:
[0089]a)從該患者獲得樣本；
[0090]b)使用功能靈敏度至少低至lpg/mL的PSA檢測確定每一樣本中的PSA水平；
[0091]c)確定該P(yáng)SA速率值超過PSA速率指標(biāo)，從而檢測到ES-BCR ;或
[0092]確定該P(yáng)SA速率值未超過PSA速率指標(biāo)，從而檢測到病情穩(wěn)定。
[0093]用于確定PSA值的第一樣本可取自治療后的任意時間，或在預(yù)先清除治療的PSA水平和PSA最低點(diǎn)之時或之后。通常，會在治療后的2周至8周之間的任意時間取第一樣本?？梢砸杂糜谇傲邢偌膊〉呐R床監(jiān)測的任意間隔設(shè)定來取樣。優(yōu)選在治療后30或45天取第一樣本，隨后優(yōu)選以3個月的間隔獲取其他的樣本。如果樣本PSA值顯示出ES-BCR已發(fā)生或顯示治療失敗，則可調(diào)整時間進(jìn)程。
[0094]應(yīng)從PSA最低點(diǎn)測量PSA水平的升高的速率。PSA升高速度超過指標(biāo)水平的患者具有發(fā)生早期生化復(fù)發(fā)的特征。可通過使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括單變量邏輯回歸和受試者工作特性(ROC)分析、雙變量分析或多變量分析或其他合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來獲得病情穩(wěn)定和具有ES-BCR的患者亞群進(jìn)行良好區(qū)分的指標(biāo)值，從而獲得、評價或確定速率指標(biāo)。
[0095]如下文進(jìn)一步討論的，PSA水平隨時間的升高速率是患者是否具有ES-BCR或病情穩(wěn)定的一個良好指標(biāo)。此外，諸如第二連續(xù)升高的速率指標(biāo)可用作患者是否具有ES-BCR或病情穩(wěn)定的指標(biāo)。[PSA]指標(biāo)的改變速度或第二連續(xù)升高指標(biāo)可以為0.2pg/mL/月和
2.5pg/mL/ 月之間的任意值，優(yōu)選 0.2,0.3,0.4.、0.5,0.6,0.8,0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2.、3.4、
3.6,3.8 或 4.0pg/mL/ 月，并且更優(yōu)選 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 或 2.0pg/mL/ 月，或這些值中的任意值。作為另外一個實(shí)例，Ln[PSA]相對時間的斜率指標(biāo)可以為超過約0.015 至 0.0425 之間的任意水平，優(yōu)選0.015,0.175,0.020,0.0225,0.025,0.0275,0.030、0.0325,0.035,0.0375,0.040,0.0425 或 0.045，并且更優(yōu)選 0.03。
[0096]此外，在一種實(shí)施方式中，患者是否具有ES-BCR的倍增時間指標(biāo)可以為400-800天之間的任意天數(shù)，更優(yōu)選 400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725,750,775或800天，并且最優(yōu)選550天。當(dāng)PSA速率值未超過PSA速率指標(biāo)時，確定病情是穩(wěn)定的；如果PSA速率值等于或超過PSA速率指標(biāo)，則檢測到了 ES-BCR。在倍增時間指標(biāo)的情況下，如果PSA倍增時間天數(shù)等于或少于倍增時間指標(biāo)，則檢測到了 ES-BCR。對于倍增時間值和指標(biāo)，如果倍增時間值小于倍增時間指標(biāo)，將確定倍增時間值超過倍增時間指標(biāo)。
