本申請(qǐng)涉及免疫檢測(cè)，尤其涉及一種磷酸化tau蛋白p-tau217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、阿爾茨海默病（alzheimer?disease，ad）俗稱老年癡呆，是最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。在出現(xiàn)ad的臨床癥狀前15~20年，就存在神經(jīng)病理改變，如腦組織會(huì)出現(xiàn)β淀粉樣蛋白（aβ）斑塊、tau蛋白過(guò)度磷酸化等，aβ蛋白和tau蛋白的積聚會(huì)使神經(jīng)元功能出現(xiàn)障礙甚至死亡，導(dǎo)致患者記憶等認(rèn)知功能顯著下降，但這個(gè)過(guò)程進(jìn)展極其緩慢，因此將窗口前移，在疾病早期進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別有助于ad的早期干預(yù)。

2、目前臨床上對(duì)于ad的診斷手段包括量表評(píng)估、核磁共振成像（magneticresonance?imaging，mri）、正電子發(fā)射斷層掃描（positron?emission?tomography，pet）以及腦脊液（cerebro-spinal?fluid，csf）檢測(cè)等，由于存在客觀性不足、侵入性強(qiáng)、操作繁瑣，價(jià)錢昂貴等缺點(diǎn)極大限制了臨床推廣使用，特別是在基層醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)中的使用。ad臨床漏診率高達(dá)76.8%，難以對(duì)ad進(jìn)行早期篩查和干預(yù)。因此，提供一種成本低、創(chuàng)傷性小、檢測(cè)便捷、結(jié)果可標(biāo)準(zhǔn)化的ad血液標(biāo)志物的精準(zhǔn)檢測(cè)成為臨床的迫切需要。

3、p-tau?217是tau蛋白的一種磷酸化形式，主要在tau蛋白的第217位蘇氨酸上發(fā)生磷酸化，在ad患者的臨床前期已經(jīng)顯著升高，可以更早提示ad的發(fā)生。研究表明，健康人群的血漿中p-tau?217的平均水平大約在0.3至0.4?pg/ml，ad患者中則達(dá)到1至2?pg/ml，陽(yáng)性判斷值在1pg/ml以下。常規(guī)免疫檢測(cè)技術(shù)通過(guò)光、電等檢測(cè)手段對(duì)試劑體系反應(yīng)后的整體信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為檢測(cè)濃度，但是其檢測(cè)限普遍在1至10ng/ml左右，難以達(dá)到如此高的靈敏度要求，無(wú)法穩(wěn)定檢出血漿中的p-tau?217。單分子免疫陣列（single?molecule?array，simoa）技術(shù)是一種數(shù)字化檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)在磁珠表面形成捕獲抗體-待測(cè)抗原-生物素化檢測(cè)抗體-親和素偶聯(lián)的酶復(fù)合物，在結(jié)合熒光底物后將磁珠落入陣列化的微孔中進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度相較于elisa和常規(guī)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法得到了指數(shù)級(jí)的提升；但檢測(cè)操作流程繁瑣復(fù)雜、檢測(cè)成本極高，極大限制了其臨床推廣使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決或部分解決相關(guān)技術(shù)中存在的問(wèn)題，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N磷酸化tau蛋白p-tau217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用，能夠提高發(fā)光微球接收感光微球產(chǎn)生的活性氧的能力，提高活性氧的利用率，提高檢測(cè)信號(hào)值，從而提升檢測(cè)靈敏度，滿足低值樣本血漿中磷酸化tau蛋白p-tau?217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)需求。

2、本申請(qǐng)第一方面提供一種磷酸化tau蛋白p-tau?217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括：

3、r1試劑，其包含發(fā)光微球，所述發(fā)光微球包被有能夠與p-tau?217特異性結(jié)合的第一抗體，所述第一抗體帶有第一標(biāo)簽分子；

4、r2試劑，其包含帶第二標(biāo)簽分子的第二抗體；

5、r3試劑，其包含能夠特異性識(shí)別和結(jié)合所述第一標(biāo)簽分子的第一配對(duì)分子；

6、所述第一抗體、第二抗體能夠與p-tau?217的不同表位特異性結(jié)合，一個(gè)所述第一配對(duì)分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)第一標(biāo)簽分子。

7、在一些實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)簽分子通過(guò)與所述第一抗體共表達(dá)連接于所述第一抗體的非特異性結(jié)合區(qū)域。

8、在一些實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)簽分子選自spy-tag、his-tag、ha-tag、snoop-tag、flag-tag、myc-tag中的一種或多種。

9、在一些實(shí)施方式中，所述第一配對(duì)分子為多聚catcher，聚合度不低于2；優(yōu)選為八聚體。

10、在一些實(shí)施方式中，所述第一配對(duì)分子的摩爾量低于或等于所述第一標(biāo)簽分子摩爾量。優(yōu)選地，所述第一配對(duì)分子與所述第一標(biāo)簽分子的摩爾比為1:(1~16)。

