專利名稱：區(qū)分血中白血球的試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溶解劑和一種通過適宜的電子儀器手段區(qū)分血樣中白血球亞群的方法。
由血樣分析白血球群體是診斷眾多疾病方法中必要的和基本的部分。測量白血球亞群的嗜酸性細胞對于診斷某些疾病來說是重要的。例如，發(fā)現(xiàn)在何杰金病、寄生蟲和過敏性疾病中，嗜酸性細胞的數(shù)量增加。
傳統(tǒng)血樣分析包括將血樣涂在顯微鏡的載玻片上，然后觀察分析該載玻片。這種方法極為耗時，而且對載玻片分析的解釋存在有個體差異。因此發(fā)展了利用流動性白細胞計數(shù)來自動分析白血球的方法。利用自動血液儀器分析白血球方法中的一個必要步驟是溶解紅細胞。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了用于全血樣品的一些溶解試劑。
美國專利4485175(Ledis等)描述了一種試劑系統(tǒng)和用自動細胞計數(shù)裝置將白血球區(qū)分為三種亞群的方法。該試劑系統(tǒng)含有血稀釋劑和溶解試劑。該溶解試劑含有季銨表面活性劑的混合物。然而，該試劑系統(tǒng)將其用途限定到將白血球區(qū)分為三種亞群淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。該試劑系統(tǒng)不能進一步將粒細胞區(qū)分為另外的三種亞群。
美國專利4751179(Ledis等)公開了一種試劑系統(tǒng)和用自動細胞計數(shù)裝置區(qū)分白血球的方法。該試劑系統(tǒng)含有1)溶解試劑，其含有含皂草甙的單一溶解稀釋劑或者含有由預(yù)稀釋劑和含皂草甙的溶解試劑組成的順序加入兩種溶液；和2)一種活性交聯(lián)劑，如作為固定劑的戊二醛。加熱血樣溶解試劑系統(tǒng)混合物并通過DC和混濁度對其分析之后，可確定四種白血球亞群。這四種亞群為淋巴細胞、單核細胞，噬中性細胞和嗜酸性細胞。該方法要求，在通過儀器測定之前，需將樣品混合物在60-75℃下加熱。
美國專利5155044(Ledis等)公開了一種試劑系統(tǒng)和用于全血樣品的快速分離和白血球分析并能使用可測量傳導率(DC)、放射頻率(RF)和光散射(LS)的自動血液分析儀來自動區(qū)分為五種亞群。該試劑系統(tǒng)由含有酸或酸和皂草甙混合物的水性溶解試劑和水性鹽淬滅(quench)溶液組成。該方法是快速的并且在一步測量中能夠從全血樣品中區(qū)分5部分白血球。該單一測量步驟是用相同的溶解試劑系統(tǒng)測量單個血液等分試樣來區(qū)分白血球。然而，使用該試劑和方法來將白血球區(qū)分為五種亞群需要高級和昂貴的激光裝置。如果僅僅用這種試劑系統(tǒng)的DC和RF檢測，粒細胞亞群不會被完全區(qū)分為嗜堿性細胞、嗜酸性細胞和嗜中性細胞亞群。不能區(qū)分粒細胞，這是因為在該專利所述條件下，亞群的DC和RF信號相互重疊。
通過DC和RF測量將白血球區(qū)分為四或五種亞群的另一方法是使用多種試劑和進行多步測量。各個試劑用于區(qū)分特定的亞群。通常，使用第一種溶解試劑(如美國專利5116539(Hamaguchi等)和美國專利5389549(Hamaguchi等)所述)來通過測量DC和RF將白血球區(qū)分為三種亞群(即，單核細胞、淋巴細胞和粒細胞)。
在美國專利5116539中，使用另一種溶解試劑進行另一個測量而獲得嗜酸性細胞亞群。這能夠區(qū)分為淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性細胞和剩余的粒細胞四部分。該溶解試劑是一種由聚氧乙烯非離子表面活性劑和將溶液PH調(diào)節(jié)在3-11范圍內(nèi)的緩沖劑組成的低滲水溶液。該溶解試劑除了嗜酸性細胞之外不僅溶解紅血球也溶解白血球，這樣可根據(jù)其剩余細胞的體積對嗜酸性細胞計數(shù)。然而，為了分離嗜酸性細胞，使用該溶解試劑的方法需要在40℃溫度下將樣品混合物培養(yǎng)50秒鐘。這種升高溫度需要明顯更復雜的儀器，因為必須控制反應(yīng)的熱量。另外，延長反應(yīng)時間會直接減少自動分析儀的工作效率。
在美國專利5389549中，需要兩種另外的溶解試劑并需要進行另外兩次測量，獲得嗜酸性細胞和嗜堿性細胞以便區(qū)分出五個部分。在該文獻中，從總粒細胞群中減去分別測定的嗜酸性細胞和嗜堿性細胞的和而獲得嗜中性細胞亞群。
