本發(fā)明屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)測(cè)定瑪咖中11種瑪咖酰胺含量的方法。

背景技術(shù)：

瑪咖(Lepidium meyenii)為十字花科獨(dú)行菜屬的一種一年生草本植物，最早生長(zhǎng)在海拔超過4000米的秘魯中央的安第斯山區(qū)，具有2000年的食用歷史?，斂У母o部分比地上部分具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，根形似小圓蘿卜，外形顏色有紫、黑、黃等。研究表明瑪咖具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，瑪咖還具有許多傳統(tǒng)的療效，如作為瀉藥、治療風(fēng)濕病、呼吸道疾病、痛經(jīng)及女性更年期綜合征等。另外，瑪咖還具有改善性功能、提高人畜生育能力、緩解疲勞及抗氧化等功能。基于以上特點(diǎn)，瑪咖被稱為“秘魯人參”?，斂е械默斂０繁灰暈橹饕幕钚怨δ艹煞?，是評(píng)價(jià)瑪咖質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。

目前對(duì)瑪咖酰胺的檢測(cè)方法很多，高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)技術(shù)應(yīng)用于瑪咖酰胺的含量檢測(cè)也有報(bào)道，但已有報(bào)道的方法中同時(shí)測(cè)定瑪咖酰胺的種類較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的采用HPLC法能同時(shí)測(cè)定瑪咖中11種瑪咖酰胺的含量，并利用建立的方法測(cè)定了20個(gè)不同樣品的含量，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)便快捷，是一種分析瑪咖酰胺類成分的有效途徑，可為瑪咖中瑪咖酰胺的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為瑪咖品種選育及優(yōu)良品種推廣奠定理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種同時(shí)測(cè)定瑪咖中11種瑪咖酰胺含量的方法，包括以下幾個(gè)步驟：

(1)待測(cè)溶液的制備

粉碎，過篩，精密稱取瑪咖粉末，以1g:10mL料液比加入石油醚，超聲提取30min，過濾，濾渣再重復(fù)提取兩次，合并濾液，濃縮，用甲醇定容制得待測(cè)溶液；

(2)對(duì)照品混合液的制備

分別精密稱取N-(間-甲氧基芐基)-亞麻酰胺、N-芐基亞麻酰胺、N-(間甲氧基芐基)-亞油酰胺、N-芐基亞油酰胺、N-芐基十五碳酰胺、N-(間-甲氧基芐基)-十六碳酰胺、N-芐基十六烷酰胺、N-芐基-9Z-十八碳烯酰胺、N-芐基十七烷酰胺、N-(間-甲氧基芐基)-十八碳酰胺、N-芐基十八烷酰胺對(duì)照品，用甲醇分別溶解后混合，配制成多組對(duì)照品混合液，所述對(duì)照品混合液中各對(duì)照品的質(zhì)量濃度介于0.5～1000μg/mL范圍內(nèi)；

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別吸取步驟(2)中多組對(duì)照品混合溶液，進(jìn)行液相色譜測(cè)定；

色譜條件為：色譜柱Xtimate XB-C18色譜柱4.6×250mm，5μm；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為水、流動(dòng)相B為乙腈；梯度：0～24min，80％流動(dòng)相B～100％流動(dòng)相B；檢測(cè)器G4212-60008二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm、280nm；流速0.8mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL；

以步驟(2)中各對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(4)待測(cè)溶液中瑪咖酰胺含量的測(cè)定

按步驟(3)的色譜條件對(duì)待測(cè)溶液進(jìn)行測(cè)定，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中每種瑪咖酰胺的含量。

進(jìn)一步的，步驟(3)中所述的多組對(duì)照品混合溶液中各瑪咖酰胺的濃度范圍分別為:N-(間-甲氧基芐基)-亞麻酰胺0.5～35μg/mL、N-芐基亞麻酰胺5～300μg/mL、N-(間甲氧基芐基)-亞油酰胺0.5～100μg/mL、N-芐基亞油酰胺4～1000μg/mL、N-芐基十五碳酰胺1～30μg/mL、N-(間-甲氧基芐基)-十六碳酰胺5～50μg/mL、N-芐基十六烷酰胺1～1000μg/mL、N-芐基-9Z-十八碳烯酰胺5～150μg/mL、N-芐基十七烷酰胺1～40μg/mL、N-(間-甲氧基芐基)-十八碳酰胺1～10μg/mL、N-芐基十八烷酰胺5～60μg/mL。

進(jìn)一步的，該方法對(duì)11種瑪咖酰胺的檢出限如下：

N-(間甲氧基芐基)-亞麻酰胺：2.57；

N-芐基亞麻酰胺：1.46；

N-(間甲氧基芐基)-亞油酰胺：2.06；

N-芐基亞油酰胺：1.64；

N-芐基十五碳酰胺：10.35；

N-(間甲氧基芐基)-十六碳酰胺：2.91；

N-芐基十六烷酰胺：2.82；

N-芐基-9Z-十八碳烯酰胺：1.29；

N-芐基十七烷酰胺：7.85；

N-(間甲氧基芐基)-十八碳酰胺：4.93；

N-芐基十八烷酰胺：3.41。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明的提取方法,解決了現(xiàn)有的回流或索氏提取等方法的操作麻煩、提取率低、成本高、提取時(shí)間較長(zhǎng)的問題；

