專利名稱：新型人β2整合素α亞單位的制作方法
本申請是1996年2月22日提交的系列號為No.08/605,672的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，該專利申請正在審批；No.08/605,672是1994年12月21日提交的系列號為No.08/362,652的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，該專利申請正在審批；No.08/362,652是1994年8月5日提交的系列號為No.08/286,889的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，該專利申請已在1995年12月28日授權(quán)，專利號為美國專利5,470,953。而該專利又是1993年12月23日提交的系列號為No.08/173,497的美國專利申請的部分繼續(xù)申請，后者已在1995年8月1日授權(quán)，專利號為美國專利5,437,958。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及編碼新型人β2整合素α亞單位的多核苷酸的克隆和表達(dá)，這種新型人β2整合素α亞單位被命名為αd，它在結(jié)構(gòu)上與已知的人β2整合素α亞單位--CD11a、CD11b和CD11c有關(guān)。本發(fā)明還涉及從其他種分離的顯示與人αd編碼序列同源的多核苷酸。發(fā)明背景整合素是一組活躍地參與細(xì)胞黏附的膜相關(guān)分子。整合素是由一個α亞單位和一個β亞單位非共價結(jié)合組成的跨膜異二聚體。目前，至少已經(jīng)確定了14種α亞單位和8種β亞單位(Springer綜述，《自然》346卷，425-434頁(1990))。β亞單位一般能與一種以上的α亞單位結(jié)合，整合素群體中具有共同的β亞單位的異二聚體被分類成亞族。
有一組局限于白血細(xì)胞中表達(dá)的人整合素，其特征是含有共同的β2亞單位。由于這種細(xì)胞特異性表達(dá)，這些整合素通常被稱為白細(xì)胞整合素、Leu-CAMs或白細(xì)胞整合素。由于含有共同的β2亞單位，這組整合素的另一種命名是β2整合素。β2亞單位(CD18)先前是在與三種不同的α亞單位--CD11a、CD11b或CD11c結(jié)合的狀態(tài)下被分離的。Kishimoto等，《細(xì)胞》48卷，681-690頁(1987)中介紹了編碼人CD18的cDNA的分離。在官方的WHO命名中，上述異二聚體蛋白被稱為CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18；在通常的命名中，它們被分別稱為LFA-1、Mac-1或Mol和p150、95或LeuM5(Cobbold等，《白細(xì)胞分型III》，McMichael(編輯)，牛津出版社，788頁(1987))。已經(jīng)證明人β2整合素α亞單位CD11a、CD11b和CD11c在還原條件下進(jìn)行電泳時，分別以表觀分子量約180kD、155kD和150kD遷移，而且編碼這些亞單位的cDNA已經(jīng)被克隆(CD11a，Larson等，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》108卷，703-712頁(1989)；CD11b，Corbi等，《生物化學(xué)雜志》263卷，12403-12411(1988)；CD11c，Corbi等，《EMBO J》6卷，4023-4028(1987))。由分子量的大致相似而定義的人β2整合素α和β鏈的推定同源物已在其他種屬中得到不同的鑒定，這些動物包括猴和其他靈長類(Letvin等《血液》61卷，408-410頁(1983))、鼠(Sanchez-Madrid等《J.Exp.Med》154卷，1517頁(1981))和狗(Moore等，《組織抗原》36卷211-220頁(1990))。
來自其他種屬的推定同源物的絕對分子量已顯示明顯的差異(見諸如Danilenko等，《組織抗原》40卷，13-21頁(1992))，在沒有序列信息的情況下，對人整合素亞單位和在其他種屬中鑒定的整合素亞單位進(jìn)行明確的比較是不可能的。而且，在不同的種屬中已經(jīng)觀察到一個蛋白家族的成員在數(shù)量上不同，例如，在兔中比在人中分離到更多的IgA同種型(Burnet等，《EMBO J》8卷，4041-4047頁(1989)和Schneiderman等，《美國科學(xué)院院報(bào)》86卷，7561-7565(1989))。類似地，在人中已經(jīng)鑒定了至少六種金屬硫蛋白的變體(Karin和Richards，《自然》299卷，797-802頁(1982)和Varshney等，《分子細(xì)胞生物學(xué)》6卷，26-37頁(1986))，而在鼠中只證明兩種這樣的變體(Searle等，《分子細(xì)胞生物學(xué)》4卷，1221-1230頁(1984))。因此，在一個物種中一個蛋白家族中存在多個成員并不意味著在其他物種中存在相應(yīng)的家族成員。
具體到β2整合素，在狗中已經(jīng)觀察到與人CD18相當(dāng)?shù)耐贫ㄈ?能夠與四種之多的潛在不同的α亞單位形成二聚體(Danilenko等，上文)。用犬脾細(xì)胞免疫鼠制備抗體能夠產(chǎn)生這樣的單克隆抗體，這種單克隆抗體能免疫沉淀主要基于類似但不是相同分子量而實(shí)驗(yàn)性地選來作為人CD18、CD11a、CD11b和CD11c的犬同源物的蛋白。另一種識別和免疫沉淀一種第四α樣犬亞單位的抗犬脾細(xì)胞抗體---Ca11.8H2，也能夠與β2亞單位結(jié)合，但這種亞單位具有獨(dú)特的分子量，并且限制表達(dá)于一種分化類型的組織巨噬細(xì)胞。
用小鼠樹突細(xì)胞免疫倉鼠制備抗體能產(chǎn)生兩種抗整合素抗體(Metlay等《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》171卷，1753-1771(1990))。第一種抗體---2E6能夠免疫沉淀由具有約180kD和90kD的分子量以及分子量范圍為150-160kD的次要帶的亞單位組成的占優(yōu)勢的異源二聚體。第二種抗體---N418免疫沉淀由具有約150kD和90kD分子量的亞單位組成的另一種明顯的異源二聚體。基于細(xì)胞黏附阻斷研究，人們提出了這樣一種假說，抗體2E6識別人CD18的一種鼠對應(yīng)物。而N418抗原的分子量表明對人CD11c/CD18的一種鼠同源物的識別，進(jìn)一步的分析表明該鼠抗原顯示與在人CD11c/CD18中觀察到的組織分布圖譜不一致的組織分布圖譜。
犬Ca11.8H2抗體和鼠N418抗體識別的抗原可能代表了一類以前鑒定的犬或鼠α亞單位的變體種類(例如糖基化或剪切變體)。此外，這些抗原可能代表獨(dú)特的犬或鼠整合素α亞單位。在沒有一級結(jié)構(gòu)的具體信息的情況下，這些可能性無法區(qū)分。
在人中，CD11a/CD18在所有的白細(xì)胞上表達(dá)，CD11b/CD18和CD11c/CD18主要局限表達(dá)于單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞。但CD11c/CD18也在某些B細(xì)胞種類中檢出。一般來說，CD11a/CD18在淋巴細(xì)胞中占優(yōu)勢，CD11b/CD18在粒細(xì)胞中占優(yōu)勢，而CD11c/CD18在巨噬細(xì)胞中占優(yōu)勢(見綜述，Arnout《血液》75卷，1037-1050(1990))。而α鏈的表達(dá)因各細(xì)胞類型的激活和分化狀態(tài)而不同(見綜述Larson和Springer《免疫學(xué)綜述》114卷181-217(1990))。
使用能夠阻斷β2整合素相關(guān)的細(xì)胞黏附的單克隆抗體已經(jīng)證明，β2整合素參與人的免疫和炎癥應(yīng)答。例如，CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18活躍地參與自然殺傷細(xì)胞與淋巴瘤和腺癌細(xì)胞的結(jié)合(Patarroyo等《免疫學(xué)綜述》114卷，67-108頁)、粒細(xì)胞集聚(Nourshargh等，《免疫學(xué)雜志》142卷，3193-3198(1989))、不依賴粒細(xì)胞的血漿滲出(Arfors等，《血液》69卷，338-340頁(1987))、受到激活的白細(xì)胞的趨化應(yīng)答(Arfors等，上文)和白細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附(Price等《免疫學(xué)雜志》139卷，4147-4177頁(1987)和Smith等《J.Clin.Invest.》83卷，2008-2017頁(1989))。β2整合素在免疫和炎癥應(yīng)答中的基本作用在被稱為白細(xì)胞黏附缺陷(LAD)的臨床綜合征中非常明顯，該綜合征的臨床表現(xiàn)包括復(fù)發(fā)和經(jīng)常性地受到危及生命的細(xì)菌感染的威脅。LAD是由于β2亞單位的異源性突變造成的(Kishimoto等《細(xì)胞》50卷，193-202(1987))，并且疾病的嚴(yán)重程度與β2亞單位表達(dá)的缺陷程度有關(guān)。完整的整合素異源二聚體的形成受到β2突變體的損害(Kishimoto等，上文)。
有趣的是，至少有一種針對CD18的抗體已經(jīng)顯示在體外能夠抑制人免疫缺陷病毒類型-1(HIV-1)合胞體的形成，盡管這種抑制作用的精確機(jī)制還不清楚(Hildreth和Orentas，《科學(xué)》244卷，1075-1078(1989))。該發(fā)現(xiàn)與下面的發(fā)現(xiàn)一致CD11a/CD18的一個主要受體---ICAM-1也是鼻病毒血清型的主要群體的表面受體(Greve等，《細(xì)胞》56卷，839(1989))。
β2整合素結(jié)合活性在人免疫和炎癥應(yīng)答中的意義說明有必要對這類表面蛋白進(jìn)行更完全的理解。鑒定未知的該亞家族的成員以及它們的反受體，并制備能夠改變β2整合素生物活性的單克隆抗體或其他可溶性因子，將為在β2整合素相關(guān)的免疫和炎癥應(yīng)答中治療性干預(yù)提供實(shí)用的方法。發(fā)明簡述在一個方面，本發(fā)明提供新型的純化和分離的多核苷酸(例如DNA和RNA轉(zhuǎn)錄物，包括有義鏈和反義鏈)，這些多核苷酸編碼具有αd固有的結(jié)合和/或免疫特性的新型人β2整合素α亞單位αd及其變體(即刪除、添加或取代類似物)。本發(fā)明的優(yōu)選DNA分子包括cDNA、基因組DNA及全部或部分化學(xué)合成的DNA分子。目前一個優(yōu)選的多核苷酸是SEQ ID NO1中列出的DNA，它編碼SEQ ID NO2的多肽。本發(fā)明還提供包含αd編碼序列的重組質(zhì)粒和病毒DNA結(jié)構(gòu)(表達(dá)結(jié)構(gòu))，其中αd編碼序列可操縱地與一個或多個同源或異源的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件連接。
本發(fā)明還提供與編碼人αd的多核苷酸顯示同源性的分離和純化的小鼠和大鼠多核苷酸。一個優(yōu)選的小鼠多核苷酸列于SEQ ID NO52，一個優(yōu)選的大鼠多核苷酸列于SEQ ID NO54。
本發(fā)明的另一個方面是，提供用能表達(dá)αd多肽或其變體的本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞在大量制備αd多肽時特別有用，αd多肽可以從宿主細(xì)胞本身或宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中分離。在其細(xì)胞外膜表面表達(dá)αd多肽的宿主細(xì)胞作為免疫原在制備αd特異的抗體時也特別有用。優(yōu)選地，用αd轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞也進(jìn)行共轉(zhuǎn)染來表達(dá)一種β2整合素，使異源二聚體在表面表達(dá)。
本發(fā)明還提供純化和分離的αd多肽及其片段和變體。優(yōu)選的αd多肽列于SEQ ID NO2。本發(fā)明的新型αd產(chǎn)物可以從天然的原料中分離，但與αd變體產(chǎn)物一樣，優(yōu)選用本發(fā)明的宿主細(xì)胞通過重組方法進(jìn)行生產(chǎn)。可以通過改變選擇來進(jìn)行重組過程的宿主細(xì)胞和/或分離后加工來制備完全糖基化、部分糖基化和完全去糖基化形式的αd多肽。本發(fā)明的αd多肽變體包含水溶性和不溶性的αd多肽，包括具有下面特性、其中一個或多個氨基酸被刪除或取代的類似物(1)αd特異的生物學(xué)活性或免疫學(xué)特征沒有喪失，并優(yōu)選有一個或多個有增強(qiáng)；或(2)一個特別的配體/受體結(jié)合或信號功能被特異性地失活。本發(fā)明還提供融合的多肽，其中αd氨基酸序列與來自其他多肽的氨基酸序列順序表達(dá)。這樣的融合多肽與野生型的αd相比具有修飾的生物學(xué)、生物化學(xué)、和/或免疫學(xué)特性。本發(fā)明還包括包含額外的氨基酸殘基(例如賴氨酸或半胱氨酸)從而便于多聚體形成的多肽類似物。
本發(fā)明還包括特異性地與αd結(jié)合的多肽或非肽類分子。優(yōu)選的結(jié)合分子包括抗體(例如單克隆和多克隆抗體)、反受體(例如膜相關(guān)和可溶性形式)和其他配體(例如天然產(chǎn)生或合成的分子)，包括那些在αd單克隆抗體和/或特異性反受體存在下競爭性地與αd結(jié)合的分子。結(jié)合分子在純化αd多肽和鑒定表達(dá)αd的細(xì)胞類型時非常有用。結(jié)合分子還可用于調(diào)節(jié)αd的體內(nèi)結(jié)合和/或信號傳導(dǎo)活性(即抑制、阻斷或激活)。
本發(fā)明還提供鑒定αd結(jié)合分子的試驗(yàn)，包括體外試驗(yàn)例如固相配體結(jié)合試驗(yàn)、溶液結(jié)合試驗(yàn)和閃爍親近試驗(yàn)；以及基于細(xì)胞的試驗(yàn)例如雜交篩選試驗(yàn)等等。基于細(xì)胞的試驗(yàn)在宿主細(xì)胞中提供表型改變作為特異性結(jié)合相互作用或特異性結(jié)合相互作用被破壞的結(jié)果，從而間接定量或測量某些特異性結(jié)合相互作用。
鑒定能調(diào)節(jié)αd活性的抗體或其他化合物的體外試驗(yàn)可以包括，例如，固化αd或一種αd結(jié)合的天然配體，將非固化的結(jié)合配體用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記，將結(jié)合配體一起溫育，測定待測化合物對標(biāo)記數(shù)量的影響，其中在有待測化合物的情況下比沒有待測化合物的情況下，結(jié)合的標(biāo)記減少，就說明待測試劑是一種αd結(jié)合的抑制劑。
另一種類型的鑒定能調(diào)節(jié)αd與配體相互作用的化合物的體外試驗(yàn)包括，將αd或其片段固化于包被(或飽和)了一種熒光試劑的固相支持物上，配體用一種能激發(fā)熒光的化合物標(biāo)記，將固化的αd與標(biāo)記的配體在存在或不存在一種推定的調(diào)節(jié)化合物的情況下接觸，檢測熒光試劑的光發(fā)射，與沒有調(diào)節(jié)化合物存在時熒光試劑的光發(fā)射相比能夠影響熒光試劑光發(fā)射的化合物就被鑒定為調(diào)節(jié)化合物。另外，在試驗(yàn)中也可以將αd配體固化而將αd標(biāo)記。
本發(fā)明包含的一種鑒定能調(diào)節(jié)αd與一種配體相互作用的化合物的基于細(xì)胞的方法包含用一個DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，該DNA結(jié)構(gòu)中含有一個在啟動子控制之下的報(bào)告基因，該啟動子受含有一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼部分或全部αd與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域的第一種融合的雜合DNA序列；在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼配體的全部或部分與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域的第二種融合的雜合DNA序列，第二種融合中的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域與第一種融合中的不同；通過測量在存在或沒有推定調(diào)節(jié)物的情況下，報(bào)告基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的產(chǎn)量，來檢測配體與αd在特定宿主細(xì)胞中的結(jié)合，從而評價推定的調(diào)節(jié)化合物對αd與配體相互作用的影響。那些與沒有調(diào)節(jié)化合物時報(bào)告基因產(chǎn)物的產(chǎn)量相比報(bào)告基因產(chǎn)物的產(chǎn)量改變的化合物就被鑒定為調(diào)節(jié)化合物。這里優(yōu)選在試驗(yàn)中使用的是lexA啟動子、lexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GAL4反式激活結(jié)構(gòu)域、lacZ報(bào)告基因和一種酵母宿主細(xì)胞。
上述試驗(yàn)的一個修改版本可以用來分離編碼一種能結(jié)合αd的蛋白的多核苷酸，包括用一個DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，該DNA結(jié)構(gòu)中含有一個在啟動子控制之下的報(bào)告基因，該啟動子受含有一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個激活結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)；在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼部分或全部αd與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域的第一種融合的雜合DNA序列；在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼配體的全部或部分與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域的第二種融合的雜合DNA序列，第二種融合中的DNA結(jié)合區(qū)域或激活區(qū)域與第一種融合中的不同；通過檢測宿主細(xì)胞中報(bào)告基因產(chǎn)物的產(chǎn)量來檢測在特定宿主細(xì)胞中αd結(jié)合蛋白與αd的結(jié)合；并從特定宿主細(xì)胞中分離編碼αd結(jié)合蛋白的第二種雜合DNA序列。
在一個使用割裂雜交試驗(yàn)(split hybrid assay)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定αd蛋白或其片段與αd結(jié)合蛋白或其片段結(jié)合的抑制劑的方法，這種方法包含如下步驟(a)用第一個DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所說的宿主細(xì)胞，該DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)包含編碼第一個選擇標(biāo)記蛋白的第一個選擇標(biāo)記基因和編碼一個抑制蛋白的抑制基因，其中所說的抑制基因在一個啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下，(b)用第二個DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所說的宿主細(xì)胞，該DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)包含編碼第二個選擇標(biāo)記蛋白的第二個選擇標(biāo)記基因和編碼第三個選擇標(biāo)記蛋白的第三個選擇標(biāo)記基因，其中所說的第三個標(biāo)記基因在一個操縱子的轉(zhuǎn)錄控制之下，所說的操縱子特異性地受所說的抑制蛋白作用，從而所說的抑制蛋白與所說的啟動子相互作用降低所說的第三個選擇標(biāo)記蛋白的表達(dá)；(c)用第三個DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所說的宿主細(xì)胞，該DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)包含編碼第四個選擇標(biāo)記蛋白的第四個選擇標(biāo)記基因和編碼一個αd蛋白或其片段與一個轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或所說的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的反式作用結(jié)構(gòu)域同框的αd融合蛋白基因；(d)用第四個DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所說的宿主細(xì)胞，該DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)包含編碼第五個選擇標(biāo)記蛋白的第五個選擇標(biāo)記基因和編碼一個αd結(jié)合蛋白或其結(jié)合片段與所說的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或所說的轉(zhuǎn)錄激活蛋白的反式作用結(jié)構(gòu)域同框的第二個融合蛋白基因，該DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或反式作用結(jié)構(gòu)域不包含在第一個融合蛋白基因中；(e)將所說的宿主細(xì)胞在允許所說的αd蛋白或其片段和αd結(jié)合蛋白或其結(jié)合片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)，從而使所說的αd蛋白或其片段與αd結(jié)合蛋白或其結(jié)合片段相互作用，使所說的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所說的反式作用結(jié)構(gòu)域接近，重組成所說的轉(zhuǎn)錄激活蛋白；所說的轉(zhuǎn)錄激活蛋白作用于所說的啟動子，使所說的抑制蛋白的表達(dá)提高；所說的抑制蛋白與所說的啟動子相互作用，使第三個選擇標(biāo)記蛋白不表達(dá)；(f)檢測所說的選擇基因表達(dá)的缺乏；(g)將所說的宿主細(xì)胞在存在一種所說的αd蛋白或其片段與所說的αd結(jié)合蛋白或其片段結(jié)合的待測抑制劑的條件下培養(yǎng)；(h)比較在存在和不存在所說的待測抑制劑的情況下，所說的選擇標(biāo)記蛋白的表達(dá)，其中所說的選擇標(biāo)記蛋白的表達(dá)降低說明待測抑制劑能夠抑制所說的αd蛋白或其片段與所說的αd結(jié)合蛋白或其結(jié)合片段的結(jié)合，從而使所說的轉(zhuǎn)錄激活蛋白不能重組，所說的抑制蛋白的表達(dá)沒有增加，而所說操縱子使所說的選擇標(biāo)記蛋白的表達(dá)增加。
本發(fā)明包括不同的基因和調(diào)節(jié)序列編碼在單一DNA分子的宿主細(xì)胞以及一個或多個抑制基因、選擇標(biāo)記基因、αd融合蛋白基因和αd結(jié)合蛋白基因編碼在不同DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)的宿主細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞用編碼抑制基因、選擇標(biāo)記基因、αd融合蛋白基因和αd融合結(jié)合蛋白基因的DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，上述基因均編碼在不同的表達(dá)結(jié)構(gòu)上。無論導(dǎo)入多少個DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)，每個轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包含一個選擇標(biāo)記基因序列，該選擇標(biāo)記基因序列的表達(dá)用來證明轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染已經(jīng)確實(shí)完成。各轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)上編碼的選擇標(biāo)記基因與tet操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)選擇標(biāo)記不同，其差別在于tet操縱子調(diào)節(jié)下的選擇標(biāo)記基因的表達(dá)在該優(yōu)選實(shí)施方案中是核心的，即tet操縱子對選擇標(biāo)記基因表達(dá)的調(diào)控在宿主細(xì)胞中提供可以測量的表型改變，用以鑒定結(jié)合蛋白抑制劑。各轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)上編碼的選擇標(biāo)記基因是提供來作為各DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)成功轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的決定物。本發(fā)明的優(yōu)選宿主細(xì)胞包括命名為YI596和YI584的釀酒酵母(S.cerevisiae)，這兩種菌在1996年8月13日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive.Rockville.Maryland 20852，并分別被給予保藏號ATCC 74384和ATCC 74385。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括任何能夠表達(dá)如上所需的αd蛋白和αd結(jié)合蛋白以及能被前述調(diào)節(jié)異源蛋白表達(dá)的有功能的啟動子和操縱子序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以是哺乳動物、昆蟲或酵母來源的細(xì)胞。在此，最優(yōu)選的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)選酵母細(xì)胞可以選自包括表1中介紹的釀酒酵母在內(nèi)的各種菌株。其他的酵母種類包括粟酒裂殖酵母(S.pombe)、乳克魯維酵母(K.lactis)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、卡爾斯伯酵母(S.carlsbergensis)和白色假絲酵母(C.albicans)。本發(fā)明的優(yōu)選哺乳動物類宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS、HeLa、3T3、CV1、LTK、293T3、Rat1、PC12或任何其他人或嚙齒類來源的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞系包括SF9細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因受一個操縱子調(diào)節(jié)，并編碼一個所說的宿主細(xì)胞的營養(yǎng)所需的合成途徑中的一個酶，這樣，對于在缺乏所說的必需營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長的所說宿主細(xì)胞來說，所說的選擇標(biāo)記蛋白的表達(dá)是需要的。這樣，在一個抑制蛋白與操縱子相互作用的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄被下調(diào)，而宿主細(xì)胞通過其不能在缺乏必需營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長但能在含有該必需營養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長來進(jìn)行鑒定。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因編碼HIS3蛋白，用編碼HIS3的DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在存在或不含組氨酸的培養(yǎng)基上生長后進(jìn)行選擇。然而本發(fā)明可包括任何其他由一個操縱子調(diào)節(jié)的選擇標(biāo)記基因。其他基因包括，例如，URA3、LEU2、LYS2或那些編碼任何產(chǎn)生可被完全地從生長培養(yǎng)基中去除的必需營養(yǎng)的各種途徑中所需要的多種酶的基因。此外，傳統(tǒng)的報(bào)告基因例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢火蟲螢光素酶、β-半乳糖苷酶(β-gal)、分泌型堿性磷酸酶(SEAP)、綠熒光蛋白(GFP)、人生長激素(hGH)、β-葡萄醛酸酶、新霉素、潮霉素、胸苷激酶(TK)等也可用于本發(fā)明。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含一個編碼四環(huán)素抗性蛋白的抑制蛋白基因，該蛋白作用于tet操縱子，使選擇標(biāo)記基因的表達(dá)降低。但本發(fā)明還包括tet抑制蛋白和操縱子以外的其他抑制蛋白和操縱子，例如大腸桿菌trp抑制蛋白和操縱子、his抑制蛋白和操縱子以及l(fā)ac抑制蛋白和操縱子。
融合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和反式激活結(jié)構(gòu)域組分可來自同一個轉(zhuǎn)錄因子或來自不同的轉(zhuǎn)錄因子，只要在αd和αd結(jié)合蛋白結(jié)合時使這兩種結(jié)構(gòu)域接近形成一個有功能的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，高效率地提高抑制蛋白的表達(dá)。一個高效率的轉(zhuǎn)錄激活蛋白被定義為同時含有一個能顯示與被識別的啟動子序列高親和力結(jié)合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個對表達(dá)抑制基因mRNA所需的轉(zhuǎn)錄機(jī)制蛋白有高親和力的反式激活結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的融合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組分可來自任何不同蛋白質(zhì)，例如，LexA或Ga14。類似地，本發(fā)明的融合蛋白的反式激活組分可來自多種不同的轉(zhuǎn)錄激活蛋白，包括如Ga14或VP16。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)抑制蛋白轉(zhuǎn)錄的啟動子序列可以是任何能在所選宿主細(xì)胞中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的序列。啟動子可以是特異地被本發(fā)明的所選DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別的DNA序列，或任何其他能與融合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以高親和力相互作用的DNA序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明啟動子序列是一個HIS3或一個醇脫氫酶(ADH)啟動子。這里最優(yōu)選的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明使用了一個ADH啟動子。但本發(fā)明包括大量的其他啟動子，包括例如，來自從編碼HIS3、ADH、URA3、LEU2等基因的啟動子序列。
本發(fā)明的方法包括任何所有的上述宿主中的變化。特別地，本發(fā)明包括下面的方法宿主細(xì)胞是一種酵母細(xì)胞，選擇標(biāo)記基因編碼HIS3，選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄受tet操縱子的調(diào)節(jié)，抑制蛋白基因編碼四環(huán)素抗性蛋白，四環(huán)素抗性蛋白的轉(zhuǎn)錄受HIS3啟動子的調(diào)節(jié)，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自LexA，反式激活結(jié)構(gòu)域來自VP16。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如下的方法宿主細(xì)胞是一種酵母細(xì)胞，選擇標(biāo)記基因編碼HIS3，選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄受tet操縱子的調(diào)節(jié)，抑制蛋白基因編碼四環(huán)素抗性蛋白，四環(huán)素抗性蛋白的轉(zhuǎn)錄受醇脫氫酶啟動子的調(diào)節(jié)，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域來自LexA，反式激活結(jié)構(gòu)域來自VP16。
在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是一種哺乳動物細(xì)胞，其改變包括，使用哺乳動物DNA表達(dá)結(jié)構(gòu)來編碼αd和αd結(jié)合融合蛋白基因、抑制基因、和選擇標(biāo)記基因，并使用編碼抗生素或藥物抗性標(biāo)記的選擇標(biāo)記基因(即，新霉素、潮霉素、胸苷激酶)。
至少有三種不同類型的文庫用來鑒定小分子的調(diào)節(jié)物。它們包括(1)化學(xué)文庫，(2)天然產(chǎn)物文庫，(3)含有隨機(jī)肽、寡核苷酸或有機(jī)分子的組合文庫。