美國專利5196346(Lefevre等)公開了一種溶解試劑和使用該溶解試劑通過溶解除嗜堿性細胞之外的所有血細胞(包括紅血球和白血球)來自動測定全血樣品中的嗜堿性細胞的方法。溶解試劑由聚氧乙烯醚類表面活性劑、苯二甲酸/HCL混合物、十二烷基硫酸鈉(SDS)和丁基化的羥基甲苯型抗氧劑。SDS用作蛋白質(zhì)變性劑來減少測量儀器中沉淀的形成并且還發(fā)現(xiàn)可促進細胞溶解。所公開的方法要求將反應(yīng)溫度控制在30-40℃并局限于僅記錄嗜堿性細胞的數(shù)目。
未決的美國專利申請08/488630(于1995年6月8日申請)公開了一種溶解試劑系統(tǒng)和使用DC、RF和光散射測量裝置將白血球自動區(qū)分為五種亞群的方法。該溶解試劑系統(tǒng)由含有乙氧基化的長鏈胺化合物和酸的水溶性溶解試劑和含有高滲的堿性試劑組合物的穩(wěn)定劑組成。該公開的溶解試劑系統(tǒng)使用DC、RF和光散射測量經(jīng)一次測量區(qū)分白血球的五個部分。然而，如果在僅裝有DC和RF測量裝置的血液分析儀上使用該溶解試劑時，僅獲得四種亞群，即單核細胞、淋巴細胞、嗜堿性細胞和嗜中性細胞與嗜酸性細胞總數(shù)。
另外，未決的美國專利申請08/496469(1995年6月29日申請)公開了溶解試劑和使用DC、RF和光散射測量儀將白血球自動區(qū)分為五種亞群的方法。該溶解試劑由含有聚氧乙烯表面活性劑和酸的水性溶解試劑和高滲的堿性穩(wěn)定試劑組合物組成。公開的溶解試劑系統(tǒng)使用DC、RF和光散射測量時也一步區(qū)分白血球為五個部分。然而，如果在僅裝有DC和RF測量裝置的血液分析儀上使用該溶解試劑時，僅獲得四種亞群，即單核細胞、淋巴細胞、嗜堿性細胞和嗜中性細胞與嗜酸性細胞總數(shù)。
本發(fā)明涉及新的溶解試劑組合物。所述溶解試劑組合物為酸性高滲水溶液，其含有烷基硫酸的堿金屬鹽、嗜酸性細胞溶解劑(eosinolyticagent)、非離子表面活性劑和生理性鹽。此新的溶解試劑組合物可溶解紅血球并通過選擇皺縮嗜酸性細胞而從其它粒細胞亞群中選擇性地影響和分離嗜酸性細胞亞群。這樣至少能夠區(qū)分一種白血球亞群。
該溶解試劑組合物具有完全在室溫下操作的優(yōu)點。為了完全分離嗜酸性細胞亞群，現(xiàn)有技術(shù)在升高的溫度(30℃或更高)下進行。這種升高溫度需要明顯更復雜的儀器，因為必須控制反應(yīng)的熱量。本發(fā)明通過在室溫下最佳操作克服了需要控制溫度的缺陷。
另外，本發(fā)明涉及使用溶解試劑組合物自動測定血中白血球亞群的方法。本發(fā)明的方法包括將血樣與溶解試劑組合物混合、在室溫下將樣品混合物培養(yǎng)不超過25秒鐘并用自動血液儀分析樣品混合物。表面活性劑的協(xié)同效果對嗜酸性亞群產(chǎn)生快速選擇性的作用，通過簡單的DC和RF測量快速從其它白血球亞群中分出嗜酸性細胞亞群。而且，該方法具有不需要昂貴的激光裝置測定嗜酸性細胞亞群的優(yōu)點。
另外，本發(fā)明涉及使用新的溶解試劑組合物和第二種溶解試劑來僅通過DC和RF測量而獲得至少白血球的五個部分區(qū)分。


圖1a和1b顯示按實施例I所述方法由正常全血樣品中區(qū)分的嗜酸性細胞。圖1a顯示DC與OP(混濁度，RF和DC的函數(shù))的二維圖且圖1b分別顯示RF與OP的圖。白血球亞群作為標記物來顯示。
圖2顯示按實施例I所述方法進行的全血樣品DC與旋轉(zhuǎn)光散射(RLS)圖，與實施例I不同的是用裝有DC、RF和光散射裝置的實驗性血液分析儀通過集中流動法(focused flow method)進行分析。
圖3a和3b顯示按實施例II的方法使用本發(fā)明列舉的溶解試劑組合物所進行的全血樣品二維圖。
圖4顯示使用實施例IV所述第二種溶解試劑的例子和實施例VI所述的穩(wěn)定劑并按實施例VII的方法進行的全血樣品二維圖。每組代表一個或多個標記的白血球亞群。
本發(fā)明涉及水性溶解試劑組合物和通過DC和RF測量快速區(qū)分至少一種白血球亞群的方法。該溶解試劑組合物溶解紅血球并從其它粒細胞亞群中選擇性地皺縮嗜酸性細胞亞群。更具體講，本發(fā)明涉及，該溶解試劑和該溶解試劑基于血樣與溶解試劑組合物混合后體積的不同區(qū)分和計數(shù)嗜酸性細胞而不用激光測量的方法。另外，提供一種僅僅使用DC和RF測量來區(qū)分至少五種白血球亞群的方法。
