一種檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子（AuNPs）生物傳感器及其制備方法，包括：（1）制備AuNPs溶液；（2）加入GSH溶液作為抗聚集劑，混合均勻，對(duì)AuNPs進(jìn)行表面保護(hù)；（3）分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清肌酐溶液，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行比色和定量檢測(cè)，得出血清肌酐濃度與共振光散射(RLS)強(qiáng)度的關(guān)系曲線，即得到所述金納米粒子生物傳感器。GSH能在AuNPs的表面形成保護(hù)層，降低由于血清肌酐的加入而引起AuNPs的聚集程度，在合適的GSH濃度下，加入不同濃度的血清肌酐溶液，AuNPs溶液體系呈現(xiàn)顏色漸變的現(xiàn)象；同時(shí)利用AuNPs分散狀態(tài)或聚集程度與RLS強(qiáng)度的關(guān)系，可實(shí)現(xiàn)對(duì)血清肌酐的定量檢測(cè)。本發(fā)明的可視化測(cè)定和RLS強(qiáng)度檢測(cè)血清肌酐的方法具有簡(jiǎn)單快速、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】—種檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學(xué)與納米材料光譜分析領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，金納米粒子(AuNPs)作為一種生物化學(xué)納米傳感探針，憑借著簡(jiǎn)單快速、容易合成、高比表面積和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。同時(shí)，金納米粒子的分散狀態(tài)(酒紅色)或聚集狀態(tài)(藍(lán)色)又能作為比色分析的重要依據(jù)。比色分析法是開(kāi)始于十九世紀(jì)三、四十年代的一種定量分析的方法，通過(guò)比較或測(cè)量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測(cè)組分含量。選擇適當(dāng)?shù)娘@色反應(yīng)和控制好適宜的反應(yīng)條件，是比色分析的關(guān)鍵。
[0003]共振光散射(RLS)技術(shù)是在1993年由Pasternack等提出的、在普通熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行的檢測(cè)技術(shù)，最早應(yīng)用于生化分析中，因其具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等一系列的優(yōu)點(diǎn)，也被應(yīng)用于其它領(lǐng)域，如:藥物分析、納米材料等。共振光散射技術(shù)是一種利用光散射現(xiàn)象建立的測(cè)試方法。光散射指的是當(dāng)光束通過(guò)某種介質(zhì)時(shí)，從入射光方向以外所觀察得到的現(xiàn)象，該現(xiàn)象廣泛地存在于光與粒子的作用當(dāng)中。當(dāng)介質(zhì)中的電子受到光電磁波的電場(chǎng)振動(dòng)時(shí)，形成偶極振子，偶極振子從而向各個(gè)方向發(fā)射電磁波，即為光散射波。顯然，散射波會(huì)隨著介質(zhì)粒徑大小而產(chǎn)生不同。當(dāng)粒徑(r)遠(yuǎn)大于入射光波長(zhǎng)(Xci)時(shí)，產(chǎn)生的散射可看作是反射和折射；如果粒徑與入射光波長(zhǎng)接近，便產(chǎn)生丁達(dá)爾(Tyndall)散射；如果粒徑很小，且20r ( λ0時(shí)，則產(chǎn)生以瑞利散射為主的分子散射。在普通的熒光分光光度計(jì)上選擇合適的激發(fā)和發(fā)射通帶寬度，采用相等的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射單色器后所得的同步光譜(Λ λ =Onm)即為散射粒子的共振光散射光譜(RLS)。共振光散射光譜法只需要普通熒光分光光度計(jì)，調(diào)節(jié)激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)相等，即可獲得待測(cè)組分所引起的共振光散射強(qiáng)度。大量數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)表明，共振光散射強(qiáng)度與共振光散射粒子的濃度在一定范圍內(nèi)有線性關(guān)系，據(jù)此可直接進(jìn)行定量分析。