[0097]在其他的實(shí)施方式中，所觀察到的最大PSA指標(biāo)和Ln[PSA]相對時間的斜率指標(biāo)的組合用于確定患者是否病情穩(wěn)定或具有ES-BCR。例如，該方法還包含c)確定PSA水平超過15pg/mL的PSA指標(biāo)并且Ln[PSA]相對時間的斜率超過0.03的Ln[PSA]相對時間的斜率指標(biāo)，從而檢測到ES-BCR。另外，如果PSA水平小于15pg/mL或PSA水平升高速率低于約0.03，則檢測到病情穩(wěn)定。在該實(shí)施例中，如果兩個PSA升高速率都等于或超過速率指標(biāo)，并且所觀察到的PSA值等于或超過所觀察到的最大PSA指標(biāo)，則確定ES-BCR。
[0098]在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測患者是否具有急性、中性或慢性早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR, early stage biochemical recurrence)的方法，包含
[0099]a)從前列腺癌治療后的患者獲得系列血清樣本；
[0100]b)使用功能靈敏度為約0.5pg/mL的PSA檢測測量每一樣本中的PSA水平；
[0101]c)確定PSA速率值；
[0102]d)確定PSA速率值等于或小于PSA速率指標(biāo)，從而檢測到了 ES-BCR ;和
[0103]e)根據(jù)PSA速率指標(biāo)將ES-BCR分類為急性、中性或慢性。
[0104]PSA倍增時間值等于或超過速率閾值的患者可根據(jù)倍增時間被分類為具有急性、中性或慢性早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)。作為一個實(shí)施例，在某些實(shí)施方式中，倍增時間等于或少于10個月顯示出快速復(fù)發(fā)；倍增時間大于約10個月到長達(dá)等于24個月或約24個月顯示出中性ES-BCR，倍增時間大于約24個月顯示出慢性復(fù)發(fā)。
[0105]在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測患者是否具有急性、中性或慢性早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)的方法，包含
[0106]a)從前列腺癌治療后的患者獲得一系列血清樣本組；[0107]b)使用功能靈敏度為約0.5pg/mL的PSA檢測測量每一樣本中的PSA水平；
[0108]c)確定倍增時間值和所觀察到的最大PSA值；
[0109]d)確定倍增時間等于或小于倍增時間指標(biāo)，從而檢測到了 ES-BCR ;和
[0110]e)根據(jù)倍增時間和所觀察到的最大PSA將ES-BCR分類為急性、中性或慢性。
[0111]在另一方面，可將PSA倍增時間等于或超過倍增時間閾值的患者根據(jù)倍增時間和/或所觀察到的最大PSA分類為四個ES-BCR亞類。I型復(fù)發(fā)患者的倍增時間少于150天。2型復(fù)發(fā)患者的倍增時間為150-400天，3型復(fù)發(fā)患者和4型復(fù)發(fā)患者的倍增時間超過400天。對于3型患者，所觀察到的最大PSA超過200pg/mL，而4型患者對于超過400天的持續(xù)時間所觀察到的最大PSA值不超過200pg/mL。
[0112]在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種確定檢測患者在前列腺癌的搶救性治療之后是否具有早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)的方法，包含
[0113]a)從接受搶救性治療后的患者獲得樣本；
[0114]b)使用功能靈敏度為約0.5pg/mL的PSA測定測量每一樣本中的PSA水平；
[0115]c)使用一個或多個樣本的PSA水平來確定PSA值；