在本發(fā)明的第一個實施方案中，水性溶解試劑組合物含有烷基硫酸的堿金屬鹽，酸，促進嗜酸性細胞亞群選擇皺縮的選自有機磷酸酯、有機磷酸酯的堿金屬鹽、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性細胞溶解劑，保護嗜中性細胞不受溶解的非離子表面活性劑和足以將所述溶解試劑組合物的重量克分子滲透壓濃度調(diào)節(jié)在370-720mOsm之間的生理鹽分。這些膜活性的化學物質(zhì)的協(xié)同作用能夠使溶解試劑快速溶解紅血球，同時選擇性地皺縮并從白血球的其它亞群中區(qū)分嗜酸性細胞。
本發(fā)明溶解劑中烷基硫酸堿金屬鹽的功能是決定性的。它溶解紅血球從而給白血球區(qū)分分析提供了機會。另外，它也選擇性地影響嗜酸性細胞亞群細胞膜并皺縮細胞體積快速下降。烷基硫酸堿金屬鹽的烷基鏈長為10-18個碳原子，優(yōu)選12-14個碳原子。烷基硫酸堿金屬鹽的優(yōu)選實例包括十二烷基硫酸鈉和十四烷基硫酸鈉。最優(yōu)選使用十二烷基硫酸鈉。烷基硫酸堿金屬鹽的濃度大約為0.02％-0.16％，優(yōu)選大約0.04％-0.12％。
所述酸的功能有助于選擇溶解紅血球并為選擇皺縮嗜酸性細胞亞群提供酸性環(huán)境。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嗜酸性細胞亞群的選擇皺縮僅僅在酸性介質(zhì)中發(fā)生。
本發(fā)明可使用各種各樣的酸。然而，優(yōu)選使用PK低于3的那些酸。該酸可為有機酸、無機酸或其混合物。本發(fā)明溶解劑中合適酸的實例為乙酸、檸檬酸、甲酸、丙酸、鹽酸、磷酸、硫酸及其混合物。酸的量需要足以快速溶解紅血球，但同時不能引起其它粒細胞亞群的損傷。溶解劑的PH應(yīng)當保持在大約1.4-3.4的范圍之內(nèi)，優(yōu)選大約1.8-2.6。
一組表面活性劑起嗜酸性細胞溶解劑的功能。其存在于溶解試劑組合物中有助于嗜酸性細胞的皺縮并幫助皺縮嗜酸性細胞形成區(qū)分分析的有區(qū)別組。這些嗜酸性細胞溶解劑包括有機磷酸酯、有機磷酸酯的堿金屬鹽、乙氧基化的磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物。
由于這些表面活性劑顯著不同的化學特性，本發(fā)明條件下的這些表面活性劑的作用方式現(xiàn)在是未知的?？傊请x子嗜酸性細胞溶解劑具有低于約15的親水親脂平衡值(HLB)。已知這些非離子嗜酸性細胞溶解劑在廣泛的PH下是由強到溫和的紅血球溶解劑。然而，這不能解釋其對嗜酸性細胞胞質(zhì)膜的選擇作用及其從其它粒細胞亞群中區(qū)分嗜酸性細胞亞群的能力。根據(jù)所使用具體化學物質(zhì)的效力決定嗜酸性細胞溶解劑的濃度范圍為0.05％-0.8％，可通過經(jīng)驗來確定。
另一組表面活性劑起白血球保護劑的功能。白血球保護劑具有兩個功能。一個功能是幫助選擇性地溶解紅血球。第二個功能是保護白血球，特別是嗜中性細胞亞群在溶解反應(yīng)期間免受損傷。合適的實例包括具有HLB為16或更大的乙氧基化的烷醇或乙氧基化的烯醇及其混合物。
如果在分析期間嗜中性細胞亞群受溶解劑的影響，它們也會在大小上皺縮并干擾嗜酸性細胞的分類。然而，如果使用過量的白血球保護劑，嗜酸性細胞亞群的分離只會在大于約45秒鐘的延長反應(yīng)時間下進行，或者變得不能完成。所以，需要合適濃度的白血球保護劑(可通過實驗來確定)。乙氧基化的烷醇或乙氧基化的烯醇的濃度大約為0.5-3％，優(yōu)選約為0.8-2％。
使用生理鹽分調(diào)節(jié)溶解試劑的重量克分子滲透壓濃度。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嗜酸性細胞的皺縮僅僅在大約370-720mOsm，優(yōu)選大約400-570mOsm范圍的高滲環(huán)境下發(fā)生。在優(yōu)選的實施方案中，為此目的而使用堿金屬氯化物和硫酸堿金屬鹽。適當組合堿金屬氯化物和硫酸堿金屬鹽，嗜酸性細胞的皺縮可快速發(fā)生并且嗜酸性細胞皺縮后形成有區(qū)別的群體。
合適的生理鹽分的例子包括氯化鈉或氯化鉀和硫酸鈉或硫酸鉀。堿金屬氯化物的濃度范圍約為0.1％-1.2％，優(yōu)選約為0.3-1.0％。硫酸堿金屬鹽的濃度范圍約為0.4-2％，優(yōu)選約為0.6-1.5％。
任選地，可使用聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物來幫助溶解紅血球碎片并減少由碎片產(chǎn)生的噪音。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)共聚物有助于嗜酸性細胞亞群形成區(qū)別組。本發(fā)明優(yōu)選的方案是使用Pluronic共聚物(由BASF公司生產(chǎn)，Parsippany，New Jersey)，如Pluronic10R5和Pluronic L35。