[0004]肌酐是一種含氮的有機(jī)非蛋白類化合物，是肌酸分解代謝的最終產(chǎn)物，包括血清肌酐和尿肌酐。人體血清肌酐的含量直接反映腎功能的健康程度。在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，血清肌酐的含量是檢驗(yàn)?zāi)I功能的其中一個(gè)特異性指標(biāo)。當(dāng)腎臟機(jī)能受損時(shí)，血清肌酐的正常排泄受到阻礙，使血清肌酐含量增加，即血清中肌酐含量升高意味著腎功能受到損害，故血清肌酐的測(cè)定在臨床診斷中有非常重要的意義。人類血清肌酐的合理生理濃度為4(Γ150ymol/L，當(dāng)血清肌酐濃度超過(guò)150 ymol/L，說(shuō)明血清肌酐濃度過(guò)高，表明此時(shí)腎臟已經(jīng)受到一定程度的損害；當(dāng)血清肌酐濃度超過(guò)250 ymol/L，就需要進(jìn)行腎透析。目前為止，血清肌酐的濃度在臨床上仍然是一個(gè)決定是否需要進(jìn)行腎臟透析的重要參考指標(biāo)。
[0005]目前測(cè)定血清肌酐的主要方法有化學(xué)測(cè)定法(堿性苦味酸法)、非酶電化學(xué)生物傳感法、電化學(xué)分析法、拉曼散射法、毛細(xì)管電泳法、同位素稀釋質(zhì)譜法、基于納米安培電流生物傳感法及高效液相層析法等。這些方法在血清肌酐的檢測(cè)上雖然都顯示出一定的靈敏度和選擇性，但是仍然存在著許多缺陷，如:實(shí)驗(yàn)操作和樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)，特異性差，需要昂貴的儀器等。因此，開(kāi)發(fā)快速簡(jiǎn)單、低成本且具有良好性能和較寬線性范圍的傳感器是必要的，其對(duì)腎病患者會(huì)起到積極的作用，且對(duì)于血清肌酐分析方法的發(fā)展及其在生物化學(xué)、藥學(xué)和臨床上的應(yīng)用都具有十分重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器的制備方法的制備方法。
[0007]具體地，該制備方法包括以下步驟:
(1)制備金納米粒子溶液；
(2)加入還原型谷胱甘肽溶液作為抗聚集劑，混合均勻，對(duì)金納米粒子進(jìn)行表面保護(hù)；
(3)分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清肌酐溶液，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，得出血清肌酐濃度與共振光散射強(qiáng)度的關(guān)系曲線圖，即得到所述的金納米粒子生物傳感器。
[0008]金納米粒子(AuNPs)在水溶液中的狀態(tài)與共振光散射(RLS)強(qiáng)度存在一定的關(guān)系，分散狀態(tài)下的AuNPs其體系RLS強(qiáng)度較低，而處于聚集狀態(tài)下的AuNPs其體系的RLS強(qiáng)度則明顯增加。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)血清肌酐能使AuNPs發(fā)生聚集，當(dāng)金納米顆粒聚集到一定的程度，金納米粒子的粒徑就會(huì)改變，導(dǎo)致RLS強(qiáng)度增加，AuNPs溶液的顏色也會(huì)發(fā)生明顯變化，該性質(zhì)是本發(fā)明進(jìn)行比色分析的依據(jù)。但是，本發(fā)明人同時(shí)發(fā)現(xiàn)微量的血清肌酐即可引起缺少表面保護(hù)的AuNPs發(fā)生劇烈聚集，意味著此時(shí)缺少保護(hù)的AuNPs溶液，其RLS強(qiáng)度及顏色變化對(duì)肌酐濃度的改變?nèi)狈Ρ嫖龆龋簿褪钦f(shuō)，即使肌酐的濃度繼續(xù)加大，其RLS強(qiáng)度的增加值和AuNPs溶液顏色依然與加入微量肌酐所得到的結(jié)果一樣。
