一種同時檢測血漿中復方丹蔞片主要成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)同時檢測血漿樣本中復方丹蔞片主要成分葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的方法。所述液相色譜中，流動相由乙腈和體積分數為0.1％的甲酸水溶液組成，采用梯度洗脫。所述質譜采用正負離子快速切換分析模式，MRM掃描方式。同時測定給藥丹蔞片后，大鼠血漿中這幾種主要成分的血藥濃度變化情況。方法學考察結果表明所建立的方法符合體內生物樣品測定要求，方法靈敏度好，專屬性強，穩(wěn)定、可靠，適宜含量較低物質的檢測。
【專利說明】—種同時檢測血漿中復方丹蔞片主要成分的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及一種同時檢測血漿中復方丹萎片主要成分的分析方法及其在藥代動力學中的應用。
【背景技術】
[0002]復方丹萎片是由瓜萎皮、薤白、葛根、川芎、丹參、赤芍、澤瀉、黃芪、骨碎補、郁金，十味中藥組成的上市中成藥。臨床主要用于寬胸通陽、化痰散結、活血化瘀，用于痰瘀互結所致的胸痹心痛，癥見胸悶胸痛、憋氣、舌質紫暗、苔白膩；冠心病心絞痛見上述證候者。文獻報道其主要成分為黃酮類、酚酸類、丹參酮類、三萜烷類、內酯類和芍藥苷等，并且葛根素、芍藥苷、丹參酮類成分在片劑中的含量較高。葛根素、芍藥苷、芒柄花黃素、丹參酮II A、隱丹參酮分別是葛根、赤芍、葛根和黃芪、丹參中的主要成分，大量文獻對其藥理活性進行了報道。但還沒有文獻同時對這幾種成分的藥代動力學進行報道，對復方丹萎片藥效物質基礎研究的文章也未見有報道。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS/MS)同時檢測血漿樣本中復方丹萎片主要成分葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的方法。并采用該方法對復方丹萎片中這幾種成分的藥代動力學特點進行研究，進一步了解復方丹萎片的吸收入血成分及其血藥濃度變化情況，為闡明復方丹萎片的藥物作用機制提供指導。
[0004]本發(fā)明所提供的方法包括:步驟(I)樣品的制備和步驟(2)采用液相色譜串聯質譜法進行檢測；
[0005]步驟(I)樣品的制備采用包括以下步驟的方法:
[0006]a)向待測血漿樣品中加入混合內標溶液、甲酸，并混勻；
[0007]b)加入乙酸乙酯提取劑，混勻后靜置；
[0008]c)離心，收集上清液，氮氣吹干，收集干燥物；
[0009]d)將得到的干燥物用甲醇復溶，混勻、離心，取上清液。
[0010]步驟a)中，所述混合內標溶液中所述內標為大黃素和桅子苷；其中，大黃素作為丹參酮和黃酮類化合物(即葛根素、芒柄花黃素、丹參酮II A和隱丹參酮)的內標，桅子苷作為芍藥苷的內標。所述混合內標溶液具體通過包括下述步驟的方法配制:精密稱取大黃素1.08mg,桅子苷1.0Omg于IOmL容量瓶中，加入適量甲醇溶解，并定容至刻度線，分別配成內標大黃素、桅子苷的儲備液；精密移取各內標儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成含大黃素1.08 μ g/mL'桅子苷5.00 μ g/mU1的混合內標溶液。
[0011]所述步驟a)中，所述待測血漿樣品與甲酸的體積比為100:20。
[0012]所述步驟b)中，所述靜置的時間為2_5min。所述待測血漿樣品與乙酸乙酯的體積比為 1:5-10。
[0013]所述步驟d)中，在離心步驟前還可包括對混勻后的產物進行超聲的步驟。[0014]所述超聲的時間為30-60S。
[0015]步驟a)、b)、c)和d)中，所述混勻均采用渦旋的方式，渦旋的時間均為l_2min。
[0016]步驟c)和d)中，所述離心的條件均為18000Xg-19000Xg離心10_15min。
[0017]步驟(2)檢測所用液相色譜條件如下:
[0〇18]色譜柱為C18柱；
[0019]流動相由乙腈和體積分數為0.1% (v/v)的甲酸水溶液組成；
[0020]洗脫方式為梯度洗脫；
[0021]所述梯度洗脫的程序如下:
[0022]O-1Omin:乙腈的體積分數由10%增加至30% ；
[0023]10-15min:乙腈的體積分數由30%增加至90% ；
[0024]15-24min:乙腈的體積分數維持90%不變；
[0025]步驟⑵檢測所用質譜條件如下:采用API3200?LC/MS/MS液質分析系統(tǒng)；Turbo1nSpray?離子源，正負離子快速切換分析模式，MRM掃描方式。
[0026]所述液相色譜條件中，色譜柱具體為Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6mmX 100mm, 1.8 μ m);流動相流速為400 μ L/min ;柱溫為30°C ;進樣量為5 μ L。