其它可有可無的添加劑也可包含在溶解試劑組合物中，其濃度為所存在的量與溶解試劑組合物的主要組分相容。其中這些添加劑為具有抗氧特性的(以增加組合物的貯存時間)和具有抗微生物特性的防腐劑。具有抗氧特性的防腐劑包括但不限于EDTA和丁基甲基苯酚。具有抗微生物特性的防腐劑包括但不限于二羥甲基二甲基海因和異硫伏殺磷(isothiozolone)衍生物。
在本發(fā)明的第二個實施方案中，提供一種溶解血樣中紅血球并分析所剩白血球亞群的方法。該方法包括步驟1)將血樣暴露于溶解組合物一定時間，該時間足以溶解紅血球并在所述血樣中分出至少一種白血球亞群，所述溶解劑含有烷基硫酸的堿金屬鹽，酸，促進嗜酸性細胞亞群選擇皺縮的選自有機磷酸酯、有機磷酸酯的堿金屬鹽、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性細胞溶解劑，保護嗜中性細胞亞群不受溶解的非離子表面活性劑和足以將所述溶解試劑組合物的重量克分子滲透壓濃度調(diào)節(jié)在370-720mOsm之間的生理鹽分，步驟2)從嗜酸性細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜中性細胞中區(qū)別出至少一種白血球亞群，和步驟3)報告所述區(qū)分的結(jié)果。
將血樣暴露于溶解組合物一定時間，該時間足以溶解紅血球并在所述血樣中分出至少一種白血球亞群。通過溶解劑與血樣混合來使血樣暴露于溶解劑，以便將血樣稀釋大約45-70倍。在室溫下培養(yǎng)稀釋的樣品混合物。優(yōu)選的，溫度大約在15-30℃。培養(yǎng)時間大約為10-25秒，優(yōu)選少于18秒鐘。用自動血液分析儀分析樣品混合物。該儀器測量并至少區(qū)分一種白血球亞群，優(yōu)選嗜酸性細胞亞群或嗜中性細胞亞群，而且最優(yōu)選嗜酸性細胞亞群。
使用至少兩種選自DC、RF和光散射測量中的測量方式來進行區(qū)分。優(yōu)選僅僅使用DC和RF測量進行區(qū)分。DC方法檢測樣品混合物通過狹窄的輸液管時因顆粒與液體介質(zhì)之間導電率的不同而在電流上會發(fā)生任何變化。在DC方法中，檢測信號的強度基本與顆粒體積成比例。在RF方法中，樣品混合物通過緊密相鄰電極之間的狹窄輸液管，因顆粒和液體介質(zhì)之間電介質(zhì)常數(shù)的不同故可測得在電極之間電阻抗上所發(fā)生的變化。在RF方法中，檢測反映信息的信號涉及顆粒的結(jié)構(gòu)和組成它們材料的性質(zhì)。DC和RF檢測規(guī)則和技術(shù)的詳細情況在受讓于Coulter Electronic，Inc.的美國專利2656508和受讓于Coulter Electronic，Inc.的美國專利4298836中有所教導。
使用本發(fā)明溶解試劑組合物來對血樣進行白血球區(qū)別分析的方法是一種使用溶解試劑的快速方法。溶解試劑組合物溶解紅血球并選擇性地影響嗜酸性細胞亞群的胞質(zhì)膜并皺縮嗜酸性細胞亞群細胞體積。粒細胞而不是嗜酸性細胞在溶解反應(yīng)期間基本保持完整。
實施例I描述應(yīng)有所公開的溶解試劑組合物來區(qū)別并記錄全血樣品中白血球的數(shù)目的優(yōu)選實施方案。圖1顯示使用DC和RF測量按照實施例I描述的方法區(qū)別分析全血樣品。細胞流過一個孔，該孔處有一記錄細胞對放射頻率和直流電反應(yīng)的阻抗測量裝置。處理電信號并分別繪制圖1a和1b所述的DC與混濁度或RF與混濁度的二維圖。如圖所示，血樣與本發(fā)明溶解試劑組合物混合之后，嗜酸性細胞亞群從其它白血球群中完全分離出來。盡管實施例用非集中流動儀器進行，如圖2所示使用集中流動系統(tǒng)會獲得相同結(jié)果。
注意到，盡管與溶解試劑混合后嗜酸性細胞的大小被巨大地減小，但其RF信號未察覺受到影響。使用DC和RF檢測技術(shù)區(qū)別嗜中性細胞和嗜酸性細胞主要是通過它們大小和混濁度的顯著差異來完成的。如圖1a和1b所述，嗜酸性細胞亞群的混濁度右移并完全從嗜中性細胞和其它白血球亞群中移出。