11、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括：

12、r4試劑，其包含感光微球以及包被于所述感光微球的能夠與所述第二標(biāo)簽分子特異性結(jié)合的第二配對(duì)分子。

13、在一些實(shí)施方式中，所述第一標(biāo)簽分子和第一配對(duì)分子、第二標(biāo)簽分子和第二配對(duì)分子分別組成的兩組特異性標(biāo)簽系統(tǒng)相互不發(fā)生反應(yīng)。

14、本申請(qǐng)第二方面提供一種如第一方面所述的試劑盒的使用方法，其包括將所述r1試劑、r2試劑、r4試劑與待測(cè)樣本混合溫育后，再加入所述r3試劑使至少兩個(gè)發(fā)光微球聚集成多聚發(fā)光微球。

15、在一些實(shí)施方式中，加入r1、r2試劑后反應(yīng)時(shí)間≥45min；加入r3試劑后反應(yīng)時(shí)間為0~15min。

16、本申請(qǐng)第三方面提供一種試劑盒或其使用方法在檢測(cè)血液樣本中p-tau?217的應(yīng)用。

17、值得注意的是，所述在檢測(cè)血液樣本中p-tau?217的應(yīng)用為非疾病診斷目的的應(yīng)用。

18、本申請(qǐng)?zhí)峁┑募夹g(shù)方案可以包括以下有益效果：通過(guò)在發(fā)光微球中引入標(biāo)簽化后的抗體，并通過(guò)添加能夠捕獲該標(biāo)簽的配對(duì)分子，利用配對(duì)分子與該標(biāo)簽之間的特異性反應(yīng)能夠使反應(yīng)體系中的游離發(fā)光微球聚集在免疫復(fù)合物上，提高感光微球產(chǎn)生的活性氧的利用率，從而提升檢測(cè)信號(hào)值，整體上提升光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)性能，滿足低值樣本血液樣本中p-tau?217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)對(duì)于靈敏度的檢測(cè)需求。而且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不改變常規(guī)檢測(cè)順序、不干擾試劑特異性，易操作，檢測(cè)成本低、適用范圍廣，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

19、應(yīng)當(dāng)理解的是，以上的一般描述和后文的細(xì)節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本申請(qǐng)。

技術(shù)特征：

1.一種磷酸化tau蛋白p-tau217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標(biāo)簽分子通過(guò)與所述第一抗體共表達(dá)連接于所述第一抗體的非特異性結(jié)合區(qū)域。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標(biāo)簽分子選自spy-tag、his-tag、ha-tag、snoop-tag、flag-tag、myc-tag中的一種或多種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一配對(duì)分子為多聚catcher，聚合度不低于2。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述第一配對(duì)分子的摩爾量低于或等于所述第一標(biāo)簽分子摩爾量。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，還包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述第一標(biāo)簽分子和第一配對(duì)分子、第二標(biāo)簽分子和第二配對(duì)分子分別組成的兩組特異性標(biāo)簽系統(tǒng)相互不發(fā)生反應(yīng)。

8.如權(quán)利要求1至7任一所述試劑盒的使用方法，其特征在于，將所述r1試劑、r2試劑、r4試劑與待測(cè)樣本混合溫育后，再加入所述r3試劑使至少兩個(gè)發(fā)光微球聚集成多聚發(fā)光微球。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，加入r1、r2試劑后反應(yīng)時(shí)間≥45min；加入r3試劑后反應(yīng)時(shí)間為0~15min。

10.如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)血液樣本中p-tau?217的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及一種磷酸化Tau蛋白p?tau?217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其使用方法和應(yīng)用。該試劑盒包括R1試劑、R2試劑和R3試劑，R1試劑包含發(fā)光微球以及包被于所述發(fā)光微球的帶第一標(biāo)簽分子的能夠與p?tau?217特異性結(jié)合的第一抗體；R2試劑包含帶第二標(biāo)簽分子的第二抗體；R3試劑包含能夠與所述第一標(biāo)簽分子特異性結(jié)合的第一配對(duì)分子；所述第一抗體、第二抗體能夠與p?tau?217的不同表位特異性結(jié)合，一個(gè)所述第一配對(duì)分子能夠結(jié)合至少兩個(gè)第一標(biāo)簽分子。本申請(qǐng)技術(shù)方案能夠提高發(fā)光微球接收感光微球產(chǎn)生的活性氧的能力，提升檢測(cè)靈敏度，滿足血漿中p?tau?217的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)需求。

技術(shù)研發(fā)人員：李澤鵬,吳晨,劉宇卉,李臨
受保護(hù)的技術(shù)使用者：科美博陽(yáng)診斷技術(shù)（上海）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19