[0027]所述質譜條件中，所述正負離子快速切換分析模式中，正離子模式參數設置為:氣簾氣(CUR):30psi ;碰撞氣(CAD) =IOpsi ;離子噴霧電壓(IS):5500V ;溫度(TEM):450°C ；氣流I(GSl):30psi ;氣流2(GS2):60psi ;加熱(Ihe):0η ;負離子模式參數設置為:氣簾氣(CUR):15psi ;碰撞氣(CAD):12psi ;離子噴霧電壓(IS):-4500V ;溫度(TEM):450°C ;氣流I(GSl):30psi ;氣流 2(GS2):40psi ;加熱(Ihe):0η。
[0028]所述MRM方法的參數如下:
[0029]葛根素:母離子質量數(Ql):415.3;碎片離子質量數(Q3):295.1;解簇電壓(DP):-65V;入口電壓(EP):-6V;采樣時間(Dwell Time): 100 ;碰撞能:_32V ;碰撞池出口電壓(CXP):-20V ;保留時間(Rt):9.0Omin ；
[0030]芒柄花黃素:母離子質量數(Ql) =267.3 ;碎片離子質量數(Q3):252 ;解簇電壓(DP):-48V ;入口電壓(EP):-5V ;采樣時間(Dwell Time):100 ;碰撞能:-30V ;碰撞池出口電壓(CXP):-25V;保留時間(Rt):17.05min ；
[0031]芍藥苷:母離子質量數(Ql):449.1 ;碎片離子質量數(Q3):327.1 ;解簇電壓:_56V ;入口電壓(EP):-7V ;采樣時間(Dwell Time):100 ;碰撞能:_15V ;碰撞池出口電壓(CXP):-26V ;保留時間(Rt):11.1lmin ；
[0032]隱丹參酮:母離子質量數(Ql) =297.3 ;碎片離子質量數(Q3):251.3 ;解簇電壓:70V ;入口電壓(EP):6V ;采樣時間(Dwell Time):100 ;碰撞能:30V ;碰撞池出口電壓(CXP):21V;保留時間(Rt):19.76min ；
[0033]丹參酮II A:母離子質量數(Ql):295.3 ;碎片離子質量數(Q3):249.2;解簇電壓:80V ;入口電壓(EP):4.5V ;采樣時間(Dwell Time):100 ;碰撞能:35V ;碰撞池出口電壓(CXP):32V;保留時間(Rt):20.96min ；
[0034] 大黃素(SI):母離子質量數(Ql) =269.1 ;碎片離子質量數(Q3):225.1 ;解簇電壓:-65V ;入口電壓(EP):-7V ;采樣時間(Dwell Time):100 ;碰撞能:-39V ;碰撞池出口電壓(CXP):-15V;保留時間(Rt):18.31min ；[0035]桅子苷(S2):母離子質量數(Ql):387.0 ;碎片離子質量數(Q3):224.8 ;解簇電壓:-40V ;入口電壓(EP):-5V ;采樣時間(Dwell Time):100 ;碰撞能:-16V ;碰撞池出口電壓(CXP):-5V;保留時間(Rt):9.63min。
[0036]本發(fā)明還包括一種液相色譜串聯質譜法同時檢測血漿樣本中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的含量的方法，具體包括下述步驟:
[0037]I)標準曲線的制備:取一系列濃度的葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的混合標準品溶液加入空白血漿樣品中，按照上述的樣品制備方法進行制備，然后對得到的上清液按照上述的液相色譜串聯質譜法進行檢測，并分別記錄每個濃度的葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮對應的峰面積；以葛根素與內標峰面積比值Y為縱坐標，以葛根素濃度X為橫坐標，制備葛根素的線性回歸方程；以芒柄花黃素與內標峰面積比值Y為縱坐標，以芒柄花黃素濃度X為橫坐標，制備芒柄花黃素的線性回歸方程；以芍藥苷與內標峰面積比值Y為縱坐標，以芍藥苷濃度X為橫坐標，制備芍藥苷的線性回歸方程；以丹參酮II A與內標峰面積比值Y為縱坐標，以丹參酮II A濃度X為橫坐標，制備丹參酮II A的線性回歸方程；以隱丹參酮與內標峰面積比值Y為縱坐標，以隱丹參酮濃度X為橫坐標，制備隱丹參酮的線性回歸方程；