化學(xué)文庫由已知化合物或通過天然產(chǎn)物篩選而鑒定為“標(biāo)的”的化合物的結(jié)構(gòu)類似物組成。天然產(chǎn)物文庫是微生物、動物、植物或水生有機(jī)體的提取物，上述有機(jī)體用來按下述方法制備用于篩選的混合物(I)從土壤、植物或水生微生物中發(fā)酵和抽提培養(yǎng)液，(II)抽提植物或水生有機(jī)體。組合文庫由大量的肽、寡核苷酸或有機(jī)化合物的混合物組成。它們可以相對容易地用傳統(tǒng)的自動合成方法、PCR、克隆或適當(dāng)?shù)暮铣煞椒ㄟM(jìn)行制備。其中最令人感興趣的是肽和寡核苷酸組合文庫。其他令人感興趣的文庫包括肽、蛋白、肽模擬物、多平行合成收集物、重組和多肽文庫。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)針對αd的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。生產(chǎn)能分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的。雜交瘤細(xì)胞系可以在用純化的αd、αd變體或能在其細(xì)胞外膜表面表達(dá)αd或其變體的細(xì)胞免疫一種動物后進(jìn)行制備。免疫原細(xì)胞類型包括在體內(nèi)表達(dá)αd的細(xì)胞或通常不能在體內(nèi)表達(dá)αd的轉(zhuǎn)染的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞系。這里本發(fā)明優(yōu)選的抗體由命名為169A、169B、170D、170F、170E、170X、170H、188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R、188T、195A、195C、195D、195E、195H、197A-1、197A-2、197A-3、197A-4、199A、199H、199M、205A、205C、205E、212A、212D、217G、217H、217I、217K、217L、217M、226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H、226I、236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、237L、237L、236M、240F、240G和240H的雜交瘤分泌。
通過αdDNA和氨基酸序列公開而提供的信息的價值也被指明。在一個實(shí)施例系列中，公開的αdcDNA序列使分離人αd基因組序列包括基因組序列的轉(zhuǎn)錄控制元件成為可能。本發(fā)明還包括αd等位變體和異源種類(例如大鼠和小鼠)的DNA的鑒定。人αd基因組DNA和異源種屬的DNA可以用標(biāo)準(zhǔn)的DNA/DNA雜交技術(shù)，在適度嚴(yán)格的條件下，使用αdcDNA序列作為探針對一個合適的文庫進(jìn)行篩選來完成。另外，使用基于已知的cDNA序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)也可用來擴(kuò)增和鑒定基因組αdDNA序列。編碼αd多肽包括其片段和其他變體的合成DNA可用傳統(tǒng)的合成方法進(jìn)行生產(chǎn)。
本發(fā)明的DNA序列信息還可用來通過同源重組或“敲除”策略(見諸如，Kapecchi，《科學(xué)》244卷，1288-1292頁(1989))產(chǎn)生不能表達(dá)有功能的αd多肽或表達(dá)一種變異的αd多肽的嚙齒類動物。這樣的嚙齒類動物可用作體內(nèi)研究αd和αd調(diào)節(jié)劑的模型。
本發(fā)明的DNA和氨基酸序列還使分析αd中活躍地參與反受體結(jié)合的表位以及調(diào)節(jié)而不是活躍地參與結(jié)合的表位成為可能。參與膜信號傳導(dǎo)的表位的鑒定也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的DNA還可用來檢測表達(dá)αd多肽的細(xì)胞類型。使用αdDNA檢測αdRNA的標(biāo)準(zhǔn)DNA/RNA雜交技術(shù)可用來確定一種細(xì)胞中αd轉(zhuǎn)錄的組成水平以及應(yīng)答于內(nèi)部或外部試劑的轉(zhuǎn)錄水平改變。而接著，能改變αd轉(zhuǎn)錄或翻譯的試劑的鑒定又能用來評估其潛在的治療或預(yù)防價值。本發(fā)明的DNA還可以用αdDNA對細(xì)胞RNA進(jìn)行原位雜交來確定在復(fù)雜的細(xì)胞群體和組織中αd特異性信息的細(xì)胞定位。
本發(fā)明的DNA還可用來鑒定顯示與人αd序列同源的非人多核苷酸序列。獲得了非人αdDNA序列就可建立人系統(tǒng)的動物模型(包括，例如，轉(zhuǎn)基因模型)。
作為本發(fā)明的另一個方面，針對αd的單克隆抗體和多克隆抗體可用于將αd定位于亞細(xì)胞腔體或組織中單個的細(xì)胞的免疫組化分析。這類免疫組化分析在與原位雜交聯(lián)用來定位αd基因的αdmRNA和多肽產(chǎn)物兩者時特別有用。
鑒定能表達(dá)αd的細(xì)胞類型對發(fā)展治療性和預(yù)防性試劑有顯著的衍生效果。預(yù)期本發(fā)明的αd相關(guān)產(chǎn)物可用于治療在其疾病過程中巨噬細(xì)胞為基本因素的疾病。在本領(lǐng)域中，許多與巨噬細(xì)胞活性相關(guān)的病理狀態(tài)的動物模型已經(jīng)得到介紹。例如，在小鼠中，Jutila等，《白細(xì)胞生物學(xué)雜志》54卷，30-39頁(1993)，報(bào)道了巨噬細(xì)胞聚集在慢性和急性炎癥的位點(diǎn)。在大鼠中，Adams等[《移植》53卷，1115-1119(1992)和《移植》56卷，794-799頁(1993)]介紹了一個向異性腹部心臟同種移植后的移植動脈硬化的模型。Rosenfeld等(《動脈粥樣硬化》7卷，9-23頁(1987)和《動脈粥樣硬化》7卷，24-34頁(1987))介紹了用一種甾醇添加劑食物喂養(yǎng)在兔中誘導(dǎo)動脈粥樣硬化。Hanenberg等(《糖尿病》32卷，126-134頁(1989))報(bào)告了BB大鼠中胰島素依賴型糖尿病的自發(fā)發(fā)展。Yamada等(《胃腸病學(xué)》104卷，759-771頁(1993))介紹了在大鼠中注射鏈球菌肽聚糖-多糖多聚體后誘導(dǎo)炎癥性腸道疾病、慢性肉牙炎。Cromartie等(《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》146卷，1585-1602頁(1977))和Schwab等(《感染與免疫》59卷，4436-4442頁(1991))報(bào)道了在大鼠中注射鏈球菌細(xì)胞壁蛋白導(dǎo)致特征為外周關(guān)節(jié)炎癥及隨后關(guān)節(jié)損傷的關(guān)節(jié)炎。最后，Huitinga等(《歐洲免疫學(xué)雜志》23卷，709-715頁(1993))介紹了Lewis大鼠的實(shí)驗(yàn)型過敏性腦脊髓炎，這是多發(fā)性硬化的一種模型。在上述每種模型中，αd抗體、其他αd結(jié)合蛋白或αd的可溶性形式被用來緩解疾病狀態(tài)，推測是通過使巨噬細(xì)胞活性失活。
本發(fā)明提供治療這些疾病和其他疾病狀態(tài)的藥用組合物。藥用組合物的設(shè)計(jì)目的是抑制αd與其配體之間的相互作用，包括αd的各種可溶性和膜結(jié)合形式(包括完整的αd多肽或其活躍地參與αd結(jié)合的片段)、可溶性和膜結(jié)合形式的αd結(jié)合蛋白(包括抗體、配體等)、αd結(jié)合活性的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外調(diào)節(jié)物、和/或αd和/或αd配體多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)物，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工和/或細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)物。
本發(fā)明還包括治療含有αd結(jié)合或表達(dá)αd的細(xì)胞局部集聚的疾病的方法，在該方法中，向患有所說疾病的病人提供一定數(shù)量的本發(fā)明的藥物組合物，其數(shù)量足夠調(diào)節(jié)αd結(jié)合水平或調(diào)節(jié)表達(dá)αd的細(xì)胞類型的集聚。本發(fā)明的治療方法應(yīng)用于以下疾病狀態(tài)，包括但不限于I型糖尿病、動脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化、哮喘、牛皮癬、肺炎、急性呼吸窘迫綜合征和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。附圖簡述本發(fā)明的大量其他方面和優(yōu)點(diǎn)將用下面的描述顯示，對


如下圖1A至1D包含人氨基酸序列CD11b(SEQ ID NO3)、CD11c(SEQ ID NO4)、和αd(SEQ ID NO2)的一個排列比較。發(fā)明詳述本發(fā)明用下列與從一個人脾細(xì)胞cDNA文庫中分離編碼αd的cDNA有關(guān)的實(shí)施例來說明。更具體地說，實(shí)施例1說明了使用抗犬αTM1抗體來設(shè)法檢測一種同源的人蛋白。實(shí)施例2詳細(xì)介紹了純化犬αTM1和多肽的N末端測序來設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增犬αTM1基因的寡核苷酸引物。實(shí)施例3談到了大量制備用于內(nèi)部測序的犬αTM1，用來設(shè)計(jì)其它PCR引物。實(shí)施例4介紹了使用PCR和內(nèi)部引物來擴(kuò)增犬αTM1基因的一個片段。實(shí)施例5談到了編碼人αd的cDNA序列的克隆。實(shí)施例6介紹了表達(dá)αdmRNA的人組織和細(xì)胞的Northern印跡雜交。實(shí)施例7詳細(xì)介紹了人αd表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和用獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。實(shí)施例8談到了轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞中αd表達(dá)的ELISA分析。實(shí)施例9介紹了用人αd表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的FACS分析。實(shí)施例10談到了CD18與共轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中αd結(jié)合的免疫沉淀。實(shí)施例11涉及αd表達(dá)結(jié)構(gòu)在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。實(shí)施例12談到了αdCD18依賴的與細(xì)胞間黏附分子ICAM-R、一種ICAM-R突變蛋白和補(bǔ)體因子iC3b的結(jié)合。實(shí)施例13介紹了鑒定αd配體/抗配體相互作用的抑制劑或增強(qiáng)劑(即調(diào)節(jié)物)的閃爍親近篩選試驗(yàn)。實(shí)施例14談到了構(gòu)建編碼αd可溶性形式的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合分析。實(shí)施例15涉及針對αd的多克隆血清和單克隆抗體的制備。實(shí)施例16介紹了使用αd單克隆抗體的流式細(xì)胞儀分析。實(shí)施例17談到了αd在人單核細(xì)胞上的表達(dá)。實(shí)施例18介紹了使用抗αd多克隆血清分析αd組織分布、αd在外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá)、在炎癥和非炎癥滑膜中的表達(dá)，在來自乳腺癌病人的病態(tài)肺和肝、人骨髓和PBMC中的表達(dá)。實(shí)施例19談到了αd在體內(nèi)和體外表達(dá)的上調(diào)。實(shí)施例20介紹了顯示與人αd基因序列同源的大鼠cDNA序列的分離。實(shí)施例21談到了大鼠αdmRNA的組織特異性表達(dá)。實(shí)施例22涉及全長的大鼠αd表達(dá)質(zhì)粒、大鼠αdI結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒包括I結(jié)構(gòu)域/IgG融合蛋白的構(gòu)建，針對全長和I結(jié)構(gòu)域融合蛋白的單克隆抗體的制備，和針對與人IgG4融合的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域序列的多克隆抗血清的制備。實(shí)施例23介紹了單克隆抗體199M的特異性。實(shí)施例24顯示了使用表達(dá)大鼠αd的巨噬細(xì)胞的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果。實(shí)施例25介紹了來自骨髓的大鼠αd的免疫沉淀。實(shí)施例26介紹了大鼠αd在多種動物模型中的表達(dá)。實(shí)施例27涉及一種使用αd單克隆抗體抑制NK-腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的靶細(xì)胞裂解的試驗(yàn)。實(shí)施例28談到了顯示與人αd基因序列同源的小鼠cDNA序列的分離。實(shí)施例29介紹了另外的用于證明序列分析的小鼠αdcDNA克隆的分離。實(shí)施例30涉及多種小鼠組織的原位雜交分析，來確定人αd推定小鼠同源物的組織和細(xì)胞特異性表達(dá)。實(shí)施例31介紹編碼人αd推定小鼠同源物的表達(dá)結(jié)構(gòu)的制備。實(shí)施例32談到了“敲除”小鼠的設(shè)計(jì)，其中編碼人αd推定小鼠同源物的基因被破壞。實(shí)施例33介紹了顯示與人αd同源的兔cDNA克隆的分離。實(shí)施例35涉及單克隆抗體217L識別的抗原的表征。實(shí)施例36介紹了人疾病狀態(tài)的動物模型，其中分析了αd調(diào)節(jié)的治療可能性。實(shí)施例37介紹了αd在動物模型疾病狀態(tài)中的表達(dá)。實(shí)施例1檢測犬αTM1的人同源物的嘗試檢測針對犬αTM1的單克隆抗體Ca11.8H2(Moore，等上文)對人外周血淋巴細(xì)胞的交叉反應(yīng)，來設(shè)法鑒定一種犬αTM1的人同源物。細(xì)胞制備物(通常為1×106細(xì)胞)與未稀釋的雜交瘤上清或一種純化的鼠IgG陰性的對照抗體(10ug/ml)在冰上于存在0.1％疊氮化鈉的條件下溫育。結(jié)合的單克隆抗體用隨后與6ug/ml的FITC接合的馬抗鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame，CA)溫育來進(jìn)行檢測。染色的細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)中的2％ w/v低聚甲醛進(jìn)行固定，并用Facstar Plus熒光激活細(xì)胞分選儀(Becton Dickinson，MountainView，CA)進(jìn)行分析。通常，用對數(shù)放大分析10,000個細(xì)胞來測量熒光密度。
結(jié)果顯示，Ca11.8H2不與人外周血淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白交叉反應(yīng)，而對照細(xì)胞贅生性犬外周血淋巴細(xì)胞基本上都是犬αTM1陽性。
由于針對犬α亞單位的單克隆抗體Ca11.8H2不與人同源物交叉反應(yīng)，分離犬αTM1DNA對于分離可能存在的對應(yīng)的人基因來說是據(jù)信是必要的。實(shí)施例2親和純化犬αTM1用于N末端測序親和純化犬αTM1來測定N末端氨基酸序列，用于寡核苷酸探針/引物設(shè)計(jì)。簡而言之，將抗αTM1單克隆抗體Ca11.8H2偶聯(lián)到Affigel 10色譜樹脂上(BioRad，Hercules，CA)，蛋白通過特異性的蛋白-蛋白相互作用進(jìn)行分離。根據(jù)BioRad推薦的程序，將抗體按約5mg抗體每ml樹脂的濃度接合到樹脂上。接合反應(yīng)后，去除多余的抗體，樹脂用三倍體積的0.1M的乙醇胺進(jìn)行封閉。然后用三十倍體積的磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌樹脂。
25克的一只狗脾臟在250ml 25mM Tris-HCl、pH8.0、含有0.32M蔗糖并含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中勻漿。在1000g離心15分鐘使核和細(xì)胞殘?jiān)恋?。?00,000g離心30分鐘使膜從上清中沉淀。將膜沉淀在200ml裂解緩沖液(50mM NaCl、50mM硼酸鹽、pH8.0、2％ NP-40)中重新懸浮，并在冰上溫育1小時。然后在100,000g離心60分鐘沉淀不溶物質(zhì)。將10毫升清亮的上清轉(zhuǎn)入含有0.5ml上述Ca11.8H2接合的Affigel 10樹脂的一個15ml的聚丙烯試管中。然后將試管在4℃旋轉(zhuǎn)保溫過夜，接著用50倍體積的D-PBS洗滌樹脂。然后將樹脂轉(zhuǎn)入一個微量離心管中，在1ml含有0.1MTris-HCl、pH6.8、2％ SDS、20％甘油和0.002％溴酚藍(lán)的Laemmli(非還原性)樣品緩沖液中煮沸10分鐘。離心沉淀樹脂并棄去，上清用1/15體積的β-巰基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)處理，并上7％聚丙烯酰胺凝膠。分離的蛋白按下述方法轉(zhuǎn)移到Immobilon PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。
凝膠在去離子的、Millipore過濾的水中洗滌一次，在含10％甲醇的10mM 3-[環(huán)己氨基]-1-丙磺酸(CAPS)、pH10.5轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15-45分鐘。Immobilon膜用甲醇浸濕，并用過濾水漂洗，然后在CAPS轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15-30分鐘。初步的轉(zhuǎn)移用BioRad轉(zhuǎn)移裝置在70伏進(jìn)行3小時。轉(zhuǎn)移后移去Immobilon膜，并在過濾的0.1％R250考馬斯染料中染色10分鐘。膜在50％甲醇/10％乙酸中脫色三次，每次10分鐘。脫色后，膜在過濾水中洗滌，并空氣干燥。
檢測到了約150kD、95kD、50kD和30kD的蛋白條帶。推測50kD和30kD條帶是抗體污染產(chǎn)生的。然后對150kD和95kD帶進(jìn)行N末端測序，但95kD蛋白是封閉的，阻礙了測序。從膜上切下150kD蛋白帶，直接用Applied Biosystems(Foster City，CA)Model 473A蛋白測序儀按照廠商的指示進(jìn)行測序。所獲得的氨基酸序列采用單字母氨基酸命名列于SEQ ID NO5。
FNLDVEEPMVFQ (SEQ ID NO5)所鑒定的序列包含整合素家族α亞單位的FNLD序列特征(Tamura等《細(xì)胞生物學(xué)雜志》111卷，1593-1604頁(1990))。引物設(shè)計(jì)和設(shè)法擴(kuò)增犬αTM1的序列根據(jù)N末端序列信息，設(shè)計(jì)了三個用于雜交的寡核苷酸探針a)“Tommer”，一個完全簡并的寡核苷酸；b)“Patmer”，一個部分簡并的寡核苷酸；c)“Guesser”一個基于哺乳動物密碼子使用的非簡并性寡核苷酸。這些探針分別列于下面的SEQ ID NO6、7和8。這里以及本文的其他核苷酸序列的核酸符號符合37 C.F.R §1.882。5’-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3’ (SEQ ID NO6)5’-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3’ (SEQ ID NO7)5’-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3’ (SEQ ID NO8)基于序列數(shù)據(jù)，使用這些寡核苷酸在幾種低嚴(yán)格條件下對一個克隆到λZAP(Stratagene，La Jolla，CA)的犬脾/外周血巨噬細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行雜交沒有檢測到相關(guān)的克隆。
根據(jù)推導(dǎo)的N末端序列隨后設(shè)計(jì)了四個其他的寡核苷酸引物來設(shè)法從上面介紹的Stratagene文庫的平板裂解物中純化的噬菌體文庫DNA用PCR擴(kuò)增犬αTM1序列，這四個引物命名為5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec(分別列于SEQ ID NO9、10、11和12，其中Deg表示簡并，Spec表示非簡并)。5’-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3’ (SEQ ID NO9)5’-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3’ (SEQ ID NO10)5’-TGRAANACCATNGGYTC-3’ (SEQ ID NO11)5’-TTGGAAGACCATNGGYTC-3’(SEQ ID NO12)αTM1寡核苷酸引物與T3或T7載體引物匹配，T3和T7引物分別列于SEQ ID NO13和SEQ ID NO14，它們能與λZAP中發(fā)現(xiàn)的Bluescript噬菌粒中的多接頭區(qū)域的兩翼序列雜交。5’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’ (SEQ ID NO13)5’-AATACGACTCACTATAG-3’ (SEQ ID NO14)PCR擴(kuò)增在含鎂并含150ng文庫DNA、1ug每種引物、200uMdNTPs、和2.5單位的Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的Taq緩沖液(Boehringer Mannheim，indianapolis，IN)中進(jìn)行，產(chǎn)物在含有0.25 ug/ml溴化乙啶的Tris-乙酸鹽-EDTA(TAE)緩沖液中用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。DNA通過在10×SSPE中吸收過夜轉(zhuǎn)移到Hybond膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上，轉(zhuǎn)移之后，固化的DNA用含有0.6M NaCl的0.5M NaOH變性，用含1.5M NaCl的Tris-HCl、pH8.0中和，在用Stratalinker(Stratagene)交聯(lián)裝置進(jìn)行紫外交聯(lián)前用2×SSPE洗滌。將膜在預(yù)雜交緩沖液(5×SSPE、4×Denhardts、0.8％SDS、30％甲醛)中50℃攪拌溫育2小時。
寡核苷酸探針5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec(分別為SEQ IDNO9、10、11和12)在用含有100-300uCi γP32-dATP和1-3單位的多核苷酸激酶的Boehringer Mannheim激酶緩沖液中于37℃標(biāo)記1-3小時。未整合的標(biāo)記用Sephadex G-25 fine(Pharmacia，Piscataway，NJ)色譜使用10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA(TE)緩沖液移去，流出液直接加入預(yù)雜交溶液。膜用探針在42℃處理16小時并攪拌和反復(fù)洗滌，最后用1×SSPE/0.1％SDS在50℃的嚴(yán)格條件下洗滌15分鐘。印跡隨后在Kodak X-Omat AR膠片上-80℃曝光1-4小時。
寡核苷酸5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec僅與來自用它們作為引物的反應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交，而不能如預(yù)期的那樣與不用它們作為引物的反應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交。因此，結(jié)論是，沒有PCR產(chǎn)物是αTM1特異的，因?yàn)闆]有產(chǎn)物能與所有的適當(dāng)引物雜交。實(shí)施例3犬αTM1的大量親和純化用于內(nèi)部測序?yàn)樘峁┯糜谝镌O(shè)計(jì)的其它氨基酸序列，純化犬αTM1用于內(nèi)部測序。用三份冷凍的脾(每份約50克)和來自成年犬的兩個部分脾的冷凍細(xì)胞來制備內(nèi)部測序的蛋白。50克脾在200-300ml硼酸緩沖液中用Waring攪拌器勻漿。勻漿物質(zhì)用1倍體積含有4％NP-40的緩沖液稀釋，然后將混合物溫和攪拌至少1小時。在2000g離心20分鐘清除所產(chǎn)生的裂解物中的大量殘?jiān)?，然后用Corning(Corning，NY)預(yù)濾器或Corning0.8微濾器過濾，裂解物進(jìn)一步用Corning0.4微濾膜系統(tǒng)過濾使之澄清。
脾裂解物和實(shí)施例2介紹的抗體接合的Affigel10樹脂按150∶1的體積比組合成100ml小份，在4℃旋轉(zhuǎn)溫育過夜。在1000g離心5分鐘移去裂解物，與更多的抗體接合的Affigel 10樹脂混合并按上述溫育過夜。然后將吸附的樹脂小份合并并與50倍體積的D-PBS/0.1％ Tween 20洗滌，然后將樹脂轉(zhuǎn)入50ml Biorad柱。吸附的蛋白用3-5倍體積的0.1M甘氨酸(pH2.5)從樹脂中洗脫；收集約900ul的各級份，并用100ul 1M Tris緩沖液、pH8.0中和，從每個級份中移取15ul，在等體積的含有1/15體積1M二硫蘇糖醇的2XLaemmli樣品緩沖液中煮沸。將這些樣品在8％ Novex(San Diego，CA)聚丙烯酰胺凝膠上電泳。使用Daiichi試劑盒(Enprotech，Natick，MA)按廠商推薦的程序用考馬斯染料或銀染顯色。將含有最大量蛋白的級份混合并真空濃縮。剩余的溶液用還原性Laemmli樣品緩沖液進(jìn)行50％稀釋，并在Tris-甘氨酸/SDS緩沖液中上1.5mm 7％聚丙烯酰胺凝膠。使用Hoefer轉(zhuǎn)移裝置按實(shí)施例2中介紹的程序?qū)⒌鞍讖哪z轉(zhuǎn)移到Immobilon膜上。
從10 PVDF膜上切下對應(yīng)于犬αTM1的蛋白帶，并獲得了47ug的總蛋白，將帶在4ml 50％的甲醇中脫色5分鐘，空氣干燥，并切成1×2mm的小片。將膜小片浸入2ml 95％丙酮，4℃、30分鐘，并不時震蕩，然后空氣干燥。
在對膜結(jié)合的蛋白進(jìn)行蛋白裂解前，將3mg的溴化氰(CNBr)(Pierce，Rockford，IL)溶解于1.25ml 70％的甲酸中。然后將此溶液加入含有PVDF膜小片的試管中，在暗處室溫溫育24小時。然后將上清(S1)移入另一個試管，用0.25ml 70％的甲酸洗滌膜小片。將此上清(S2)移出，加進(jìn)前面的上清(S1)中。在混合的上清(S1和S2)中加入2毫升Milli Q水，然后將溶液凍干。將PVDF膜小片在氮?dú)庵懈稍铮?.25ml 60％的乙腈、0.1％四氟乙酸(TFA)在42℃再抽提17小時。將上清(S3)移出，膜小片用1.0ml 80％的乙腈、0.08％的TFA在42℃再抽提1小時。將此上清與前面的上清(S1、S2和S3)混合，真空干燥。
然后將干燥的CNBr片段溶解于63ul8M尿素、0.4M NH4HCO3。將片段在5ul 45mM二硫蘇糖醇(DTT)中還原，并接著在50℃溫育15分鐘。然后將溶液冷卻至室溫，并加入5ul 100mM碘乙酰胺(Sigma，St Louis，MO)將片段堿裂解。在室溫溫育15分鐘后，樣品用187ul Milli Q水稀釋至尿素終濃度為2.0 。然后按酶與蛋白1∶25(w∶w)的比例加入胰蛋白酶(Worthington，F(xiàn)reehold，NJ)，蛋白在37℃消化24小時。加入30ul TFA終止消化。
然后在Waters 625 LC系統(tǒng)(Millipore，Milford，MA)上用高效液相色譜(HPLC)將蛋白片段分開，使用在0.05％TFA和HPLC水(緩沖液A)平衡的2.1×250mm 5micron Vydac C-18柱(Vydac，Hesperia，MA)。肽用0.04％TFA中濃度不斷增加的80％乙腈(緩沖液B)進(jìn)行洗脫，38-75％梯度的緩沖液B洗脫65-95分鐘，75-98％的緩沖液B洗脫95-105分鐘。肽以0.2ml/分鐘的流速分級，并在210nm檢測。
分級之后，肽的氨基酸序列用自動Edman降解法進(jìn)行分析。序列分析在Applied Biosystems Model 437A蛋白測序儀上使用廠商的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)進(jìn)行，并使用Model 610A Data Analysis軟件程序版本1.2.1。所有的測序試劑由Applied Biosystems提供。8個內(nèi)部片段中7個的氨基酸序列列于下面，其中“X”表示氨基酸不確定。VFQEXGAGFGQ(SEQ ID NO15)LYDXVAATGLXQPI (SEQ ID NO16)PLEYXDVIPQAE (SEQ ID NO17)FQEGFSXVLX (SEQ ID NO18)TSPTFIXMSQENVD (SEQ ID NO19)LVVGAPLEVVAVXQTGR (SEQ ID NO20)LDXKPXDTA (SEQ ID NO21)引物設(shè)計(jì)將一個獲得的內(nèi)部氨基酸序列(列于SEQ ID NO22)隨后用于設(shè)計(jì)一個完全簡并的寡核苷酸引物，將其命名為p4(R)，列于SEQ IDNO23。FGEQFSE(SEQ ID NO22)5’-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3’ (SEQ ID NO23)實(shí)施例4一個犬αTM1片段的PCR克隆犬αTM1基因的5’部分用PCR從雙鏈的犬脾cDNA中擴(kuò)增。制備雙鏈的犬脾cDNA將1克來自幼犬脾的冷凍物質(zhì)浸入干冰上的液氮中，在20mlRNA-Stat 60緩沖液(Tel-Test B Inc，F(xiàn)riendswood，TX)中勻漿。加入4ml氯仿，溶液在12,000g離心15分鐘進(jìn)行抽提。RNA用10ml乙醇從水相中沉淀。然后在Dynal Oligo dT Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)上選擇Poly A+RNA。將5小份的100ug總RNA合并并用等體積的2X結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl、pH7.5、1.0M LiCl、1mMEDTA、0.1％SDS)稀釋。然后將RNA與Oligo dT Dynabeads(所有的樣品用1.0ml或5mg珠)一起溫育5分鐘。按照廠商推薦的程序，在用2mM EDTA、pH7.5洗脫P(yáng)oly A+mRNA前，用含有10mMTris-HCl、pH7.5、0.15M LiCl、1mM EDTA和0.1％SDS的緩沖液洗滌珠。然后使用洗脫的Poly A+mRNA和Boehringer Mannheim cDNASynthesis Kit，按照廠商推薦的程序，制備雙鏈的cDNA。部分犬αTM1cDNA的分離在一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)中使用寡核苷酸引物5’Deg(SEQ ID NO9)和p4(R)(SEQ ID NO23)，使用150ng雙鏈cDNA、500ng每種引物、200uM dNTPs、和1.5單位的Taq聚合酶(BoehringerMannheim)，在含鎂的Taq緩沖液(Boehringer Mannheim)中進(jìn)行。將獲得的產(chǎn)物(初次反應(yīng)的1ul)加入用同樣引物的第二輪反應(yīng)中以增加產(chǎn)物數(shù)量。將此條帶從1％瓊脂糖凝膠中洗脫，在65℃于10mMTris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、1.5mM NaCl的緩沖液中轉(zhuǎn)至Schleicher& Schuell(Keene，NH)NA45紙上。并使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)按照廠商推薦的程序，連接到pCRtmII載體(Invirtogen，San Diego，CA)中。連接混合物電轉(zhuǎn)化至XL-1 Blue細(xì)菌(Stratagene)中。一個克隆2.7被確定含有對應(yīng)于αTM1肽序列的序列，該序列在引物設(shè)計(jì)中沒有使用。
測序用Applied Biosystems 373A DNA測序儀(Foster City，CA)、使用雙脫氧終止循環(huán)測序試劑盒(ABI)進(jìn)行，在該試劑盒中，熒光標(biāo)記的dNTPs按如下方法在一個不對稱的PCR反應(yīng)摻入(McCabe，“用不對稱PCR制備單鏈DNA”，《PCR方法方法和應(yīng)用指南》，Innis等(編輯)76-83頁，Academic PressNew York(1990))。樣品在96℃放置4分鐘，然后進(jìn)行下列步驟的25個循環(huán)96℃，15秒、50℃，1秒、60℃，4分鐘。包括圖形和文本文件的測序數(shù)據(jù)自動下載到計(jì)算機(jī)上的樣品文件中。克隆2.7的整個插入子的序列列于SEQID NO24。
設(shè)法從Stratagene文庫(如實(shí)施例2介紹)分離全長的犬αTM1cDNA沒有成功。以克隆2.7作為探針、使用30％甲醛的低嚴(yán)格條件的雜交，對約1×106噬菌斑進(jìn)行篩選，沒有獲得陽性克隆。使用來自克隆2.7的特異性寡核苷酸或與基于保守的α亞單位基元GFFKR的簡并寡核苷酸(Tamura等，上文)匹配的基于其他肽片段的氨基酸序列的簡并引物，設(shè)法擴(kuò)增克隆2.7中顯示的序列的相關(guān)下游序列，也沒有成功。實(shí)施例5推定的犬αTM1的人同源物的克隆為設(shè)法分離與犬αTM1同源的人序列，使用來自克隆2.7的約1kb犬αTM1片段作為探針。探針在實(shí)施例2介紹的條件下使用NT2(列于SEQ ID NO25)和p4(R)(SEQ ID NO23)引物，用PCR進(jìn)行制備。5’-GTNTTYCARGARGAYGG-3’(SEQ ID NO25)PCR產(chǎn)物用Qiagen(Chatsworth，GA)Quick Spin試劑盒按廠商推薦的程序進(jìn)行純化。純化的DNA(200ng)用Boehinger Mannheim隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒按廠商推薦的程序，用200 uCi α32P dCTP進(jìn)行標(biāo)記。未摻入的同位素用Sephadex G25(fine)gravity色譜去除。探針在使用前用0.2N NaOH變性，并用0.4M Tris-HCl、pH8.0中和。