[0116]其中，如果PSA值超過PSA指標(biāo)，則檢測到了 ES-BCR，如果PSA值未超過PSA指標(biāo)，則檢測到了病情穩(wěn)定。
[0117]在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種包含使用PCR信號檢測的適合于進(jìn)行PSA夾心免疫測定的核酸-抗PSA偶合物(conjugate,結(jié)合物)的試劑盒，其中該測定具有至少低至0.2pg/mL的檢測限和至少低至0.5pg/mL的功能靈敏度。該試劑盒還包含確定一個或多個PSA值的軟件。
[0118]在另外一個方面，本發(fā)明提供了一種包含檢測患者是否具有早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)的方法說明的標(biāo)簽(label )，其包含
[0119]a)從前列腺癌治療后的患者獲得樣本；
[0120]b)使用功能靈敏度小于lpg/mL的PSA檢測測量樣本中的PSA水平；
[0121]c)使用一個或多個樣本的PSA水平來確定PSA值；
[0122]其中，如果PSA值等于或超過PSA指標(biāo)，則檢測到了 ES-BCR，如果PSA值未超過PSA指標(biāo)，則檢測到病情穩(wěn)定。
[0123]實(shí)施例
[0124]使用較高靈敏度測定來測量總PSA (tPSA)的臨床研究顯示，通過使用較高靈敏度的檢測來監(jiān)測血清PSA的變化能夠提前檢測到生化復(fù)發(fā)。相比之下，以前報(bào)道的常規(guī)檢測的功能靈敏度是有限的，并且不能可靠地報(bào)告低于約0.01ng/mL(10pg/mL)的PSA水平。因此，使用高靈敏度[PSA]測定提供了更可靠的早期BCR檢測。
[0125]實(shí)施例1:檢測水平非常低的前列腺特異性抗原(PSA)的核酸檢測免疫測定(Nucleic Acid Detection Tmmunoassay, ΜΑΡ1ΑΦ測定)
[0126]使用功能靈敏度為0.5pg/mL的核酸檢測免疫測定(NADIA?測定)來測量血清樣本中的總PSA(tPSA)。參見Clin Chem53 (6) Suppl., 2007, #C-150以夾心免疫測定的形
式來實(shí)施NADIA?測定。
[0127]在設(shè)計(jì)為檢測接受前列腺根除術(shù)的男性患者樣本中pg/mL水平的PSA測定中使用了針對PSA上不同表位的兩種抗體。[0128]實(shí)施例1A:產(chǎn)牛.信號核酸-抗.PSA偶合物(coniugate)
[0129]第一抗體偶合(化學(xué)連接)于Jablonski 和 Adams 在 IVD Technology (2006 年 11月)中所描述的60個堿基的寡核苷酸。然后在pH范圍為7.0-7.5下將該報(bào)告抗體在含有牛血清白蛋白(BSA)和表面活性劑的的緩沖稀釋液中稀釋到約10-30皮摩爾(pM)以減少非特異性結(jié)合。
[0130]實(shí)施例1B:產(chǎn)生捕獲核酸-抗PSA偶合物
[0131]將第二抗體固定在直徑大約為I微米的順磁微粒上。捕獲抗體具有與其化學(xué)連接的生物素，使用Pierce提供的類別號為21335的EZ-連接硫代-NHS-LC-生物素(硫代琥珀酰亞胺基-6-(生物素氨基)己酸酯(鹽)，使用它們的目錄中描述的方法來使用上述生物素，隨后通過制造商Seradyn(類別號為3015-2104)制造的已連接到磁性微粒上的鏈霉親和素連接物將其連接到順磁微粒上。
[0132]實(shí)施例1C:NADIA?測定的備件
[0133]使75微升(μ I)的報(bào)告抗體與20 μ I的患者血清樣本在室溫下反應(yīng)兩小時。然后以異質(zhì)的形式將固定在順磁微粒上的捕獲抗體加入到報(bào)告抗體和樣本溶液中。輕輕攪拌使順磁微粒保持為懸浮狀態(tài)，從而使該混合物反應(yīng)30分鐘。
