一種熒光型分子印跡探針的制備方法
【專利摘要】一種熒光型分子印跡探針的制備方法，以碲化鎘量子點(diǎn)為熒光元素，對碲化鎘量子點(diǎn)進(jìn)行包硅處理后作為載體，苯基膦酸為替代模板分子，采用表面印跡和抗原決定基法合成分子印跡探針，步驟如下：制備碲化鎘量子點(diǎn)溶液；制備量子點(diǎn)包硅微球；制備以量子點(diǎn)包硅微球?yàn)楹恕⒎肿佑≯E層為殼的復(fù)合材料；制備熒光型分子印跡探針。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該熒光型分子印跡聚合物結(jié)合了量子點(diǎn)的高靈敏性和分子印跡的高選擇性，在載體表面修飾分子印跡層，識(shí)別位點(diǎn)接近表面，易于選擇性識(shí)別目標(biāo)分子；采用抗原決定基法所合成的熒光探針可以識(shí)別目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽并表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)型效果。
【專利說明】一種熒光型分子印跡探針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及量子點(diǎn)熒光探針的制備技術(shù)，特別是一種熒光型分子印跡探針的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]分子印跡技術(shù)是制備在形狀、大小、空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)上與目標(biāo)分子完全匹配的分子印跡聚合物的技術(shù)，參見:G.Valtakis, L.Andersson, R.Muller, K.Mosbach,Nature, 1993，361(6413): 645-647; L.X.Chen, S.F.Xu, J.H.Li, Chem.Soc.Rev.,2011，40 (5)，2922-2942。分子印跡技術(shù)作為一種分離技術(shù)，具有預(yù)定性、識(shí)別性、實(shí)用性三大特點(diǎn)。目前分子印跡聚合物已被成功地應(yīng)用于小分子的識(shí)別分析，但是分子印跡聚合物對生物大分子比如多肽或者蛋白的識(shí)別依然是一種嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，這是因?yàn)樯锎蠓肿油哂休^大的分子量、一定的溶解性以及復(fù)雜的構(gòu)象變化。盡管存在種種困難，通過金屬螯合印跡、表面印跡和抗原決定基印跡等方法已經(jīng)成功地合成了大分子印跡聚合物，參見:L.Qin, X.ff.He, ff.Zhang, ff.Y.Li, Y.K.Zhang, Anal.Chem., 2009，81 (17): 7206-7216;J.X.Liu, K.G.Yang, Q.L.Deng, Q.R.Li, L.H.Zhang, Z.Liang, Y.K.Zhang, ChemCommun., 2011, 47 (13): 3969-3971 ；M.Kempe, M.Glad, K.Mosbach, J.Mol.Recognit.1995, 8 (1-2): 35-39; A.Nematollahzadeh, ff.Sun, C.S.A.Aureliano, D.Lutkemeyer,J.Stute, M.J.Abdekhodaie, A.Shojaei, B.Sellergren, Angew.Chem.1nt.Ed., 2011,50 (2): 495-498 ；A.Rachkov, N.Minoura, J.Chromatogr.A, 2000, 889 (1-2): 111-118;A.Rachkov, N.Minoura, Biochim Biophys Acta 2001, 1544 (1-2): 255-266; H.Nishino,C.S.Huang, K.J.Shea, Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.2006, 45 (15): 2392-2396。
[0003]量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)是由II _ VI族或III _ V族元素組成的半導(dǎo)體納米晶粒。由于量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)、發(fā)射光譜窄且對稱、發(fā)射波長可調(diào)、熒光量子產(chǎn)率高等良好的熒光特性，它成為在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有生命力的發(fā)展方向之一，參見:M.Bruchez Jr., M.Moronne, P.Gin, S.Weiss, A.P.Alivisatos, Science, 1998, 281(5385): 2013-2016; ff.C.ff.Chan, S.Nie, Science, 1998，281 (5385): 2016-2018。理想的熒光探針具有較高的靈敏性而且必須能夠與相應(yīng)的目標(biāo)分析物發(fā)生特異性的結(jié)合，由于合適的天然抗體價(jià)格昂貴、提取過程繁瑣，而且穩(wěn)定性差，因此將量子點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)與分子印跡技術(shù)的特點(diǎn)相結(jié)合具有非常的意義。