制備pCDNA/Amp(Invitrogen San Diego，CA)中的人脾cDNA文庫的Hybond濾紙(Amersham)上菌落提呈物。濾紙先按實(shí)施例2介紹的方法變性和中和，接著在含有30％甲醛的預(yù)雜交液(8ml/濾紙)中在50℃溫育2小時，并溫和攪拌。將如上介紹的標(biāo)記探針加入此溶液中，并與濾紙一起在42℃溫育14小時。濾紙?jiān)? X SSC/0.1％SDS中在37℃洗滌兩次，在2 X SSC/0.1％SDS中在50℃洗滌兩次。最后的嚴(yán)格洗滌是在65℃、1 X SSC/0.1％SDS中洗滌兩次(1 X SSC是150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉、pH7.0)，濾紙用增感屏在Kodak X-OmatAR膠片上曝光6小時。將在復(fù)制提呈物上有信號的菌落在含鎂的LB培養(yǎng)基(LBM)/羧芐青霉素平板上劃線，并在37℃溫育過夜。所獲得的劃線菌落用Hybond濾紙?zhí)岢剩⑦@些濾紙按上述方法進(jìn)行處理。濾紙?jiān)诟鼑?yán)格的條件下與按上述方法標(biāo)記的、來自克隆2.7的1kb探針在50％的甲酰胺雜交溶液中在50℃雜交3小時。探針處理的濾紙用0.1 X SSC/0.1％SDS、65℃的最終嚴(yán)格條件進(jìn)行洗滌，并用增感屏在-80℃在Kodak X-Omat AR膠片上曝光2.5小時。鑒定陽性克隆，并在LBM/羧芐青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。使用Promega Wizardminiprep kit按照廠商推薦的程序由培養(yǎng)物制備DNA，并對所獲得的DNA進(jìn)行測序。
初步篩選獲得了18個克隆，而在更嚴(yán)格的雜交條件下的第二輪篩選產(chǎn)生了一個陽性克隆，將其命名為19A2。人αd克隆19A2的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別列于SEQ ID NO1和2。人αdcDNA和預(yù)測的多肽的特征克隆19A2包含成熟蛋白的全部編碼區(qū)域，加上48個堿基(16個氨基酸殘基)的5’上游信號序列和241個堿基的3’非翻譯序列，該序列不以聚腺苷酸化的序列終止。成熟蛋白的核心分子量預(yù)計(jì)為125kD左右。其胞外結(jié)構(gòu)域預(yù)計(jì)大約包含SEQ ID NO2的17至1108氨基酸殘基。該胞外結(jié)構(gòu)域緊接著一段與人CD11c跨膜區(qū)域同源的約20個氨基酸區(qū)域(SEQ ID NO2的殘基1109-1128)。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域含有約30個氨基酸(大約SEQ ID NO2的殘基1129至1161)。該蛋白還含有一個與CD11a、CD11b和CD11c(Larson和Springer，上文)、αE(Shaw等，《生物化學(xué)雜志》269卷，6016-6025頁(1994))和VLA-1和VLA-2(Tamura等，上文)中共同的I(插入子)結(jié)構(gòu)域同源的約202個氨基酸的區(qū)域(殘基150至352左右)。其他整合素中的I結(jié)構(gòu)域已經(jīng)證明參與ICAM結(jié)合(Landis等，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》120卷，1519-1527頁(1993)；Diamond等，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》120卷，1031-1043頁(1993))，這說明αd也可以與表面分子的ICAM家族的成員結(jié)合。該區(qū)域還沒有證明存在于其他整合素亞單位。
αd的推導(dǎo)的氨基酸序列顯示與CD11a、CD11b和CD11c的序列分別約有36％、60％和66％的同源性。圖1顯示了CD11b(SEQ ID NO3)、CD11c(SEQ ID NO4)和αd(SEQ ID NO2)的氨基酸序列排列比較。
β2整合素α亞單位的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通常在同一物種中也各不相同，但個別α亞單位在物種間也顯示高度的同源性。與這些發(fā)現(xiàn)一致，αd的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域明顯地與CD11a、CD11b和CD11c不同，除了已經(jīng)證明在所有的α整合素中保守的膜親和GFFKR氨基酸序列之外(Rojiani等，《生物化學(xué)》30卷，9859-9866頁(1991))。因?yàn)檎纤氐募?xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域涉及“內(nèi)外”信號傳導(dǎo)和親和性調(diào)節(jié)(Lands等，上文)，因此αd可能與和CD11a、CD11b和CD11c相互作用的不同細(xì)胞質(zhì)分子相互作用，因而參與與其他β2整合素不同的信號途徑。
αd的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有保守的與I結(jié)構(gòu)域鄰接的保守DGSGS氨基酸序列，在CD11b中DGSGS序列是配體相互作用所必需的金屬結(jié)合區(qū)域(Michishita等《細(xì)胞》72卷，857-867頁(1993))。CD11b和CD11c的三個額外的推測陽離子結(jié)合位點(diǎn)在αd序列中是保守的，在克隆19A2(SEQ ID NO1)中為氨基酸465-474、518-527和592-600。其αdI結(jié)構(gòu)域與CD11a、CD11b和CD11c的相應(yīng)區(qū)域的同源性分別為36％、62％和57％。這個區(qū)域的低序列同源性表明，αd可能與一套與其他已知的β2整合素相互作用的蛋白不同的細(xì)胞外蛋白相互作用。另外，αd對其他已知β2整合素配體如ICAM-1、ICAM-2和/或ICAM-R的親和性，可能與其他β2整合素/ICAM相互作用中證明的親和性不同(見實(shí)施例12)。分離另外的人αdcDNA克隆用于序列證明為證明編碼人αd的DNA序列，用雜交的方法從一個pcDNA/Amp中的人脾Oligo dt-primed cDNA文庫(Invitrogen)(實(shí)施例5中介紹)中分離另外的人cDNA。該文庫是通過選擇瓊脂糖凝膠電泳上長度大于3kb的cDNA構(gòu)建的。雜交所用的探針來自下面介紹的αd的5’區(qū)域。雜交條件與上述初步分離人αd克隆的條件相同。只有下面的雜交后處理有所不同，濾紙?jiān)? X SSC/0.1％SDS中在室溫洗滌兩次，在2X SSC/0.1％SDS在42℃洗滌一次。濾紙用Kodak X-Omat AR膠片曝光過夜。
5’αd雜交探針用PCR從19A2克隆中制備，PCR使用引物CD11c 5’For(SEQ ID NO94)和CD11c 5’Rev(SEQ ID NO95)在下面的條件下進(jìn)行。樣品在94℃放置4分鐘，然后進(jìn)行下列步驟的30個循環(huán)i)94℃，15秒；ii)50℃，30秒、iii)72℃，1分鐘。使用Perkin-Elmer9600熱循環(huán)儀。CD11c 5’For(5’)CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3’) (SEQ ID NO94)CD11c 5’Rev(5’)CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3’) (SEQ ID NO95)擴(kuò)增產(chǎn)物使用BioRad(Hercules，CA)Prep-A-Gene kit按照廠商推薦的程序進(jìn)行純化。所獲得的5’αd探針為約720堿基長，對應(yīng)于SEQ ID NO1的1121-1839核苷酸區(qū)域。純化的DNA(約50ng)用Boehinger Mannheim(Indianapolis，Indiana)隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒按廠商推薦的程序，用32PdCTP進(jìn)行標(biāo)記。未摻入的同位素用Centrisep自旋柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)按照廠商推薦的程序去除。將標(biāo)記的探針加至含有45％甲酰胺的預(yù)雜交溶液中的濾紙中，在50℃溫育反應(yīng)過夜。溫育后，濾紙按上面的介紹進(jìn)行洗滌。
13個克隆在復(fù)制提呈物上有信號。將陽性克隆從母板上挑出，在LBM和羧芐青霉素(100ug/ml)稀釋，按不同的稀釋度鋪于Hybond(Amersham)濾紙。復(fù)制膜用與初次雜交相同的溶液進(jìn)行雜交，在雜交后，濾紙用2 X SSC/0.1％SDS、42℃的最終嚴(yán)格條件進(jìn)行洗滌，并在膠片上曝光。
初次鑒定的13個陽性克隆有10個在第二輪篩選中被證實(shí)。在這10個克隆中，2個克隆(命名為A7.Q和A8.Q)被測序，并確定其編碼人αd。克隆A7.Q被發(fā)現(xiàn)長約2.5kb，包括5’前導(dǎo)序列、部分編碼區(qū)域和額外的60個堿基的5’非翻譯區(qū)。該不完全的編碼區(qū)被確定是相當(dāng)于SEQ ID NO1的2152核苷酸的內(nèi)含子區(qū)域錯誤剪接的結(jié)果。A8.Q被確定長約4kb，跨越整個αd編碼區(qū)，還含有相當(dāng)于SEQ ID NO1的305堿基的內(nèi)含子區(qū)域。與首次分離的αd克隆(SEQ ID NO1)比較，有一個差異被發(fā)現(xiàn)，即A7.Q和A8.Q均被確定在堿基1495處有一個三堿基CAG密碼子插入?？寺7.Q和A8.Q的序列分別列于SEQ IDNO96和97，由克隆A7.Q和A8.Q編輯的人序列以及相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列分別列于SEQ ID NO98和99。實(shí)施例6組織中人αd表達(dá)的Northern分析為測定αd相對表達(dá)水平和組織特異性，使用來自克隆19A2的片段作為探針進(jìn)行Northern分析。將來自各人組織或培養(yǎng)細(xì)胞系的約10ug總RNA在存在1ug溴化乙啶的情況下上甲醛瓊脂糖凝膠。在100V電泳4小時后，將RNA轉(zhuǎn)移到在10 X SSC中浸泡過夜的硝酸纖維膜(Schleicher & Schuell)上。將膜在真空中80℃烘烤1.5小時。用含有50％甲酰胺的3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)的預(yù)雜交溶液在42℃封閉膜3小時?？寺?9A2的片段使用Boehringer Mannheim隨機(jī)引物試劑盒按照廠商的指示，用αP32dCTP和αP32dTTP兩者進(jìn)行標(biāo)記。未摻入的標(biāo)記在TE緩沖液中用Sephadex G25柱移去。膜按1.5×106/ml預(yù)雜交緩沖液的量用探針進(jìn)行處理。然后將印跡在室溫用2 XSSC/0.1％SDS、在42℃用2 X SSC/0.1％SDS、在50℃用2 XSSC/0.1％SDS、在50℃用1 X SSC/0.1％SDS、在50℃用0.5 XSSC/0.1％SDS、在50℃用0.1 X SSC/0.1％SDS連續(xù)洗滌。然后將印跡用膠片曝光19小時。
使用來自克隆19A2的一個BstXI片段(相當(dāng)于SEQ ID NO1中2011至3388核苷酸)的雜交揭示出在肝、胎盤、胸腺和扁桃體總RNA中在約5kb范圍內(nèi)有弱信號；在腎、腦或心臟樣品中沒有發(fā)現(xiàn)信號。如用溴化乙啶染色測定的，腎樣品帶中存在的RNA量最少。
在使用克隆19A2的第二個片段(包含SEQ ID NO1的堿基500至2100區(qū)域)時，在使用polyA+RNA(Clontech)的人多組織Northern(MTN)印跡中檢測到兩種不同大小的RNA轉(zhuǎn)錄物。在脾和骨骼肌中觀察到約6.5kb的條帶，在肺和外周血白細(xì)胞中觀察到4.5kb的條帶。觀察到的大小上的變化可能是下列原因造成的組織特異性的腺苷酸化、探針與其他整合素家族成員的交叉反應(yīng)或與可變剪接的mRNA雜交。
使用來自克隆19A2的第三個片段(跨越SEQ ID NO1中的2000至3100核苷酸)進(jìn)行的Northern分析與用其他克隆19A2片段的結(jié)果一致。
來自三種骨髓譜系細(xì)胞系的RNA也用相當(dāng)于SEQ ID NO1的核苷酸500至2100和2000至3100的片段作為探針進(jìn)行了分析。預(yù)先用PMA刺激的THP-1細(xì)胞在同樣的大小范圍給出了擴(kuò)散的信號(約5.0kb)，強(qiáng)度略大于組織信號。來自未刺激和DMSO刺激的HL-60細(xì)胞的RNA與αd探針雜交給出與組織樣品相同強(qiáng)度的信號。但是，PMA似乎提高了信號強(qiáng)度。因?yàn)镻MA和DMSO分別驅(qū)使HL-60細(xì)胞向單核/巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞途徑分化。該結(jié)果提示，在單核/巨噬細(xì)胞類型中αd的表達(dá)增強(qiáng)。U937細(xì)胞表達(dá)αd信息，但此信號不因?yàn)镻MA刺激而增加。在Molt、Daudi、H9、JY或Jurkat細(xì)胞中沒有檢測到條帶。實(shí)施例7小鼠水和食物。
幽門螺桿菌攻擊在第一次口服免疫后四星期，利用幽門螺桿菌攻擊來自B-H組的小鼠。在攻擊前4小時使小鼠在沒有固體食物和沒有水的情況下過夜。利用不銹鋼導(dǎo)管給小鼠口服100微升3％碳酸氫鈉，接著口服5.0×109CFU/毫升劑量的幽門螺桿菌。在攻擊后，恢復(fù)小鼠的水和食物。
從小鼠收集血液和組織在第一次免疫后12個星期，使小鼠沒有食物過夜，隨后處死以便分析保護(hù)性和免疫應(yīng)答。在頸錯位處死之前，利用甲氧熒烷麻醉小鼠用于心臟末端取血。在無菌條件下，小心取出每個小鼠的脾和胃，分別置于冰上的無菌容器中直到進(jìn)一步加工。獲取大小腸，以便進(jìn)一步分離腸液。
加工胃和測量脲酶活性通過組織中活性脲酶的存在測量小鼠胃中幽門螺桿菌的定居程度。根據(jù)供應(yīng)商的說明利用Jatrox測試(Rohm-PharmaGmbH，Weiterstadt，德國)。暴露胃粘膜并利用PBS洗滌，將一半胃竇部分立即置于含有底物的Eppendorf管內(nèi)以便測量脲酶活性。在將試管室溫溫育4小時后測量550納米的吸光值。剩余的胃組織儲藏在-20℃以便進(jìn)一步處理。從天然小鼠的胃獲得的脲酶活性值用于建立基線以表明沒有幽門螺桿菌感染和因此的保護(hù)，天然小鼠沒有經(jīng)過免疫或攻擊。表1表達(dá)鼠傷寒沙門氏菌疫苗菌株的UreA和UreB
反應(yīng)中加入適當(dāng)數(shù)量的用EcoRI和XbaI消化的載體pcDNA.3(Invitrogen)及另外1單位的連接酶。繼續(xù)反應(yīng)14小時。然后用十分之一的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化XL-1 Blue感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)所獲得的克隆，并按實(shí)施例5分離DNA。用EcoRI消化來鑒定三個該酶切位點(diǎn)陽性即加工信號序列陽性的克隆。將其命名為pATM.B1(CD11b/αd，來自引物ER1B)、pATM.C10(CD11c/αd，來自引物ER1C)和pATM.D2(腺苷酸/αd，來自引物ER1d)。每個克隆中適當(dāng)信號序列的存在用核酸測序來證實(shí)。
上面討論的αd質(zhì)粒的表達(dá)用每種質(zhì)粒與一個CD18表達(dá)質(zhì)粒--pRC.CD18共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞來進(jìn)行。作為陽性對照，COS細(xì)胞也用質(zhì)粒pRC.CD18和一個CD11a表達(dá)質(zhì)粒--pDC.CD11A共轉(zhuǎn)染。
在轉(zhuǎn)染16小時前，將細(xì)胞加入培養(yǎng)基(DMEM/10％FBS/penstrep)，按50％匯合裝入10cm的Corning tissue culture-treated培養(yǎng)皿中。對以下所有的方法，用不含胰蛋白酶的Versene緩沖液(含0.5mMNaEDTA的PBS)從皿中取出細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，板用無血清的DMEM洗滌一次。在每個板中將15微克的每種質(zhì)粒加入5ml轉(zhuǎn)染緩沖液中(含有20ug/ml DEAE-Dextran和0.5mM氯喹的DMEM)，在37℃溫育1.5小時后，細(xì)胞用5ml DMEM/10％DMSO休克1分鐘。然后用培養(yǎng)基按10ml/每板取代該DMSO溶液。
所獲得的轉(zhuǎn)染子按實(shí)施例8、9和10介紹的方法用ELISA、FACS和免疫沉淀進(jìn)行分析。實(shí)施例8COS轉(zhuǎn)染子的ELISA分析為確定CD18表達(dá)質(zhì)粒pRC.CD18和αd表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞是否在其細(xì)胞表面表達(dá)與CD18結(jié)合的αd，使用針對CD18產(chǎn)生的第一抗體(例如由ATCC HB203純化的TS1/18)進(jìn)行PCR。作為陽性對照，也對共轉(zhuǎn)染了CD18表達(dá)質(zhì)粒和一種CD11a表達(dá)質(zhì)粒--pDC.CD11A的細(xì)胞進(jìn)行ELISA。在此對照中，第一抗體包括CD18抗體和抗CD11a抗體(例如，由ATCC HB202純化的TS1/18)。
為進(jìn)行ELISA，來自每個板的細(xì)胞用Versene緩沖液移出，并轉(zhuǎn)入一個單獨(dú)的96孔平底的Corning組織培養(yǎng)板。在試驗(yàn)前將細(xì)胞在培養(yǎng)基中溫育2天。然后將板按150ul/孔用D-PBS/0.5％硬骨魚皮膚明膠(Sigma)溶液洗滌兩次。除顯色過程外，此緩沖液用于所有的步驟。所有的洗滌和溫育均在室溫進(jìn)行?？子妹髂z溶液封閉1小時，第一抗體用明膠溶液稀釋至10ug/ml，然后在每孔中加入50ul。每一第一抗體做三個重復(fù)的孔。溫育1小時后，板按150ul/孔用明膠溶液洗滌3次。1∶3500稀釋的二抗(羊抗鼠Ig/HRP-Fc特異性(Jackson，West Grove，PA))按50ul/孔加入板中，并溫育1小時。洗滌三次后，板用100ul/孔的鄰苯二胺(OPD)(Sigma)溶液(檸檬酸緩沖液中的1mg/ml OPD)顯色20分鐘，然后加入50ul/孔的15％硫酸。
在ELISA程序中用抗CD18特異性抗體對轉(zhuǎn)染子進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，在僅用編碼CD18的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中相對于背景沒有明顯的表達(dá)。用含有CD11a和CD18的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在用CD18特異的抗體或用CD11a特異的試劑分析時，顯示比背景高的表達(dá)。進(jìn)一步對編碼CD18和一種αd表達(dá)結(jié)構(gòu)(pATM.C10或pATM.D12)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行分析表明，CD18的表達(dá)被αd同時表達(dá)所恢復(fù)。在轉(zhuǎn)染了pATM.C10或pATM.D12的COS細(xì)胞中，檢測到的CD18表達(dá)的提高可與在共轉(zhuǎn)染CD11a/CD18陽性對照細(xì)胞中觀察到的提高相比。實(shí)施例9COS轉(zhuǎn)染子的FACS分析為進(jìn)行FACS分析，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染的第二天用新鮮的培養(yǎng)基飼養(yǎng)，并在進(jìn)行試驗(yàn)前溫育2天。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用3ml Versene從板中移取，用5ml FACS緩沖液(DMEM/2％FBS/0.2％疊氮化鈉)洗滌一次，并用稀釋至500,000細(xì)胞/0.1mlFACS緩沖液樣品。在每個樣品中加入10微升1mg/ml FITC接合的CD18、CD11a或CD11b特異的抗體(Becton Dickinson)或800ug/ml的CFSE接合的鼠23F2G(抗-CD18)(ATCC HB11081)。然后將樣品在冰上溫育45分鐘，用FACS緩沖液按每次5ml洗滌3次。并重新懸浮于0.2ml FACS緩沖液中。然后將樣品上Becton Dickinson FACscan，并用Lysys II軟件(BectonDickinson)分析數(shù)據(jù)。
轉(zhuǎn)染了CD18序列的COS細(xì)胞僅不被CD18、CD11a或CD11b染色。用CD11a/CD18共轉(zhuǎn)染時，大約15％的細(xì)胞被針對CD11a或CD18的抗體染色。所有轉(zhuǎn)染了CD18和任何一種αd結(jié)構(gòu)物的細(xì)胞不會產(chǎn)生對CD11a和CD11b可以檢測到的染色。pATM.B1、pATM.C10和pATM.D12組能對CD18分別染出4％、13％和8％的陽性。CD11a/CD18組中的陽性群體的熒光比背景高四倍。與其相比，用αd結(jié)構(gòu)物和CD18結(jié)構(gòu)物共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的群體顯示比背景增加4-7倍的熒光強(qiáng)度。實(shí)施例10共轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的人αd/CD18復(fù)合物的生物素標(biāo)記的免疫沉淀設(shè)法對共轉(zhuǎn)染了CD18和每種實(shí)施例7中分別介紹的αd表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀，來確定αd是否能作為整合素特征性的αβ異源二聚體復(fù)合物的部分來分離。
轉(zhuǎn)染細(xì)胞(1-3×108細(xì)胞/組)用Versene緩沖液從培養(yǎng)皿中移取，在50ml/組D-PBS中洗滌3次。每個樣品用2mg的Sulpho-NHS生物素(Pierce，Rockford，IL)在室溫標(biāo)記15分鐘。反應(yīng)用在50ml/樣品的冷D-PBS中洗滌3次進(jìn)行淬滅。洗滌的細(xì)胞重新懸浮于1ml裂解緩沖液(1％NP40、50mM Tris-HCl、pH8.0、0.2M NaCl、2mM Ca++、2mM Mg++和蛋白酶抑制劑)中，并在冰上溫育15分鐘。在100,000離心5分鐘使不溶性物質(zhì)沉淀，將上清移入一個新管。為去除與鼠免疫球蛋白非特異性反應(yīng)的物質(zhì)，先進(jìn)行一個預(yù)清除步驟。將25微克的鼠免疫球蛋白(Cappel，West chester，PA)與上清在4℃溫育。2.5小時后，在每個樣品中加入100ul(25ug)的兔抗鼠Ig接合的Sepharose(由蛋白A Sepharose 4B和兔抗鼠IgG制備，均來自Zymed，San Francisco，CA)，繼續(xù)在4℃旋轉(zhuǎn)溫育16小時。離心從上清中移出Sepharose珠。預(yù)清除后，隨后將上清用20ug抗CD18抗體(TS1.18)在4℃處理2小時。通過與100ul/樣品的上面介紹的兔抗鼠/蛋白A-Sepharose制備物一起溫育來從上清中分離抗體/抗原復(fù)合物。珠用10mM HEPES、0.2M NaCl和1％Triton-X 100洗滌4次。將洗滌的珠沉淀，并在20ul含2％巰基乙醇的2 X Laemmli樣品緩沖液中煮沸10分鐘。將樣品離心，并上8％預(yù)先倒好的Novex聚丙烯酰胺凝膠(Novex)，用100V電泳30分鐘。蛋白在TBS-T緩沖液中在200mAmps轉(zhuǎn)移1小時，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上(Schleicher &Schuell)。膜用1∶6000稀釋的鏈親和素辣根過氧化物酶(BOD)(Boehringer Mannheim)處理1小時，接著在TBS-T中洗滌3次。然后用Amersham增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒根據(jù)廠商的指示顯示印跡。然后將膜在Hyperfilm MP(Amersham)上曝光0.5至2分鐘。
來自用pRC.CD18與pATM.B1、pATM.C10或pATM.D12轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的CD18復(fù)合物的免疫沉淀顯示了一種異源二聚體的表面表達(dá)，該異源二聚體含有約100kD的、與預(yù)測的CD18的大小一致的β鏈和對應(yīng)于αd的、約150kD的α鏈。實(shí)施例11人αd在中國倉鼠卵巢細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染為確定αd是否與CD18結(jié)合成異源二聚體表達(dá)于細(xì)胞表面，編碼每條鏈的cDNA都瞬時和穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到缺乏αd和CD18兩者的細(xì)胞系中。
為進(jìn)行這些試驗(yàn)，將αdcDNA用如實(shí)施例7介紹的額外的前導(dǎo)序列和一個Kozak共有序列擴(kuò)增，并亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3中。最后的結(jié)構(gòu)命名為pATM.D12，將其與一個修飾的編碼人CD18的商業(yè)載體--pDC1.CD18共轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶(DHFR)-的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。質(zhì)粒pDC1.CD18編碼一個DHFR+標(biāo)記，轉(zhuǎn)染子可用適當(dāng)?shù)暮塑账崛狈Φ呐囵B(yǎng)基進(jìn)行選擇，產(chǎn)生pDC1.CD18的修飾如下質(zhì)粒pRC/CMV(Invitrogen)是一個帶有巨細(xì)胞病毒啟動子和氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因的哺乳動物表達(dá)載體。將來自質(zhì)粒pSC1190-DHFR的DHFR基因插入到pRC/CMV SV40復(fù)制起始位點(diǎn)的5’端。此外，將來自質(zhì)粒pHF2G-DHF的5’區(qū)域的多接頭連接到pRC/CMV/DHFR結(jié)構(gòu)物中DHFR基因的3’端。接著將CD18編碼序列克隆到產(chǎn)生的質(zhì)粒的5’側(cè)翼多接頭區(qū)域和牛生長激素poly A編碼區(qū)域之間。
CD18的表面表達(dá)使用單克隆抗體TS1/18用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在此細(xì)胞系中檢測到的αd和CD18之間的異源二聚體的形成與實(shí)施例10中用COS細(xì)胞中的瞬時表達(dá)所做的免疫沉淀一致。實(shí)施例12人αd以CD18依賴的方式與ICAM-R結(jié)合借鑒證明能介導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞接觸的白細(xì)胞整合素與細(xì)胞間黏附分子(ICAMs)的相互作用的報(bào)道(Hynes，《細(xì)胞》69卷，11-25頁(1992))，CHO細(xì)胞表達(dá)的αd/CD18與ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1結(jié)合的能力用兩種方法進(jìn)行評價。
在同樣的試驗(yàn)中，將可溶性的ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1 IgG1融合蛋白固化在塑料上，并測定αd/CD18 CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞與固化的配體結(jié)合的能力。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用calcein內(nèi)部標(biāo)記，用結(jié)合緩沖液(含1％BSA的RPMI)洗滌，并僅在緩沖液(含有或不含10ng/ml的PMA)或含有10ug/ml的抗CD18單克隆抗體的緩沖液中溫育。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入用可溶性的ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白預(yù)先包被的96孔Immulon 4微滴定板中，或以牛血清白蛋白包被作為陰性對照。這些黏附分子的可溶性形式的設(shè)計(jì)已在共同提交和共同擁有的1993年8月5日提交的系列號為No.08/102,852的美國專利申請中介紹和充分公開。在加入標(biāo)記的細(xì)胞前，孔用含1％BSA的PBS封閉。將板浸入含0.1％BSA的PBS中20分鐘進(jìn)行洗滌后，使用Cytofluor2300(Millipore，Milford，MA)測量每孔中剩余的總熒光。
在使用固化的ICAMs的試驗(yàn)中，αd/CD18共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞都顯示比BSA包被的孔增加3-5倍的與ICAM-R/IgG1孔的結(jié)合。這種結(jié)合的特異性和CD18依賴性用抗CD18抗體TS1/18的抑制作用進(jìn)行證明。CD11a/CD18轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與ICAM-1/IgG1孔的結(jié)合與觀察到的其與BSA包被的孔的結(jié)合相當(dāng)，CD11a/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞僅在用PMA預(yù)先處理后才顯示與ICAM-1/IgG1孔的結(jié)合有2-3倍的提高，αd/CD18轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用PMA處理不影響其與ICAM-1/IgG1孔的結(jié)合。沒有檢測到αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞與VCAM-1/IgG1孔的結(jié)合。αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞與可溶性的ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白的結(jié)合用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。在每個測量中，將約1百萬αd/CD18轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(生長于搖瓶中進(jìn)行高表達(dá))懸浮于含有或不含10ug/ml抗CD18抗體的100ul結(jié)合緩沖液(RPMI和1％BSA)中。在室溫溫育20分鐘后，細(xì)胞在結(jié)合緩沖液中洗滌，并加入ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1融合蛋白至終濃度5ug/ml。結(jié)合在37℃進(jìn)行30分鐘，然后將細(xì)胞洗滌3次，并重新懸浮于100ul含1∶100稀釋的FITC接合的羊抗人IgG1的結(jié)合緩沖液。溫育30分鐘后，將樣品洗滌3次，并懸浮于200ul結(jié)合緩沖液，用Becton DickinsonFACScan進(jìn)行分析。約40-50％的αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示與ICAM-R/IgG1結(jié)合，但不與ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1蛋白結(jié)合。用PMA預(yù)先處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞不影響其與ICAM-1/IgG1、ICAM-1/IgG1或VCAM-1/IgG1的結(jié)合，這與固化黏附試驗(yàn)一致。與ICAM-R的結(jié)合在用抗CD18抗體TS1/18處理αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞后降低到背景水平。
由這些雙結(jié)合試驗(yàn)收集的數(shù)據(jù)說明，αd/CD18與ICAM-R結(jié)合，并且與ICAM-1和VCAM-1的結(jié)合相比更優(yōu)先。αd/CD18與ICAM-R的結(jié)合比與ICAM-1的結(jié)合更優(yōu)先，與用CD11a/CD18和CD11b/CD18觀察到的結(jié)果相反。因此，αd/CD18結(jié)合的修飾有希望選擇性地影響ICAM-R起主要作用的正常和病理的免疫功能。而且，在檢測針對ICAM-R的不同胞外結(jié)構(gòu)域的免疫特異性抗體抑制ICAM-R與αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合的能力的相似試驗(yàn)中，結(jié)果表明，αd/CD18和CD11a/CD18與ICAM-R的不同結(jié)構(gòu)域相互作用。
CD11a/CD18不能與溶液中的ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1結(jié)合說明，CD11a/CD18與ICAM1或ICAM-R之間的結(jié)合親和性太低，不能在溶液中結(jié)合。而檢測到αd/CD18與ICAM-R/IgG1的結(jié)合則表明非常高的結(jié)合親和性。
在上述介紹的試驗(yàn)中，VCAM-1/Ig融合蛋白含有7個細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。融合蛋白在轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中制備，蛋白產(chǎn)量用ELISA測定。來自CHO細(xì)胞上清的7結(jié)構(gòu)域VCAM-1融合蛋白不經(jīng)純化直接使用，蛋白產(chǎn)量被發(fā)現(xiàn)極低。由于VCAM-1制備物中的低蛋白產(chǎn)量，使用一種商業(yè)化的VCAM-1制備物(R & Systems，Minneapolis，MN)來重新檢測αd/CD18與VCAM-1的結(jié)合，以確定是否是低濃度的VCAM-1導(dǎo)致了沒有檢測到αd的結(jié)合。
與前面一樣，CHO細(xì)胞表達(dá)的αd和CD18用于采用固化的重組黏附分子的黏附試驗(yàn)中。使用流式細(xì)胞儀，結(jié)果顯示，αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞表達(dá)αd和CD18兩者，并且不表達(dá)其他β2整合素。同時還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞不表達(dá)兩種已知的VCAM-1結(jié)合的配體蛋白--α4β1和α4β7。親本CHO細(xì)胞系顯示不表達(dá)α4或β2整合素。結(jié)合試驗(yàn)基本上按上面的介紹進(jìn)行。