[0038]2)待測血漿樣品中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的含量測定:將待測血漿樣品按照上述的樣品制備方法進行制備，然后對得到的上清液按照上述的液相色譜串聯質譜法進行檢測，并分別記錄葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮對應的峰面積；計算葛根素與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述葛根素的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中葛根素的濃度；計算芒柄花黃素與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述芒柄花黃素的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中芒柄花黃素的濃度；計算芍藥苷與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述芍藥苷的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中芍藥苷的濃度；計算丹參酮II A與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述丹參酮II A的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中丹參酮II A的濃度；計算隱丹參酮與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述隱丹參酮的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中隱丹參酮的濃度。
[0039]本發(fā)明所述方法可成功用于復方丹萎片主要成分(葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮)的藥代動力學研究。
[0040]所述復方丹萎片由下列質量份的原料制成:瓜萎皮30-145重量份、薤白15-65重量份、葛根55-220重量份、川芎20-85重量份、丹參55-220重量份、赤芍20-85重量份、澤瀉55-220重量份、黃芪50-180重量份、骨碎補10_40重量份、郁金20-85重量份。
[0041]制備方法如下:取原料藥，川芎、郁金、澤瀉粉碎成細粉，過篩，混勻；赤芍、瓜萎皮、薤白加70%乙醇加熱回流提取1-3次，每次1-2小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.25-1.30 (65 °C );葛根和丹參，單包，加乙醇回流提取2-4次，每次0.5-2小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.25-1.30 (650C );黃芪、骨碎補及丹參醇提后的藥渣，加水煎煮1_3次，每次1_2小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.25-1.30 (650C );將三種濃縮液與上述細粉混合，減壓干燥，粉碎，加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成片劑。
[0042]本發(fā)明建立了液液萃取的大鼠血漿樣品處理方法、采用液質聯用(LC-ES1-MS/MS)的分析法，同時測定給藥丹萎片后，大鼠血漿中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、隱丹參酮和丹參酮II A的血藥濃度變化情況，并對其進行方法學考察。結果表明所建立的方法符合體內生物樣品測定要求，方法靈敏度好，專屬性強，穩(wěn)定、可靠，適宜含量較低物質的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1為測定的血漿樣品的色譜圖，其中，(a)為空白血漿色譜圖；(b)為空白血漿中加入各化合物及內標的色譜圖；(c)為大鼠給6g/kg丹萎片后30min的血漿色譜圖。
[0044]圖2為大鼠血漿中各成分的血藥濃度-時間曲線，其中，a為大鼠血漿中葛根素的血藥濃度-時間曲線山為大鼠血漿中芒柄花黃素的血藥濃度-時間曲線；c為大鼠血漿中芍藥苷的血藥濃度-時間曲線；d為大鼠血漿中隱丹參酮的血藥濃度-時間曲線；e為大鼠血漿中丹參酮II A的血藥濃度-時間曲線。
【具體實施方式】
[0045]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0046]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047]下述實施例中所用的藥材復方丹萎片由吉林康乃爾藥業(yè)提供。下述實施例中所用的試劑:
[0048]乙腈(美國Fisher)
[0049]超純水(Mi 11 ipore超純水凈化系統(tǒng)制得)
[0050]甲醇(色譜級別，天津市康科德科技有限公司)
[0051]乙酸乙酯(分析純級別，天津市康科德科技有限公司)
[0052]甲酸(高純，含量>99.99%，天津市光復精細化工研究所)
[0053]下述實施例中所用的儀器:
[0054]液質聯用儀:Agilentl200高效液相色譜儀，API3200串接四極桿質譜儀
[0055]超純水器:Mi11 ipore 公司，Mi I1-Q II 型