[0004]基于分子印跡技術(shù)的量子點(diǎn)熒光探針的制備技術(shù)，將分子印跡技術(shù)的高選擇性與量子點(diǎn)的高靈敏性性相結(jié)合，已成功地被用于小分子和蛋白質(zhì)的識(shí)別分析，參見:c.1.Lin, A.K.Joseph, C.K.Chang, Y.D.Lee, J.Chromatogr.A, 2004, 1027 (1-2):259-262; H.F.Wang.Y.He, T.R.Ji, X.P.Yan, Anal.Chem.2009，81 (4): 1615-1621; ff.Zhang, X.ff.He, Y.Chen, ff.Y.Li, Y.K.Zhang, Biosens.Bioelectron., 2011, 26 (5):2553-2558; ff.Zhang, X.ff.He, ff.Y.Li, Y.K.Zhang, 2012，48 (12): 1757-1759。本發(fā)明采用表面印跡和抗原決定基印跡方法制備熒光探針，利用優(yōu)良熒光性能的量子點(diǎn)作為熒光元素，先合成量子點(diǎn)包硅的微球并使其作為熒光載體，然后加入替代模板、功能單體和交聯(lián)劑制備熒光分子印跡聚合物探針用于選擇性地識(shí)別目標(biāo)物并表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)型效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對上述技術(shù)分析和存在問題，提供一種熒光型分子印跡探針的制備方法，該方法采用表面印跡和抗原決定基法，對目標(biāo)分子的識(shí)別具有較高的選擇性和靈敏性；且制備方法簡單，不同批次間重現(xiàn)性較好，在實(shí)際樣品中對目標(biāo)物的選擇性識(shí)別和檢測有著良好的應(yīng)用前景。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種熒光型分子印跡探針的制備方法，以碲化鎘量子點(diǎn)為熒光元素，對碲化鎘量子點(diǎn)進(jìn)行包硅處理后作為載體，苯基膦酸為替代模板分子，采用表面印跡和抗原決定基法合成分子印跡探針，包括如下步驟:
1)將碲粉(Te)、NaBH4與超純水混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并攪拌的條件下還原碲粉得到NaHTe溶液，將NaHTe溶液快速加入到含巰基丙酸(MPA)的CdCl2溶液中，用濃度為1.0 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為10.0，先在室溫下攪拌30分鐘，然后沸水浴加熱2 h，制得到碲化鎘量子點(diǎn)溶液；
2)將上述碲化鎘量子點(diǎn)溶液加入無水乙醇中，再加入氨水，攪拌條件下加入四乙氧基硅烷，25°C下反應(yīng)2 h，離心后棄去上清液，將沉淀物在無水乙醇中洗滌三次，真空干燥后得到量子點(diǎn)包娃微球；
3)將模板苯基膦酸加入無水乙醇中，加入3-脲丙基三甲氧基硅烷，預(yù)組裝30分鐘，然后將其加入到量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液中，再加入正辛基三甲氧基硅烷，室溫下攪拌12h，通過溶膠凝膠水解聚合反應(yīng)在量子點(diǎn)包硅微球的表面形成分子印跡層，得到以量子點(diǎn)包娃微球?yàn)楹?、分子印跡層為殼的復(fù)合材料；
4)將洗脫劑甲醇-氫氧化鈉的混合溶液加入到復(fù)合材料中，混合均勻，震蕩30分鐘，離心除去上清液，重新用上述洗脫劑甲醇-氫氧化鈉的混合溶液洗滌，重復(fù)此過程直到用紫外分光光度計(jì)檢測模板分子洗凈為止，即可制得熒光型分子印跡探針。
[0007]所述巰基丙酸的CdCl2溶液中巰基丙酸與CdCl2的摩爾比為2.4:1 ；NaHTe溶液中NaBH4與超純水的用量比為45.5 mg/mL, Te與NaBH4的摩爾比為1:19 ;碲化鎘量子點(diǎn)溶液中1^2_與巰基丙酸的摩爾比為1:4.8。
[0008]所述量子點(diǎn)包硅微球中氨水的質(zhì)量百分比濃度為25%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷(TE0S)、碲化鎘量子點(diǎn)的用量比為200 μ L:40 mL:100 μ L:8 mL。