[0134]孵育結(jié)束時，從剩余溶液磁性分離微粒，小心地去除剩余溶液而在孔的一側(cè)留下磁性顆粒。然后將磁性顆粒清洗3-5次從而去除未結(jié)合的報(bào)告抗體。將該溶液緩沖至中性pH，該溶液含有如Tween20的表面活性劑。所得到的清洗后的顆粒只含有PSA(如果存在的話)，捕獲抗體和由DNA標(biāo)記的報(bào)告抗體成為夾心結(jié)構(gòu)。
[0135]然后將含有與DNA互補(bǔ)的互補(bǔ)引物和Taq聚合酶的PCR試劑加入到清洗后的順磁微粒中，進(jìn)行實(shí)時PCR。該P(yáng)CR擴(kuò)增步驟使用標(biāo)準(zhǔn)的市售試劑。在含有結(jié)合于報(bào)告抗體的DNA的免疫復(fù)合物的存在下，進(jìn)行DNA模板的擴(kuò)增。
[0136]然后從由已知的tPSA濃度校準(zhǔn)(5、25和100pg/mL)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取未知樣本。此外，每一 96孔板包含0.0pg/mL、10.0pg/mL和80.0pg/mL的PSA對照,進(jìn)一步保證每塊板的運(yùn)行的PCR擴(kuò)增步驟都在適當(dāng)?shù)目刂葡隆?br> [0137]如Jablonski和Adams在IVD Technology (2006年11月)中所述,還可以以同質(zhì)形式進(jìn)行該測定。例如，第一抗PSA單克隆抗體由寡核苷酸序列(a)標(biāo)記，第二抗體偶合于寡核苷酸序列(b)或(C)。寡核苷酸序列(a)分別與序列(b)和(C) 3’末端的最后9個和15個堿基互補(bǔ)。在含有0.1%的牛血清白蛋白(BSA)的IOmmol Tris (pH8.0)中將偶合對稀釋到lO-lOOpmol，并且在PSA的存在下結(jié)合2小時。然后用Tris/BSA稀釋溶液，從而將塊狀偶合物濃度降至低于lpmol，并在52°C下保持I分鐘以使未結(jié)合的偶合物完全融化。加入含有Taq聚合酶和下游引物的PCR試劑混合物，并封閉(seal)反應(yīng)。將溫度降低至23°C以使與免疫復(fù)合物相連的DNA鏈完全雜交并且開始第一鏈的延伸。游離的MAb-DNA在稀釋溶液中的第一延伸的時間范圍(time frame)內(nèi)不能以相同程度雜交，并且不能參與隨后的指數(shù)擴(kuò)增。使與PSA免疫復(fù)合物相連的重疊DNA標(biāo)記延伸5分鐘，通過將溫度提高到85°C超過3分鐘來結(jié)束。立即開始所形成的模板的實(shí)時PCR擴(kuò)增，破壞不再需要的免疫復(fù)合物。該測定的靈敏度確定為約100fg/mL。
[0138]為了證明NADIA? PSA 測定的性能，IMD 從 Eleftherios Diamandis M.D.Ph.D.(University Health Network and Toronto Medical Laboratories,多倫多,ON,加拿大)的實(shí)驗(yàn)室獲得患者樣本。這些樣本包括42位先前被Dr.Diamandis描述為具有病情穩(wěn)定特征的患者，和43位具有被他分類為具有生化復(fù)發(fā)的PSA值升高的患者。在前列腺切除術(shù)后獲得這些樣本，如果手術(shù)后他們的PSA值降低至100pg/mL則將他們的樣本包括在內(nèi)。使用幾種標(biāo)準(zhǔn)確定生化復(fù)發(fā)，并且生化復(fù)發(fā)是基于研究過程中獲得的時間點(diǎn)值。參見Yuj HejDiamandisj Eleftheriosj P.Wong, Pu1-Yuen; Nam，Robert; Trachtenberg, John iiDetection of Prostate Cancer Relapse with Prostate Specific Antigen Monitoring atLevels of.0Olto0.lug/L” J.Urologyl57:913-18(1997)?