[0056]高速離心機:美國Sigma公司，3K15
[0057]超低溫冰箱:美國Thermo Heto公司，_86°C
[0058]超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250E
[0059]氮吹儀:美國Organomation 公司，N_EAVP?111
[0060]十萬分之一天平:瑞士Mettler Toledo 公司，AX205
[0061]萬分之一天平:德國Sartorius公司，BP121S
[0062]旋渦混合器:上海滬西分析儀器廠，XW-80A
[0063]下述實施例中所用的試驗動物:
[0064]健康雄性大鼠，品系SD，級別SPF級，體重200±20g，購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司。
[0065]下述實施例中所用的五種待測物標準品:葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A,隱丹參麗(中國藥品生物制品檢定所，純度> 98% )
[0066]內標:大黃素、振子昔(中國藥品生物制品檢定所，純度> 98% )。[0067]本研究首先對沉淀蛋白的方法進行了優(yōu)化，對沉淀試劑甲醇與樣品的體積比進行了考察，結果見表1。
[0068]表1甲醇比例對五種化合物的回收率和基質效應的影響
【權利要求】
1.一種液相色譜串聯質譜法同時檢測血漿樣本中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的方法，包括:步驟⑴樣品的制備和步驟(2)采用液相色譜串聯質譜法進行檢測； 所述步驟(1)樣品的制備采用包括以下步驟的方法: a)向待測血漿樣品中加入混合內標溶液、甲酸，并混勻；所述混合內標溶液中內標為大黃素和桅子苷；其中，大黃素作為葛根素、芒柄花黃素、丹參酮II A和隱丹參酮的內標,桅子苷作為芍藥苷的內標； b)加入乙酸乙酯提取劑，混勻后靜置； c)離心，收集上清液，氮氣吹干，收集干燥物； d)將得到的干燥物用甲醇復溶，混勻、離心，取上清液； 所述步驟(2)檢測所用液相色譜條件如下: 色譜柱為C18柱； 流動相由乙腈和體積分數為0.1 %甲酸水溶液組成； 洗脫方式為梯度洗脫； 所述梯度洗脫的程序如下: O-1Omin:乙腈的體積分數由10%增加至30% ； 10-15min:乙腈的體積分數由30%增加至90% ； 15-24min:乙腈的體積分數維持90%不變。
2.一種液相色譜串聯質譜法同時檢測血漿樣本中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的含量的方法，包括下述步驟: .1、標準曲線的制備: 取一系列濃度的葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的混合標準品溶液加入空白血漿樣品中，按照權利要求1所述的樣品制備方法進行制備，然后對得到的上清液按照權利要求1所述的液相色譜串聯質譜法進行檢測，并分別記錄每個濃度的葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮對應的峰面積； 以葛根素與內標峰面積比值Y為縱坐標，以葛根素濃度X為橫坐標，制備葛根素的線性回歸方程； 以芒柄花黃素與內標峰面積比值Y為縱坐標，以芒柄花黃素濃度X為橫坐標，制備芒柄花黃素的線性回歸方程； 以芍藥苷與內標峰面積比值Y為縱坐標，以芍藥苷濃度X為橫坐標，制備芍藥苷的線性回歸方程； 以丹參酮II A與內標峰面積比值Y為縱坐標，以丹參酮II A濃度X為橫坐標，制備丹參酮II A的線性回歸方程； 以隱丹參酮與內標峰面積比值Y為縱坐標，以隱丹參酮濃度X為橫坐標，制備隱丹參酮的線性回歸方程； .2、待測血漿樣品中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮IIA和隱丹參酮的含量測定: 將待測血漿樣品按照權利要求1所述的樣品制備方法進行制備，然后對得到的上清液按照權利要求1所述的液相色譜串聯質譜法進行檢測，并分別記錄葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮對應的峰面積；計算葛根素與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述葛根素的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中葛根素的濃度； 計算芒柄花黃素與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述芒柄花黃素的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中芒柄花黃素的濃度； 計算芍藥苷與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述芍藥苷的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中芍藥苷的濃度； 計算丹參酮II A與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述丹參酮II A的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中丹參酮II A的濃度； 計算隱丹參酮與內標峰面積比值Y，將Y值代入所述隱丹參酮的線性回歸方程中，計算得到所述待測血漿樣品中隱丹參酮的濃度。