[0009]所述復(fù)合材料中量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液的濃度為1.0 mg/mL,量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液、苯基膦酸、乙醇、3-脲丙基三甲氧基硅烷與正辛基三甲氧基硅烷的用量比為20 mL:40 mg:5 mL: 200 uL:1.076 mL。
所述洗脫劑中氫氧化鈉的濃度為0.1 mol/L,甲醇與氫氧化鈉溶液的體積比為4:1 ;洗脫劑與復(fù)合材料的用量比為2 mL/mg。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
I)量子點(diǎn)作為熒光元素，合成熒光型分子印跡聚合物結(jié)合了量子點(diǎn)的高靈敏性和分子印跡的高選擇性； 2)以量子點(diǎn)包硅微球?yàn)檩d體，采用表面印跡的方式，在載體表面修飾分子印跡層，識(shí)別位點(diǎn)接近表面，易于選擇性識(shí)別目標(biāo)分子；
3)采用抗原決定基法所合成的熒光探針可以識(shí)別目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽并表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)型效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是該熒光型分子印跡探針的透射電鏡圖。
[0012]圖2是該熒光型分子印跡探針對目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽的識(shí)別性能的熒光表征。
[0013]圖3是非印跡聚合物(參比)對目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽的識(shí)別性能的熒光表征。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例:
一種熒光型分子印跡探針的制備方法，以碲化鎘量子點(diǎn)為熒光元素，對碲化鎘量子點(diǎn)進(jìn)行包硅處理后作為載體，苯基膦酸為替代模板分子，采用表面印跡和抗原決定基法合成分子印跡探針，包括如下步驟:
1)將0.0636 g碲粉(Te)、0.363 g NaBH4與8 mL超純水混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并攪拌的條件下還原碲粉得到NaHTe溶液，當(dāng)反應(yīng)液由紫色完全變?yōu)榘咨螅瑢aHTe溶液快速加入到含巰基丙酸(MPA)的CdCl2溶液中，含巰基丙酸(MPA)的CdCl2溶液的用量比為12.5 mL CdCl2,53 μ L巰基丙酸和180 mL超純水，然后用濃度為1.0 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為10.0，先在室溫下攪拌30分鐘，然后沸水浴加熱2 h，制得到碲化鎘量子點(diǎn)溶液；
2)將8mL上述碲化鎘量子點(diǎn)溶液加入40 mL無水乙醇中，再加入200 μ L、質(zhì)量百分比濃度為25%的氨水，攪拌條件下加入100 μ L四乙氧基硅烷，25°C下反應(yīng)2 h，離心后棄去上清液，將沉淀物在無水乙醇中洗滌三次，真空干燥后得到量子點(diǎn)包硅微球；
3)將40mg模板苯基膦酸加入5 mL無水乙醇中，再加入200 μ L 3-脲丙基三甲氧基娃燒，預(yù)組裝30分鐘，然后將其加入到20 mL、濃度為1.0 mg/mL的量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液中，再加入1.076 mL正辛基三甲氧基硅烷，室溫下攪拌12 h，通過溶膠凝膠水解聚合反應(yīng)在量子點(diǎn)包硅微球的表面形成分子印跡層，得到以量子點(diǎn)包硅微球?yàn)楹恕⒎肿佑≯E層為殼的復(fù)合材料；
4)將體積比為4:1的洗脫劑甲醇-氫氧化鈉的混合溶液加入到上述復(fù)合材料中，洗脫劑與復(fù)合材料的用量比為2 mL/mg，混合均勻并震蕩30分鐘，離心除去上清液，重新用上述洗脫劑甲醇-氫氧化鈉的混合溶液洗滌，重復(fù)此過程直到用紫外分光光度計(jì)檢測模板分子洗凈為止，即可制得熒光型分子印跡探針。
[0015]制得的熒光型分子印跡探針對目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽的識(shí)別性能檢測: 將熒光型分子印跡探針和參照物分別加入到緩沖溶液中，超聲分散，使兩種物質(zhì)的濃