圖2顯示按實施例I的方法在裝有DC、RF和光散射裝置的實驗性血液分析儀上通過集中流動法使用相同的血樣由DC與旋轉(zhuǎn)光散射圖確證本發(fā)明的嗜酸性細胞組。在DC與光散射二維圖中，通過其大小和光散射的區(qū)別從嗜中性細胞中分出嗜酸性細胞。通過本發(fā)明方法分出的嗜酸性細胞的數(shù)目與通過常規(guī)手工方法記錄的嗜酸性細胞的數(shù)目一致。
在本發(fā)明的第三個實施方案中，提供一種溶解血樣中紅血球并將剩余的白血球亞群分為至少五種白血球亞群的方法。該方法包括步驟1)用第一種溶解劑組合物處理第一個血液等分試樣足夠時間，以使紅血球溶解，并從所述血樣中分出至少一種白血球亞群，步驟2)用第二種溶解劑系統(tǒng)處理所述血液的第二個等分試樣，以使紅血球溶解，并且從所述血樣中分出四種白血球亞群，步驟3)使用DC和RF測量分析所述處理血液的第一個等分試樣，步驟4)使用DC和RF測量分析所述處理血液的第二個等分試樣，步驟5)報告至少五種白血球亞群。
處理第一個血液等分試樣的步驟1是使用本發(fā)明第一個實施方案中所述的溶解劑組合物來完成的。直接分析第一個血液等分試樣的步驟3是通過本發(fā)明第二個實施方案中所述的方法來完成的。
步驟2是通過用第二種溶解劑系統(tǒng)處理血液樣品的第二個等分試樣，足以使得紅血球溶解，并且從所述血樣中分出四種白血球亞群來完成的。第二個溶解劑系統(tǒng)將白血球分為淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性細胞和除嗜堿性細胞之外的粒細胞。血樣與第二種溶解劑的混合時間少于10秒鐘。
第二種溶解劑通常將包括溶解試劑和穩(wěn)定劑組合物。第二種溶解劑系統(tǒng)的一個實例是包含溶解試劑，它含有下式所示的乙氧基化的長鏈胺化合物
其中R為具有12-22個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基，m和n各為1或更大并且m+n在20和40之間；和將溶解試劑的PH調(diào)節(jié)在2.0-3.6范圍之內(nèi)的酸；和高滲堿性穩(wěn)定劑組合物。優(yōu)選R為具有14-20個碳原子的烷基。另外，優(yōu)選地，用于調(diào)節(jié)PH的酸含有有機酸。更優(yōu)選調(diào)節(jié)PH的酸含有甲酸和選自乙酸、檸檬酸、草酸、乙醇酸、丙酸、鹽酸、硫酸和磷酸及其混合物的酸的有效混合物。
第二種溶解劑系統(tǒng)的另一實例是含有溶解試劑，它含有下式所示的聚氧乙烯表面活性劑R1-R2-(CH2CH2O)n-H其中R1為具有10-22個碳原子的烷基，鏈烯基或炔基，R2為-O-或-COO-，且n在20-35之間；和將溶解試劑的PH調(diào)節(jié)在2.0-4.0范圍之內(nèi)的酸；和高滲堿性穩(wěn)定劑組合物。優(yōu)選R為具有14-20個碳原子的烷基。另外，優(yōu)選地，用于調(diào)節(jié)PH的酸含有有機酸。優(yōu)選調(diào)節(jié)PH的酸含有甲酸和選自乙酸、檸檬酸、草酸、乙醇酸、丙酸、鹽酸、硫酸和磷酸及其混合物的酸的有效混合物。
在實施例IV和V中提供了第二種溶解劑的兩個實例。實施例VI中提供了實施例IV和V的第二種溶解劑中使用的穩(wěn)定劑的實例。
步驟4是通過使用DC和RF分析溶解血液的第二個等分試樣來完成的。圖4描述四種白血球亞群，它是通過使用實施例IV中所述的第二種溶解劑和實施例VI中所述的穩(wěn)定劑組合物按實施例VII所述的方法分析血液樣品獲得的。如圖4所述，使用DC和RF測量清楚地分離出淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性細胞和除嗜堿性細胞之外的粒細胞的四種細胞亞群。
步驟5報告至少五種白血球亞群。如上所示，步驟4中直接獲得淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性細胞。通過由步驟4中獲得的除嗜堿性細胞之外的粒細胞減去由步驟3中獲得的嗜酸性細胞亞群而獲得嗜中性細胞亞群。
溶解劑組合物、第二種溶解試劑系統(tǒng)或其組合均可以試劑盒的形式出售，其中可將溶解試劑包裝在容器(如塑料容器)中。優(yōu)選地將如何按照本發(fā)明使用這些組分的說明書包括在容器內(nèi)或容器上。
通過參考下列實施例進一步描述本發(fā)明，這些實施例是說明性的而不限定本發(fā)明的范圍。