結(jié)果表明，αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞與固化的VCAM-1以約14.2％的比例結(jié)合，與之比較，其與固化的BSA以7.5％的比例結(jié)合，與固化的E-選擇素以2.8％的比例結(jié)合。此外，在存在針對VCAM-1的第一個結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體時，與固化VCAM-1的結(jié)合基本上被阻斷(3.0％結(jié)合)。親本CHO細(xì)胞不與VCAM-1、E-選擇素或BSA結(jié)合(結(jié)合比例均低與2％)。轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的結(jié)合經(jīng)過細(xì)胞的系列傳代后也會降低，這與經(jīng)過同一時間后觀察到的αd表面表達(dá)降低相一致。
為確定自然表達(dá)αd/CD18的細(xì)胞是否以VCAM-1作為結(jié)合伙伴，分離外周血的嗜酸性粒細(xì)胞，在存在10ng/ml IL-5的條件下培養(yǎng)5-7天以提高αd的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測顯示，IL-5使αd的表達(dá)提高2-4倍，但對α4的表達(dá)沒有作用。
結(jié)果表明，培養(yǎng)的嗜酸性粒細(xì)胞與固化的VCAM-1以28.8％的比例結(jié)合，并且結(jié)合被一種抗CD18單克隆抗體(結(jié)合率為17.1％)和一種針對α4的單克隆抗體(結(jié)合率為18.1％)部分抑制。與前面用低水平和/或不純的VCAM-1的初步結(jié)果相反，這些數(shù)據(jù)表明αdβ2是VCAM-1的一種配體。
上面介紹的FACS黏附試驗(yàn)被用來檢測一種ICAM-R突變體E37A/Ig與表達(dá)αd/CD18的CHO細(xì)胞的結(jié)合。E37A/Ig已經(jīng)顯示排除了與LFA-1/Ig嵌合體結(jié)合(Sadhu等《細(xì)胞黏附與通信》2卷，429-440頁(1994))。來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞系的突變蛋白以可溶性形式表達(dá)，并按Sadhu等，上文的介紹，用ProsepA柱純化。
在重復(fù)的試驗(yàn)中，沒有檢測到E37A/Ig與αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合。用FITC接合的抗人抗體檢測到的E37A/Ig嵌合體的平均熒光強(qiáng)度(MFI)與單獨(dú)的檢測抗體的MFI相同，這說明，在試驗(yàn)中使用E37A/Ig沒有檢測到比背景高的信號。與此類似，在按實(shí)施例14的介紹進(jìn)行的ELISA中，E37A/Ig突變體沒有表現(xiàn)出與固化的αd/CD18接合。αd與iC3b接合補(bǔ)體成分C3可以被蛋白酶切割形成復(fù)合物iC3b，iC3b啟動補(bǔ)體激活的替代途徑，最終導(dǎo)致靶的細(xì)胞介導(dǎo)的破壞。CD11b和CD11c都參與iC3b結(jié)合，并參與隨后的iC3b包被的顆粒的巨噬細(xì)胞吞噬。CD11b I結(jié)構(gòu)域中的一個肽片段最近已經(jīng)證實(shí)是iC3b相互作用的位點(diǎn)(Ueda等，《美國科學(xué)院院報(bào)》91卷，10680-10684(1994))。iC3b的結(jié)合區(qū)域在CD11b、CD11c和αd高度保守，這提示了一種αd/iC3b結(jié)合相互作用。
αd與iC3b的結(jié)合用轉(zhuǎn)染細(xì)胞或自然表達(dá)αd的細(xì)胞系(例如，PMA刺激的HL60細(xì)胞)與iC3b包被的綿羊紅細(xì)胞(sRBC)在一個玫瑰花環(huán)試驗(yàn)中進(jìn)行。(Dana等《臨床研究雜志》73卷，153-159(1984))。αd/CD18 CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞、VLA4-CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞(陰性對照)和PMA刺激的HL60細(xì)胞(陽性對照)在存在和沒有抗CD18單克隆抗體(例如TS1/18.1)的情況下形成玫瑰花環(huán)的能力進(jìn)行了比較。實(shí)施例13使用閃爍親近試驗(yàn)篩選來鑒定αd結(jié)合的調(diào)節(jié)物本發(fā)明的αd配體與其結(jié)合伙伴(αd配體/抗αd配體對)之間的結(jié)合的特異性抑制物，可以用多種方法來確定，例如主要介紹于美國專利No.4,271,139、Hart和Greenwald，《分子免疫學(xué)》，12卷，265-267頁(1979)和Hart和Greenwald，《核酸醫(yī)學(xué)雜志》20卷，1062-1065頁(1979))的閃爍親近試驗(yàn)技術(shù)。上述文獻(xiàn)均在此引為參考。
簡而言之，將αd配體/抗αd配體對的一個成員直接或間接結(jié)合在一個固相支持物上。間接俘獲涉及一種直接與支持物結(jié)合的單克隆抗體，該抗體能識別可溶性的整合素β鏈蛋白的C末端的一個特異性表位。該表位可以是血凝素蛋白或分枝桿菌III9表位(Anderson等，《免疫學(xué)雜志》141卷，607-613(1988)。一種熒光試劑也與支持物結(jié)合。另外，熒光試劑可按美國專利No.4,568,649的介紹整合到支持物中，該專利在此引為參考。αd配體/抗αd配體對的非支持物結(jié)合成員用放射性化合物標(biāo)記，該放射性化合物發(fā)射能激發(fā)熒光試劑的射線。當(dāng)配體與放射性標(biāo)記的抗配體結(jié)合時，標(biāo)記物與支持物結(jié)合的熒光試劑足夠接近，激發(fā)熒光試劑，并產(chǎn)生光發(fā)射。當(dāng)沒有結(jié)合時，標(biāo)記物一般與固相支持物太遠(yuǎn)而不能激發(fā)熒光試劑，光發(fā)射很弱。測量發(fā)射的光，該發(fā)射光與配體和抗體配體的結(jié)合相關(guān)。在樣品中加入結(jié)合抑制物將減少熒光發(fā)射，因?yàn)橐种莆镒柚狗派湫詷?biāo)記被固相支持物俘獲到近處。因此，結(jié)合抑制物可以通過它們對樣品中的熒光發(fā)射的影響來進(jìn)行鑒定。潛在的αd的抗配體也可以用相似的方法進(jìn)行鑒定。
按如下方法使用可溶性的重組αd/CD18亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(見實(shí)施例14)在閃爍親近試驗(yàn)中篩選CAM結(jié)合的調(diào)節(jié)物。將重組整合素用預(yù)先包被在一個閃爍劑包埋板上的非阻斷性抗α亞單位或抗β亞單位抗體固化。在板中同時加入化學(xué)文庫化合物和一種特異性的生物素標(biāo)記的CAM/Ig嵌合體。CAM/Ig嵌合體的結(jié)合用標(biāo)記的鏈親和素進(jìn)行檢測。在此試驗(yàn)中，ICAM-1/Ig和ICAM-R/Ig用NHS-Sulfo-生物素LC(長鏈，Pierce)按照廠商推薦的程序進(jìn)行生物素標(biāo)記。標(biāo)記蛋白在ELISA反應(yīng)中，在用鏈親和素-HRP并接著用OPD顯色進(jìn)行檢測時，仍能與CAM特異性抗體反應(yīng)，并能顯示與固化的LFA-1反應(yīng)。
另外，將重組亮氨酸拉鏈蛋白純化或部分純化，直接包被在閃爍包埋板上。同時加入未標(biāo)記的CAM/Ig嵌合體和化學(xué)文庫化合物。結(jié)合的CAM/Ig用125I標(biāo)記的抗人Ig進(jìn)行檢測。
另一種選擇是，將純化的CAM/Ig蛋白固化在閃爍板上。在板中加入化學(xué)文庫化合物和表達(dá)重組亮氨酸拉鏈整合素的細(xì)胞的濃縮上清。重組整合素的結(jié)合用一種標(biāo)記的、非阻斷性抗α亞單位或抗β亞單位抗體進(jìn)行檢測。篩選小分子的調(diào)節(jié)物作為閃爍親近試驗(yàn)的一種替代，相同的αd結(jié)合伙伴和抑制劑可以用下面介紹的ELISA樣試驗(yàn)來鑒定。
可溶性的αd/CD18亮氨酸拉鏈(LZ)結(jié)構(gòu)(見實(shí)施例14)用抗αd抗體212D(見實(shí)施例15)從組織培養(yǎng)上清中俘獲。212D抗體用碳酸氫鹽包被緩沖液(pH9.5)在4℃過夜固定于96孔ImmulonIV板(Costar)。同樣的方法也用于固化抗CD11a抗體TS2/4.1，用來固化一種LFA-1亮氨酸拉鏈(LFA-1LZ)融合蛋白，LFA-1在試驗(yàn)VCAM-1結(jié)合時用作陰性對照，在試驗(yàn)ICAM-1結(jié)合時用作陽性對照。板用300ul/孔的3％牛血清白蛋白封閉1小時，并用D-PBS洗滌。按100ul/孔加入表達(dá)αd/CD18LZ或LFA-1LZ的穩(wěn)定CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組織培養(yǎng)上清，并在4℃溫育6-8小時。板用含Tween20的Tris緩沖鹽溶液(TBS-T)洗滌兩次，接著用含有2mM的每種氯化鈣、氯化鎂和氯化錳的TBS(不含Tween)洗滌一次。后者在剩下的試驗(yàn)中用作試驗(yàn)和洗滌緩沖液。
在俘獲整合素后，板用250ul/孔的TBS洗滌三次。將純化的CAM/Ig(見實(shí)施例12)從起始濃度10至20ug/ml經(jīng)過系列的2∶3稀釋后加入每孔中。與CAM/Igs在室溫結(jié)合2小時后，板按前述方法進(jìn)行洗滌。結(jié)合的融合蛋白用辣根過氧化物酶接合的羊抗人Ig抗體(Jackson Labs)進(jìn)行檢測，并接著用鄰苯二胺(OPD)進(jìn)行顯色。
結(jié)果顯示，ICAM-1/Ig與LFA-1LZ接合時，信號增加5至7倍，但不與αd/CD18LZ接合。相反，VCAM-1/Ig在含有αd/CD18LZ的孔中顯示比背景高5倍的信號。一種ICAM-R突變體E37A/Ig(見實(shí)施例12)不與兩種整合素接合。
檢測了αd特異性單克隆抗體212D、217L、217I、217H、217G、217K和217M抑制VCAM-1與固化的αd/CD18接合的能力。此外，使用抗VCAM-1單克隆抗體130K、130P和IG11B1(Caltag)來確定反應(yīng)的特異性?？功羋單克隆抗體的使用濃度為5ug/ml，抗VCAM-1抗體的使用濃度是25ug/ml，考慮到本試驗(yàn)系統(tǒng)中的VCAM-1處于溶液中，因此使用較高的抗VCAM-1抗體濃度。
在用217I或130K與130P一起處理的孔中產(chǎn)生了部分阻斷(50％)。130K/130P的組合還完全抑制了VLA-4與VCAM-1的相互反應(yīng)，這說明αd和VLA-4與VCAM-1的不同位點(diǎn)結(jié)合，并有可能發(fā)展選擇性地干預(yù)αd/VCAM-1結(jié)合的拮抗劑。
本試驗(yàn)可按如下所述來進(jìn)行高通量的篩選試驗(yàn)，篩選αd結(jié)合的抑制物。將VCAM-1/Ig生物素化并按上述方法在存在預(yù)先溶于DMSO中的混合化合物時進(jìn)行使用，然后用一種鏈親和素-銪(Eu)復(fù)合物檢測結(jié)合的VCAM-1/Ig。鏈親和素-Eu復(fù)合物螯合后被激活，產(chǎn)生可以測量的光發(fā)射。光發(fā)射的改變，或更具體的說降低，就表明VCAM-1/αd結(jié)合的抑制，這很可能是小分子混合物中的一種或多種化合物作用的結(jié)果，然后就可以對它們進(jìn)行單獨(dú)分析或分成小的組別進(jìn)行分析。實(shí)施例14可溶性人αd表達(dá)結(jié)構(gòu)全長、可溶的人αd/CD18異源二聚體蛋白的表達(dá)能方便地為免疫和結(jié)合試驗(yàn)提供純化的材料。制備可溶性蛋白的優(yōu)勢在于其能夠從上清中而不是從細(xì)胞裂解物中純化(如用全長的膜結(jié)合αd/CD18)，此時，收率提高且雜質(zhì)減少。
可溶性αd表達(dá)質(zhì)粒按如下進(jìn)行構(gòu)建?？寺≡谫|(zhì)粒pATM.D12中的、相當(dāng)于SEQ ID NO1中的0-3161堿基區(qū)域的核苷酸片段，用HindIII和AatII消化的方法進(jìn)行分離。使用分別列于SEQ ID NO30和SEQ IDNO31的引物sHAD.5和sHAD.3從質(zhì)粒pATM.D12擴(kuò)增了一個相當(dāng)于SEQ ID NO1的堿基3130-3390的、與HindIII/AatII片段重疊并在3’末端含有一個額外的MluI限制位點(diǎn)的PCR片段。5’-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3’ (SEQ ID NO30 )5’-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3’(SEQ ID NO31)PCR產(chǎn)物用AatII和MluI消化，并與HindIII/AatII片段連接。所獲得的產(chǎn)物連接到HindIII/MluI消化的質(zhì)粒pDC1.s中。
將該結(jié)構(gòu)與CD18在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中共表達(dá)，表達(dá)用來自35S-甲硫氨酸標(biāo)記的細(xì)胞中免疫沉淀的CD18復(fù)合物的放射性自顯影來檢測。同時還將該結(jié)構(gòu)與CD18在293細(xì)胞中共表達(dá)(Berman等，《細(xì)胞生物化學(xué)雜質(zhì)》，52卷，183-195頁(1993))?？扇苄匀Lαd結(jié)構(gòu)本發(fā)明還包括其他的αd表達(dá)結(jié)構(gòu)，為便于表達(dá)和純化一種完整的αd/CD18異源二聚體，可溶性αd和CD18表達(dá)質(zhì)粒被構(gòu)建為包括一種“亮氨酸拉鏈”融合序列，該序列使異源二聚體在純化過程中穩(wěn)定(Chang等《美國科學(xué)院院報(bào)》91卷，11408-11412(1994))。簡而言之，編碼拉鏈的酸性和堿性氨基酸鏈的DNA用Chang等介紹的寡核苷酸進(jìn)行引物退火來制備。該DNA序列被進(jìn)一步修飾來分別在5’和3’末端包括額外的MluI和XbaI限制位點(diǎn)，使該DNA序列便于亞克隆到前面所述的αd或CD18表達(dá)結(jié)構(gòu)中。此外，在XbaI位點(diǎn)后面加入代表血凝素蛋白或一個聚組氨酸序列的序列以及一個終止密碼子。整合血凝素或聚組氨酸是為了便于表達(dá)蛋白的純化。編碼拉鏈的堿性鏈的序列整合到表達(dá)CD18的質(zhì)粒載體上，酸性鏈插入到αd鏈結(jié)構(gòu)上。修飾的αd和CD18蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)時，推測拉鏈結(jié)構(gòu)的酸性鏈和堿性鏈之間的相互作用將使異源二聚體穩(wěn)定，并使完整的αd/CD18分子能夠用上面介紹的親和純化進(jìn)行分離。
構(gòu)建帶有酸性和堿性“亮氨酸拉鏈”序列的表達(dá)可溶性的αd和CD18的質(zhì)粒，按照實(shí)施例7介紹的DEAE/Dextran方法轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。所獲得的蛋白被稱為“αd/CD18LZ”。血凝素和聚組氨酸標(biāo)記沒有整合到αd/CD18LZ中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在還原血清(2％)條件下生長14天。用實(shí)施例8介紹的ELISA方法每隔5天從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中收集上清檢測蛋白的產(chǎn)生。簡而言之，將αd/CD18LZ固化在用抗αd單克隆抗體169B(見實(shí)施例15)包被的板上。加入生物素化抗CD18單克隆抗體TS1/18.1(見實(shí)施例8)，接著加入鏈親和素/辣根過氧化物酶(HRP)接合物和鄰苯二胺(OPD)，檢測αd/CD18LZ復(fù)合物。上清中的蛋白可清楚地檢出。使用可溶性全長αd表達(dá)產(chǎn)物的接合試驗(yàn)使用上面介紹的可溶性全長αd/CD18LZ異源二聚體的功能性結(jié)合試驗(yàn)通過將異源二聚體固化在單克隆抗體169B或一種非阻斷性抗CD18單克隆抗體(見實(shí)施例15)包被的板上來進(jìn)行?？自诩尤肫鹗紳舛葹?0ug/ml的CAM/Ig嵌合體前(見實(shí)施例12)用魚皮明膠封閉以防止非特異性結(jié)合。嵌合體與αd/CD18的結(jié)合用羊抗人Ig HRP接合物(Jackson Labs)進(jìn)行檢測，并接著用OPD顯色。
VCAM-1/Ig被觀察到與俘獲的αd/CD18LZ的結(jié)合比與俘獲的CD11a/CD18高3-5倍。ICAM-1/Ig和ICAM-2/Ig與可溶性的CD11a/CD18異源二聚體的結(jié)合比背景分別高大約15和10倍，但不與αd/CD18結(jié)合。VCAM-1的結(jié)合在存在VCAM-1特異性抗體130K和130P聯(lián)用時減低大約50％。
使用固化在96孔板上的ICAM/Ig蛋白并隨后加入細(xì)胞上清中的重組可溶性整合素也進(jìn)行了結(jié)合試驗(yàn)。可溶性整合素的結(jié)合用非標(biāo)記的非阻斷性α和β亞單位特異的鼠抗體，接著與HRP接合的羊抗鼠抗體溫育，并用OPD顯色，進(jìn)行檢測。
結(jié)果顯示，非阻斷性抗體檢測到的αd/CD18LZ與ICAM-R/Ig的結(jié)合，比在不含抗體的對照孔中檢測到的結(jié)合，高10倍。沒有檢測到可溶性αd/CD18與固化的ICAM-1/Ig的結(jié)合，但在αd/CD18與固化的CD11b/CD18和CD11a/CD18之間觀察到的結(jié)合，分別比背景結(jié)合高15和5倍。
因?yàn)橐郧暗难芯恳呀?jīng)證明，CD11b和CD11c與脂多糖(LPS)結(jié)合(Wright，《Curr.Opin.Immunol.》3卷，83-90頁(1991)，Ingalls和Golenbock，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》181卷，1473-1479頁(1995))，LPS與αd/CD18的結(jié)合也用流式細(xì)胞儀和板基試驗(yàn)進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，從明尼蘇達(dá)沙門氏菌和傷寒沙門氏菌分離的FITC標(biāo)記的LPS(均獲自Sigma)在20ug/ml時能夠微弱地與αd/CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞結(jié)合。在未轉(zhuǎn)染的對照CHO細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)合。在ELISA型試驗(yàn)中，生物素化的LPS(Luk等，《Alan.Biochem》232卷，217-224頁(1995))在0.5-3.0ug時結(jié)合所獲得的αd/CD18LZ信號比單獨(dú)的俘獲抗體和阻斷試劑高4倍。LPS與CD11a/CD18的表觀結(jié)合在排除了每個試驗(yàn)背景與抗CD11a抗體TS2/4結(jié)合后降低。
為鑒定αd/CD18的其他配體，在一個兩層次研究中使用了重組αd/CD18LZ蛋白。不同細(xì)胞類型與固化蛋白的結(jié)合用來確定何種細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)αd配體。然后用抗體抑制來確定所觀察到的細(xì)胞結(jié)合是否是已知的表面黏附分子引起的。如果沒有抑制結(jié)果，使用αd/CD18LZ與來自能與αd結(jié)合的細(xì)胞的裂解物蛋白的免疫共沉淀來設(shè)法鑒定配體?？扇苄匀甩羋I結(jié)構(gòu)域表達(dá)結(jié)構(gòu)已經(jīng)有報(bào)道CD11a中的I結(jié)構(gòu)域能作為一個獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行表達(dá)，并能保持其配體結(jié)合能力和抗體識別特性(Randi和Hogg《生物化學(xué)雜志》269卷，12395-12398(1994)，Zhout等，《生物化學(xué)雜志》269卷，17075-17079(1994)，Michishita等《細(xì)胞》72卷，857-867頁(1993))。為制備一種包含αdI結(jié)構(gòu)域和人IgG4的可溶性融合蛋白，用PCR擴(kuò)增αdI結(jié)構(gòu)域，使用設(shè)計(jì)在兩翼添加BamHI和XhoI限制位點(diǎn)以便于亞克隆的引物。引物列于SEQ ID NO32和33，并在酶切位點(diǎn)下劃線。5’-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3’(SEQ ID NO32)5’-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3’(SEQ ID NO33)SEQ ID NO32中緊接著BamHI位點(diǎn)3’端的C核苷酸相當(dāng)于SEQ ID NO1的435核苷酸，SEQ IN NO33中緊接著XhoI位點(diǎn)3’端的G核苷酸互補(bǔ)于SEQ ID NO1中的1067核苷酸。擴(kuò)增的I結(jié)構(gòu)域用適當(dāng)?shù)拿赶瑢⒓兓钠芜B接到哺乳動物表達(dá)載體pDCs和原核表達(dá)載體pGEX-4T-3(Pharmacia)，并對I結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行測序。然后用合適的表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的COS、CHO或大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。
已知αd對ICAM-R具有親和性，αdI結(jié)構(gòu)域的表達(dá)可能具有足夠的親和性來用作αd參與的細(xì)胞黏附的抑制劑。人αdI結(jié)構(gòu)域/IgG4融合蛋白的分析蛋白質(zhì)用在還原和非還原條件下SDS-PAGE進(jìn)行分析，并用銀染或考馬斯染色進(jìn)行顯示。然后將蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon PVDF膜上，并用抗人IgG單克隆抗體或抗牛Ig單克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析。
檢測到的蛋白被測定在非還原條件下以約120kD遷移，在還原條件下以45kD遷移。在非還原條件下還檢測到弱帶，它能夠與抗人抗體反應(yīng)但不與抗牛抗體反應(yīng)。一個200kD的弱帶被Western印跡確定為牛Ig。使用I結(jié)構(gòu)域表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合試驗(yàn)在一個ELISA試驗(yàn)中檢測了I結(jié)構(gòu)域特異性識別ICAM-R/IgG嵌合蛋白的能力。在TBS中系列稀釋的αdI結(jié)構(gòu)域IgG4融合蛋白(Iαd/IgG4)與固化于Immulon IV RIA/EIA板的ICAM-1/IgG、ICAM-R/IgG、VCAM-1/IgG或一種無關(guān)的IgG1骨髓瘤蛋白一起溫育。CD11aI結(jié)構(gòu)域/IgG嵌合蛋白和人IgG4/κ骨髓瘤蛋白用作陰性對照。結(jié)合的IgG4用生物素化的抗IgG4單克隆抗體HP6023，并接著加入鏈親和素-辣根過氧化物酶接合物，用底物鄰苯二胺顯色，進(jìn)行檢測。
在重復(fù)的試驗(yàn)中，用任何一種固化蛋白沒有檢測到CD11a/IgG4蛋白或IgG4骨髓瘤蛋白的結(jié)合。Iαd/CIgG4蛋白不與魚皮明膠或牛血清白蛋白封閉試劑、人IgG1或ICAM-1/IgG結(jié)合。使用1-5ug/ml濃度的Iαd/IgG4蛋白在ICAM-R/IgG蛋白包被的孔中檢測到了比背景高2-3倍的結(jié)合信號。VCAM-1/IgG蛋白包被的孔中的信號比背景高7-10倍。在前面的試驗(yàn)中，αd/CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞不能結(jié)合VCAM-1/IgG蛋白，這表明VCAM-1結(jié)合可能是分離的I結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的特征。另外的αdI結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)另外的αdI結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)用與前面的結(jié)構(gòu)相同的方式制備，但圍繞αdI結(jié)構(gòu)域整合更多的氨基酸。具體結(jié)構(gòu)包括i)來自外顯子5(SEQID NO2的127-353氨基酸)，在當(dāng)前結(jié)構(gòu)的前面；ii)在I結(jié)構(gòu)域之后的EF手性重復(fù)(SEQ ID NO2的17-603氨基酸)；iii)在轉(zhuǎn)膜區(qū)域截短的α鏈(SEQ ID NO2的17-1029氨基酸)，帶有一個用于純化和檢測的IgG4尾巴。將這些結(jié)構(gòu)連接到哺乳動物表達(dá)載體pDCS1或原核表達(dá)載體pGEX-4T-3(Pharmacia)中，并對I結(jié)構(gòu)域測序。然后在用適當(dāng)表達(dá)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的COS、CHO或大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白。蛋白用ProSepA(Bioprocessing Limited，Durham，England)柱進(jìn)行純化，并用抗IgG4單克隆抗體HP6023檢測反應(yīng)性，在聚丙烯酰胺凝膠上用考馬斯染色進(jìn)行顯示。
為構(gòu)建用于表達(dá)完整的αd多肽的表達(dá)質(zhì)粒，按下面的方法對上文介紹的pATM.D12進(jìn)行修飾來表達(dá)一種αd-IgG4融合蛋白。編碼IgG4的DNA用PCR的方法從載體pDCS1中分離，使用分別整合了5’AatII限制位點(diǎn)(SEQ ID NO89)和3’XbaI限制位點(diǎn)(SEQ ID NO90)的引物。5’-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3’(SEQ ID NO89)5’-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3’ (SEQ ID NO90)質(zhì)粒pATM.D12用AatII和XbaI消化，并將適當(dāng)消化和純化的IgG4 PCR產(chǎn)物連接到一個線性的載體中。實(shí)施例15制備人αd特異的單克隆抗體1.將來自實(shí)施例7的瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞在Dulbecco’s磷酸緩沖鹽水(D-PBS)中洗滌三次，按5×106細(xì)胞/鼠與50ug/鼠的胞壁酰二肽(Sigma)一起注射到Balb/c小鼠中。小鼠用同一方式間隔2周再注射兩次。小鼠的放血前和免疫血清用實(shí)施例9介紹的方法進(jìn)行篩選，將與表達(dá)αd/CD18的轉(zhuǎn)染細(xì)胞有最高反應(yīng)的小鼠的脾臟融合。然后分別篩選缺乏與CD11a/CD18轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞和篩選與αd表達(dá)質(zhì)粒和CD18共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞反應(yīng)的雜交瘤上清。
用此方法沒有獲得單克隆抗體。
2.另一種制備單克隆抗體的方法是，從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的上清中親和純化可溶性的αdI結(jié)構(gòu)域/IgG4融合蛋白，并按上述方法免疫Balb/c小鼠。建立雜交瘤，并用ELISA篩選能與αdI結(jié)構(gòu)域融合蛋白反應(yīng)的來自這些雜交瘤的上清。然后分析陽性培養(yǎng)物與CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞上表達(dá)的全長αd/CD18復(fù)合物的反應(yīng)性。
小鼠1908接受三次αd/CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的初次免疫和兩次可溶性αd/CD18異源二聚體的加強(qiáng)免疫。最后兩次免疫包括50ug/鼠的αdI結(jié)構(gòu)域/IgG4融合蛋白。融合產(chǎn)生了270個產(chǎn)生IgG的孔。45個孔的上清在ELISA中顯示與Iαd/IgG4融合蛋白的結(jié)合比與人IgG4的結(jié)合至少高7倍。FACS分析確定，沒有上清能與αd/CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞反應(yīng)。
為確定上清是否能在另一種環(huán)境下識別整合素α亞單位，新鮮的冷凍脾切片用45孔中的24孔上清進(jìn)行染色，三個上清被確定為陽性。一個染上了紅髓中的大量細(xì)胞，而另外兩個染上了紅髓及小梁中的分散細(xì)胞。
進(jìn)一步分析了這些上清免疫沉淀來自αd/CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞或PMA刺激的HL60細(xì)胞的生物素化CD18的能力。選擇其上清能識別去污劑裂解物中的蛋白(這種蛋白結(jié)構(gòu)上不局限于以異源二聚體形式表達(dá)的蛋白)的融合孔進(jìn)行進(jìn)一步的亞克隆。能識別去污劑中蛋白的單克隆抗體可能在免疫沉淀來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織和細(xì)胞系的異源二聚體復(fù)合物時更有用。
3.另一種制備單克隆抗體的替代方法是，CD18復(fù)合物用抗CD18單克隆抗體23F2G在預(yù)先清除了CD11a/CD18(使用單克隆抗體TS2/4)和CD11b/CD18(用單克隆抗體Mo-1)后從人脾裂解物中免疫沉淀。5只10-12周齡的Balb/c小鼠用皮下注射的方法用約30ug在福氏完全佐劑中的所獲蛋白在第0天進(jìn)行免疫，接著在第28和第43天按30ug/鼠并用福氏不完全佐劑進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)免疫后10天抽取試驗(yàn)血清。在Western印跡中用1∶500稀釋的每種血清檢測1ug/條免疫原的方法對反應(yīng)性進(jìn)行評價。來自三只小鼠的血清能檢測到約95和150kD的帶，在用1∶50稀釋的免疫前血清處理的條中沒有發(fā)現(xiàn)信號。推測150kD代表一種體內(nèi)糖基化狀態(tài)的αd。此外，所有經(jīng)過免疫的血清都能免疫沉淀來自生物素化αd/CD18CHO細(xì)胞的裂解物的蛋白，這種蛋白在SDS-PAGE上以適當(dāng)?shù)姆肿恿窟w移，并代表異源二聚體。由這些結(jié)果，選擇小鼠#2212，在64天用PBS中的30ug免疫原，使用腹膜內(nèi)注射的方法，進(jìn)一步免疫。在4天后處死小鼠，無菌取出脾臟。
將脾臟在浸沒在補(bǔ)加有2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的無血清RPMI 1640中的兩個顯微鏡載玻片的磨沙端研磨，形成單個細(xì)胞的懸液(RPMI)(Gibco，Canada)。細(xì)胞懸液濾過一個無菌的70篩Nitex細(xì)胞濾過器(Becton，Dickinson，Parsippany，New Jersey)。濾過物在200×g離心5分鐘洗滌2次。所獲得的沉淀重新懸浮于20ml無血清RPMI。從三只Balb/c幼鼠取出的胸腺細(xì)胞也用同樣的方法進(jìn)行制備。
在融合前，將在融合前三天用含10％Fetalclone血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，Utah)的RPMI維持在對數(shù)生長期的NS-1骨髓瘤細(xì)胞，在200×g離心5分鐘進(jìn)行沉淀。用上一段介紹的方法洗滌兩次，并計(jì)數(shù)。將大約2×108脾細(xì)胞與4×107NS-1細(xì)胞混合，將所獲得的混合物用200×g離心沉淀。上清棄去。敲擊試管取出細(xì)胞沉淀，并在1分鐘內(nèi)加入2ml 75mM Hepes(pH8.0、37℃)(BoehringerMannheim)中的50％ PEG1500，并攪動。在接著的7分鐘內(nèi)加入另外14ml無血清RPMI，接著立即加入16ml的RPMI。所獲得的混合物在200×g離心10分鐘，棄去上清。沉淀重新懸浮于200ml含有15％FBS、100mM次黃嘌呤鈉、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25單位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺細(xì)胞/ml的RPMI，并按200ul/孔分于96孔平底組織培養(yǎng)板(Corning，聯(lián)合王國)上。在融合后的第2、4和6天飼喂細(xì)胞，方法是用一只18G針(Becton Dickinson)從每孔中吸出約100ul，并按100ul/孔加入上面介紹的鋪板培養(yǎng)基，但含有10單位/ml的IL-6和不含胸腺細(xì)胞外。
在融合后的第7-10天，用抗體俘獲ELISA對每孔中的上清進(jìn)行篩選，檢測鼠IgG的存在。Immulon 4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)用50ul/孔的1∶5000稀釋于50mM碳酸鈉緩沖液、pH9.6的羊抗鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)在4℃進(jìn)行包被。板用含有0.5％Tween20的PBS(PBST)洗滌三次，并加入來自每個孔的培養(yǎng)上清50ul。在37℃溫育30分鐘后，孔用PBST按上述方法洗滌。然后在每孔中加入50ul的按1∶3500稀釋于PBST的辣根過氧化物酶接合的羊抗鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoRsesearch，WestGrove，Pennsylvania)。板按上述方法進(jìn)行溫育，用PBST洗滌四次，然后加入在100mM檸檬酸、pH4.5中含有1mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.1ul/ml 30％ H2O2的底物。在5分鐘后加入50ul 15％的硫酸終止顏色反應(yīng)。用讀板機(jī)(Dynatech)確定每孔的490nm吸收。