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟a)中，所述待測血漿樣品與甲酸的體積比為100:20 ； 步驟b)中，所述靜置的時間為2-5min;所述待測血漿樣品與乙酸乙酯的體積比為1:5-10 ； 步驟a)、b)、c)和d)中，所述混勻均采用渦旋的方式，渦旋的時間均為l-2min; 步驟c)和d)中，所述離心的條件均為18000Xg_19000Xg離心10_15min。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于:所述液相色譜條件中，色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱，規(guī)格為-A.6mmX 100mm,填料直徑為1.8 μ m ;流動相流速為400 μ L/min ;柱溫為50°C ;進樣量為5 μ L。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于: 步驟⑵檢測所用質譜條件如下:采用API3200?LC/MS/MS液質分析系統(tǒng)；Turbo1nSpray?離子源，正負離子快速切換分析模式，多反應監(jiān)測掃描方式。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于:所述質譜條件中，所述正負離子快速切換分析模式中，正離子模式參數設置為:氣簾氣:30psi ;碰撞氣:IOpsi ;離子噴霧電壓:5500V ;溫度:4500C ;氣流 I:30psi ;氣流 2:60psi ;加熱； 負離子模式參數設置為:氣簾氣:15psi ;碰撞氣:12psi ;離子噴霧電壓:-4500V ;溫度:4500C ;氣流 I:30psi ;氣流 2:40psi ;加熱。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于:所述質譜條件中，所述多反應監(jiān)測方法參數如下: 葛根素:母離子質量數:415.3 ;碎片離子質量數:295.1 ;解簇電壓:_65V ;入口電壓:-6V ;采樣時間:100 ;碰撞能:-32V ;碰撞池出口電壓:-20V ;保留時間:9.0Omin ； 芒柄花黃素:母離子質量數:267.3 ;碎片離子質量數:252 ;解簇電壓:_48V ;入口電壓:-5V ;采樣時間:100 ;碰撞能:-30V ;碰撞池出口電壓:-25V ;保留時間:17.05min ； 芍藥苷:母離子質量數:449.1 ;碎片離子質量數:327.1 ;解簇電壓:_56V;入口電壓:-7V ;采樣時間:100 ;碰撞能:-15V ;碰撞池出口電壓:-26V ;保留時間:11.1lmin ； 隱丹參酮:母離子質量數:297.3 ;碎片離子質量數:251.3 ;解簇電壓:70V ;入口電壓:6V ;采樣時間:100 ;碰撞能:30V ;碰撞池出口電壓:21V ;保留時間:19.76min ； 丹參酮II A:母離子質量數:295.3 ;碎片離子質量數:249.2 ;解簇電壓:80V ;入口電壓:4.5V ;采樣時間:100 ;碰撞能:35V ;碰撞池出口電壓:32V ;保留時間:20.96min ；大黃素:母離子質量數:269.1 ;碎片離子質量數:225.1 ;解簇電壓:_65V;入口電壓:-7V ;采樣時間:100 ;碰撞能:-39V ;碰撞池出口電壓:-15V ;保留時間:18.31min ； 桅子苷:母離子質量數:387.0 ;碎片離子質量數:224.8 ;解簇電壓:_40V;入口電壓:_5V ;采樣時間:100 ;碰撞能:_16V ;碰撞池出口電壓:_5V ;保留時間:9.63min。
8.權利要 求1-7中任一項所述的方法在測定復方丹萎片中葛根素、芒柄花黃素、芍藥苷、丹參酮II A和隱丹參酮的藥代動力學中的應用。
【文檔編號】G01N30/88GK104007220SQ201410258709
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權日:2014年6月11日
【發(fā)明者】常艷旭, 吳思丹, 龐玉華, 張鵬, 高秀梅, 李晉, 馬文芳 申請人:吉林康乃爾藥業(yè)有限公司