[0009]谷胱甘肽是一種低分子量的硫醇，可分為氧化型(GSSG)和還原型(GSH)，來(lái)源于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的組織。在本制備方法中，利用的是還原型谷胱甘肽。當(dāng)具有硫醇基的GSH加入到AuNPs溶液中時(shí)，其很容易附著到金納米粒子的表面，能在金納米粒子表面形成一個(gè)保護(hù)層，可以降低由于血清肌酐的加入而引起AuNPs的聚集程度，即在本制備方法中GSH作為金納米粒子的抗聚集劑和保護(hù)劑。由此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在合適的GSH濃度下，不同濃度的血清肌酐能使AuNPs體系發(fā)生不同程度的聚集，由此呈現(xiàn)從紅色到藍(lán)色，有明顯梯度的顏色變化。與此同時(shí)，因?yàn)楣舱窆馍⑸湫盘?hào)強(qiáng)度是由樣品的聚集程度決定的，因此，GSH的加入使得RLS的增加值與血清肌酐濃度呈正比，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)血清肌酐的定量檢測(cè)。
[0010]作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，其中所述金納米粒子的粒徑范圍為16.5 土 2.5 nm。如前所述,共振光散射與介質(zhì)的粒徑大小直接相關(guān),散射波會(huì)隨著介質(zhì)粒徑大小而產(chǎn)生不同。在本發(fā)明的制備方法中，金納米粒子的粒徑范圍在16.5 土 2.5nm時(shí)，AuNPs溶液顏色改變對(duì)血清肌酐濃度的變化最為靈敏和穩(wěn)定，所測(cè)得的RLS的強(qiáng)度增加值與血清肌酐濃度間存在良好的線性關(guān)系。如果金納米粒子的粒徑大于19nm或小于14nm，RLS的增加值和AuNPs溶液顏色改變對(duì)血清肌酐濃度的變化不夠靈敏。
[0011]作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，其中所述金納米粒子與所述還原型谷胱甘肽的含量關(guān)系為每0.5ml濃度為0.5 X金納米粒子溶液中加入0.2ml濃度為I μ M的還原性谷胱甘肽溶液。0.5mL的AuNPs能在最大程度上滿足本發(fā)明對(duì)實(shí)現(xiàn)血清肌酐梯度顏色變化檢測(cè)的要求，因此，本發(fā)明優(yōu)選AuNPs的含量為0.5ml。同時(shí)，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若AuNPs為0.5ml，當(dāng)GSH (IyM)的含量低于0.2ml時(shí)(例如，0.15mL),AuNPs表面的GSH濃度較低，不能提供有效的保護(hù)，導(dǎo)致AuNPs聚集程度較大，不能顯示出良好的梯度變化和定量分析范圍；當(dāng)GSH (I μ Μ)的含量高于0.2mL (例如，0.3mL)時(shí)，AuNPs表面的GSH濃度較高，導(dǎo)致AuNPs的抗聚集效果明顯，不能滿足肌酐的比色和RLS定量分析要求，因此，0.2mL的GSH (I μ Μ)被選為0.5ml AuNPs的最佳抗聚集劑含量。
[0012]作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，其中所述金納米粒子溶液的制備方法如下:
(1)將氯金酸溶液煮沸；
(2)加入檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌煮沸約10min ；
(3)停止加熱，攪拌約20min至溶液冷卻至室溫，即得到金納米粒子溶液。
[0013]制備得到的金納米粒子溶液的濃度可依靠紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于521 nm處的吸光度來(lái)實(shí)現(xiàn)定量，當(dāng)金納米粒子在521 nm處的吸光度為1.000時(shí)，其濃度記作IX。通過(guò)TEM圖像可以推測(cè)AuNPs的平均粒徑，如前所述，金納米粒子的最佳粒徑范圍為16.5 土2.5 nm。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種由本發(fā)明方法制備成的檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器，以克服現(xiàn)有血清肌酐檢測(cè)技術(shù)中設(shè)備昂貴、特異性不強(qiáng)以及操作過(guò)程繁瑣的缺陷。
[0015]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種本發(fā)明制備的檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器在檢測(cè)血清肌酐含量的應(yīng)用方法，包括以下步驟:
(1)將pH為7.05的Britton-Robinson緩沖液和金納米粒子溶液均勻混合；
(2)加入還原型谷胱甘肽溶液，均勻混合；
(3)加入待測(cè)血清肌酐溶液，室溫下培育25min ；
(4)若溶液為酒紅色，則初步判斷待測(cè)血清肌酐溶液的濃度范圍為O?40μ M ;若溶液為紫色，則初步判斷待測(cè)血清肌酐溶液的濃度范圍為40?250 μ M ;若溶液為藍(lán)色，則初步判斷待測(cè)血清肌酐溶液的濃度大于250 μ M0
[0016]在本應(yīng)用方法中，由于GSH對(duì)AuNPs的表面保護(hù)，因此，不同濃度的血清肌酐能使AuNPs體系發(fā)生不同程度的聚集，由此呈現(xiàn)從紅色到藍(lán)色，有明顯梯度的顏色變化。因此，可以通過(guò)體系從酒紅色到紫色，再到藍(lán)色的顏色變化來(lái)用肉眼鑒別出血清肌酐的病理臨界值及其大致濃度范圍，具有明顯的簡(jiǎn)單快速和實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0017]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種本發(fā)明制備的檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器在檢測(cè)血清肌酐含量的應(yīng)用方法，包括以下步驟:
(1)將pH為7.05的Britton-Robinson緩沖液和金納米粒子溶液均勻混合；
(2)加入還原型谷胱甘肽溶液，均勻混合；
(3)加入待測(cè)血清肌酐溶液，室溫下培育25min ；
(4)將溶液置于熒光分光光度計(jì)上，以相同激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，在200?700nm的范圍內(nèi)進(jìn)行同步掃描，得到所述待測(cè)血清肌酐溶液的共振光散射強(qiáng)度；
(5)由所述血清肌酐濃度與共振光散射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，即可得出所述待測(cè)血清肌酐的濃度。
[0018]基于相同的原理，前一種應(yīng)用方法實(shí)現(xiàn)的是血清肌酐的簡(jiǎn)單快速、可視化檢測(cè)，得到的是血清肌酐的大致濃度范圍；后一種應(yīng)用方法利用共振光散射技術(shù)實(shí)現(xiàn)的是血清肌酐的定量檢測(cè)，該定量檢測(cè)血清肌酐的方法靈敏度高、線性范圍較寬且成本低、操作簡(jiǎn)單。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法制備的檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn):1)具有較好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，對(duì)血清肌酐具有很高的特異性，不易受到檢測(cè)樣品中其他物質(zhì)的干擾；2)利用GSH作為金納米粒子的抗聚集劑和保護(hù)劑，使得RLS的增加值和AuNPs溶液顏色的改變對(duì)血清肌酐濃度的變化極為敏感，能有效地?cái)U(kuò)展比色檢測(cè)的范圍，增加體系的顏色區(qū)分度，使肉眼檢測(cè)血清肌酐成為了可能；3)操作簡(jiǎn)單方便，極為快速，既能可視化檢測(cè)，也可精確定量檢測(cè)，滿足實(shí)際應(yīng)用中對(duì)于血清肌酐檢測(cè)的不同需求。因此，本發(fā)明制備的金納米粒子生物傳感器在檢測(cè)血清肌酐含量方面體現(xiàn)出良好的發(fā)展前旦
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【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為本發(fā)明制備方法的實(shí)驗(yàn)原理圖。
[0021]圖2為檢測(cè)不同濃度血清肌酐溶液的共振光散射強(qiáng)度信號(hào)關(guān)系圖。
[0022]圖3為制備的金納米粒子的透射電鏡圖。
[0023]圖4為比色檢測(cè)血清肌酐的顏色變化圖。
[0024]圖5為不同抗聚集劑對(duì)金納米粒子保護(hù)性能對(duì)比效果圖。