[0139]NALM/VR PSA測定的靈敏度足以準(zhǔn)確區(qū)別背景值的回顧性臨床研究中所有女性樣本中的tPSA值和男性群體樣本中所觀察到的最低值。
[0140]實(shí)施例2:評價疾病結(jié)果的指標(biāo)的回顧性研究
[0141 ] N A L)J Λ'.ι-測定被用于測量前列腺根除術(shù)后前列腺癌患者的系列血清樣本中的tPSA水平。將結(jié)果與較早的使用基于免疫熒光(IFM)測定的研究測定的血清樣本的PSA水平的測量結(jié)果進(jìn)行比較。Vassilikos et al.，Clin.Biochem.33:115-123 (2000)。然后分析NADIA?測定結(jié)果從而確定患者臨床結(jié)果的一致性。
[0142]樣本
[0143]遵循以前發(fā)表的研究(J Uroll57:913-8，1997)儲存的血清樣本(N=435)用于本研究。在1993和1994年收集樣本,使用Abbott Laboratories IMx測定來測量PSA水平，然后將樣本于_40°C冷凍儲存。樣本也用于Vassilikos等的研究，其中使用IFM測定來確定tPSA水平。在Clin Chem迎:2108 - 14，1993中更詳細(xì)地描述了 IFM測定。從85位RP后的基線tPSA〈100pg/mL (利用Mx測定測量)的患者獲得用于Vassilikos等的研究的血清樣本，在RP后從每一位患者 獲取超過3個系列樣本(平均為5.0,中值為5,范圍為3-6)。中值年齡為63歲(年齡范圍為49-73歲)，RP前的tPSA為7.1ng/mL(0.1-49.0)，Gleason評分為7 (5-9)，腫瘤累及程度百分比是25% (1-90%)。臨床分期為Tla-c (16)、T2a_b (35)和未知(33)。4位患者接受了 RP前治療(激素=1 ;放射療法=2)。在Journal of Urology的研究中，對開始時以Abbott IMx測定確定tPSA值的血清樣本通過IFM方法進(jìn)行了再次分析，與初始值比較未顯示顯著差異。Journal of Urology的文章確定了 BCR為>2次的連續(xù)tPSA升高達(dá)到>100pg/mL，復(fù)發(fā)從第一次tPSA升高開始。
[0144]如果RP后前列腺根除術(shù)(RP)后患者的PSA水平低于使用目前FDA批準(zhǔn)的常規(guī)PSA測定的可檢測限，就將他們的血清樣本包括在NADIA?測定PSA研究中。多種常規(guī)測定都報(bào)道患者在手術(shù)后具有零或〈0.1ng/mL (〈100pg/mL)的值。NADIA? PSA可檢測低于FDA批準(zhǔn)的PSA測定大約200倍的PSA水平。因此，使用更高靈敏度的PSA測定能夠在第一時間測量前列腺切除術(shù)后患者的真實(shí)PSA水平。更靈敏和更準(zhǔn)確的PSA水平測量使得能夠?qū)⒒颊叻譃閮深?病情穩(wěn)定和早期生化復(fù)發(fā)。
[0145]研究中患者的描述性統(tǒng)計(jì)
[0146]因?yàn)闊oNADTA#/測定數(shù)據(jù)或不能獲得手術(shù)數(shù)據(jù)，7位患者被預(yù)期性地排除出該分析。本研究中包括的患者的最終數(shù)目為85位。在下表1中示出了本研究中包括的每一位患者隨著時間取樣獲得的[PSA] (pg/mL)測量結(jié)果。
[0147]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測患者是否具有早期生化復(fù)發(fā)(ES-BCR)的方法，包括: a)從前列腺癌治療后的患者獲得樣本； b)使用檢出限低于2.0pg/mL的PSA測定來測量所述樣本中的PSA水平； c)使用一個或多個樣本的PSA水平確定PSA值； 其中，如果所述PSA值至少是或超過PSA指標(biāo)，則檢測到ES-BCR，如果所述PSA值未超過所述PSA指標(biāo)，則檢測到病情穩(wěn)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述PSA指標(biāo)是[PSA]。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢出限至少低至1.0pg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或14所述的方法，其中，所述檢出限至少低至0.5pg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或14所述的方法，其中，所述檢出限至少低至0.2pg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣本是所述患者的系列樣本組中的一個,并確定每一樣本中的所述PSA的量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述PSA指標(biāo)是速率指標(biāo)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述速率指標(biāo)是倍增時間。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述速率指標(biāo)是Ln[PSA]相對時間的斜率。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述速率指標(biāo)是[PSA]升高的速度。
【文檔編號】G01N33/574GK103884840SQ201410149086
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2008年2月21日
【發(fā)明者】羅伯特·卡姆, 魯斯·桑德斯, 愛德華·亞布隆斯基, 托馬斯·亞當(dāng)斯, 馬克·J·薩爾諾 申請人:艾瑞斯國際有限公司