雜交瘤進(jìn)一步用下面的方法進(jìn)行鑒定。來自產(chǎn)生IgG培養(yǎng)物的上清用流式細(xì)胞儀分析其與αd/CD18轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞而不是與JY細(xì)胞(在前面的原位染色試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，一種LFA-1陽性，但其他β2整合素陰性的B細(xì)胞系)的反應(yīng)性。簡而言之，將5×105αd/CD18轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞或αd/CD18-JY細(xì)胞懸浮于50ul含有2％FBS和10mM NaN3(FACS緩沖液)的RPMI中，分別將各細(xì)胞懸液加入96孔圓底板(Corning)中的50ul IgG陽性雜交瘤培養(yǎng)物上清中，在冰上溫育30分鐘后，細(xì)胞用醫(yī)用離心機(jī)沉淀洗滌兩次。將每孔的上清棄去，并將沉淀重新懸浮于200-300ul FACS緩沖液。最后一次洗滌用50ul/孔的1∶100稀釋的在FACS緩沖液中制備的羊抗鼠IgG(H+L)-FITC接合物的F(ab’)2代替。按上述方法溫育后，細(xì)胞用補(bǔ)加了10mM NaN3的Dulbecco’s PBS(D-PBS)洗滌兩次。并最后懸浮于含有1％低聚甲醛的D-PBS。然后將樣品轉(zhuǎn)移到聚丙烯試管中，用Becton DickinsonFACsan分析儀進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(FACs)。
融合產(chǎn)生了四個按兩種標(biāo)準(zhǔn)判斷似乎是陽性的培養(yǎng)物。在大約4天后用擴(kuò)大的上清進(jìn)行第二次重復(fù)篩選時，四個培養(yǎng)物中有三個保持陽性。這三個孔命名為169A、169B、169D，將這三個孔通過在15％FBS、100mM次黃嘌呤鈉、16mM胸腺嘧啶和10單位/ml IL-6的RPMI中兩倍稀釋連續(xù)克隆2至3次?？寺“迳系目自谒奶旌竽繙y計(jì)數(shù)，記錄最少密度孔中的克隆數(shù)。每一克隆的選擇孔在7-10天后用FACS進(jìn)行分析。在兩個培養(yǎng)物169A和169B中發(fā)現(xiàn)活性。在最后一次克隆中，含有單個克隆的陽性孔在含有11％FBS的RPMI中擴(kuò)大。169A和169B克隆上清中的抗體用IsoStrip試劑盒(Boehringer Mannheim)按照廠商指示進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)它們屬于IgG1同種型。
與來自CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞和PMA刺激的HL-60細(xì)胞的αd/CD18復(fù)合物的免疫沉淀被用作特異性的第四輪篩選。雜交瘤169A和169B能沉淀來自CHO細(xì)胞系的適當(dāng)帶以及來自HL-60細(xì)胞的一條單一α鏈類型，這個結(jié)果被SDS-PAGE所確定。雜交瘤169A和169B在1995年5月31日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852進(jìn)行了保藏，其保藏號分別為HB11907和HB11906。
為分析169A和169B更完全的結(jié)合特性，檢測了每種抗體抑制另一種抗體或抗CD18抗體TS1/18.1與可溶性αd/CD18結(jié)合的能力?？扇苄匀L的αd/CD18被96孔板中的每種未標(biāo)記的抗體分別固化，用生物素化抗體來檢測相同或不同非標(biāo)記抗體與蛋白的結(jié)合。使用一種羊抗鼠Ig/HRP接合物并接著加入OPD底物來檢測結(jié)合。結(jié)果顯示，抗體169A能夠阻斷生物素化169A和TS1/18.1的結(jié)合，而抗體169B僅阻斷其自身的結(jié)合。4.選擇另一只小鼠(#2214)，用與小鼠#2212相同的方法進(jìn)行初始免疫，并在70天進(jìn)行融合前的加強(qiáng)免疫，免疫使用PBS中的來自脾裂解物的30ug純化αd。4天后處死小鼠，無菌取出脾臟。陽性細(xì)胞的融合和克隆如上所述進(jìn)行。融合產(chǎn)生了5個抗αd單克隆雜交瘤，命名為170D、170F、170E、170X和170H，使用IsoStrip試劑盒(Boehringer Mannheim)按照廠商指示進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)它們屬于IgG1同種型。
5.選擇另一只小鼠(#2211)，用與小鼠#2212和小鼠#2214相同的方法進(jìn)行初始免疫，在88天用30ug免疫原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在203天用30ug免疫原進(jìn)行融合前的加強(qiáng)免疫。小鼠在4天后處死，按照前述的方法取出脾臟并融合。雜交瘤按照上面段落的詳細(xì)介紹，通過抗體俘獲ELISA和流式細(xì)胞儀篩選雜交瘤上清。
鑒定了15個陽性的雜交瘤，命名為188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R和188T，并用ELISA進(jìn)行分型。簡而言之，Immmulon 4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)按50ul/孔用在50mM碳酸鈉緩沖液、pH9.6按1∶5000稀釋的羊抗鼠IgA、G、M(Organ Teknika)在4℃包被。板用含1％BSA的PBS在37℃封閉30分鐘，用PBS/0.5％Tween20(PBST)洗滌三次，加入50ul的培養(yǎng)物上清(用PBST1∶10稀釋)。如前所述進(jìn)行溫育和洗滌后，加入50ul用含1％正常羊血清的PBST按1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶接合的兔抗鼠IgG1、G2a或G3(Zymed，San Francisco，California)。板按前述進(jìn)行溫育，用PBST洗滌四次，然后加入100ul底物，底物為含有1mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.1ul/ml 30％ H2O2的100mM檸檬酸、pH4.5。在5分鐘后加入50ul 15％的硫酸終止顏色反應(yīng)。用讀板機(jī)(Dynatech)讀A490nm。所有15個抗體被確定為IgG1。
將來自小鼠#2211的剩余脾細(xì)胞在一個冷凍小管中冷凍，并貯存于液氮。將冷凍小管置于37℃水浴箱內(nèi)迅速解凍，并使其以圓周方式移動，直至內(nèi)容物融解。將細(xì)胞轉(zhuǎn)至一個15ml離心管，同時緩慢加入1ml含有11％FBS的預(yù)熱RPMI，加入過程為3至5分鐘。等待5分鐘后，再加入5ml預(yù)熱的RPMI，試管在200×g離心5分鐘，吸出上清。將細(xì)胞重新懸浮于RPMI，按前述方法進(jìn)行融合。按前述方法用抗體俘獲法和流式細(xì)胞儀對雜交瘤上清進(jìn)行篩選。
融合產(chǎn)生了5個克隆，命名為195A、195C、195D、195E和195H。用ELISA程序按前述方法對這些克隆進(jìn)行分型，單克隆抗體195A、195C、195D和195E被確定為IgG1，195H被確定為IgG2a。
6.在制備抗αd單克隆抗體的另一個努力中，小鼠#2213用與小鼠2214、2211和2212同樣的方法進(jìn)行免疫，但在第414天和441天用與瓊脂糖珠接合的30ug人αd/CD18亮氨酸拉鏈(LZ)進(jìn)行進(jìn)一步的免疫。用于小鼠#2213的免疫原通過將人αd/CD18LZ(實(shí)施例14)與抗CD18單克隆抗體和蛋白A瓊脂糖免疫沉淀來制備。沉淀的復(fù)合物按1∶1的比例重懸于PBS成為淤漿。在加強(qiáng)免疫后4天處死小鼠。取出脾臟，按前述方法進(jìn)行融合。
陽性的雜交瘤用ELISA方法進(jìn)行鑒定，使用用非阻斷性抗CD18抗體的F(ab)’2片段固化的人αd/CD18LZ。簡而言之，F(xiàn)(ab)’2片段在4℃按100ng/孔包被于Immulon 4 ELISA板。吸出緩沖液后，孔用0.5％魚皮明膠(Sigma)在37℃封閉30分鐘。在PBST中洗滌三次后，加入50ul/孔來自先前用編碼可溶性αd/CD18LZ的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞的上清。板在37℃溫育30分鐘。重復(fù)洗滌步驟，并加入50ul/孔的雜交瘤上清。單克隆抗體的檢測按前述方法進(jìn)行。陽性細(xì)胞按前述方法用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，使用用αd/CD18LZ編碼DNA轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞，兩個被命名為212A和212D的陽性雜交瘤得到鑒定。雜交瘤分泌的抗體使用前面介紹的分型ELISA分型為IgG1。
7.在另一個制備抗人αd單克隆抗體的方法中。小鼠用按前述方法制備的αd/CD18LZ瓊脂糖珠進(jìn)行免疫，每只小鼠在第0天、36天和66天接受30ug的免疫原。在用前面介紹的重組蛋白ELISA程序?qū)π∈笱暹M(jìn)行篩選后，選擇小鼠#2477進(jìn)行融合。融合、選擇和克隆程序使用上面212融合中介紹的方法進(jìn)行。鑒定了7個陽性雜交瘤---217F、217G、217H、217I、217K、217L和217M，但在最后一輪克隆中雜交瘤喪失了反應(yīng)性，這一點(diǎn)被流式細(xì)胞儀確定。來自剩余6個雜交瘤系的抗體按前述方法進(jìn)行分型，均被發(fā)現(xiàn)為IgG1。
8.在另一個制備αd單克隆抗體的方法中，小鼠#2480用小鼠#2477同樣的方法進(jìn)行免疫，但在第217天和218天用30ug的αd/CD18LZ經(jīng)腹膜內(nèi)注射進(jìn)行進(jìn)一步的免疫。小鼠在第221天處死，取出脾臟，并按前述方法進(jìn)行融合。雜交瘤上清按介紹的ELISA方法進(jìn)行篩選，并用流式細(xì)胞儀確定其與先前用編碼αd/CD18的DNA轉(zhuǎn)染的JY細(xì)胞的反應(yīng)性。篩選過程按上面的介紹進(jìn)行。融合產(chǎn)生了3個陽性的雜交瘤，240F、240G和240H，三種雜交瘤分泌的抗體用ELISA法均分型為IgG1。
9.為鑒定能抑制功能性αd接合的抗體，使用可溶性αd/CD18LZ(見實(shí)施例14)進(jìn)行免疫。蛋白在一種親和層析樹脂上從瞬時轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清中分離，將樹脂結(jié)合的αd用作免疫原。一只被選小鼠按上面介紹的方法進(jìn)行免疫，并在初次免疫后兩周給予最后的加強(qiáng)。用這種技術(shù)免疫可以防止經(jīng)常與細(xì)胞的去污劑裂解相關(guān)的蛋白構(gòu)象的可能改變。另外的小鼠用也與樹脂結(jié)合的重組蛋白進(jìn)行免疫，但不用從細(xì)胞裂解物中純化的蛋白進(jìn)行初次免疫。
按前述方法制備的、由免疫產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞用ELISA在用一種非阻斷性抗體的Fab片段從細(xì)胞上清中固化的重組蛋白上進(jìn)行篩選。此外，使用流式細(xì)胞儀分析其與先前用αdcDNA轉(zhuǎn)染的JY細(xì)胞的反應(yīng)性。
10.另一種選用方法，單克隆抗體按如下進(jìn)行制備。使用來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的去污劑裂解物的親和純化的αd/CD18和50ug/ml胞壁酰二肽按前述方法免疫Balb/c小鼠。通過用CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的生物素化復(fù)合物免疫沉淀確定其對αd/CD18的血清反應(yīng)性之前，小鼠接受三次免疫。陽性動物的雜交瘤按標(biāo)準(zhǔn)程序建立。然后使用αd/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞用流式細(xì)胞儀對雜交瘤培養(yǎng)物進(jìn)行選擇。CD11a/CD18轉(zhuǎn)染細(xì)胞用作僅與CD18反應(yīng)的對照。
11.另一種單克隆抗體制備的選用方法是，Balb/c小鼠接受一種免疫/免疫抑制程序，這種免疫/免疫抑制程序被設(shè)計(jì)來減少與免疫中使用的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上的CHO細(xì)胞決定子的反應(yīng)。該程序包括用未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞進(jìn)行免疫，并接著用環(huán)磷酰胺處理來殺死與CHO細(xì)胞反應(yīng)的B細(xì)胞前體。在經(jīng)過三輪的免疫和環(huán)磷酰胺處理后，小鼠按前述方法用αd/CD18 CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行免疫。
12.另一種選用方法是，按前述的預(yù)清除方法富集來自PMA刺激的HL60細(xì)胞的去污劑裂解物的CD18復(fù)合物。其他的β2整合素在同一柱上被清除。用所獲得的復(fù)合物進(jìn)行免疫、雜交瘤制備和篩選過程均按上文所述方法進(jìn)行。多克隆血清的制備使用純化的αdI結(jié)構(gòu)域/IgG4嵌合體(實(shí)施例14)來在兔中制備多克隆抗血清。用福氏完全佐劑中的αdI結(jié)構(gòu)域/IgG4抗原按100ug/兔進(jìn)行初次免疫，接著用福氏不完全佐劑中的相同數(shù)量的蛋白進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫。在第三和第四次注射后測試待測血液。兔免疫球蛋白(Ig)在一個蛋白A-瓊脂糖柱上從血清中純化，并在一個人IgG/Affigel 10柱上預(yù)清除抗人IgG反應(yīng)性。用在ELISA中與I結(jié)構(gòu)域嵌合體反應(yīng)但不與人IgG反應(yīng)來證明完全的清除。
預(yù)清除的多克隆血清被用來從先前用αd和CD18表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的表面生物素化的CHO細(xì)胞的去污劑裂解物中免疫沉淀蛋白。免疫沉淀按前面實(shí)施例10中介紹的方法進(jìn)行。預(yù)清除的血清識別一種蛋白復(fù)合物，該蛋白復(fù)合物與用抗CD18單克隆抗體TS1.18沉淀的蛋白分子量相同。此外，血清在與來自αd/CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的CD18復(fù)合物進(jìn)行Western印跡時，識別一個適當(dāng)大小的單一條帶。由人脾臟親和純化的整合素CD11a/CD18、CD11b/CD18和VLA4不被兔多克隆血清識別。流式細(xì)胞儀測定發(fā)現(xiàn)，該血清不能與溶液中的αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞反應(yīng)。因此結(jié)論是，兔多克隆血清僅能識別變性的αdI結(jié)構(gòu)域/IgG4蛋白。
在一個制備抗αd/CD18多克隆抗血清的努力中，一只小鼠用αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(D6.CHO，αd/CD18)和輔助肽免疫3次，用純化的αd/CD18異源二聚體免疫一次。最后一次加強(qiáng)免疫僅包括αd/CD18異源二聚體。大約100ul免疫血清通過加入大約108LFA-1轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在4℃預(yù)清除2小時。檢測所獲得的血清在1/5000、1/10000、1/20000和1/40000稀釋時與正常人脾上的αd的反應(yīng)性。多克隆抗體在1/20000的稀釋度時具有反應(yīng)性，而在1/40000時染色非常弱。實(shí)施例16使用抗αd單克隆抗體的流式細(xì)胞儀分析在用抗αd單克隆抗體212D、217K和217L進(jìn)行的研究中使用幾種原代和永生化細(xì)胞系。細(xì)胞染色按實(shí)施例7中介紹的方法進(jìn)行和分析。MAGE-3(黑色素瘤相關(guān)蛋白)肽特異的原代CD8+/CD56-和CD4-/CD8-/CD56+原代細(xì)胞系對CD11b和CD11c顯示強(qiáng)陽性，但不被任何一種αd抗體染色。MAGE-3肽特異細(xì)胞使用荷肽抗原遞呈細(xì)胞(APCs，樹突細(xì)胞或單核細(xì)胞)從外周血單個核細(xì)胞群體中擴(kuò)大。經(jīng)過在限制稀釋條件下重復(fù)刺激結(jié)合表型選擇，產(chǎn)生了能夠特異性地殺傷攜帶肽來源的原始蛋白的靶細(xì)胞的克隆化裂解細(xì)胞系。
來自外周血的樹突細(xì)胞，在存在細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF時培養(yǎng)7天后，能被針對CD11a、CD11b和CD11c的抗體以及217L抗αd抗體強(qiáng)染色。在重復(fù)的試驗(yàn)中，抗體217D、217K、217I、217H和217M不與這些細(xì)胞和來自不同供體的樹突細(xì)胞反應(yīng)。培養(yǎng)的第14天后，217L抗原的表面表達(dá)減弱，染色在第21天完全消失。在培養(yǎng)過程中，CD11b和CD11c的表達(dá)保持在高水平(比背景高2-3個數(shù)量級)。實(shí)施例17人單核細(xì)胞αd的表達(dá)從外周血中純化人單核細(xì)胞從一個志愿供者抽取約300ml血加入3.8％檸檬酸鈉緩沖液中(Sigma)。血液用無內(nèi)毒素的PBS(Sigma)稀釋至480ml，將30ml稀釋的血小心鋪在50ml離心管中的17ml Histopaque上。在BeckmanTabletop離心機(jī)中用1500rpm離心30分鐘進(jìn)行分層。代表單個核細(xì)胞的細(xì)胞層從每層中收集，并轉(zhuǎn)到一個新的50ml管。用無內(nèi)毒素的PBS、0.1％BSA(無內(nèi)毒素)將體積增加至50ml，在Beckman Tabletop離心機(jī)中用1500rpm離心15分鐘。棄去上清，將細(xì)胞重懸于一個小體積的PBS/BSA中，隨后混合。
從按上述方法獲得的細(xì)胞混合群體中純化單核細(xì)胞需要第二次分層(按Percoll(Denholm和Wolber，《免疫學(xué)方法雜志》144卷，247-251頁(1991))。簡而言之，將10ml 10X的Hanks緩沖液(Gibco)與600ul的1N HCL混合。在此混合物中，加入60ml的Percoll(Pharmacia，Piscataway NJ)，將混合物緩慢攪拌使所有的Percoll進(jìn)入溶液。將Percoll溶液的pH調(diào)為7.0，然后將8.0ml的分級混合物加入6個15ml的圓底聚丙烯試管。在每個分級中精確加入4ml細(xì)胞懸液，并將試管顛倒幾次使其充分混合。分級物用一個固定角轉(zhuǎn)頭在室溫下在1690rpm離心25分鐘。單核細(xì)胞級份在分層物中顯示為一層薄的白帶，將其收集并轉(zhuǎn)至一個新的50ml離心管中。用PBS/0.1％BSA將體積調(diào)為50ml，離心沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于小體積中，并混合，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞數(shù)量。將細(xì)胞重懸于FACS緩沖液(RPI 1640，0.2％FBS、0.2％疊氮化鈉)中并調(diào)整為1.0×106/條件，即在每種FACS染色條件下使用1.0×106細(xì)胞，來分析不同的細(xì)胞標(biāo)記。FACS染色和分析單抗體細(xì)胞染色使用對αd或細(xì)胞標(biāo)記具有免疫特異性并與一種可用熒光檢測的標(biāo)記物直接接合的抗體來進(jìn)行。將鼠抗人αd抗體212D或217L按10ug/ml加入細(xì)胞，然后在冰上溫育30分鐘，并洗滌3次。在另外的細(xì)胞樣品中加入10微升直接接合的細(xì)胞標(biāo)記CD3-FITC(Becton-Dickinson)(T細(xì)胞特異)或CD33-FITC(Becton-Dickinson)(單核細(xì)胞特異)，同時將10ul二抗--抗鼠FITC(Sigma)加入到212D和217L染色的細(xì)胞中。所有的樣品在冰上在暗處溫育30分鐘，洗滌3次，重懸于300ul 2％的低聚甲醛中。將樣品上BectonDickinson FACScan，并用LysysII軟件(Becton Dickinson)分析數(shù)據(jù)。
在第一個實(shí)驗(yàn)中，在用雙分級法純化的全體細(xì)胞中，單核細(xì)胞占68％，T細(xì)胞占18％。有相當(dāng)數(shù)量的兩種細(xì)胞類型在212D和217L進(jìn)行αd染色時被染上，分別為細(xì)胞的55％和65％?；诤笠粋€實(shí)驗(yàn)，在對新鮮分離的人單核細(xì)胞進(jìn)行αd染色時，似乎在相對數(shù)量上存在供體與供體之間的差異，雖然分離的單核細(xì)胞總是染色陽性。當(dāng)在細(xì)胞中加入人IgG(在加入第一抗體前以1mg/ml在冰上10分鐘進(jìn)行使用)來阻斷任何可能的Fc受體結(jié)合問題時，αd染色沒有改變。當(dāng)這些細(xì)胞在使用Hydron包被的培養(yǎng)皿(Interferon Sciences)在10％FBS/RPM-1640中懸浮培養(yǎng)并分析αd表達(dá)時，在24小時內(nèi)表面表達(dá)就有喪失，并且該減少過程持續(xù)一個7天的時間過程。相對于其他整合素包括CD11a、CD11b和CD11c在新鮮分離的人單核細(xì)胞上的表達(dá)，αd染色較低。人單核細(xì)胞的αd2色FACS染色為進(jìn)行2-色FACS染色，212D和217L抗體均用NHS-LC-生物素(Pierce)按照廠商的指示進(jìn)行生物素化。在一個單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞按上述方法分離，并用生物素標(biāo)記的212D和217L抗體和一種生物素標(biāo)記的對照IgG1抗體10ug/ml在冰上染色30分鐘。細(xì)胞在FACS緩沖液(修飾為含有D-PBS、2％FBS和0.2％疊氮化鈉)中洗滌三次，并重新懸浮于1.0ml的FACS緩沖液中。將10ul FITC-接合的CD33(單核細(xì)胞特異)和5ul鏈親和素PE(PharMingen)一起加入細(xì)胞懸液中。樣品于暗處在冰上溫育30分鐘，在FACS緩沖液中洗滌三次，重懸于300ul 1％低聚甲醛中。樣品按上述方法進(jìn)行FACS。
在兩種抗體中，217L顯示相比于對照明顯地與CD33+細(xì)胞結(jié)合?？贵w也能與這種細(xì)胞類型結(jié)合，但染色的CD33+細(xì)胞的數(shù)量明顯低于在抗體217L中觀察到的數(shù)量。這個結(jié)果在兩個單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中一致。在使用生物素化的抗體212D和217L的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，217L-生物素總是比212D-生物素染更多的細(xì)胞。
代表淋巴細(xì)胞混合物的單個核細(xì)胞和用Percoll梯度分離前獲得的單核細(xì)胞也用上面介紹的2色分析進(jìn)行了檢測，檢測采用212D和217L-生物素以及FITC接合的對CD3(T細(xì)胞)、CD4(輔助T細(xì)胞)、CD5(胸腺細(xì)胞、成熟T細(xì)胞、B細(xì)胞亞群)、CD8(細(xì)胞毒/抑制T細(xì)胞)、CD14(單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小節(jié)樹突網(wǎng)狀細(xì)胞)、CD20(B細(xì)胞)和CD56(NK細(xì)胞、T細(xì)胞亞群)(Becton Dickinson)免疫特異性的抗體進(jìn)行雙染色。沒有發(fā)現(xiàn)與這些細(xì)胞標(biāo)記共表達(dá)的αd陽性群體。實(shí)施例18αd分布的分析αd/CD18的組織分布用按實(shí)施例15介紹的方法制備的多克隆抗血清進(jìn)行測定。
純化的兔多克隆抗體在對冷凍的人脾切片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析時使用的濃度范圍為120ng/ml到60ug/ml。將6微米厚的切片放置在Superfrost Plus Slides(VWR)上并貯存于-70℃。使用前，將載玻片從-70℃中取出，在55℃放置5分鐘。然后將切片在冰冷的丙酮中固定2分鐘，空氣中干燥。將切片在室溫在含有1％BSA、30％正常人血清和5％正常兔血清的溶液中封閉30分鐘。將第一抗體加入每個切片在室溫處理1小時。未結(jié)合的抗體通過在TBS緩沖液中洗滌載玻片三次去除，每次洗滌5分鐘。接著，將在同一TBS緩沖液中的兔抗鼠IgG連接抗體加入到每個切片中。一種鼠堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APAAP)抗體，在室溫溫育30分鐘，用來檢測二抗。然后將載玻片在TBS緩沖液中洗滌3次。加入Fast Blue底物(Vector Labs)，顯色反應(yīng)通過浸入水中予以終止。載玻片在Nuclear Fast Red(Sigma)中負(fù)染，并在水中漂洗，然后用Aqua Mount(Baxter)計(jì)數(shù)。用這種試劑在脾紅髓中檢測到染色，但用無關(guān)的兔多克隆Ig制備物或來自同一動物的未純化的免疫前血清沒有檢測到染色。
一旦鼠血清被確定具有特異性的αd活性，就用它來對不同的淋巴樣或非淋巴樣組織進(jìn)行染色。識別CD18、CD11a、CD11b和CD11c的單克隆抗體也在同一實(shí)驗(yàn)中用作對照。用αd多克隆抗血清以及針對CD11c、CD11a、CD11b和CD18的單克隆抗體對正常的脾切片的染色得到了下列結(jié)果。用αd多克隆抗血清觀察到的圖譜不顯示以CD11a、CD11b、CD11c或CD18作為標(biāo)記的相同圖譜。發(fā)現(xiàn)了某些位于白髓的邊緣區(qū)的細(xì)胞的清楚標(biāo)記圖譜和邊緣區(qū)外周的細(xì)胞的清楚標(biāo)記。該圖譜用其他抗體沒有觀察到。分散于紅髓的單個細(xì)胞也被標(biāo)記，它們可能是或不是與用CD11a和CD18所見的相同細(xì)胞群體或亞群。
用CD11c標(biāo)記的確顯示了邊緣區(qū)中的一些染色細(xì)胞，但與αd多克隆抗血清相比，抗體并沒有顯示圍繞白髓的清晰環(huán)狀圖譜，在紅髓中的標(biāo)記也沒有給出與αd多克隆血清相同的染色圖譜。
因此，用αd多克隆血清所見的標(biāo)記圖譜與用針對其他β2(CD11a、CD11b、CD11c和CD18)的抗體所見的圖譜相比是獨(dú)特的。這說明，αd在人體內(nèi)的分布不同于其他β2整合素。用單克隆抗體分析人αd表達(dá)的特性使用雜交瘤169A和169B分泌的抗體，用免疫沉淀法分析冷凍組織切片中的人αd表達(dá)，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系和外周血白細(xì)胞中人αd的表達(dá)。在兩組實(shí)驗(yàn)中使用的雜交瘤上清都不稀釋。組織染色所有的染色均按上面的介紹進(jìn)行，除了肝切片按下面的方法進(jìn)行。在丙酮固定后，切片在含1％的H2O2和1％疊氮化鈉的TBS中在室溫冷卻15分鐘。用第一抗體染色后，加入一種直接與過氧化物酶接合的兔抗鼠抗體，在室溫處理30分鐘。載玻片在TBS緩沖液中洗滌3次。用一種與過氧化物酶直接接合的豬抗兔抗體在室溫溫育30分鐘來檢測二抗。然后將載玻片在TBS緩沖液中洗滌三次，加入AEC底物(VectorLabs)，進(jìn)行顯色。載玻片用Hematoxylin Gill’s No.2(Sigma)進(jìn)行負(fù)染，接著在水中漂洗，然后脫水和計(jì)數(shù)。
在脾切片中，大多數(shù)表達(dá)位于脾紅髓中形態(tài)鑒定為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞上。大量的粒細(xì)胞被染色，而巨噬細(xì)胞只有一個亞群產(chǎn)生信號。白髓中的一小部分小節(jié)樹突細(xì)胞也被αd抗體微弱地染色。在整個紅髓和白髓都檢測到CD11a和CD18染色。CD11c染色主要見于脾白髓和圍繞白髓的邊緣區(qū)中的推測為巨噬細(xì)胞的大細(xì)胞，同時還發(fā)現(xiàn)在紅髓中的分散的染色。CD11b與αd染色在紅髓中的分布似乎重疊但不相同，并且沒有白髓參與。
對正常和(類風(fēng)濕)關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的整合素表達(dá)也進(jìn)行了比較。在正常組織中用所有抗整合素抗體(包括能與CD11a、CD11b、CD11c、CD18以及αd特異性免疫反應(yīng)的抗體)發(fā)現(xiàn)了最少的染色，其中靜止細(xì)胞(推測是巨噬細(xì)胞)廣泛分布。在炎癥的滑膜中，所有的整合素的表達(dá)多位于淋巴小管周圍的成束的細(xì)胞。αd和CD11b的表達(dá)圖譜是相似的，CD11c似乎表達(dá)不強(qiáng)，并且限于白細(xì)胞的一個亞群。
在狗中，CD11b而不是αd的表達(dá)見于肝巨噬細(xì)胞或枯否氏細(xì)胞。正常人肝切片的染色(與前面的狗肝切片染色的介紹一樣，上文)證明了在人中這一染色圖譜是保守的。此外，檢測到了低水平的CD11c。在來自一個肝炎病人的切片中，所有白細(xì)胞整合素的染色都高于在正常肝中所觀察到的染色，而在這些樣品中αd的表達(dá)在巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞上被檢測到。
用抗αd抗體在人結(jié)腸切片中觀察到了最少的染色，并觀察到微弱的平滑肌染色和白細(xì)胞染色。在來自Crohn’s病患者的切片中檢測到了高水平的所有白細(xì)胞整合素。
正常的肺顯示了有限數(shù)量的弱αd陽性細(xì)胞，通過形態(tài)它們被確定為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。在一個肺氣腫病人的肺組織中，在中性粒細(xì)胞和含有血鐵黃蛋白(一種含鐵色素)的巨噬細(xì)胞上檢測到了αd染色，這說明紅細(xì)胞被這些細(xì)胞吞噬。
檢測了正常腦切片和來自多發(fā)性硬化(MS)病人的斑損的整合素表達(dá)。在正常腦中，αd染色比CD11a、CD11b和CD11c的強(qiáng)度低，并局限于用形態(tài)學(xué)和CD68染色分型為小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞。CD11b陽性細(xì)胞位于小管周圍，并分布于整個組織。CD11c+細(xì)胞似乎位于小管內(nèi)，而αd+細(xì)胞圍繞小管。在MS組織切片中，αd表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞和非巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞亞群上均被發(fā)現(xiàn)。αd+細(xì)胞位于斑損內(nèi)以及整個皮層。αd信號的強(qiáng)度與CD11c相同，但低于CD11b的強(qiáng)度。
用抗白細(xì)胞整合素和抗CAM抗體對來自PDAY(青年人的動脈粥樣硬化病理生理決定子，LSU醫(yī)學(xué)中心)組織樣品的胸主動脈和腹主動脈切片均進(jìn)行了分析。檢查的病灶與主動脈脂肪性條紋一致，主動脈脂肪性條紋由大的泡沫細(xì)胞(主要是帶有攝入的脂的巨噬細(xì)胞)的內(nèi)膜下集聚和較小的白細(xì)胞浸潤組成。使用αd和其他β2整合素α鏈(CD11a、CD11b和CD11c)加上一個巨噬細(xì)胞標(biāo)記(CD68)特異的單克隆抗體進(jìn)行的單標(biāo)記研究顯示，多數(shù)裝滿脂的巨噬細(xì)胞分別表達(dá)中等水平的αd和CD18，而表達(dá)低水平或比中等水平低的CD11a和CD11c。僅微弱表達(dá)CD11b，且僅由巨噬細(xì)胞的一個亞群表達(dá)。
進(jìn)行雙標(biāo)記研究來確定αd和ICAM-R抗原在主動脈切片中的相對定位。因?yàn)檫@些切片中的泡沫細(xì)胞能被對巨噬細(xì)胞標(biāo)記特異的抗體Ham56染色，而不能被對平滑肌肌動蛋白特異的抗體染色，因此能夠確定泡沫細(xì)胞不是由內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞衍生的。表達(dá)αd的CD68陽性的巨噬細(xì)胞被小的ICAM-R陽性白細(xì)胞包圍和分開。CD68陰性但能被αd和ICAM-R抗體染色的小白細(xì)胞的數(shù)量似乎有限。
αd在正常組織中的分布似乎在靜止的白細(xì)胞，其分布圖譜與CD11b和CD11c的圖譜重疊但不相同。CD11b和CD11c是前面已經(jīng)鑒定為具有有限的白細(xì)胞分布的另外兩種白細(xì)胞整合素α鏈。細(xì)胞形態(tài)表明，αd染色大量限于巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞染色有限。一般來說，組織炎癥表現(xiàn)為增加特定組織中觀察到的白細(xì)胞數(shù)量和種類，并伴隨有白細(xì)胞整合素包括αd染色的增加。因?yàn)樵诓±斫M織中白細(xì)胞整合素的細(xì)胞和空間分布是不同的，因此可以推知，在不同的情況下，對每個家族成員包括αd存在不同的功能和配體。
有趣的是，αd在早期粥樣硬化病灶中的表達(dá)顯示比CD11a、CD11b和CD11c要更強(qiáng)，這表明αd在這些病灶的建立中可能起著核心作用。αd和ICAM-R陽性細(xì)胞的并列分布，這一點(diǎn)被表明αd和ICAM-R之間相互作用的證據(jù)所支持，說明αd可能在這些病灶中參與早期的白細(xì)胞的募集或激活。細(xì)胞系和外周血白細(xì)胞染色抗體169A和169B在FACS中能夠?qū)η八鑶魏思?xì)胞細(xì)胞系HL60染色。αd在這些細(xì)胞中的表面表達(dá)受到PMA刺激的負(fù)面影響，有報(bào)道說PMA刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化途徑，但不被DMSO影響，DMSO誘導(dǎo)粒細(xì)胞分化(Collins等，《血液》70卷，1233-1244(1987))。169A和169B與PMA刺激的FACS圖譜與用抗CD11b和抗CD11c單克隆抗體中所觀察到的圖譜相對立。一種單核細(xì)胞系THP-1也顯示能被169A和169B弱染色。此外，在FACS中，外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞門(gates)的一個細(xì)胞亞群顯示弱陽性，而B淋巴細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)沒有αd的表面表達(dá)。T淋巴細(xì)胞的CD8+亞群是αd+。此外，抗體169A和169B不能在下面的細(xì)胞系中檢測到抗原B細(xì)胞系JY、Ramos；嗜堿性粒細(xì)胞系KU813和T細(xì)胞系Jurkat、SKW和Molt 16。