(2)本發(fā)明的檢測(cè)方法為梯度洗脫方法，分離度好，可以同時(shí)檢測(cè)瑪咖中11種瑪咖酰胺；本發(fā)明只用乙腈和水作為流動(dòng)相，解決了三氟乙酸對(duì)色譜柱損耗大、清洗麻煩等問題，流動(dòng)相配置方便，簡(jiǎn)便了操作；

(3)本發(fā)明的方法線性關(guān)系良好、精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、回收率高、簡(jiǎn)便、快捷并且準(zhǔn)確可行，可作為瑪咖中主要瑪咖酰胺標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中瑪咖酰胺對(duì)照品混合液的液相色譜圖；

圖2是實(shí)施例1中S18拉薩紫瑪咖樣品的液相色譜圖。

其中：1為編號(hào)C1,2為編號(hào)C2,3為編號(hào)C3,4為編號(hào)C4,5為編號(hào)C5,6為編號(hào)C6,7為編號(hào)C7,8為編號(hào)C8,9為編號(hào)C9,10為編號(hào)C10,11為編號(hào)C11。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實(shí)施例內(nèi)容。實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

本實(shí)施例選擇編號(hào)為S1-S20的20種瑪咖作為待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定，具體步驟如下：

(1)待測(cè)溶液的制備

粉碎待測(cè)樣品，過篩，精密稱取5.0g瑪咖粉末，加入50mL石油醚，超聲提取30min，過濾，濾渣以上述方法再提取兩次，合并濾液，濃縮，用甲醇定容至10mL，待HPLC定量分析。

(2)對(duì)照品混合液的制備

分別精密稱取N-(間-甲氧基芐基)-亞麻酰胺、N-芐基亞麻酰胺、N-(間甲氧基芐基)-亞油酰胺、N-芐基亞油酰胺、N-芐基十五碳酰胺、N-(間-甲氧基芐基)-十六碳酰胺、N-芐基十六烷酰胺、N-芐基-9Z-十八碳烯酰胺、N-芐基十七烷酰胺、N-(間-甲氧基芐基)-十八碳酰胺、N-芐基十八烷酰胺對(duì)照品，用甲醇分別溶解后混合，配制成六組對(duì)照品混合液，所述對(duì)照品混合液中各對(duì)照品的質(zhì)量濃度介于0.5～1000μg/mL范圍內(nèi)；各對(duì)照品的濃度具體如下表1：

表1

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別吸取步驟(2)中多組對(duì)照品混合溶液，進(jìn)行液相色譜測(cè)定；

色譜條件為：色譜柱Xtimate XB-C18色譜柱4.6×250mm，5μm；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為水和流動(dòng)相B為乙腈；梯度：0～24min，80％流動(dòng)相B～100％流動(dòng)相B；檢測(cè)器G4212-60008二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm、280nm；流速0.8mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL；

以步驟(2)中各對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線；按信噪比3:1確定檢測(cè)限，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及檢出限見表2；

表2 11種瑪咖酰胺對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

(4)待測(cè)溶液中瑪咖酰胺含量的測(cè)定

色譜條件為：色譜柱Xtimate XB-C18色譜柱(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相為A(水)和B(乙腈)，梯度：0～24min，80％B～100％B；檢測(cè)器G4212-60008二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm、280nm；流速0.8mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10μL，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中每種瑪咖酰胺的含量。結(jié)果如下表3：

表3瑪咖中瑪咖酰胺的含量(單位：μg/g)

實(shí)施例2

(1)精密度實(shí)驗(yàn)

取瑪咖酰胺對(duì)照品溶液，上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算各瑪咖酰胺峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，結(jié)果所有瑪咖酰胺的RSD值在0.94％～4.73％之間，表明所用儀器精密度良好。結(jié)果如表4所示。

表4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

(2)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取S18樣品(產(chǎn)于拉薩的紫瑪咖)提取溶液，上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算各瑪咖酰胺含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果所有瑪咖酰胺的RSD值在0.42％～4.42％之間，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果如表5所示。

表5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

(3)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一瑪咖樣品提取液，按上述色譜條件，分別在放置0、2、4、8和12h后進(jìn)樣分析，計(jì)算含量，計(jì)算樣品各瑪咖酰胺的RSD，結(jié)果其RSD值在0.47％～4.40％之間，表明供試品溶液在室溫條件下放置12h穩(wěn)定性良好。結(jié)果如表6所示。

表6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝5)

(4)加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別取9份相同重量的已知各瑪咖酰胺含量的瑪咖樣品按上述方法制備瑪咖酰胺提取液，分別加入不同含量的瑪咖酰胺對(duì)照品溶液，完全混勻后經(jīng)過0.45μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10μL。各瑪咖酰胺的平均回收率在98.23％～100.82％之間，表明方法準(zhǔn)確率高，結(jié)果見表7。

表7加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝9)

綜上所述，本發(fā)明的方法線性關(guān)系良好、精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、回收率高、簡(jiǎn)便、快捷并且準(zhǔn)確可行，可作為瑪咖中主要瑪咖酰胺標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法。