實施例I用下列組分配制溶解劑組合物1、T-mulz(Harcros Chemical，Inc.，50％有機磷酸 5.0g酯的鉀鹽)2、十二烷基硫酸鈉 1.0g3、Hetoxol STA30(Heterene，乙氧基化的十八烷醇) 10.0g4、Pluronic 10R5(BASF) 15.0g5、甲酸 0.2ml6、硫酸鈉 9.0g7、氯化鉀 6.0g8、預(yù)溶解在乙醇中的BHT 0.05g9、proclin300(Rohm & Haas Co.) 0.5ml10、PH(通過4M HCL來調(diào)節(jié))2.211、去離子水調(diào)節(jié)到1L往28ml EDTA抗凝的正常全血樣品中，加入1800ml的溶解劑組合物，并且在室溫(大約21℃)下，通過振蕩將混合物輕輕混合9秒鐘，在加入溶解劑組合物后的大約13秒鐘時準備進行區(qū)別分析。血液混合物保持在酸性(PH約為2.2)和重量克分子滲透壓濃度484mOsm的條件下。在裝有DC和RF裝置的實驗性血液分析儀上使用非集中流動技術(shù)進行區(qū)別分析。圖1a和1b中描述了所得的二維圖。圖1a的豎軸和橫軸分別為DC和混濁度，并且圖1b的豎軸和橫軸分別為RF和混濁度。嗜酸性細胞群被區(qū)分并計數(shù)，而且按絕對值或者相對于總白血球數(shù)計算的百分數(shù)來報告結(jié)果。
實施例II用下列組分配制溶解劑組合物，并用于白血球亞群區(qū)別分析。往28mlEDTA抗凝的正常全血樣品中，加入1600ml的溶解劑組合物，并且在室溫(大約21℃)下，通過振蕩將混合物輕輕混合8秒鐘，在加入溶解劑組合物后的大約12秒鐘時準備進行區(qū)別分析。圖3a和3b顯示兩個DC與混濁度的圖。圖3a與正常血樣相對應(yīng)，圖3b對應(yīng)于嗜酸性細胞升高(手工區(qū)別計數(shù)為12％)的血樣。1、Burco TME(Burlington Chemical Co.Inc.，乙 1.5g氧基化的十二烷基硫醇，HLB＝13.0)2、十二烷基硫酸鈉 1.0g3、Hetoxol STA30(Heterene，乙氧基化的十八烷8.0g醇)4、Pluronic L35(BASF) 10.0g5、檸檬酸 17.0ml6、硫酸鈉 9.0g7、氯化鉀 6.0g8、去離子水調(diào)節(jié)到1L9、PH 2.2實施例III用下列組分配制溶解劑組合物，并用于白血球亞群區(qū)別分析。在28mlEDTA抗凝的正常全血樣品中，加入大約1880ml的溶解劑組合物，并且在室溫(大約21℃)下，通過振蕩將混合物輕輕混合11秒鐘，在加入溶解劑組合物后的大約15秒鐘時準備進行區(qū)別分析。然后在實驗性血液分析儀上分析樣品。1、Tergitol NP-13(Union Carbide，乙氧基化的壬 1.0g基苯酚)2、十四烷基硫酸鈉 1.0g3、Hetoxol STA30(Heterene) 10.0g4、甲酸0.2g5、硫酸鈉 9.0ml6、氯化鉀 5.0g7、Pluronic 10R5 15.0g8、去離子水調(diào)節(jié)到1L9、PH 2.2實施例IV第二種溶解劑的第一個實例用下列組分配制包含乙氧基化的長鏈胺化合物的溶解劑組合物將下式的陽離子乙氧基化的長鏈胺化合物
其中m+n的值為30，溶于去離子水，濃度為20g/L。用甲酸將PH調(diào)到3.2。另外加入下列防腐劑0.2g/L EDTA，Proclin300(Rohm & Haas Co.)，和0.05g/L 2，6-二-叔丁基-4-甲基苯酚(預(yù)先溶于乙醇)。
實施例V第二種溶解劑的第二個實例用下列組分配制包含聚氧乙烯表面活性劑的溶解劑組合物將下式的聚氧乙烯表面活性劑C18H37O(CH2CH2O)nH其中n的值為30，溶于去離子水，濃度為20g/L。加入0.8g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS，Aldrich)。用甲酸將PH調(diào)到2.8。
使用第二種溶解劑和穩(wěn)定劑來制備將白血球分離為淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性細胞和除嗜堿性細胞亞群的粒細胞的溶解劑系統(tǒng)。實施例VI描述了穩(wěn)定劑的一個實例。
實施例VI第二種溶解劑的穩(wěn)定劑如上文所述來配制穩(wěn)定劑，它包括14g/L NaCL，32g/L Na2SO4和6.6g/LNa2CO3的緩沖劑，PH調(diào)到11.0。該試劑的重量克分子滲透壓濃度為1080mOsm。