根據(jù)HL60細(xì)胞的結(jié)果，粒細(xì)胞用ficoll/hypaque梯度離心并接著裂解血紅細(xì)胞的方法從外周血中分離。通過在乙酸中觀察核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)所有的制備物＞90％為PMNs。單獨(dú)的制備物用50ng/ml的PMA或10-8M甲?；?fMLP)刺激30分鐘，使可能的細(xì)胞內(nèi)整合素貯存釋放。相對于一種IgG1對照，未刺激的群體顯示低但卻明顯的169A和169B抗原的表達(dá)，在刺激后觀察到可以察覺的提高。在PMNs中，αd和CD11c的表面表達(dá)比在HL60細(xì)胞中更相似。隨后抗體169B被用來沉淀來自生物素化的PMNs的一種去污劑裂解物的異源二聚體分子，該分子含有分別約150和95kD相當(dāng)于αd和CD18大小的亞單位。
αd在PMNs上的存在不能由已知的有關(guān)犬αd表達(dá)的信息進(jìn)行預(yù)測。犬中性粒細(xì)胞不象其人對應(yīng)物，它表達(dá)T輔助細(xì)胞標(biāo)記CD4，還表達(dá)整合素VLA-4，因此在狗中可能有與在人中不同的配體和功能。PBL亞族的染色本研究用來確定這種β2整合素在人外周血白細(xì)胞中的分布。此外，還對αd的細(xì)胞表面密度相對于其他β2整合素進(jìn)行了比較。最后，還對純化的人嗜酸性粒細(xì)胞中αd表達(dá)的急性調(diào)節(jié)進(jìn)行了評價。
人外周血白細(xì)胞用密度梯度分離成單個核細(xì)胞級份(含單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)(Warner等，《免疫學(xué)方法雜志》105卷，107-110頁(1987))。對于某些實(shí)驗(yàn)，嗜酸性粒細(xì)胞用CD16免疫磁選擇純化至純度大于95％(Hansel等，《免疫學(xué)方法雜志》122卷，97-103頁(1989))。皮膚肥大細(xì)胞用酶解的方法從人皮膚中分離，并按前述方法進(jìn)行富集(Lawrence等，《免疫學(xué)雜志》139卷，3062-3069頁(1987))。
細(xì)胞用適當(dāng)稀釋的CD11a(MHM24)、CD11b(H5A4)、CD11c(BU-15)或αd(169A)特異的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。還使用一種鼠對照抗體。洗滌細(xì)胞，然后與藻紅蛋白接合羊抗鼠IgG一起溫育。在一些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞與過量的鼠IgG和FITC-標(biāo)記的鼠單克隆抗體或羊多克隆抗體一起溫育，上述抗體特異于特定細(xì)胞(例如，CD3、CD4或CD8對T細(xì)胞特異；CD16+淋巴細(xì)胞對NK細(xì)胞特異；抗-IgE對嗜堿性粒細(xì)胞特異(Bochner等，《免疫學(xué)方法雜志》125卷，265-271頁(1989))。然后用流式細(xì)胞儀(Coulter EPICS Profile)檢測樣品，使用不同的選通(gating)來鑒定細(xì)胞亞群。
為進(jìn)行使用嗜酸性粒細(xì)胞的研究(在該研究中檢測了αd表達(dá)的急性上調(diào))，在用不同的單克隆抗體按前述方法進(jìn)行標(biāo)記前，細(xì)胞用佛波酯(10ng/ml)、RANTES(100ng/ml)(Schall，《細(xì)胞因子》3卷，165-183頁(1991))或IL-5(10ng/ml)刺激15分鐘。
結(jié)果顯示，αd在所有的外周血嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞上出現(xiàn)。一小類(約30％)CD8+淋巴細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)表達(dá)αd。皮膚肥大細(xì)胞和CD4+淋巴細(xì)胞不表達(dá)αd。一般來說，CD11a和CD11b以比αd高的密度出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞上，后者以相對低的類似于CD11c的水平表達(dá)。在白細(xì)胞中，單核細(xì)胞和CD8+細(xì)胞具有最高密度的αd，而嗜酸性粒細(xì)胞具有最低水平的αd表達(dá)。在中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞中的表達(dá)處于中間。
用CC趨化因子RANTES刺激外周嗜酸性粒細(xì)胞沒有導(dǎo)致任何一種β2整合素表達(dá)的改變。然而用佛波酯處理在CD11b和αd的表達(dá)中產(chǎn)生了2至3倍的增加，但不影響CD11a或CD11c的表達(dá)。IL-5處理導(dǎo)致CD11b表達(dá)的選擇性上調(diào)，而不影響其他整合素亞單位的水平。
綜合起來，這些結(jié)果表明，在外周血白細(xì)胞中，αd一般以與CD11c相當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)。最高的表達(dá)水平被發(fā)現(xiàn)于單核細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞的一個亞群。人皮膚肥大細(xì)胞不表達(dá)αd。純化的嗜酸性粒細(xì)胞似乎具有CD11b和αd的前體的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)貯存庫。但I(xiàn)L-5相對PMA顯示的不同上調(diào)說明，這些貯存庫各不相同。
還使用組合的選通和表面標(biāo)記用流式細(xì)胞儀按前面的介紹對外周血白細(xì)胞(PBL)亞群的染色圖譜進(jìn)行了測定，來更精確地確定169A/B陰性的淋巴細(xì)胞群體。PBL按前述方法在Ficoll上分離，并分別用169A、169B和針對CD14(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記)、CD20(B細(xì)胞)、CD56(NK細(xì)胞)、T細(xì)胞受體α/β(T細(xì)胞)、CD16(中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞)和α4(中性粒細(xì)胞的一個陰性標(biāo)記)的抗體染色。門用大小和標(biāo)記分布來確定。
結(jié)果顯示，在CD14+單核細(xì)胞門中的細(xì)胞顯示低水平的169A和169B染色。在淋巴細(xì)胞門中的早期實(shí)驗(yàn)中觀察到的雙峰表達(dá)圖譜用增加向前散射進(jìn)行了解決?；旌系腡CR+/CD20+群體顯示具有較低但一致水平的169A/B表達(dá)，而一個對CD56有50％染色陽性、定位在略高側(cè)向散射(細(xì)胞復(fù)雜性)的細(xì)胞群體，顯示具有不同的169A/B陰性群體。該陰性群體也不為TCR、CD20、CD14或CD16抗體識別。αd的滑膜分布為確定αd、其他β2整合素及其反受體在炎癥和非炎癥滑膜中的細(xì)胞分布，針對不同β2整合素和免疫球蛋白超基因家族的單克隆抗體被用于免疫組織學(xué)研究。在正常、骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織樣品中的蛋白表達(dá)得到了測定。
結(jié)果顯示，滑膜襯細(xì)胞層表達(dá)高水平的VCAM-1、CD11b/CD18和αd/CD18。在這些細(xì)胞中，CD11c/CD18表達(dá)受到限制，CD11a/CD18一般檢測不到。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜炎中，滑膜細(xì)胞層中β2整合素的表達(dá)的增加與增生的程度成比例。表達(dá)CD11c的細(xì)胞比例顯著增加，接近CD11b和αd的比例，但CD11a的表達(dá)沒有增加。
在組織的襯下區(qū)域，CD3/CD11a/ICAM-R+淋巴細(xì)胞的集聚和擴(kuò)散浸潤，散布于CD68/CD11b/αd+巨噬細(xì)胞中。集聚的顯著數(shù)量證明特別是在T細(xì)胞富含區(qū)域的強(qiáng)烈αd表達(dá)。
滑膜內(nèi)皮細(xì)胞不同地表達(dá)ICAM-1和ICAM-2，極少有ICAM-R表達(dá)的證據(jù)。
綜合起來，這些結(jié)果顯示，滑膜巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣的滑膜細(xì)胞組成地表達(dá)高水平的β2整合素CD11b和αd。在滑膜炎中，在襯區(qū)域和襯下區(qū)域都有該亞群細(xì)胞的擴(kuò)增，并伴隨著CD11c表達(dá)的明顯增加。類風(fēng)濕滑膜T淋巴細(xì)胞的特殊群體除了表達(dá)CD11a和ICAM-R，還表達(dá)高水平的αd，后一分子已在前面顯示在外周血淋巴細(xì)胞中以低水平表達(dá)。αd在患病的肺和肝組織中的表達(dá)將來自一個結(jié)節(jié)病個體的肺組織和來自兩個硬化個體的肝組織制成6um厚的切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)載玻片上在室溫中空氣干燥15分鐘。在使用前，載玻片在50℃溫育大約5分鐘。切片在室溫下在冷凍的(4℃)丙酮(EM Science)中固定2分鐘，并在室溫下空氣干燥。將切片置于100ml 1X TBS、1.1ml 30％H2O2(Sigma)、1.0 NaN3(Sigma)的溶液中，在室溫放置15分鐘，以除去內(nèi)源性的過氧化物酶活性。每個切片用150ul含有20％正常人血清(Boston Biomedica)、5％正常大鼠血清(Harlan)和2％BSA(Sigma)的1X TBS溶液在室溫下封閉30分鐘。溫育后，輕輕地從切片上吸干溶液。第一抗體按10ug/ml的蛋白濃度在封閉溶液中制備，并在每個組織切片上加入75ul，在室溫處理1小時。溫育后，切片在1X TBS中洗滌三次，每次5分鐘，以除去未結(jié)合的抗體。在最后一次洗滌后，吸去組織周圍多余的TBS。生物素化的大鼠抗小鼠抗體(Jackson Laboratories)在封閉溶液中稀釋至1∶400，并在每個切片中加入75ul，在室溫處理30分鐘。載玻片用1X TBS洗滌2次，每次5分鐘。過氧化物酶接合的羊抗生物素抗體(VectorLaboratories)在封閉溶液中稀釋至1∶200，并在每個切片中加入75ul，室溫處理30分鐘。載玻片用1X TBS洗滌2次，每次洗滌5分鐘。加入底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(Vector Laboratories)或二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物(Vector Laboratories)，浸入水中使顯色過程終止，載玻片在Gill’s蘇木精#2(Sigma)中負(fù)染，在水中漂洗，然后用Aquamount(Baxter)或Cytoseal(VWR)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在結(jié)節(jié)病肺中，只有217L單克隆抗體染上細(xì)胞，多數(shù)217L表位表達(dá)位于肉牙腫。肉牙腫中的巨大細(xì)胞顯示為217L抗原陰性。217L表位的表達(dá)位于形態(tài)學(xué)顯示為上皮組織細(xì)胞的細(xì)胞上，這種細(xì)胞是巨噬細(xì)胞系的高度分化的吞噬細(xì)胞型細(xì)胞。在結(jié)節(jié)病肺中其他整合素的分布被觀察到與217L表位的分布重疊，但表達(dá)圖譜不同。例如，對所有其他整合素免疫特異的抗體能夠標(biāo)記217L染色陰性的肉牙腫中的細(xì)胞以及巨大細(xì)胞。
來自第二個被診斷為結(jié)節(jié)病的病人的切片為217L表位表達(dá)陰性。但從病理報(bào)告中看不出該病人是否接受過類固醇免疫抑制劑，這是最常見形式的治療。
在來自硬化的肝組織的切片中，抗αd抗體標(biāo)記肝小節(jié)之間的結(jié)締組織中的泡沫細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞的一個亞群。CD11c的分布與αd表達(dá)重疊但不一樣，抗CD11c抗體也標(biāo)記一個泡沫細(xì)胞亞群，但比抗αd抗體標(biāo)記更多的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。CD11a和CD11b表達(dá)的分布與αd表達(dá)沒有明顯的重疊。
抗體217L也能染上束狀的并從212D和217L鑒定的群體中分離出來的吞噬細(xì)胞型細(xì)胞。針對CD11b和CD11c的抗體以不同的方式染上217L+束。
在相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，用抗體212D和217L對人脾組織切片以及來自非人的靈長動物M.nemestrina的系列切片進(jìn)行染色。還用流式細(xì)胞儀評價來自新鮮的人和猴脾組織的脾細(xì)胞中αd的表達(dá)?？贵w212D和217L都能識別人和猴脾細(xì)胞。用ICC和FACS，αd+群體均占總細(xì)胞的約20％，不像在嚙齒動物中顯示更大百分比的αd+細(xì)胞。陽性細(xì)胞顯示與巨噬細(xì)胞形態(tài)相同。人骨髓染色人骨髓樣品按照標(biāo)準(zhǔn)方法獲自正常骨髓供體的髂骨。原始樣品在Iscove’s培養(yǎng)基中按1∶3稀釋，在2000 RPM離心20分鐘。小心收集淺黃衣層，洗滌一次，在溶血緩沖液(0.83％氯化銨、0.1％碳酸鈉、無EDTA)中溶血。細(xì)胞重懸于含15％FBS的PBS中，分成100ul中的100,000細(xì)胞/管，置于冰上。按前述方法進(jìn)行免疫染色。簡而言之，在每孔中分別加入單克隆的鼠抗αd抗體212D或217L或鼠抗人CD18或鼠抗人CD50(ICAM-R特異)抗體至終濃度10ug/ml，混合物在冰上溫育20分鐘。將細(xì)胞洗滌兩次，并與羊抗鼠FITC再另外保溫20分鐘。細(xì)胞洗滌兩次，并重懸于1％低聚甲醛中。用熒光激活細(xì)胞分選儀FACSCAN(Becton Dickinson)測量熒光。
四個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，αd表達(dá)用212D抗體測定時見于13至43％的細(xì)胞上(中間值27％)、用217L時見于6-55％的細(xì)胞上(中間值21％)，CD18表達(dá)見于60-96％的細(xì)胞上(中間值71％)，CD50見于86-99％細(xì)胞上(中間值94％)。αd在乳腺癌病人外周血單個核細(xì)胞上的表達(dá)使用Ficoll分離法從經(jīng)過了骨髓移植的高危乳腺癌病人的血液樣品中分離外周血單個核細(xì)胞。高危乳腺癌病人即預(yù)后不良的乳腺癌病人。按上述方法用免疫染色來篩選表達(dá)αd的細(xì)胞。
結(jié)果顯示，αd表達(dá)用212D抗體測定時發(fā)現(xiàn)在20％的細(xì)胞上，用217L時在13％的細(xì)胞上?？贵w212D還染上了顯示很可能是淋巴細(xì)胞的小細(xì)胞的一個亞群。表達(dá)αd的細(xì)胞的百分比與在正常血液供體中一般觀察到的百分比相當(dāng)。
此外，抗體212D顯示不僅染上為CD14+的大細(xì)胞，還能染上實(shí)驗(yàn)鑒定為CD3+的小得多的細(xì)胞。在血液和骨髓中都觀察到這個結(jié)果。
表達(dá)αd細(xì)胞的數(shù)量的變化可以用從不同供體抽取的骨髓細(xì)胞組成的變化來解釋(例如骨髓數(shù)量與循環(huán)血數(shù)量相比)。實(shí)施例19αd表達(dá)的上調(diào)因?yàn)榘准?xì)胞整合素在血液透析中和慢性腎衰竭中觀察到的免疫改變中一般上調(diào)(Rabb等，《 J.Am.Soc.Nephrol.》，6卷，1445-1450頁(1995)和Rabb等《Am.J.Kidnet Dis.》23卷，155-166頁(1994))，我們檢測了在血液透析和慢性腎衰竭中αd/CD18的表面表達(dá)。此外，還研究了在PKC刺激后αd/CD18在體外的表達(dá)。
全血樣品獲自5個隨機(jī)選擇的沒有腎病的住院病人。在表面染色和流式細(xì)胞儀分析前，血液樣品與50ng/ml的PMA在37℃溫育30分鐘。同時也從患有慢性腎衰竭的病人中收集血液樣品。病人情況穩(wěn)定，沒有糖尿病，每周三次進(jìn)行血液透析?；€樣品在開始透析前獲取，接著在用一個cuprophane膜透析中15分鐘和180分鐘抽取樣品。使用來自不患有已知疾病的正常個體的血液樣品作為對照。
為進(jìn)行細(xì)胞染色，將5ug的抗體169A和169B(和一個陰性對照1B7)與100ul全血在暗處溫育15分鐘。在每個混合物中加入BectonDickinson裂解試劑(2ml)，在暗處繼續(xù)溫育10分鐘。然后沉淀細(xì)胞，重懸于PBS。離心再次沉淀細(xì)胞，并與FITC接合的二抗混合，在暗處溫育30分鐘。然后將細(xì)胞用PBS洗滌、離心、棄去上清、重懸于1.0％福爾馬林。
使用Rabb等《J.Am.Soc.Nephrol.》6卷，1445-450頁(1995))的方法進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。樣品用Simulset軟件(Becton Dickinson)在FACscan流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)上進(jìn)行分析。每個樣品最少分析22,000個細(xì)胞。粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群用前向光散射和側(cè)向光散射進(jìn)行分門。細(xì)胞亞群的純度用CD45染色和CD14染色進(jìn)行評價。
結(jié)果顯示，αd/CD18的表達(dá)可在從正常人供體抽取的血液中檢測到，表達(dá)在單核細(xì)胞上最高，在淋巴細(xì)胞上最低。在中性粒細(xì)胞上的表達(dá)介于單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之間。用抗體169B染色弱于用抗體169A染色。PMA處理上調(diào)αd/CD18表達(dá)，特別是在中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上。
在來自腎衰竭病人的樣品中，在開始透析前，αd/CD18的表達(dá)在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上檢測到。在使用白細(xì)胞激活膜透析15分鐘后，檢測到αd/CD18表達(dá)的少量增加。在處理的后期，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上的表達(dá)實(shí)際上減少。這個結(jié)果表明，αd/CD18表達(dá)與觀察到的透析后CD11a/CD18、CD11b/CD18和L-選擇素的表達(dá)不同。實(shí)施例20大鼠cDNA的分離因?yàn)槿腿甩羋亞單位都存在，我們設(shè)法在其他物種包括大鼠(本實(shí)施例)、小鼠(實(shí)施例20，上文)中分離同源性基因。
從一個大鼠脾λgt10文庫(Clontech)中獲得了顯示與人αd基因同源的大鼠cDNA的部分序列。將該文庫按2×104pfu/板鋪于150mmLBM/瓊脂平板。按標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》2.110頁)的介紹，將文庫提呈到Hybond膜上(Amersham)，變性3分鐘，中和3分鐘，用緩沖液洗滌5分鐘。立即將膜置于一個Stratalinker(Stratagene)上，用自動交聯(lián)裝置使DNA交聯(lián)。將膜分別在低度和高度嚴(yán)格條件下，在30％或50％甲醛中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。先用一種32P標(biāo)記的探針對膜進(jìn)行篩選，該探針從人αdcDNA中制備，并相當(dāng)于克隆19A2(SEQ ID NO1)的堿基500至2100。探針使用Boehringer Mannheim’s隨機(jī)引物試劑盒按照廠商推薦的程序進(jìn)行標(biāo)記。濾膜用2X SSC在55℃進(jìn)行洗滌。
鑒定了兩個克隆，它們被命名為684.3和705.1，它們顯示與人αd、人CD11b、和人CD11c序列同源。兩個克隆都在基因的3’區(qū)域與人αd基因匹配，對684.3來說，起始于堿基1871而延伸至堿基3012，對克隆705.1，為堿基1551至3367。
為分離包含5’區(qū)域的更完整的大鼠序列，使用初次篩選中同樣的程序，但使用由克隆A1160制備的一種鼠探針(見實(shí)施例20，上文)，對相同的文庫進(jìn)行再次篩選。從第二次篩選選擇單個、分離的噬菌斑，在LBM/瓊脂平板上維持為單個克隆。在一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR程序中使用測序引物434FL和434FR(分別為SEQ ID NO34和35)來制備用于測序的DNA。5’-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3’ (SEQ ID NO34)5’-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3’ (SEQ ID NO35)PCR產(chǎn)生的DNA用Quick自旋柱(Qiagen)按照廠商推薦的程序進(jìn)行純化。
鑒定了兩個克隆，它們被命名為741.4和741.11，它們與克隆684.3和705.1重疊，在重疊區(qū)域，克隆741.4和741.1與克隆684.3和705.1 100％同源。一個合并的與人αd基因具有同源性的大鼠cDNA列于SEQ ID NO36，預(yù)測的氨基酸序列列于SEQ ID NO37。大鼠αd5’端的克隆使用一個Clontech大鼠脾RACE克隆試劑盒，按照廠商推薦的程序，獲得了一個大鼠αd基因5’cDNA片段。使用的基因特異的寡核苷酸被命名為741.11#2R和741.11#1R(分別為SEQ ID NO59和58)。5’-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3’ (SEQ ID NO59)5’-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3’ (SEQ IN NO58)寡核苷酸741.11#2R包含SEQ ID NO36中的131-152堿基對，但方向相反；741.11#1R包含SEQ IN NO36中的696-715堿基對，方向也相反。使用3’-多數(shù)寡核苷酸741.11#1R進(jìn)行初次PCR。接著用寡核苷酸741.11#2R和初次反應(yīng)產(chǎn)生的DNA進(jìn)行第二次PCR。在1％瓊脂糖凝膠上檢測到了大約300堿基對的一條帶。
將第二次PCR的產(chǎn)物按照廠商推薦的程序連接到質(zhì)粒pCRTAII(Invitrogen)中。挑取白色(陽性)克隆，并加入到100ul含有1ul的50mg/ml羧芐青霉素貯存液和1ul的M13 K07噬菌體培養(yǎng)物的LBM中，并分別加入到一個圓底96孔組織培養(yǎng)板的單個孔中?；旌衔镌?7℃溫育30分鐘至1小時。初次溫育期之后，加入100ul的LBM(含有1ul的50mg/ml羧芐青霉素貯存液和10mg/ml卡那霉素貯存液的1∶250稀釋物)，繼續(xù)在37℃溫育過夜。
使用無菌的96孔金屬轉(zhuǎn)移吸頭，將96孔板的上清轉(zhuǎn)移到4張Amersham Hybond尼龍濾膜上。按照標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)V膜變性、中和和交聯(lián)。濾膜在20ml預(yù)雜交緩沖液(5X SSPE，5X Denhardts、1％ SDS、50ug/ml變性鮭精DNA)在50℃預(yù)雜交數(shù)小時并搖動。
寡核苷酸探針741.11#1和741.11#1R(分別為SEQ ID NO56和57)包含堿基對86-105(SEQ ID NO36)，分別為正向和反向，它們按下面方法進(jìn)行標(biāo)記。5’-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3’ (SEQ ID NO56)5’-AGGTTAGACCCATGACAGG-3’ (SEQ ID NO57)將12ul dH2O中的大約65WP寡核苷酸DNA加熱至65℃兩分鐘。在試管中加入3ul的10mCi/mlγ-32P-ATP，并加入4ul 5X激酶緩沖液(Gibco)和1ul T4 DNA激酶(Gibco)?；旌衔镌?7℃溫育30分鐘。溫育之后，將16ul的每種標(biāo)記的寡核苷酸探針加入預(yù)雜交緩沖液中和濾膜上，并在42℃繼續(xù)雜交過夜。濾紙?jiān)?X SSPE、0.1％ SDS中在室溫下洗滌三次，每次5分鐘，并放射性自顯影6小時。將陽性克隆擴(kuò)增，并使用Magic Mini Prep Kit(Promega)按照廠商推薦的程序純化DNA?？寺?F7被選擇來進(jìn)行測序，并在重疊區(qū)域顯示與克隆741.11有100％的同源性。完整的大鼠αd核酸序列列于SEQ ID NO54，其氨基酸序列列于SEQ ID NO55。大鼠cDNA和氨基酸序列的特征大鼠β2整合素α亞單位的核酸和氨基酸序列在以前都沒有報(bào)道。但與已報(bào)道的人β2整合素α亞單位的序列比較表明，分離到的大鼠克隆和其預(yù)測的氨基酸序列與αd核苷酸和氨基酸序列最密切相關(guān)。
在核酸水平，分離的大鼠cDNA克隆與人αdcDNA比較時顯示80％的同一性，與人CD11b比較時顯示68％的同一性，與人CD11c比較時顯示70％的同一性，與鼠CD11b比較時顯示65％的同一性。在與人CD11a和鼠CD11a比較時，沒有明顯的同一性。
在氨基酸水平，由分離cDNA編碼的預(yù)測大鼠多肽在與人αd多肽比較時顯示70％的同一性，在與人CD11a比較時顯示28％的同一性，在與人CD11b比較時顯示58％的同一性，在與人CD11c比較時顯示61％的同一性，在與鼠CD11a比較時顯示28％的同一性，在與鼠CD11b比較時顯示55％的同一性。實(shí)施例21大鼠組織αd表達(dá)的Northern分析從一組Lewis大鼠組織中提取RNA來用一種大鼠αd探針進(jìn)行Northern分析。樣品包括來自正常的脾、腎、肝、肺和骨髓的總RNA，加上來自正常脾、腦、脊髓、胸腺、皮膚、小腸、大鼠抗原激活的T細(xì)胞、患EAE病(實(shí)驗(yàn)性過敏性腦脊髓炎)的脾和淋巴結(jié)的poly(A+)RNA。實(shí)驗(yàn)使用實(shí)施例6介紹的技術(shù)進(jìn)行。
αd探針選自大鼠cDNA的一個區(qū)域，包括SEQ ID NO54中的1184-3008核苷酸，該區(qū)域代表與大鼠CD11c和CD11b具有最低程度的同源性的區(qū)域。該1124 bp探針通過用EcoRI內(nèi)切酶消化10ug大鼠αdcDNA克隆684.3來制備。該片段用凝膠純化，并按實(shí)施例6中的介紹用于一個隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)。Northern印跡按實(shí)施例6中介紹的預(yù)雜交、雜交和洗滌來進(jìn)行，除了探針按5.5×105cpm/ml加入到雜交緩沖液中。
放射性自顯影5天后，在含有脾總RNA以及來自正常鼠及來自患有活躍的EAE大鼠的脾的poly(A+)RNA泳道中檢測到條帶，在患有活躍的EAE的大鼠中，RNA的量明顯大于來自正常鼠的RNA量。檢測到的轉(zhuǎn)錄物的大小與全長大鼠cDNA克隆的大小一致。實(shí)施例22嚙齒動物αd特異性抗體-針對大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/Hu IgG4融合蛋白的抗體的制備和特征分析由于已經(jīng)證明人β2整合素的I結(jié)構(gòu)域參與配體結(jié)合，可以推測對大鼠αd蛋白也是同樣。因此對大鼠αdI結(jié)構(gòu)域免疫特異的單克隆抗體有αd結(jié)合參與的人疾病的大鼠模型中是有用的。
寡核苷酸“大鼠α-DI5”(SEQ ID NO87)和“大鼠α-DI3(SEQIN NO88)從大鼠αd序列中制備，它們分別相當(dāng)于SEQ ID NO54中的堿基對469-493和堿基對1101-1125(相反方向)。將寡核苷酸用于一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)，來制備一個含有跨越相當(dāng)于SEQ ID NO54中堿基對459-1125的I結(jié)構(gòu)域的大鼠αdDNA片段。將PCR產(chǎn)物按照廠商推薦的程序連接到載體pCRTAII(Invitrogen)中，選擇一個陽性克隆并擴(kuò)增，用一個Qiagen(Chatswoth，GA)Midi Prep試劑盒按照廠商推薦的程序純化DNA。DNA用XhoI和BglII在一個標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)中酶消化，用凝膠純化一個600堿基對的帶，并隨后將其連接到pDCS1/HuIgG4表達(dá)載體中。選擇一個陽性克隆擴(kuò)增，用一個QiagenMaxi Prep試劑盒純化DNA。
將COS按半?yún)R合鋪于100mm培養(yǎng)皿，在37℃在7％CO2中生長過夜。細(xì)胞用5ml的DMEM漂洗一次。在5ml DMEM中，加入50ul DEAE-葡聚糖、2ul氯喹和15ug前面介紹的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4DNA。將混合物加入COS細(xì)胞，在37℃溫育3小時。然后移出培養(yǎng)基，在精確的1分鐘內(nèi)加入5ml CMF-PBS中的10％DMSO。細(xì)胞用DMEM溫和地洗滌一次。在細(xì)胞中加入10ml含有10％FBS的DMEM，繼續(xù)在37℃在7％CO2中溫育過夜。第二天，用新鮮的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基，并繼續(xù)再培養(yǎng)另外3天。收集培養(yǎng)基，并在板中加入新鮮的培養(yǎng)基。三天后，再收集培養(yǎng)基，棄去板。重復(fù)上述過程，直到收集到2升培養(yǎng)上清。
將按前述方法收集的上清上一個Prosep-A柱(Bioprocessing)并按下面的介紹純化蛋白。
先用15倍體積的含35mM Tris、150mM NaCl、pH7.5的洗滌緩沖液洗滌柱，將上清以低于60柱體積/小時的低速率上柱。上柱后，用15倍體積的洗滌緩沖液、15倍體積的0.55M二乙醇胺、pH8.5和15倍體積的50mM檸檬酸、pH5.0洗柱。蛋白用50mM檸檬酸、pH3.0洗脫。蛋白用1.0M Tris、pH8.0中和，并在無菌PBS中透析。
大鼠αdI結(jié)構(gòu)域蛋白用實(shí)施例14介紹的方法進(jìn)行分析。檢測到的蛋白以與人I結(jié)構(gòu)域蛋白觀察到的相同方式遷移。制備針對大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4融合蛋白的單克隆抗體小鼠分別用預(yù)先在等體積的福氏完全佐劑(FCA)(Sigma)中乳化的50ug純化的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4融合蛋白進(jìn)行免疫。將大約200ul抗原/佐劑制備物注射到每只小鼠背部和側(cè)部的4個位點(diǎn)。兩周后，小鼠通過注射100ul預(yù)先在等體積的福氏不完全佐劑(FIA)中乳化的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4抗原(50ug/鼠)進(jìn)行加強(qiáng)免疫。另外兩周后，小鼠用200ul PBS中的50ug抗原經(jīng)靜脈進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
為評價免疫小鼠中的血清滴度，在第三次免疫后10天對動物進(jìn)行眼窩后取血，使眼窩后血凝集，并離心分離血清。將血清用于生物素(BIP)標(biāo)記的大鼠脾細(xì)胞的免疫沉淀。來自每只小鼠的血清都能免疫沉淀大鼠αd和大鼠CD18的預(yù)期分子量的蛋白條帶。選擇一只小鼠進(jìn)行融合，并按第三次加強(qiáng)免疫中介紹的方法進(jìn)行第四次加強(qiáng)。
雜交瘤上清按下面的介紹用抗體俘獲法進(jìn)行篩選。Immulon 4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)在4℃按50ul/孔用在50mM碳酸鈉緩沖液、pH9.6中1∶5000稀釋的羊抗鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)進(jìn)行包被。板用含有0.05％ Tween20的PBS(PBST)洗滌三次，并加入50ul培養(yǎng)上清。在37℃溫育30分鐘后，按前述方法洗滌。加入在PBST中1∶3500稀釋的辣根過氧化物酶接合的羊抗鼠IgG9(Fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。板按前述方法進(jìn)行溫育，并用PBST洗滌四次。緊接著，加入含有1mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.1ul/ml 30％ H2O2的100mM檸檬酸、pH4.5的底物。5分鐘后加入50ul的15％硫酸終止顏色反應(yīng)。在Dynatech讀板儀上讀出490nm處的吸收。
來自含有抗體的孔中的上清也用固化的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4融合蛋白進(jìn)行ELISA分析。一個用HuIgG4抗體包被的板進(jìn)行的ELISA用作針對IgG融合伙伴反應(yīng)的對照。選擇陽性孔用下面介紹的技術(shù)在大鼠脾細(xì)胞裂解物上用BIP進(jìn)一步篩選。大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4融合蛋白多克隆抗血清的制備在用福氏完全佐劑(FCA)中的100ug純化的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4融合蛋白進(jìn)行免疫前，對兩只兔預(yù)先采血。每三周用福氏不完全佐劑(IFA)中的相同劑量重復(fù)注射。三次注射后，對兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)采血，并將收集的血清用于大鼠脾細(xì)胞裂解物上的一個標(biāo)準(zhǔn)免疫沉淀。結(jié)果確定，來自兩只兔的血清均能與大鼠αd免疫反應(yīng)。再用IFA中的100ug抗原對兔進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并用免疫沉淀分析收集的血清與大鼠αd免疫反應(yīng)的提高。10天后給予動物最后一次加強(qiáng)免疫，放血，收集血清。大鼠αd的組織學(xué)按實(shí)施例18中介紹的技術(shù)將針對大鼠αd“I”結(jié)構(gòu)域制備的兔多克隆血清用于兔組織切片的染色。在冷凍和石蠟包埋的大鼠脾切片上的染色圖譜與用針對人αd抗體所觀察到的圖譜相同，染色的單個細(xì)胞分布于整個紅髓。該染色圖譜與用針對大鼠CD11a、CD11b和CD18的單克隆抗體觀察到的圖譜不同。此外，在胸腺中觀察到了單個細(xì)胞分布于整個皮層的陽性染色圖譜。這些組織在用免疫前的兔血清染色時，不能產(chǎn)生任何信號?？贵w特異性分析大鼠用CO2窒息處死，用標(biāo)準(zhǔn)的外科技術(shù)取出脾臟。將脾臟在20mlRPMI中用一個3cc注射器塞輕推過一個金屬篩來收集脾細(xì)胞。將細(xì)胞收集到一個50錐型試管中，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中洗滌。