[0025]圖6為共振光散射強(qiáng)度差值與血清肌酐濃度的分段標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0026]圖7為比色檢測(cè)血清肌酐的紫外可見(jiàn)吸收光譜曲線關(guān)系圖。
[0027]圖8為本發(fā)明實(shí)施例制備的傳感器條件優(yōu)化對(duì)比效果圖。
[0028]圖9為還原型谷胱甘肽與其它氨基酸的詳細(xì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)圖。
[0029]圖10為本發(fā)明實(shí)施例制備的金納米粒子生物傳感器檢測(cè)血清肌酐的抗干擾性能測(cè)試圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030]為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本文所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0031]本發(fā)明巧妙利用了金納米粒子、還原型谷胱甘肽和血清肌酐各物質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，設(shè)計(jì)出一種能夠用于檢測(cè)血清肌酐含量的金納米粒子生物傳感器，其檢測(cè)血清肌酐含量的原理如圖1所示。如圖1所示，當(dāng)缺少GSH保護(hù)時(shí)，微量的血清肌酐分子即可使金納米粒子發(fā)生完全聚集，導(dǎo)致RLS的增加值和AuNPs溶液顏色的改變對(duì)血清肌酐濃度的變化不敏感，即RLS的增加值與血清肌酐含量之間并不存在線性關(guān)系，并且不能通過(guò)肉眼來(lái)進(jìn)行肌酐含量的判斷；當(dāng)加入GSH時(shí)，GSH附著到金納米粒子的表面，在金納米粒子表面形成一個(gè)保護(hù)層，降低由于血清肌酐的加入而引起AuNPs的聚集程度。在合適的GSH濃度下，不同濃度的血清肌酐能使AuNPs體系發(fā)生不同程度的聚集，由此呈現(xiàn)從紅色到藍(lán)色，有明顯梯度的顏色變化。與此同時(shí)，因?yàn)楣舱窆馍⑸湫盘?hào)強(qiáng)度是由樣品的聚集程度決定的，因此，GSH的加入使得RLS的增加值與血清肌酐濃度之間存在良好的線性關(guān)系，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)血清肌酐的定量檢測(cè)。
[0032]實(shí)施例1
1.制備特定粒徑范圍的金納米粒子膠體溶液
取2.9 mL，10 mmol/L的氯金酸(HAuC14*4H20)，以去離子水在100 mL容量瓶中稀釋到刻度線，煮沸，然后加入3.5 mL, 1% (wt%)檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌煮沸，10 min后，停止加熱，攪拌約20 min至溶液自然冷卻至室溫。將制備得到的AuNPs溶液保存在4°C的環(huán)境中。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于521 nm處檢測(cè)最后得到的金納米粒子溶液的吸光度，從而定量確定金納米粒子的濃度。當(dāng)金納米粒子在521 nm處的吸光度為1.000時(shí)，其濃度記作IX，金納米粒子的濃度約為15nM (紫外分光光度計(jì)測(cè)量計(jì)算所得)。通過(guò)圖3的TEM圖像可以推測(cè)出所制備的AuNPs的粒徑范圍為16.5 ±2.5 nm。
[0033]2.制備金納米粒子生物傳感器
在1.5mL離心管中，將0.1 mL’pH為7.05的Britton-Robin緩沖液(伯瑞坦-羅比森緩沖溶液，在10ml三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.04mol/L)中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.05即可制備得到)和0.5 mL的AuNPs溶液均勻混合，然后加入0.2 ml, 10_6 mol/L的GSH溶液，均勻混合和培育5 min ;之后在各個(gè)離心管中分別加入0.2 mL，一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清肌酐溶液，使各個(gè)離心管中體系總體積為1.0 mL，室溫下培育25 min ;最后將各個(gè)離心管中的溶液置于IX Icm的熒光石英比色皿中，對(duì)其進(jìn)行同步熒光(即激發(fā)波長(zhǎng)=發(fā)射波長(zhǎng))掃描，掃描范圍:200?700 nm，激發(fā)光狹縫寬度:2.5 nm，發(fā)射光狹縫寬度:2.5nm，掃描速率:1200 nm/min，光電倍增管電壓:600 V，得到不同濃度(O?1000 μ mol/L)標(biāo)準(zhǔn)血清肌酐的共振光散射光譜。