實施例VII區(qū)分血樣的白血球群往28ml EDTA抗凝的正常全血樣品中，加入488ml實施例IV的溶解劑組合物，并且在室溫(大約21℃)下，通過振蕩將混合物輕輕混合4秒鐘。通過加入實施例VI的穩(wěn)定劑209μl阻止溶解反應(yīng)。輕輕混合血樣混合物并在加入穩(wěn)定劑后的大約15秒鐘時準備進行區(qū)別分析。最終血液混合物保持在中性PH(約為7)和重量克分子滲透壓濃度約為445mOsm的高滲條件下。圖4顯示用DC和RF進行的區(qū)別分析。
盡管出于說明本發(fā)明的目的而顯示某些有代表性的實施方案和細節(jié)，但在不脫離本發(fā)明如所附的權(quán)利要求定義的范圍下可進行各種變化和改進。
權(quán)利要求
1.一種水性溶解劑組合物，含有a)烷基硫酸的堿金屬鹽，b)酸，c)促進嗜酸性細胞亞群選擇皺縮的選自有機磷酸酯、有機磷酸酯的堿金屬鹽、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性細胞溶解劑，d)保護嗜中性細胞不受溶解的非離子表面活性劑，和e)足以將所述溶解試劑組合物的重量克分子滲透壓濃度調(diào)節(jié)在370-720mOsm之間的生理鹽分。
2.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中烷基硫酸的堿金屬鹽的烷基具有10-18個碳原子。
3.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中溶解劑組合物中所述烷基硫酸的堿金屬鹽的濃度約為0.02％-0.16％。
4.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中用酸將溶解劑的PH調(diào)節(jié)為大約1.4-3.4。
5.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中用于調(diào)節(jié)PH的酸包括有機酸、無機酸及其混合物。
6.權(quán)利要求5的溶解劑組合物，其中酸選擇乙酸、檸檬酸、甲酸、丙酸、鹽酸、磷酸、硫酸及其混合物。
7.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所述嗜酸性細胞溶解劑的HLB小于15。
8.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所述嗜酸性細胞溶解劑的濃度范圍為0.05-0.8％。
9.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所述保護嗜中性細胞亞群不受溶解的非離子表面活性劑包括具有HLB至少為16的乙氧基化烷醇、具有HLB至少為16的乙氧基化烯醇及其混合物。
10.權(quán)利要求9的溶解劑組合物，其中非離子表面活性劑的濃度范圍為0.5-3.0％。
11.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中還包含足以促進紅血球碎片溶解量的聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物。
12.權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所述生理鹽分包括堿金屬的氯化物、硫酸的堿金屬鹽及其混合物。
13.權(quán)利要求12的溶解劑組合物，其中堿金屬的氯化物的濃度約為0.2％-1.3％。
14.權(quán)利要求12的溶解劑組合物，其中硫酸的堿金屬鹽的濃度約為0.4％-2.0％。
15.一種溶解血樣紅血球和分析剩余白血球的方法，包括a)將血樣暴露于溶解組合物一定時間，該時間足以溶解紅血球，并在所述血樣中分出至少一種白血球亞群，所述溶解劑含有1)烷基硫酸的堿金屬鹽，2)酸，3)促進嗜酸性細胞亞群選擇皺縮的選自有機磷酸酯、有機磷酸酯的堿金屬鹽、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性細胞溶解劑，4)保護嗜中性細胞不受溶解的非離子表面活性劑，和5)足以將所述溶解試劑組合物的重量克分子滲透壓濃度調(diào)節(jié)在370-720mOsm之間的生理鹽分，和b)從嗜酸性細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜中性細胞中區(qū)別出至少一種白血球亞群，c)報告所述區(qū)分的結(jié)果。
16.權(quán)利要求15的方法，其中足以溶解紅血球并在所述血樣中分出至少一種白血球亞群的時間約為10-25秒鐘。
17.權(quán)利要求15的方法，其中在室溫下溶解紅血球并在所述血樣中分出至少一種白血球亞群。