細(xì)胞在冷D-PBS中洗滌三次，并以108至109的細(xì)胞密度重懸于40ml PBS。在細(xì)胞懸液中加入4mg的NHS-Biotin(Pierce)，反應(yīng)在室溫下繼續(xù)精確進(jìn)行15分鐘。沉淀細(xì)胞，在冷D-PBS中洗滌三次。
細(xì)胞按108細(xì)胞/ml重懸于冷的裂解緩沖液中(1％NP40、50mMTris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl、1∶100的抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑酶肽溶液，在加入細(xì)胞前加入；0.0001克PMSF晶體，在加入細(xì)胞前加入)。將裂解物振蕩旋轉(zhuǎn)30秒，在室溫溫育5分鐘，并在冰上溫育15分鐘。將裂解物在10,000g離心10分鐘使不溶物沉淀。將上清收集到一個新管，貯存在4℃至-20℃之間。
將1ml裂解物與200ul蛋白A瓊脂糖淤漿(Zymed)在4℃溫育過夜進(jìn)行預(yù)清除。將預(yù)清除的裂解物按50ul/管分裝到Eppendorf管中用于每種檢測抗體。將25ul多克隆血清或100至500ul單克隆抗體上清加入預(yù)處理的裂解物中，并將獲得的混合物在4℃旋轉(zhuǎn)溫育2小時。然后加入與PBS中的蛋白A瓊脂糖珠結(jié)合的100ul兔抗鼠IgG(Jackson)，繼續(xù)在室溫旋轉(zhuǎn)溫育30分鐘。輕微離心使珠沉淀，并用冷洗滌緩沖液(10mM HEPES、0.2M NaCl、1％ Trition X-100)洗滌三次。吸出上清。加入20ul含有10％β-巰基乙醇的2X SDS樣品緩沖液。樣品在水浴槽內(nèi)煮沸2分鐘。將樣品上5％SDS PAGE凝膠，分離后，將蛋白用恒定電流過夜轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。硝酸纖維濾膜用含3％BSA的TBS-T在室溫封閉1小時，棄去封閉緩沖液。加入在0.1％BSA TBS-T中1∶6000稀釋的鏈親和素-HRP接合物(Jackson)，在室溫繼續(xù)溫育30分鐘。濾膜用TBS-T洗滌三次，每次15分鐘，并用Amersham’s ECL試劑盒按照廠商推薦的程序進(jìn)行放射性自顯影。針對全長大鼠αd蛋白的單克隆抗體的制備從大鼠脾細(xì)胞中純化大鼠αd來制備用于產(chǎn)生抗大鼠αd單克隆抗體的免疫原。收集來自約50只12-20周齡的正常雌性Lewis大鼠的脾臟，并通過使其通過一個精密的金屬篩從組織制備一個單細(xì)胞懸液。在含有150mM NH4CL、10mM KHCO3、0.1mM EDTA、pH7.4緩沖液裂解除去紅細(xì)胞，余下的白細(xì)胞用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌兩次。離心沉淀脾細(xì)胞，并在含有50mM Tris、150mM NaCL、2mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM PMSF、亮抑酶肽、抑胃酶肽和1％ Triton X-100的緩沖液中裂解。脾細(xì)胞裂解按每ml裂解緩沖液5×108脾細(xì)胞在冰上進(jìn)行30分鐘。離心除去不溶物質(zhì)。
CD11a、CD11b和CD11c按下面方法用免疫沉淀從脾裂解物中除去。將體積為750ul的蛋白A-瓊脂糖淤漿與2mg兔抗鼠免疫球蛋白在4℃溫育30分鐘。兔抗鼠-蛋白A-瓊脂糖用裂解緩沖液洗滌三次，并懸浮于終體積為1.5ml的裂解緩沖液中。將大約200ug的每種大鼠β2整合素特異的單克隆抗體515F(大鼠CD11a特異)、OX-42(大鼠CD11b特異)和100g(大鼠CD11c特異)加入每個50ml的大鼠脾裂解物中。在4℃溫育30分鐘后，將500ul的兔抗鼠-蛋白A-瓊脂糖加入到脾裂解物中，顛倒旋轉(zhuǎn)在4℃混合30分鐘。將裂解物在2500×g離心10分鐘沉淀與兔抗鼠-蛋白A-瓊脂糖結(jié)合的CD11a、CD11b和CD11c，將上清轉(zhuǎn)至一個干凈的50ml離心管。用抗體515F、OX-42和100g另外重復(fù)沉淀兩次以保證完全清除CD11a、CD11b和CD11c。
裂解物中剩余的β2整合素用親和純化方法進(jìn)行分離。將約250ul與CHBr-瓊脂糖接合的抗大鼠CD18單克隆抗體20C5B淤漿加入到裂解物中，在4℃顛倒旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。在2500×g離心10分鐘使抗體/抗原復(fù)合物沉淀，沉淀用裂解緩沖液洗滌三次，然后貯存于4℃。Armenian倉鼠的免疫1.6-8周齡的Armenian倉鼠先用50ug在福氏完全佐劑中乳化的含大鼠αdI結(jié)構(gòu)域與人IgG4重鏈融合的重組蛋白進(jìn)行免疫。初次免疫之后接著在14、33和95天用在福氏不完全佐劑中乳化的大鼠αdI結(jié)構(gòu)域/HuIgG4進(jìn)行免疫。并接著進(jìn)行兩次單獨(dú)的融合，它們被命名為197和199。
在融合197前4天(306天)，對一只倉鼠給予純化自脾細(xì)胞的大鼠αd蛋白和大鼠αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的合并物。在融合前三天(307天)用純化的大鼠αd蛋白和αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。大鼠αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞按下面的方法制備。
將一個編碼全長的大鼠αd蛋白的基因插入到pDC1載體中，并與一個人CD18-pRC結(jié)構(gòu)一起電轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在存在次黃嘌呤的條件下生長以選擇成功地轉(zhuǎn)染了pRC結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，并在存在G418的條件下生長以選擇轉(zhuǎn)染了pDC1結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。三周后，細(xì)胞用大鼠αd特異的兔多克隆血清染色，并用FACS分類。收集表達(dá)高水平的表面αd的一小百分比的細(xì)胞(大約占總數(shù)的3％)，并進(jìn)一步擴(kuò)增。重復(fù)FACS選擇數(shù)次來提供αd高水平表面表達(dá)的細(xì)胞群體。
αd轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也用流式細(xì)胞術(shù)使用一種大鼠αd特異的多克隆血清和一種人CD18特異的單克隆抗體TS1.18.1進(jìn)行分析。結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞表達(dá)高水平的大鼠αd和人CD18。
最后，細(xì)胞中αd和CD18的表達(dá)用免疫沉淀進(jìn)行評價。一種大鼠αd特異的兔多克隆血清被發(fā)現(xiàn)免疫沉淀兩種不同分子量的蛋白高分子量蛋白為約170kD，低分子量蛋白為約95kD。這些發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表面大鼠αd/人CD18異源二聚體復(fù)合物的表達(dá)一致。
在融合那天，取出脾臟，將組織在浸入在補(bǔ)加有2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的無血清RPMI1640中的兩個顯微鏡載玻片的磨沙端研磨，形成單個細(xì)胞的懸液(RPMI)(Gibco，Canada)。細(xì)胞懸液濾過一個無菌的70篩Nitex細(xì)胞濾過器(Becton，Dickinson，Parsippany，New Jersey)。在200×g離心5分鐘洗滌2次。所獲得的沉淀重新懸浮于20ml無血清RPMI。從三只Balb/c幼鼠取出的胸腺細(xì)胞也用同樣的方法進(jìn)行制備。在融合前，將在融合前三天用含10％Fetalclone血清(FCS)(HycloneLaboratories，Logan，Utah)的RPMI維持在對數(shù)生長期的NS-1骨髓瘤細(xì)胞，在200×g離心5分鐘，沉淀用前面介紹的方法洗滌兩次。
將大約1.15×108脾細(xì)胞與5.8×107NS-1細(xì)胞混合，離心并吸出上清。敲擊試管取出細(xì)胞沉淀，并在1分鐘內(nèi)加入7ml 37℃的PEG1500(75mM Hepes、pH8.0中50％)(Boehringer Mannheim)，并攪動。在接著的7分鐘內(nèi)加入另外14ml無血清RPMI。再加入8ml的RPMI。細(xì)胞在200×g離心10分鐘。棄去上清。沉淀重新懸浮于200ml含有15％FBS、100mM次黃嘌呤鈉、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25單位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺細(xì)胞的RPMI。懸液按200ul/孔分于10個96孔平底組織培養(yǎng)板(Corning，聯(lián)合王國)上。在融合后的第4、5、6和7天飼喂細(xì)胞，方法是用一只18G針(Becton Dickinson)從每孔中吸出約100ul，按前面介紹的方法除了不含胸腺細(xì)胞外加入100ul/孔的鋪板培養(yǎng)基。
在融合后的第10天，來自融合孔的上清用流式細(xì)胞儀檢測其與大鼠αd/人CD18轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的反應(yīng)性。將約5×105大鼠αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞重懸于50ul含有2.0％FBS和0.05％疊氮化鈉的RPMI中，加入96孔圓底板中的約100ul雜交瘤上清中。染色的陽性對照包括兔抗αd多克隆血清和TS1/18(抗人CD18)。細(xì)胞在冰上溫育30分鐘，在FACS緩沖液(RPMI，2.0％FBS、0.05％疊氮化鈉)中洗滌三次，并與一種在FACS緩沖液中最終稀釋為1∶200的FITC接合的羊抗倉鼠抗體(Jackson ImmunolResearch Labs)在冰上溫育30分鐘。細(xì)胞在FACS緩沖液中洗滌三次，重懸于200ml的FACS緩沖液。樣品用BectonDickinson FACscan分析儀進(jìn)行分析。為保證陽性克隆為大鼠αd特異，用非轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞重復(fù)篩選過程。將符合與大鼠αdCHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞反應(yīng)而不與非轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的孔克隆。
初次篩選后，來自陽性孔的細(xì)胞用兩倍稀釋法并接著在含15％FBS、100mM次黃嘌呤鈉、16mM胸腺嘧啶和10單位/ml IL-6的RPMI中有限稀釋進(jìn)行克隆。在有限稀釋步驟中，確定顯示生長的孔的百分比，克隆性用泊松分布分析進(jìn)行預(yù)測。10-12天后用FACS分析顯示生長的孔。最后一次克隆之后，陽性孔在RPMI和11％FBS中擴(kuò)增?？寺‘a(chǎn)生了一個用這些標(biāo)準(zhǔn)判斷為陽性的孔，從該孔中擴(kuò)增了四個單獨(dú)的亞克隆，分別命名為197A-1、197A-2、197A-3和197A-4。
在進(jìn)行199融合前，第二只倉鼠在307天用2.3×106大鼠αd(RAD)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在融合前4天(334天)和融合前3天(335天)進(jìn)行最后兩次免疫。334天的加強(qiáng)免疫包括2×106大鼠αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和200ul與瓊脂糖(前面介紹)結(jié)合的純化大鼠αd經(jīng)腹膜內(nèi)給藥。335天的加強(qiáng)免疫包括5×106大鼠αd轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，也經(jīng)腹膜內(nèi)注射給藥。199融合的融合和篩選過程與197融合相同。鑒定和克隆了三個上清與大鼠αd反應(yīng)的雜交瘤，命名為199A、199H和199M。
2.使用197和199融合相同的過程進(jìn)行第二次免疫。334天加強(qiáng)免疫后，在394和395天之前不進(jìn)行進(jìn)一步的免疫。在融合前，對倉鼠經(jīng)腹膜內(nèi)給予2×106RAD轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞及300ul純化大鼠αd-瓊脂糖。接著進(jìn)行的融合205的融合和篩選過程與融合199和197相同，除了在克隆中，Armenian倉鼠ELISA試劑如羊抗Armenian倉鼠抗體(Jackson ImmunolResearch Labs)被用作初次篩選。用此方法鑒定的陽性孔接著按介紹用FACS進(jìn)行篩選。融合205產(chǎn)生三個單獨(dú)的陽性克隆，命名為205A、205C、205E。
3.在另一種制備抗大鼠αd單克隆抗體的方法中，6至12周齡的BALB/c小鼠在第1天用純化的大鼠αd-瓊脂糖在福氏完全佐劑中經(jīng)皮下給藥進(jìn)行免疫。在第25天用福氏不完全佐劑中的相同免疫原經(jīng)相同的途徑進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫。與第二次相同的第三次加強(qiáng)免疫在第42天進(jìn)行。在融合前加強(qiáng)免疫前不再進(jìn)行進(jìn)一步的加強(qiáng)，融合前加強(qiáng)免疫包括400ul(融合226)和250ul(融合236)純化的大鼠αd-瓊脂糖的腹膜內(nèi)注射。每體積包含約10至15ug抗原，這由考馬斯染色確定。對于融合226，融合前加強(qiáng)在62天和63天進(jìn)行，融合在66天進(jìn)行；對于融合236，融合前加強(qiáng)在132天和133天進(jìn)行，融合136天進(jìn)行。兩種融合過程與前面介紹的Armenian倉鼠融合所用的過程的不同之處在于，使用5∶1比例的脾細(xì)胞對NS-1細(xì)胞，與之相比，在Armenian融合中，使用2∶1的比例。融合過程的其他方面與Armenian倉鼠過程相同。
融合226和236的篩選和克隆過程與融合197、199和205的過程相同，除了用ELISA進(jìn)行初級篩選外。在ELISA中，使用一種羊抗鼠全分子來從雜交瘤上清中俘獲鼠抗體。并使用一種羊抗鼠辣根過氧化物酶接合物來檢測鼠抗體。陽性克隆接著用FACS按照融合197至205的介紹進(jìn)行篩選。
融合226產(chǎn)生9個陽性克隆，命名為226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H和226I。融合236產(chǎn)生10個陽性克隆，命名為236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、236L和236M。從這些克隆產(chǎn)生的單克隆抗體用ELISA按照實(shí)施例15的介紹進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)所有的抗體均為IgG1同種型。針對大鼠αd單克隆抗體的特征分析為分析抗大鼠αd單克隆抗體的特征，生物素標(biāo)記的脾裂解物按前面實(shí)施例12部分D中的介紹進(jìn)行制備。裂解物在用于免疫沉淀前進(jìn)行預(yù)清除。首先，將50ug/ml的正常鼠免疫球蛋白加入到裂解物中，所獲得的溶液在4℃顛倒旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。加入包被有兔抗鼠免疫球蛋白的蛋白A-瓊脂糖淤漿75ul，繼續(xù)顛倒旋轉(zhuǎn)混合30分鐘。在一臺臺式微量離心機(jī)中在4℃以15,000rpm離心5分鐘，使兔抗鼠包被的蛋白A瓊脂糖珠沉淀，收集上清。棄去沉淀物質(zhì)。
對每個克隆的雜交瘤，將大約300ul的上清加入一個Eppendorf微量離心管，在其中加入30ul 30％的Triton X-100、30ul的抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑酶肽100X貯存液、100ug PMSF晶體和50ul預(yù)清除的生物素化大鼠脾裂解物。將樣品溫和地振蕩旋轉(zhuǎn)，在4℃置于一個顛倒旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)頭30分鐘。一個對照樣品用在50ul大鼠脾裂解物中加入10mg/ml兔抗大鼠αd特異性多克隆抗體來制備。
經(jīng)過30分鐘溫育后，在每個樣品中加入75ul蛋白A-瓊脂糖珠的PBS淤漿，在4℃顛倒旋轉(zhuǎn)溫育30分鐘。蛋白A-偶聯(lián)的珠在一臺臺式微量離心機(jī)中以15,000在4℃離心5分鐘進(jìn)行沉淀，收集上清。沉淀的珠用如下一系列1ml的去污劑順序洗滌含有10mM Tris、400mM NaCl、1.0％Triton X-100、pH8.0的緩沖液#1；含有10mMTris、400mM NaCl、1.0％ Triton X-100、0.5％ Triton X-100、pH8.0的緩沖液#2；含有10mM Tris、400mM NaCl、0.1％脫氧膽酸、pH8.0的緩沖液#3；含有10mM Tris、400mM NaCl、0.5％M LiCl2、pH8.0的緩沖液#4。最后一次洗滌用緩沖液#1進(jìn)行。在每次洗滌中將珠溫和地旋轉(zhuǎn)振蕩，并用臺式微量離心機(jī)沉淀。上清用轉(zhuǎn)移吸液器移去。最后一次洗滌后，用Hamilton注射器將剩余的緩沖液從珠中移出。在各個沉淀中加入50ul含有溴酚藍(lán)和派洛寧Y染料和終濃度為10％的β-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液。將混合物劇烈振蕩旋轉(zhuǎn)1-2分鐘，并在室溫溫育5-10分鐘。樣品在4℃在臺式微量離心機(jī)中以15,000rpm離心5分鐘，收集釋放的蛋白，轉(zhuǎn)移到一個新管中。來自每個樣品的小份在水浴槽中煮沸4分鐘，然后上7.5％SDS-PAGE凝膠。PAGE分離后，將蛋白在200mAmps轉(zhuǎn)移1小時轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。并將濾膜在3.0％ BSA/TBS-T溶液中在4℃封閉過夜。向每張濾紙加入含有1∶6000稀釋的鏈親和素-OPD的0.1％ BSA-TBS-T溶液，在室溫繼續(xù)溫育1小時。濾膜在TBS-T中洗滌5次，每次10分鐘，用Amersham’s ECL試劑盒按照廠商推薦的程序進(jìn)行顯色。
克隆199M被發(fā)現(xiàn)能免疫沉淀一種異源二聚體蛋白。較大的蛋白亞基具有約170-175kD的分子量，與用兔抗大鼠αd多克隆對照免疫沉淀的蛋白大小一致。還沉淀了分子量約為95kD的第二種蛋白，與CD18的分子量一致。實(shí)施例23單克隆抗體199M的特異性使用接合有199M單克隆抗體的CNBr-Sepharose親和柱來從脾細(xì)胞裂解物中親和純化大鼠αd。簡而言之，將大約1.3×1010大鼠脾細(xì)胞在含有150mM NaCl、10mM PMSF、10mM Tris、1％ Triton X-100、pH8.0的緩沖液中裂解。緩沖液中的細(xì)胞在冰上溫育30分鐘并在4℃用約10,000×g離心30分鐘。
將抗體199M按下述方法與CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)接合。將1克活化的樹脂懸浮于1mM HCl中15分鐘，用15ml 1mM HCl洗滌三次，用15ml含有0.1mM HCO3、0.5M NaCl、pH8.0的偶聯(lián)緩沖液洗滌一次。將偶聯(lián)緩沖液中的抗體199M按終濃度約10-20mg/ml加入到樹脂懸液中，混合物在4℃溫育過夜。第二天，離心使接合的樹脂沉淀，棄去上清。樹脂上未處理的基團(tuán)通過在室溫在0.1M Tris、pH8.0中溫育1小時進(jìn)行封閉。接合的樹脂用0.1M檸檬酸、pH3.0洗滌，并以1∶2淤漿的形式貯存于含有0.1％疊氮化鈉的裂解緩沖液中。
為進(jìn)行親和純化，將脾細(xì)胞與0.4ml的199M接合的瓊脂糖樹脂顛倒混合過夜進(jìn)行溫育。然后離心沉淀樹脂，用15ml裂解緩沖液洗滌樹脂4次。將每份約100ul的凝膠在含有0.1M Tris-HCl、pH6.8、2.0％SDS、20％甘油、0.0002％溴酚藍(lán)、10％β-巰基乙醇(終濃度為5％)的還原型樣品緩沖液中迅速煮沸，并上樣，蛋白用6.0％聚丙烯酰胺SDS凝膠(SDS-PAGE)分辨。
SDS-PAGE分離時，親和純化的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)含有兩個主要和一個次要蛋白種類。一個具有90kD分子量的主要蛋白帶與CD18的已知大小一致，未對這個條帶進(jìn)行測序。對160kD的第二個主要帶進(jìn)行了檢測，該帶與αd的預(yù)測分子量一致。此外，還檢測了表觀分子量為200kD的次要帶。160kD和200kD都用蛋白氨基端測序進(jìn)行了分析，并將結(jié)果與用大鼠αdcDNA預(yù)測的氨基酸序列以及已知的CD11c和CD11b的氨基酸序列進(jìn)行了比較。160kD和200kD帶的序列被發(fā)現(xiàn)均與用克隆的大鼠αd預(yù)測的氨基酸序列一致，這表明可能有兩種形式的αd，它們可能是剪接變體或由糖基化差異造成的。實(shí)施例24使用大鼠表達(dá)αd的巨噬細(xì)胞的T細(xì)胞增殖試驗(yàn)分離自大鼠脾臟的表達(dá)αd的巨噬細(xì)胞被用作抗原遞呈細(xì)胞(APC)來刺激一種名為LR-21的髓磷脂堿性蛋白特異性T細(xì)胞系。簡而言之，大鼠用100ul體積的鐵顆粒(BioMag，Cambridge，MA)經(jīng)靜脈注射。第二天，用脾臟制備單細(xì)胞懸液，用磁收集具有吞噬的鐵顆粒的αd+巨噬細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)和免疫沉淀顯示，吞噬鐵的細(xì)胞50至80％是αd+。
結(jié)果顯示，表達(dá)αd的脾巨噬細(xì)胞相比于其他APC例如胸腺巨噬細(xì)胞是非常弱的APC。還在增殖試驗(yàn)中用αd陽性的巨噬細(xì)胞和LR-21細(xì)胞系檢測了命名為205C的單克隆抗體。然后按如下方法進(jìn)行增殖試驗(yàn)。
αd表達(dá)陽性的脾巨噬細(xì)胞按6×106細(xì)胞/ml的密度懸浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，在每孔中加入100ul的巨噬細(xì)胞懸液。來自LR-21細(xì)胞系的細(xì)胞按1×106細(xì)胞/ml的密度懸浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，并在每孔中加入50ul懸液。在每孔中加入50ul體積的單克隆抗體205C至終濃度為50、10和2ug/ml。板在37℃溫育72小時，并加入1uCi3H-胸腺嘧啶來進(jìn)行最后24小時溫育。將細(xì)胞收集到玻璃纖維墊上，用直接β計(jì)數(shù)器(Packard Matrix96)測定3H整合。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高濃度的抗體205C(10和50ug/ml)能以劑量依賴方式降低T細(xì)胞增殖。實(shí)施例25來自大鼠骨髓的αd的免疫沉淀用PBS沖洗股骨的方法從一只Lewis大鼠中收集骨髓細(xì)胞。細(xì)胞基本上按實(shí)施例18介紹的方法洗滌、生物素化和免疫沉淀，使用20ug純化的單克隆抗體來從100ul預(yù)清除的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀蛋白。免疫沉淀蛋白的檢測按前面介紹的方法進(jìn)行。
大鼠αd單克隆抗體205C免疫沉淀以160kD和95kD遷移的兩條帶，這樣大小的帶與在用相同抗體從脾細(xì)胞裂解物中進(jìn)行蛋白質(zhì)的免疫沉淀觀察到的αd/CD18的α和β鏈的大小一致?？勾笫驝D11a、CD11b或CD11c的抗體免疫沉淀與αd不同的α鏈，所有的抗體都共沉淀一種分子量與CD18的已知分子量一致的蛋白。實(shí)施例26αd在動物模型中的表達(dá)初步的結(jié)果顯示，大鼠αd選擇性地表達(dá)于巨噬細(xì)胞的亞群，包括胸腺中的皮層巨噬細(xì)胞、肝臟中的枯否細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的維管細(xì)胞、腹膜巨噬細(xì)胞的亞群和靜止的骨髓巨噬細(xì)胞。此外，硫葡萄糖鹽巨噬細(xì)胞的一個亞群在用地塞米松刺激后顯示αd的表達(dá)上調(diào)。所觀察到的大鼠αd的巨噬細(xì)胞限制性表達(dá)表明需要對多種動物模型中的表達(dá)作進(jìn)一步的分析。大鼠αd在苯肼模型中的表達(dá)對動物給予苯肼會導(dǎo)致大量血紅細(xì)胞(rbc)損傷而產(chǎn)生暫時性貧血。受損的血紅細(xì)胞被紅髓巨噬細(xì)胞從循環(huán)中清除，從而導(dǎo)致明顯的脾大。據(jù)推測表達(dá)αd的巨噬細(xì)胞可能參與受損血紅細(xì)胞和其他外源物質(zhì)從循環(huán)中清除。
為驗(yàn)證此假說，多組大鼠單獨(dú)用鹽水或溶解于鹽水中的苯肼處理，并經(jīng)腹膜內(nèi)按100mg/kg體重進(jìn)行給藥。在一些實(shí)驗(yàn)中，大鼠用針對大鼠αd的“結(jié)構(gòu)域I”產(chǎn)生的多克隆抗血清進(jìn)行處理。
在苯肼給藥后的不同時間點(diǎn)處死動物，脾重和血細(xì)胞比容用作血紅細(xì)胞清除的參數(shù)。此外，收集腎、脾和肝進(jìn)行組織病理學(xué)分析，包括對CD11a、CD11b、CD11c和αd進(jìn)行免疫染色。
總的發(fā)現(xiàn)表明，用苯肼(鹽水對照和αd處理)處理4天后，大鼠產(chǎn)生了急劇的脾大，而血細(xì)胞比容降低。用αd多克隆血清處理對苯肼誘導(dǎo)的脾細(xì)胞重量或血比容下降沒有影響。
將來自鹽水和4天苯肼處理的大鼠的組織制成4um厚的切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)載玻片上在室溫空氣干燥15分鐘。使用前，將載玻片在50℃溫育約5分鐘。切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中在室溫固定2分鐘，并在室溫干燥。將切片置于100ml的1X TBS、1.1ml 30％的H2O2(Sigma)、1ml 10％ NaN3(Sigma)在室溫放置15分鐘以去除內(nèi)源性的過氧化物酶活性。每個切片用150ul含有1X TBS中的30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的溶液在室溫封閉30分鐘，然后溫和地從切片上去除溶液。每個切片用75ul在封閉液中稀釋至13.3ug/ml的生物素化的倉鼠抗大鼠αd抗體205C，在室溫處理1小時。溫育后，切片在1X TBS中洗滌三次，每次5分鐘，以去除任何未結(jié)合的抗體。在最后一次洗滌后在組織周圍將多余的TBS吸出。過氧化物酶接合的羊抗生物素抗體(Vector Laboratories)在封閉液中稀釋至1∶200，將75ul用于每個切片，室溫下30分鐘。溫育后，載玻片在1X TBS中洗滌2次，每次5分鐘。加入AEC(Vector Laboratories)底物，通過浸入水中使顯色終止。將載玻片在Gill’s蘇木精#2(Sigma)中負(fù)染，并在水中漂洗，然后在70％、95％、100％乙醇及二甲苯中依次脫水。然后切片用cytoseal(VWR)封固。
在用鹽水處理的大鼠脾切片中，大多數(shù)的αd表達(dá)位于脾紅髓中形態(tài)學(xué)鑒定為巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的一個亞群的細(xì)胞上。而在苯肼處理的大鼠脾中，脾紅髓經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)改變，使得唯一鑒定的細(xì)胞型是吞噬了受損血紅細(xì)胞的大巨噬細(xì)胞群體。這些巨大的巨噬細(xì)胞的大多數(shù)被觀察到表達(dá)αd。在苯肼處理的大鼠中，還顯示脾白髓中表達(dá)αd的巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加。
在苯肼處理的大鼠脾臟上，還進(jìn)行了雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)來確定αd和CD11c的表達(dá)。如前所述，αd表達(dá)在脾紅髓中顯示吞噬了受損的血紅細(xì)胞的大巨噬細(xì)胞中檢測到。CD11c表達(dá)也在脾紅髓中的大巨噬細(xì)胞中檢測到，而且在紅髓中CD11c陽性細(xì)胞顯示比αd陽性細(xì)胞多。大多數(shù)表達(dá)αd的巨噬細(xì)胞也表達(dá)CD11c，盡管觀察到一小部分αd陽性巨噬細(xì)胞不表達(dá)CD11c。也有一個群體的CD11c陽性巨噬細(xì)胞不表達(dá)αd。
因此免疫學(xué)分析表明，在苯肼處理的動物的脾臟中CD11c的表達(dá)在第4天與鹽水對照相比顯示上調(diào)。而其他整合素CD11a、CD11b和αd的表達(dá)顯示不受苯肼處理的影響。用多克隆“I”結(jié)構(gòu)域αd抗體處理也顯示不影響紅髓巨噬細(xì)胞對血紅細(xì)胞的攝取，但吞噬血紅細(xì)胞的的巨噬細(xì)胞多數(shù)是αd陽性。吞噬受損的血紅細(xì)胞的αd陽性巨噬細(xì)胞不存在于苯肼給藥7天后收集的脾臟中。
隨后使用凋亡試驗(yàn)和用生物素接合的抗體205C對4天苯肼處理的大鼠脾臟進(jìn)行雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。將來自正常大鼠和4天苯肼處理的大鼠的組織制成4微米厚的切片，在Superfrost Plus(VWR Scientific)上在室溫空氣干燥15分鐘，并貯存于-20℃。使用前，將載玻片加熱至50℃。將加溫的載玻片置于含有100ml的1X TBS、1.1ml 30％的H2O2(Sigma)、1ml 10％ NaN3(Sigma)的緩沖液在室溫放置15分鐘以去除內(nèi)源性的過氧化物酶活性。每個切片用150ul含有1X TBS中的20％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的溶液在37℃封閉10分鐘，然后溫和地從切片上去除溶液。每個切片用75ul在封閉液中稀釋至26.6ug/ml的生物素化的倉鼠抗大鼠αd抗體205C在37℃溫育30分鐘。然后切片在1X TBS中洗滌三次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。在最后一次洗滌后在組織周圍將多余的TBS吸出。將按照廠商的指示制備的堿性磷酸酶接合的親和素/生物素復(fù)合物(Vector Laboratories)用于每個切片，37℃下20分鐘。溫育后，載玻片在1X TBS中洗滌2次，每次5分鐘。切片在4℃用低聚甲醛(Sigma)固定5分鐘。然后切片在1X PBS中洗滌，并置于CSK緩沖液(100mM NaCl、300mM蔗糖、10mM PIPES pH6.8、3mM MgCl2、0.5％ Triton-X-100)中4℃兩分鐘。將切片在1X PBS中在室溫漂洗2分鐘，然后切片用1X PBS洗滌三次，每次5分鐘。將TUNEL反應(yīng)混合物(Boehringer Mannheim)應(yīng)用于每個切片，37℃下60分鐘。溫育后，切片在1X PBS中洗滌三次，每次5分鐘。凋亡試劑盒的原理與原位雜交相似，TUNEL試劑(FITC接合的)與“切口”DNA雜交。將轉(zhuǎn)變子-POD(一種識別TUNEL試劑上的FITC標(biāo)志的過氧化物酶接合的抗體)用于每個切片，37℃下30分鐘。切片用1X PBS洗滌三次，每次5分鐘。加入AEC(Vector Laboratories)底物，浸入水中終止顯色。切片用Aquamount(VWR)封固。
在模型中，脾臟的紅和白髓區(qū)域中的大量細(xì)胞都產(chǎn)生凋亡，但紅髓中已經(jīng)吞噬了血紅細(xì)胞的大巨噬細(xì)胞(表達(dá)αd并在模型的第7天消失)沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生凋亡。正常大鼠脾上大鼠αd表達(dá)的細(xì)胞類型分析為確定哪種大鼠細(xì)胞類型表達(dá)αd，在正常大鼠脾臟上進(jìn)行雙標(biāo)記染色。按前述方法制備正常大鼠脾臟的切片直至大鼠血清封閉步驟。加入第一細(xì)胞標(biāo)記抗體后，堿性磷酸酶接合的羊抗鼠抗體(JacksonLaboratories)在用于第一抗體的相同稀釋劑中稀釋到1∶500，并將75ul加入到每個切片上，室溫30分鐘。載玻片在1X TBS中洗滌2次，每次洗滌5分鐘。將堿性磷酸酶標(biāo)記的驢抗羊抗體(JacksonLaboratories)在抗體稀釋劑中稀釋到1∶300，并將75ul加至每個切片，室溫30分鐘。按上述方法洗滌和封閉后，每個切片接受75ul蛋白濃度為20ug/ml的生物素化的倉鼠抗大鼠αd抗體(205C)，各1小時45分鐘，然后洗滌去除未結(jié)合的抗體。最后一次洗滌后從組織周圍吸去多余的TBS。將過氧化物酶接合的羊抗生物素(VectorLaboratories)在抗體稀釋劑中稀釋至1∶200。并將75ul加入每個切片，室溫下45分鐘。載玻片用1X TBS洗滌2次，每次洗滌5分鐘。加入AEC底物(Vector Laboratories)，浸入水中終止顯色。然后加入Fast Blue底物(Vector Laboratories)，浸入水中終止顯色。然后載玻片用Aquamount(Baxter)封固。