[0034]圖2顯示了不同掃描波長(zhǎng)下，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清肌酐的共振光散射強(qiáng)度，由圖2可以看出，金納米粒子在561nm處的光散射峰可以被定義為共振光散射峰，并可以此作為定量分析的依據(jù)。本發(fā)明人測(cè)得金納米粒子和由GSH保護(hù)的金納米粒子溶液都呈現(xiàn)一較弱的RLS信號(hào)，而當(dāng)肌酐加入體系中時(shí)，RLS的強(qiáng)度明顯增加。另外，RLS的強(qiáng)度隨著肌酐濃度的增大而增強(qiáng)，同時(shí)其光譜圖的形狀大致相同，上述的特征都說(shuō)明在GSH保護(hù)的金納米粒子和肌酐之間存在聚集反應(yīng)，即GSH保護(hù)的金納米粒子和肌酐的結(jié)合增加了散射體的數(shù)量，從而令RLS信號(hào)增強(qiáng)。
[0035]圖6顯示了血清肌酐濃度與共振光散射強(qiáng)度差值的分段標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖6可以看出，在O?1000 μ M的范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)所使用的金納米粒子傳感器的RLS信號(hào)分別與10?250μ M和250?ΙΟΟΟμ M兩個(gè)肌酐濃度范圍形成線性關(guān)系，兩校準(zhǔn)曲線方程如圖所示。值得一提的是，肌酐濃度250 μ M對(duì)應(yīng)著比色法測(cè)定的顏色臨界點(diǎn)，與圖4Α所示的結(jié)果一致。因此，利用上述兩種線性范圍，本實(shí)驗(yàn)所提出的金納米粒子生物傳感器非常具有實(shí)際的臨床應(yīng)用意義。血清肌酐的檢出限為1.21 μ mol/Lo
[0036]而且，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著血清肌酐濃度的增加，用肉眼可以明顯看出AuNPs溶液呈現(xiàn)從酒紅色到紫色，再到藍(lán)色的梯度顏色變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。如圖4A所示，當(dāng)肌酐濃度在O?10 μ M時(shí)，AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色，當(dāng)肌酐濃度在10?250 μ M時(shí)，AuNPs溶液呈現(xiàn)紫紅色，當(dāng)肌酐濃度大于250 μ M時(shí)，AuNPs溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。圖4Β中I代表GSH (0.2μ Μ) ;2?12分別代表氨基丙酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，色氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，組氨酸，濃度均為I μ Μ，由圖4Β可以看出，除了 GSH，其他氨基酸(2?12)的加入對(duì)AuNPs溶液的顏色并無(wú)明顯影響。
[0037]我們利用紫外-可見(jiàn)光光譜分析來(lái)對(duì)該金納米粒子傳感器作進(jìn)一步的性質(zhì)探討。如圖7所示，當(dāng)血清肌酐處于較低濃度(O和I μΜ)時(shí)，只有位于521nm處出現(xiàn)一吸收峰，而當(dāng)逐漸增加血清肌酐的濃度時(shí)，在640-663nm處吸收峰強(qiáng)度逐漸增加，并且其在521nm處的吸收強(qiáng)度不斷減少，從側(cè)面證明了在GSH保護(hù)的金納米粒子之間隨著血清肌酐濃度的增力口，存在著一個(gè)粒子間的聚集過(guò)程。
[0038]實(shí)施例2
1.不同抗聚集劑對(duì)金納米粒子的保護(hù)