18.權(quán)利要求17的方法，其中室溫為15-30℃。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述白血球亞群為嗜酸性細胞亞群。
20.權(quán)利要求15的方法，其中所述白血球亞群為嗜中性細胞亞群。
21.權(quán)利要求15的方法，所述區(qū)分是通過使用至少兩種類型選自DC、RF和光散射的測量方式來進行的。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述區(qū)分是通過使用DC和RF測量方式來進行的。
23.一種溶解血樣紅血球并分析剩余白血球亞群的方法，該方法包括a)用第一種溶解劑組合物處理第一個血液等分試樣足夠時間，以使紅血球溶解，并且從所述血樣中分出至少一種白血球亞群，b)用第二種溶解劑系統(tǒng)處理所述血液的第二個等分試樣，足以使得紅血球溶解，并且從所述血樣中分出四種白血球亞群，c)使用DC和RF測量方式分析所述處理血液的第一個等分試樣，d)使用DC和RF測量方式分析所述處理血液的第二個等分試樣，e)報告至少五種白血球亞群。
24.權(quán)利要求23的方法，其中足以使得紅血球溶解，并且從所述血樣中分出至少一種白血球亞群的時間約為10-25秒鐘。
25.權(quán)利要求24的方法，其中足以使得紅血球溶解，并且從所述血樣中分出四種白血球亞群的時間約為10秒鐘。
26.權(quán)利要求23的方法，其中在室溫下使得紅血球溶解，并且從所述血樣的第一和第二等分試樣中分出白血球亞群。
27.權(quán)利要求26的方法，其中室溫約為15-30℃。
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述使用DC和RF測量分析所述處理血液的第一個等分試樣是區(qū)分嗜酸性細胞亞群。
29.權(quán)利要求23的方法，其中所述使用DC和RF測量分析所述處理血液的第二個等分試樣是區(qū)分白血球區(qū)分為包括淋巴細胞、單核細胞、嗜堿性細胞和除嗜堿性細胞之外的粒細胞的四種類型。
30.權(quán)利要求23的方法，其中第一溶解劑組合物含有a)烷基硫酸的堿金屬鹽，b)酸，c)促進嗜酸性細胞亞群選擇皺縮的選自有機磷酸酯、有機磷酸酯的堿金屬鹽、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合物的嗜酸性細胞溶解劑，d)保護嗜中性細胞不受溶解的非離子表面活性劑，和e)足以將所述溶解試劑組合物的重量克分子滲透壓濃度調(diào)節(jié)在370-720mOsm之間的生理鹽分。
31.權(quán)利要求23的方法，其中第二種溶解劑系統(tǒng)含有a)包含下式所示的乙氧基化的長鏈胺化合物和將溶解試劑的PH調(diào)節(jié)在2.0-3.6范圍之內(nèi)的酸的溶解試劑
其中R為具有12-22個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基，m和n各為1或更大并且m+n在20和40之間；和b)高滲堿性穩(wěn)定劑組合物。
32.權(quán)利要求23的方法，其中第二種溶解劑系統(tǒng)包含a)溶解試劑，它含有下式所示的聚氧乙烯表面活性劑R1-R2-(CH2CH2O)n-H其中R1為具有10-22個碳原子的烷基，鏈烯基或炔基，R2為-O-或-COO-，且n在20-35之間；和將溶解試劑的PH調(diào)節(jié)在2.0-4.0范圍之內(nèi)的酸；和b)高滲堿性穩(wěn)定劑組合物。
33.權(quán)利要求32的方法，其中第二種溶解劑系統(tǒng)還含有加入的十二烷基硫酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溶解劑和使用該溶解劑自動區(qū)分血液中白血球亞群的方法。尤其是,新的溶解劑溶解紅血球并作用于能夠區(qū)分至少一種白血球亞群的嗜酸性細胞。該溶解劑為酸,含有烷基硫酸的堿金屬鹽的高滲水溶液,嗜酸性細胞溶解劑,非離子表面活性劑和生理鹽分。當與第二種溶解劑一起使用時,能夠用DC和RF測量區(qū)分白血球的至少五個部分。
文檔編號G01N33/49GK1202621SQ9711279
公開日1998年12月23日 申請日期1997年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月17日
發(fā)明者李毅, C·尤恩格, S·C·維蘭斯 申請人:庫特國際公司