度均為100 mg/mL,然后分別加入0_35 μ M不同濃度等體積酪氨酸磷酸化多肽，用熒光分光光度計(jì)來測定探針及參照物與目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽的響應(yīng)。熒光分光光度計(jì):日立，日本，F(xiàn)-4500型；激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，激發(fā)波長設(shè)定在450 nm,在490-700 nm范圍內(nèi)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，光電管的電壓為700V。
[0016]圖1是該熒光型分子印跡探針的透射電鏡圖，圖中顯示:該方法制備的分子探針粒子的尺寸約256 nm，具有良好的分散性。
[0017]圖2是該熒光型分子印跡探針對目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽的識(shí)別性能的熒光表征，通過比較直線的斜率(探針的斜率與參比的斜率之比)，可以說明探針的識(shí)別行為。
[0018]圖3是非印跡聚合物(參比)對目標(biāo)分子酪氨酸磷酸化多肽的識(shí)別性能的熒光表征。通過參比的對照，可以看出對相同濃度的目標(biāo)分子，印跡聚合物的熒光響應(yīng)增強(qiáng)，也說明了探針具有良好的識(shí)別行為。
【權(quán)利要求】
1.一種熒光型分子印跡探針的制備方法，其特征在于:以碲化鎘量子點(diǎn)為熒光元素，對碲化鎘量子點(diǎn)進(jìn)行包硅處理后作為載體，苯基膦酸為替代模板分子，采用表面印跡和抗原決定基法合成分子印跡探針，包括如下步驟: 1)將碲粉(Te)、NaBH4與超純水混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并攪拌的條件下還原碲粉得到NaHTe溶液，將NaHTe溶液快速加入到含巰基丙酸(MPA)的CdCl2溶液中，用濃度為1.0 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為10.0，先在室溫下攪拌30分鐘，然后沸水浴加熱2 h，制得到碲化鎘量子點(diǎn)溶液； 2)將上述碲化鎘量子點(diǎn)溶液加入無水乙醇中，再加入氨水，攪拌條件下加入四乙氧基硅烷，25°C下反應(yīng)2 h，離心后棄去上清液，將沉淀物在無水乙醇中洗滌三次，真空干燥后得到量子點(diǎn)包娃微球； 3)將模板苯基膦酸加入無水乙醇中，加入3-脲丙基三甲氧基硅烷，預(yù)組裝30分鐘，然后將其加入到量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液中，再加入正辛基三甲氧基硅烷，室溫下攪拌12h，通過溶膠凝膠水解聚合反應(yīng)在量子點(diǎn)包硅微球的表面形成分子印跡層，得到以量子點(diǎn)包娃微球?yàn)楹?、分子印跡層為殼的復(fù)合材料； 4)將洗脫劑甲醇 -氫氧化鈉的混合溶液加入到復(fù)合材料中，混合均勻，震蕩30分鐘，離心除去上清液，重新用上述洗脫劑甲醇-氫氧化鈉的混合溶液洗滌，重復(fù)此過程直到用紫外分光光度計(jì)檢測模板分子洗凈為止，即可制得熒光型分子印跡探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述熒光型分子印跡探針的制備方法，其特征在于:所述巰基丙酸的CdCl2溶液中巰基丙酸與CdCl2的摩爾比為2.4:1 ；NaHTe溶液中NaBH4與超純水的用量比為45.5 mg/mL, Te與NaBH4的摩爾比為1:19 ;碲化鎘量子點(diǎn)溶液中Te與巰基丙酸的摩爾比為1:4.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述熒光型分子印跡探針的制備方法，其特征在于:所述量子點(diǎn)包硅微球中氨水的質(zhì)量百分比濃度為25%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷(TEOS)、碲化鎘量子點(diǎn)的用量比為 200 μ L:40 mL:100 μ L:8 mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述熒光型分子印跡探針的制備方法，其特征在于:所述復(fù)合材料中量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液的濃度為1.0 mg/mL，量子點(diǎn)包硅微球-乙醇溶液、苯基膦酸、乙醇、3-脲丙基三甲氧基硅烷與正辛基三甲氧基硅烷的用量比為20 mL:40 mg:5 mL: 200μ L:1.076 mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述熒光型分子印跡探針的制備方法，其特征在于:所述洗脫劑中氫氧化鈉的濃度為0.1 mol/L,甲醇與氫氧化鈉溶液的體積比為4:1 ;洗脫劑與分子印跡探針的用量比為2 mL/mgo
【文檔編號】G01N21/64GK104020147SQ201410265576
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】李文友, 李董艷, 何錫文, 張玉奎 申請人:南開大學(xué)