為了對(duì)金納米粒子進(jìn)行保護(hù)，使得RLS的增加值和AuNPs溶液顏色的改變對(duì)血清肌酐濃度的變化更為更具梯度變化，以便于擴(kuò)展肌酐比色檢測(cè)和定量分析范圍，本發(fā)明人試驗(yàn)了各種氨基酸和GSH對(duì)金納米粒子的保護(hù)效果，試驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖9所示。圖5中橫坐標(biāo)I代表GSH (0.2 μ M);橫坐標(biāo)2?12分別代表氨基丙酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，色氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，組氨酸，濃度均為ΙμΜ，由圖5可以看出固定血清肌酐的濃度為100 μ Μ，可以觀察到，在加入GSH和各種氨基酸后，只有加入GSH的反應(yīng)體系出現(xiàn)一個(gè)明顯的Λ U信號(hào)(Λ I1^s信號(hào)為加入血清肌酐后和前的，有GSH或氨基酸提供保護(hù)的金納米粒子的RLS強(qiáng)度差值)，意味著GSH能為金納米粒子提供有效的保護(hù)作用，而其余各種氨基酸并不能。
[0039]圖9是更加詳細(xì)的對(duì)比效果圖。圖9中橫坐標(biāo)中I代表谷胱甘肽，2?12代表:氨基丙酸，亮氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，賴氨酸，酪氨酸，色氨酸，蘇氨酸，纈氨酸，組氨酸。條形圖上的a分別代表:1 =AuNPs +血清肌酐(100 μ M);其余2?12 =AuNPs +各種氨基酸(I μΜ) +血清肌酐(100 μΜ);條形圖上的b分別代表:1:AuNPs + GSH (0.20 μ Μ)+ 血清肌酐(100 μ Μ);其余 2 ?12:AuNPs + GSH(0.20 μ Μ) + 各種氨基酸(I μ Μ) +血清肌酐(100 PM)。通過(guò)圖9的對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)I中，加入GSH前后對(duì)比強(qiáng)烈，可知GSH的引入的確可以令A(yù)uNPs的RLS強(qiáng)度降低；另外，由2?12的氨基酸對(duì)比可知，其他各種氨基酸不起保護(hù)作用，而且GSH加入到氨基酸中，再次證明GSH的保護(hù)效果。
[0040]2.金納米粒子生物傳感器的條件優(yōu)化
我們對(duì)GSH的用量(濃度均為I μ Μ)進(jìn)行了優(yōu)化，如圖8Α所示。由吸收關(guān)系圖可知，AuNPs體系為0.5ml,當(dāng)采用0.3mL或0.15mL的GSH時(shí)(圖中曲線I和3)，AuNPs體系呈現(xiàn)紅色或藍(lán)色，因?yàn)镚SH提供了過(guò)多和過(guò)少的保護(hù)效果，而采用0.2mLGSH時(shí)，體系的顏色變化符合理想預(yù)期，可以提供更明顯的顏色對(duì)比效果，因此，選擇0.2mL, I μ M的GSH作為抗聚集劑。
[0041 ] 我們對(duì)體系pH值進(jìn)行了優(yōu)化，如圖8B所示。明顯地，當(dāng)pH=7.05，此時(shí)AuNPs體系的Λ Iels達(dá)到最大值，因此我們選擇ρΗ=7.05為反應(yīng)的最佳pH值。此時(shí)體系其余的反應(yīng)條件為[GSH]: 0.20 μΜ,[血清肌酐]:100 μ M, [AuNPs]: 0.5Χ。
[0042]圖8C試驗(yàn)了不同AuNPs濃度下的體系Λ Iels值?？芍?dāng)AuNPs的濃度為0.5Χ時(shí)，AuNPs體系呈現(xiàn)最高的Λ Im值，因此我們選擇0.5 X的AuNPs作為體系最優(yōu)的AuNPs的濃度條件。此時(shí)體系其余的反應(yīng)條件為[GSH]: 0.20 μ Μ,[血清肌酐]:100 μ Μ, ρΗ7.05.我們還對(duì)體系培育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，由圖8D所示，最終選擇25min作為體系的最優(yōu)培育時(shí)間。此時(shí)體系其余的反應(yīng)條件為[GSH]: 0.20 μΜ,[血清肌酐]:100, 250, 500，800，1000 μΜ, [AuNPs]: 0.5X, ρΗ7.05。
[0043]3.抗干擾性測(cè)試
為探究本發(fā)明檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子傳感器對(duì)其他潛在物質(zhì)的抗干擾性能，我們分別選取了可能與血清肌酐共存的不同的金屬離子(鈣離子、鈉離子、鋅離子、鎂離子(均為50μΜ);尿素(ΙμΜ)以及抗壞血酸(ΙμΜ))進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn)。如圖10所示，在GSH(0.2 μ Μ)存在的情況下，肌酐與各種金屬離子、金屬離子混合溶液、尿素、抗壞血酸共存時(shí)所呈現(xiàn)的RLS信號(hào)值都與單獨(dú)加入肌酐的RLS信號(hào)值幾乎一樣。由此可以得出，即使體系中存在類似干擾物，其RLS信號(hào)也是可靠的。其余反應(yīng)條件為:[AuNPs]: 0.5X, pH7.05。說(shuō)明本發(fā)明制備的傳感器具有良好的血清肌酐檢測(cè)特異性。
[0044]最后應(yīng)說(shuō)明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備金納米粒子溶液； (2)加入還原型谷胱甘肽溶液作為抗聚集劑，混合均勻，對(duì)金納米粒子進(jìn)行表面保護(hù)； (3)分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清肌酐溶液，利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)，得出血清肌酐濃度與共振光散射強(qiáng)度的關(guān)系曲線圖，即得到所述的金納米粒子生物傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的金納米粒子生物傳感器的制備方法，其中所述金納米粒子的粒徑范圍為16.5 ± 2.5 nm。
3.如權(quán)利要求1所述的金納米粒子生物傳感器的制備方法，其中所述金納米粒子與所述還原型谷胱甘肽的含量關(guān)系為每0.5ml濃度為0.5 X金納米粒子溶液中加入0.2ml濃度為I μ M的還原性谷胱甘肽溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的金納米粒子生物傳感器的制備方法，其中所述 金納米粒子溶液的制備方法如下: (1)將氯金酸溶液煮沸； (2)加入檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌煮沸約10min ； (3)停止加熱，攪拌約20min至溶液冷卻至室溫，即得到金納米粒子溶液。
5.—種如權(quán)利要求1?4任一所述方法制備成的檢測(cè)血清肌酐的金納米粒子生物傳感器。
6.一種如權(quán)利要求5所述的金納米粒子生物傳感器的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將pH為7.05的Britton-Robinson緩沖液和金納米粒子溶液均勻混合； (2)加入還原型谷胱甘肽溶液，均勻混合； (3)加入待測(cè)血清肌酐溶液，室溫下培育25min ； (4)若溶液為酒紅色，則初步判斷待測(cè)血清肌酐溶液的濃度范圍為O?40μ M ;若溶液為紫色，則初步判斷待測(cè)血清肌酐溶液的濃度范圍為40?250 μ M ;若溶液為藍(lán)色，則初步判斷待測(cè)血清肌酐溶液的濃度大于250 μ M0
7.—種如權(quán)利要求5所述的金納米粒子生物傳感器的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將pH為7.05的Britton-Robinson緩沖液和金納米粒子溶液均勻混合； (2)加入還原型谷胱甘肽溶液，均勻混合； (3)加入待測(cè)血清肌酐溶液，室溫下培育25min ； (4)將溶液置于熒光分光光度計(jì)上，以相同激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，在200?700nm的范圍內(nèi)進(jìn)行同步掃描，得到所述待測(cè)血清肌酐溶液的共振光散射強(qiáng)度； (5)由所述血清肌酐濃度與共振光散射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，即可得出所述待測(cè)血清肌酐的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104345053SQ201410534807
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】高文華, 黃曉鵬, 陳耀文, 張嘉宏, 陳佳陽(yáng), 陳圖鋒, 張曉珊 申請(qǐng)人:汕頭大學(xué)