雙抗體免疫細(xì)胞化學(xué)用針對CD5、CD2、CD4、CD8、NK標(biāo)記、或HIS45(一種T細(xì)胞標(biāo)記)結(jié)合一種抗αd抗體來進(jìn)行，以設(shè)法確定表達(dá)αd的細(xì)胞的表型。用CD2/αd或HIS45/αd沒有檢測到雙標(biāo)記細(xì)胞。在正常大鼠的脾紅髓中，αd能夠標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)也能表達(dá)CD5的小細(xì)胞束。還沒有確定這種CD5陽性細(xì)胞是否是T細(xì)胞或B細(xì)胞。在紅髓中一小群αd表達(dá)細(xì)胞被測定也表達(dá)CD4。此外，NK細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞的一個亞群也被鑒定為表達(dá)αd。因此，脾臟中的αd表達(dá)發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞、可能的B細(xì)胞的一個亞群、NK細(xì)胞的一個亞群和巨噬細(xì)胞的一個亞群。αd在來自F344大鼠模型的巨大粒細(xì)胞性白細(xì)胞(LGL)腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)在F344大鼠中使用獲自國立癌癥研究所的腫瘤細(xì)胞建立了一個LGL白血病大鼠模型，該腫瘤細(xì)胞被靜脈注射到3只雄性F344大鼠中(每只一百萬細(xì)胞)。疾病顯示需要三個月，在此時，將幾只動物處死，用FACS和組織化學(xué)分析檢查組織。
為進(jìn)行FACS分析，取出部分脾臟，按下面的實(shí)施例的介紹制備單細(xì)胞懸液。簡而言之，脾組織用剪刀切成小片，并在存在D-PBS的條件下通過一個金屬篩。離心沉淀細(xì)胞，并重懸于30ml D-PBS。在一個15ml離心管中將5.0ml細(xì)胞懸液鋪于5.0ml Histopaque制備Histopaque梯度(Sigma)。將該梯度用Beckman臺式離心機(jī)在1500rpm離心30分鐘，并收集細(xì)胞層，在D-PBS中洗滌一次，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將細(xì)胞重懸于FACS緩沖液(RPMI-1640/2％FBS、0.2％疊氮化鈉)，使其密度為1×106細(xì)胞/樣品。
細(xì)胞通過與生物素接合的倉鼠抗大鼠αd抗體205C(10ug/ml)和一系列FITC標(biāo)記的抗大鼠細(xì)胞標(biāo)記的抗體溫育來進(jìn)行雙色染色。這些第二種抗體包括抗巨噬細(xì)胞-FITC、抗CD3-FITC和抗IgM(B細(xì)胞)-FITC抗體(均獲自PharMingen)，加上一種FITC接合的具有NK細(xì)胞特異性的抗體(Harlan)。FITC接合的抗體均按10ul/樣品使用。
樣品先在冰上與205C-生物素抗體溫育30分鐘，在FACS緩沖液中洗滌三次，重懸于1.0ml的FACS緩沖液。將FITC接合物與5ul鏈親和素-PE(Pharmigen)一起加入，并將樣品置于冰上30分鐘。溫育后，樣品在FACS緩沖液中洗滌三次，重懸于200ul FACS緩沖液。用Becton Dickinson FACscan檢測樣品，并用LysisII軟件(Becton Dickinson)分析數(shù)據(jù)。
結(jié)果壓倒性地證明了αd在NK或LGL細(xì)胞表面的表達(dá)。B細(xì)胞和T細(xì)胞標(biāo)記染色陽性的細(xì)胞沒有顯示αd表達(dá)，用巨噬細(xì)胞標(biāo)記染色的細(xì)胞顯示僅有輕微程度的αd表達(dá)。據(jù)信在疾病的這一點(diǎn)上，脾臟主要由NK腫瘤細(xì)胞組成，這與觀察到的大群脾細(xì)胞被NK標(biāo)記和αd表達(dá)染色的結(jié)果一致。
這些觀察也與使用從同一動物收集的外周血細(xì)胞并按上面方法進(jìn)行FACS的平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。使用外周血細(xì)胞的結(jié)果表明，循環(huán)的NK細(xì)胞也表達(dá)αd，而血液中表達(dá)其他細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞不顯示αd表達(dá)。但使用外周血細(xì)胞的結(jié)果并不像推測是由于脾臟和外周血中存在不同的細(xì)胞類型的百分比差異產(chǎn)生的脾細(xì)胞結(jié)果那樣變化劇烈。
在用來自這些模型動物的大鼠脾細(xì)胞接著進(jìn)行FACS時，獲得了相同的結(jié)果。在使用上面的細(xì)胞制備物進(jìn)行進(jìn)一步的分析時，LGL腫瘤細(xì)胞也顯示CD18以及CD11a、CD11b和CD11c表達(dá)的染色。
使用上面介紹的ICC程序，對正常和NK F344疾病組織進(jìn)行了組織化學(xué)分析。初步的數(shù)據(jù)表明，αd在NK F344腫瘤肺和肝組織中表達(dá)，但在相應(yīng)的正常組織中沒有檢測到或以極低水平表達(dá)。疾病肺組織顯示αd在小和大的細(xì)胞束以及分散于整個肺的單個細(xì)胞上表達(dá)。NK F344肝顯示小管周圍以及散布整個組織的其他細(xì)胞上的弱標(biāo)記。針對其他β2整合素的抗體顯示，這些分子在正常組織和疾病組織中以相似水平表達(dá)，雖然標(biāo)記圖譜不同。
在平行的分析中，正常大鼠胸腺在皮質(zhì)的分散細(xì)胞中顯示輕微的αd表達(dá)，而F344NK胸腺顯示αd表達(dá)水平增加。正常脾顯示紅髓中的表達(dá)，NK脾臟具有分布整個組織的束狀標(biāo)記。
然后自疾病發(fā)作開始每周檢測NK脾臟，結(jié)果顯示αd的表達(dá)水平提高，直到第三周，然后在第四周下降。實(shí)施例27使用抗αd單克隆抗體抑制NK腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的靶細(xì)胞裂解的分析NK細(xì)胞的一個特殊功能是靶向和殺傷病毒感染細(xì)胞和外源細(xì)胞。為分析NK細(xì)胞裂解特定靶細(xì)胞的能力。靶細(xì)胞用51鉻標(biāo)記，當(dāng)裂解發(fā)生時，在培養(yǎng)基中可檢測到升高的放射性。先前已經(jīng)證明在NK細(xì)胞上表達(dá)的αd，據(jù)推測其可能參與NK細(xì)胞靶向的細(xì)胞殺傷。為評價這一假說，腫瘤細(xì)胞與αd抗體預(yù)溫育，來分析αd在一個功能分析中的作用。αd陽性NK-腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的制備用從國立癌癥研究所獲得的NK腫瘤細(xì)胞注射F344大鼠，并在取出脾臟前在動物中傳代3至4周。取出脾臟，切成小片，在D-PBS存在下通過一個金屬篩。將所獲得的細(xì)胞懸液在Beckman臺式離心機(jī)上在室溫以1500rpm離心10分鐘。吸出上清，將細(xì)胞重懸于30mlD-PBS。
然后按下述方法進(jìn)行來自血液的單個核細(xì)胞的Histopaque分離。在6個15ml離心管中加入5ml Histopaque(Sigma)，在其上鋪一層上面介紹的細(xì)胞懸液5ml。細(xì)胞在Beckman臺式離心機(jī)上在室溫以1500rpm離心30分鐘。收集細(xì)胞層，合并，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。在D-PBS中制備幾種分離的腫瘤細(xì)胞的稀釋物，并隨后在存在或不存在濃度為50ug/ml的抗大鼠αd抗體的條件下溫育。對照抗體包括一種抗大鼠CD18抗體和一種抗大鼠ICAM-1抗體，這兩種抗體也以50ug/ml的濃度與細(xì)胞溫育。在試驗(yàn)前，腫瘤細(xì)胞與抗體在37℃預(yù)溫育約30分鐘。Yak-1靶細(xì)胞的鉻標(biāo)記Yak-1細(xì)胞(ATCC)是一種小鼠淋巴瘤細(xì)胞系，將該種細(xì)胞培養(yǎng)于10％FBS/RPMI 1640。離心收集細(xì)胞，在1.5至4.0ml RPMI“測試培養(yǎng)基”中按約1×107的細(xì)胞密度重懸。測試培養(yǎng)基用500ml RPMI1640、5ml Pen-Strep抗生素溶液和10ml FBS制備。在Yak-1細(xì)胞懸液中加入約200至300uCi的51鉻，然后在37℃輕微混合溫育45至60分鐘。溫育后，用測試培養(yǎng)基將體積增加至50ml，并離心沉淀細(xì)胞。棄去上清，將細(xì)胞懸浮于1至3ml測試培養(yǎng)基，并將密度調(diào)為5×104。還制備濃度為1×107細(xì)胞/ml的非標(biāo)記Yak-1細(xì)胞用作自身對照。
通過用γ計(jì)數(shù)器測試三個重復(fù)中100ul的標(biāo)記細(xì)胞懸液來測定標(biāo)記細(xì)胞的活性。短期鉻釋放試驗(yàn)將NK效應(yīng)細(xì)胞的各個稀釋物按三個重復(fù)鋪于96孔微量板中的100ul體積測試培養(yǎng)基中，在每孔中加入100ul標(biāo)記的Yak-1細(xì)胞。自身即自發(fā)或背景的釋放用100ul標(biāo)記細(xì)胞和非標(biāo)記Yak細(xì)胞在每個效應(yīng)細(xì)胞稀釋度溫育來獲得。總51鉻釋放用在一系列孔的靶細(xì)胞中加入1.0％Triton來獲得。自發(fā)釋放用僅有靶細(xì)胞的孔中發(fā)現(xiàn)的51鉻量進(jìn)行測量。效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞的溫育在37℃進(jìn)行4小時，然后將板離心，從每孔收集100ul上清，測量放射活性。
細(xì)胞裂解活性用下面的公式進(jìn)行計(jì)算
結(jié)果顯示，倉鼠抗大鼠αd抗體(包括199M和205C)和小鼠抗大鼠αd抗體(226A、226B、226C、226D、226F、226G、226H和226I)都不能影響NK腫瘤細(xì)胞殺傷或裂解標(biāo)記的靶細(xì)胞的能力。實(shí)施例28小鼠cDNA克隆的分離設(shè)法分離小鼠αd同源物使用兩種PCR制備的探針進(jìn)行種間交叉雜交相當(dāng)于人克隆19A2(SEQ ID NO1)的堿基522至2047的一個1.5kb片段；和一個相當(dāng)于人克隆19A2(SEQ ID NO1)的堿基1900至2900堿基的1.0kb大鼠片段。人探針使用分別列于SEQ ID NO38和39稱為ATM-2和9-10.1的引物對用PCR進(jìn)行制備；大鼠探針使用分別列于SEQ ID NO34和35的引物對434L和434R來制備。樣品在94℃溫育4分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)的溫度步驟順序94℃；50℃ 2分鐘；72℃ 4分鐘。5’-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3’ (SEQ ID NO38)5’-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3’(SEQ ID NO39)PCR產(chǎn)物用Qiagen Quick Spin試劑盒按照廠商推薦的程序純化，約180DNA使用Boehringer Mannheim隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒按照廠商推薦的程序用200 uCi[32P]-dCTP進(jìn)行標(biāo)記。未摻入的同位素使用Centri-sep自旋柱(Princeton Separation，Adelphia，NJ)按照廠商推薦的程序除去。使用前，探針用0.2N NaOH變性，用0.4MTris-HCl、pH8.0中和。
將一個λZAPII中的小鼠胸腺寡聚dT-引物cDNA文庫(Stratagene)按約30,000噬菌斑每15cm平板進(jìn)行鋪板。硝酸纖維膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上的噬菌斑提呈物在含有30％甲酰胺的預(yù)雜交溶液(8ml/提呈物)中在50℃攪動溫育1小時。將標(biāo)記的人和大鼠探針加入預(yù)雜交溶液中，繼續(xù)在50℃溫育過夜。將濾膜在室溫在2X SSC/0.1％SDS中洗滌兩次，在37℃在2XSSC/0.1％SDS中洗滌一次，在42℃在2X SSC/0.1％SDS中洗滌一次。濾膜在Kodak X-Omat AR膠片上在-80℃用增感屏曝光27小時。
將在復(fù)制的提呈物中顯示陽性信號的4個噬菌斑重新劃線于含鎂(LBM)/羧芐青霉素(100mg/ml)的LB培養(yǎng)基平板上，并在37℃溫育過夜。將噬菌斑用Hybond濾膜(AmershaM)提呈，按初次篩選的方法探針檢測，并在Kodak X-Omat AR膠片上在-80℃用增感屏曝光24小時。
將12個給出陽性信號的噬菌斑轉(zhuǎn)至含有10mM Tris-HCl和1mMMgCl2的低Mg++噬菌體稀釋劑中。使用T3和T7引物(分別為SEQ IN NO13和14)和下面的反應(yīng)條件用PCR測定插入子的大小。樣品在94℃溫育4分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)的溫度步驟順序94℃ 15秒；50℃30秒；72℃ 1分鐘。
6個樣品產(chǎn)生大小范圍為300堿基至1kb的不同帶。通過與輔助噬菌體共感染來釋放噬菌粒，并重新環(huán)化制備Bluescript SK-(Stratagene)。所獲得的克隆在LBM/羧芐青霉素(100mg/ml)中培養(yǎng)過夜。DNA用Promega Wizard miniprep試劑盒(Madison，WI)按照廠商推薦的程序進(jìn)行分離。純化DNA的EcoRI限制酶分析證明了用PCR檢測的分子量。插入DNA用分別列于SEQ ID NO40和41的引物M13和M13反向.1進(jìn)行測序。5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ (SEQ ID NO40)5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO41)測序按實(shí)施例4中的介紹進(jìn)行。
在6個克隆中，只有被稱為10.3-1和10.5-2的兩個克隆提供了序列信息，并且是相同的600bp片段。該600bp序列與人αd的相應(yīng)區(qū)域有68％的同一性，與人CD11a有40％的同一性，與人CD11c有58％的同一性，與小鼠CD11b有54％的同一性。然后將該600bp片段用來分離編碼可能的小鼠αd同源物的更完整的cDNA。
將一個λZAPII(Stratagene)中的小鼠脾cDNA文庫(寡聚dT和隨機(jī)引物)按約2.5×104噬菌斑/15cmLBM平板進(jìn)行鋪板。將噬菌斑提呈到Hybond尼龍轉(zhuǎn)移膜上(Amersham)，用0.5M NaOH/1.5M NaCl變性，用0.5M Tris堿/1.5M NaCl/11.6 HCl中和，并用2X SSC洗滌。用紫外線照射的方法將DNA交聯(lián)到濾膜上。
使用按上文所述方法預(yù)先標(biāo)記的探針10.3-1和10.5-2對約500,000個噬菌斑進(jìn)行了篩選。將探針加入預(yù)雜交溶液中并在50℃溫育過夜。濾膜在室溫在2X SSC/0.1％SDS中洗滌兩次，在37℃在2XSSC/0.1％SDS中洗滌一次，在42℃在2X SSC/0.1％SDS中洗滌一次。濾膜在Kodak X-Omat AR膠片上在-80℃用增感屏曝光24小時。將14個在復(fù)制提呈物上給出陽性信號的噬菌斑用于第二輪篩選，第二輪篩選與第一輪篩選基本相同，除了增加最后的高嚴(yán)格條件的洗滌，高嚴(yán)格條件的洗滌為，在50℃在2X SSC/0.1％SDS中，在50℃在0.5XSSC/0.1％SDS中，在55℃在0.2X SSC/0.1％SDS中。濾膜在Kodak X-OmatAR膠片上在-80℃用增感屏曝光13小時。
將18個陽性噬菌斑轉(zhuǎn)移到低Mg++噬菌體稀釋劑中，并按上面的介紹用PCR擴(kuò)增來測定插入子的大小。7個樣品給出范圍為600bp至4kb的陽性帶。純化DNA的EcoRI限制酶分析證明了用PCR觀察到的大小，DNA用引物M13和M13反向.1(分別為SEQ ID NO40和41)進(jìn)行測序。
一個被命名為B3800的克隆含有一個相當(dāng)于人αd19A2克隆的5’端下游200bp的區(qū)域的4kb插入子，并包括3’非翻譯區(qū)的553堿基?？寺3800顯示與人αd的相應(yīng)區(qū)域有77％的同一性，與人CD11a的相應(yīng)區(qū)域有44％的同一性，與人CD11c的相應(yīng)區(qū)域有59％的同一性，與小鼠CD11b的相應(yīng)區(qū)域有51％的同一性。第二個克隆A1160是一個1.2kb的插入子，該插入子與人αd編碼區(qū)的5’端起始甲硫氨酸下游約12核酸處并列?？寺1160顯示與人αd的相應(yīng)區(qū)域有75％的同一性，與人CD11a的相應(yīng)區(qū)域有46％的同一性，與人CD11c的相應(yīng)區(qū)域有62％的同一性，與小鼠CD11b的相應(yīng)區(qū)域有66％的同一性。
片段更接近人克隆19A2的5’端的克隆A1160，長度為1160堿基，與克隆B3800共有一段起始于堿基205并延續(xù)到堿基1134的重疊區(qū)域?？寺1160具有一個在B3800的重疊區(qū)域中不存在的110堿基的插入(克隆A1160的堿基704-814)。該插入可能位于外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)域(Fleming等，《免疫學(xué)雜志》150卷，480-490頁(1993))，在克隆A1160和B3800的隨后連接前移去。推定的小鼠αd克隆的5’cDNA端的快速擴(kuò)增使用RACE PCR(Frohman，《PCR方法，方法和應(yīng)用指南》中的“RACE，cDNA末端的快速擴(kuò)增”，Innis，等(編輯)，28-38頁，Academic Press，New York(1990))來獲得丟失的推定小鼠αd克隆的5’端序列，包括5’非翻譯序列和起始甲硫氨酸。按照廠商推薦的程序使用一個小鼠脾RACE-Ready試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)。設(shè)計(jì)兩個反義的、基因特異的引物---A1160 RACE1-初級和A1160RACE2-巢式(SEQ ID NO42和43)來進(jìn)行初級和巢式PCR。5’-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3’ (SEQ ID NO42)5’-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3’ (SEQ ID NO43)引物SEQ ID NO42和43分別對應(yīng)于從5’端302和247堿基起始的區(qū)域。使用5’錨引物(SEQ ID NO44)和試劑盒提供的小鼠脾cDNA按上文所述方法進(jìn)行PCR。5’-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3’(SEQ ID NO44)PCR產(chǎn)物電泳顯示了一條大小約280堿基的帶，將其用TA克隆試劑盒(Invitrogen)按照廠商推薦的程序亞克隆。培養(yǎng)10個所獲得的克隆，分離DNA并測序。用這種方法鑒定了5’序列的一個另外60堿基，它對應(yīng)于SEQ ID NO45的堿基1至60。小鼠cDNA和預(yù)測的氨基酸序列的特征編碼人αd的推定同源物的小鼠cDNA的一個合并序列示于SEQ IDNO45。雖然人和小鼠克隆的外部結(jié)構(gòu)域之間的同源性很高，但胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的同源性僅為30％。所觀察到的差異可能表明人和小鼠蛋白之間的C末端功能差異。另外胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的差異也可能由剪接差異引起，或表明另外的β2整合素基因的存在。
在氨基酸水平，由小鼠cDNA可預(yù)測一種蛋白(SEQ ID NO46)，該蛋白與小鼠CD11a有28％的同一性，與小鼠CD11b有53％的同一性，與人CD11a有28％的同一性，與人CD11b有55％的同一性，與人CD11c有59％的相，與人αd有70％的同一性。將人αd的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與同樣長度的其推定的小鼠同源物進(jìn)行比較，結(jié)果顯示這些區(qū)域具有相同的長度但卻有不同的一級結(jié)構(gòu)。這些區(qū)域的序列長度相似表明是種間變化而不是剪接變體形式。當(dāng)與上文實(shí)施例20中的預(yù)測大鼠多肽進(jìn)行比較時發(fā)現(xiàn)，小鼠和大鼠胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域顯示大于60％的同一性。實(shí)施例29分離另外的小鼠αdcDNA克隆用于序列驗(yàn)證為驗(yàn)證實(shí)施例28中介紹的小鼠αd的核酸和氨基酸序列，分離另外的小鼠序列用于證明。
使用一個小鼠脾隨機(jī)引物文庫和一個λZAPII中的小鼠胸腺寡聚dT-引物cDNA文庫(Stratagene)，用兩種同源性αd探針雜交的方法來進(jìn)行小鼠cDNA的分離。文庫按約5×105噬菌斑每15cmLBM平板進(jìn)行鋪板。將噬菌斑提呈到Hybond尼龍膜上(Amersham)，將膜變性(0.5M NaOH/1.5M NaCl)、中和(0.5M Tris堿/1.5M NaCl/11.6 HCl)、洗滌(2X SSC鹽溶液)。用紫外線照射的方法將DNA交聯(lián)到濾膜上。
探針使用下面介紹的引物在如下條件下的PCR反應(yīng)中制備。樣品在94℃保溫4分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)的溫度步驟順序(94℃ 15秒、50℃ 30秒、72℃ 1分鐘，使用Perkin-Elmer 9600熱循環(huán)儀。
3’探針長約900堿基并跨越從核苷酸2752至3651的區(qū)域(SEQ IDNO1中)(5’→3’)，并用分別示于SEQ ID NO69和74的引物11.b-1/2FOR11和11.b-1/1REV1來制備。該探針用于第一套提呈。
5’探針長約800堿基并跨越從核苷酸149至946的區(qū)域(SEQ IDNO1中)(5’→3’)，并用分別示于SEQ ID NO50和85的引物11.b-1/2FOR1和11.a-1/2REV2來制備。該探針用于第二套提呈。
在第三套提呈中，上面介紹的兩種探針一起用于相同的平板。
使用上面介紹的兩種探針對約500,000個噬菌斑進(jìn)行篩選，探針按實(shí)施例20種介紹的相同方法進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記探針加入含有45％甲酰胺的預(yù)雜交溶液中并在50℃溫育過夜。濾膜在室溫(22℃)在2XSSC/0.1％SDS中洗滌兩次，最后一次洗滌在50℃在2X SSC/0.1％SDS中進(jìn)行，在Kodak X-Omat AR膠片上在-80℃用增感屏放射性自顯影19小時。
對至少在復(fù)制的提呈物上給出陽性信號的13個噬菌斑進(jìn)行第二輪篩選，第二輪篩選按初次篩選的介紹進(jìn)行，除了以下變化，3’和5’標(biāo)記引物都用于雜交，并加上另外一次使用2X SSC/0.1％SDS在65℃的最后洗滌。按上面的介紹進(jìn)行2.5小時的放射性自顯影。
將給出陽性信號的13個噬菌斑(命名為MS2P1至MS2P13)轉(zhuǎn)入低Mg++噬菌體稀釋劑中。在上面所述相同條件下，使用能與ZAP II中Bluescript噬菌粒退火的T3和T7引物(序列已在前面介紹)，用PCR擴(kuò)增(Perkin-Elmer 9600 thermocycler)來測定插入子的大小。條帶大小在500堿基至4 kb的范圍內(nèi)。噬菌粒用M13和M13反向.1(分別為SEQ ID NO40和41)分離、制備和測序。對13個克隆中的5個MS2P-3、MS2P-6、MS2P9、MS2P-12、MS2P-13進(jìn)行了測序，而且它們一起，表示了從5’端的約堿基200到3’末端的第一個終止密碼子后約300堿基的區(qū)域。
自動測序按實(shí)施例4中的介紹進(jìn)行。首先使用M13和M13反向.1引物(分別為SEQ ID NO40和41)來測定每個克隆的末端序列，并確定其相對于結(jié)構(gòu)#17(SEQ ID NO45)的位置。然后每個克隆用對特定區(qū)域適當(dāng)?shù)囊?列于下面)進(jìn)行完全測序。11.b-1/2FOR1 5’-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3’(SEQ ID N050)l1.a-1/1FOR2 5’-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3’(SEQ ID NO60)11.a-1/1FOR3 5’-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3’(SEQ ID NO61)11.b-1/2FOR4 5’-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3’(SEQ ID NO62)11.b-1/2FOR5 5’-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3’(SEQ ID NO63)11.b-1/2FOR6 5’-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3’(SEQ ID NO64)11.b-1/2FOR7 5’-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3’(SEQ ID NO65)11.b-1/2FOR8 5’-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3’(SEQ ID NO66)11.b-1/2FOR9 5’-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3’(SEQ ID NO67)11.b-1/2FOR10 5’-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3’(SEQ ID NO68)11.b-1/2FOR11 5’-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3’(SEQ ID NO69)11.b-1/2FOR12 5’-GTCACAGAGGGAACCTCC-3’(SEQ ID NO70)11.b-1/2FOR13 5’-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3’(SEQ ID NO71)11.b-1/2FOR14 5’-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3’(SEQ ID NO72)11.b-1/2FOR15 5’-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3’(SEQ ID NO73)11.b-1/2REV2 5’-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3’(SEQ ID NO74)11.b-1/2REV3 5’-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3’(SEQ ID NO75)11.b-1/2REV4 5’-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3’(SEQ ID NO76)11.b-1/2REV5 5’-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3’(SEQ ID NO77)11.b-1/2REV6 5’-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3’(SEQ ID NO78)11.b-1/2REV7 5’-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3’(SEQ ID NO79)11.b-1/2REV8 5’-GATCCAACGCCAGATCATACC-3’(SEQ ID NO80)11.b-1/2REV9 5’-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO81)11.b-1/2REV10 5’-CACGTCCCCTAGCAGTGTCAG-3’(SEQ ID NO82)11.b-1/2REV11 5’-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3’(SEQ ID NO51)11.b-1/2REV12 5’-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3’(SEQ ID NO83)11.b-1/2REV13 5’-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3’(SEQ ID NO84)11.a-1/1REV1 5’-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3’(SEQ ID NO85)11.a-1/1REV2 5’-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3’(SEQ ID NO86)將序列編輯、并列，并與以前分離的小鼠αd序列(結(jié)構(gòu)物#17，SEQ IDNO45)進(jìn)行比較。
新序列排列揭示，在結(jié)構(gòu)#17中有一個始于核苷酸2308的18堿基刪除，該刪除沒有造成閱讀框移動。按上面的介紹測序的克隆MS2P-9也顯示相同的18堿基刪除。該刪除被發(fā)現(xiàn)在50％的含有該區(qū)域的小鼠克隆中發(fā)生，但在大鼠或人的αd克隆中卻沒有檢測到。18堿基刪除的特征是一個12堿基的回文序列AAGCAGGAGCTCCTGTGT(SEQ IDNO91)。這個核酸序列中的反向重復(fù)序列是自身互補(bǔ)的，并可能形成一個向外的環(huán)，在逆轉(zhuǎn)錄過程中導(dǎo)致切除。含有該額外的18堿基的小鼠αd序列列于SEQ ID NO52，其推導(dǎo)的氨基酸序列列于SEQ ID NO53。實(shí)施例30小鼠中原位雜交接著確定小鼠αd的組織分布，來提供與實(shí)施例6中介紹的人αd分布的比較。
采用體外RNA轉(zhuǎn)錄并整合32S-UTP(Amersham)的方法，從一個DNA模板中制備了一個單鏈的200bp的mRNA探針，該探針對應(yīng)于小鼠cDNA胞質(zhì)尾區(qū)域的核苷酸3460至3707。
使用放射性標(biāo)記的單鏈mRNA探針對小鼠全胚胎(受精后11-18天收集)和不同的小鼠組織包括脾臟、腎臟、肝臟、小腸和胸腺進(jìn)行原位雜交。
將組織切成6um厚，并黏附在Vectabond(VectorLaboratories，Inc，Burlingame，CA)包被的載玻片上，貯存于-70℃。在使用前，將載玻片從-70℃中取出，在50℃放置約5分鐘。將切片在4％低聚甲醛中4℃固定20分鐘，用不斷提高的乙醇梯度(75-95-100％)在4℃進(jìn)行脫水，每個濃度1分鐘，在室溫下空氣干燥30分鐘。將切片在70％甲酰胺/2X SSC中在70℃變性2分鐘，在2X SSC中漂洗2次，用上面介紹的乙醇梯度脫水并空氣干燥30分鐘。雜交在55℃在含有6×105cpm/切片的35S標(biāo)記核酸探針和在焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中終濃度為50％的甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris-HCl、pH7.5、10％硫酸葡聚糖、1X Denhardts溶液、100mM二硫蘇糖醇(DTT)和5mM EDTA的溶液中過夜(12-16小時)進(jìn)行。雜交后，切片在室溫在4X SSC/10mM DTT中洗滌1小時，在60℃在50％甲酰胺/2X SSC/10mM DTT中洗滌40分鐘，在室溫在2X SSC中洗滌30分鐘，在室溫在0.1X SSC中洗滌30分鐘。將切片脫水，空氣干燥2小時，用Kodak NTB2照相乳膠包被，空氣干燥2小時，顯色(在完全黑暗中在4℃保存后)，并用蘇木精/伊紅負(fù)染。
脾組織顯示主要在紅髓的強(qiáng)信號。這一圖譜與脾臟中組織巨噬細(xì)胞的分布一致，但不排除其他的細(xì)胞類型。實(shí)施例31小鼠表達(dá)結(jié)構(gòu)的制備為構(gòu)建包含與人αd顯示同源性的小鼠cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒，將來自克隆A1160和B3800的插入子連接。但在該連接前，將一段含有一個起始甲硫氨酸的5’前導(dǎo)序列加入到克隆A1160。設(shè)計(jì)命名為“5’PCR前導(dǎo)”(SEQ ID NO47)的引物，該引物含有(1)在位置1-6為相同的便于消化的非特異性堿基；(2)便于亞克隆到表達(dá)載體中的位置7-12的BamI位點(diǎn)(SEQ ID NO47中下劃線)；(3)位置13-18的一個共有的Kozak序列；(4)含有一個起始甲硫氨酸密碼子(SEQ IDNO47中粗體)的信號序列；和(5)特異性地與克隆A1160的5’序列重疊以便于引物退火的另外31個堿基。使用第二個稱為“3’endfrag″(SEQ ID NO48)的引物和引物“5’PCR前導(dǎo)”來從克隆A1160中擴(kuò)增插入子。5’-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3’(SEQ ID NO47)5’-GCTGGACGATGGCATCCAC-3’(SEQ ID NO48)所獲得的PCR產(chǎn)物不能被BamHI消化，說明限制酶切位點(diǎn)前的堿基數(shù)目不足，抑制了酶的識別。增加5’引物(SEQ ID NO47)中BamHI位點(diǎn)前“尾”序列的長度，在第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上重復(fù)PCR。設(shè)計(jì)了一個稱為mAD.5’.2(SEQ ID NO49)的5’引物，它在位置1-4帶有額外的非特異性堿基，并含有特異性地與前面所用的“5’PCR前導(dǎo)”引物序列重疊的另外20個堿基。5’-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3’ (SEQ ID NO49)將引物“mAD.5’.2”和“3’end frag″同時用于以第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板的PCR反應(yīng)中。將獲得的第二次PCR產(chǎn)物按照廠商推薦的程序亞克隆到質(zhì)粒pCRtmII(Invitrogen)中，并轉(zhuǎn)化到One shot感受態(tài)細(xì)胞中(Invitrogen)。用BamHI和EcoRI限制酶切分析了一個含有PCR產(chǎn)物的克隆，并進(jìn)行測序。證實(shí)了序列之后，用BamHI和EeoRI消化和凝膠純化分離插入子。
用EcoRI和NotI消化、凝膠純化從克隆B3800中分離插入子，并加入一個含有擴(kuò)大的A1160 BamHI/EcoRI片段的連接反應(yīng)中。連接在14℃進(jìn)行14小時。在連接反應(yīng)中加入用BamHI和NotI消化的載體pcDNA.3(Invitrogen)及額外的連接酶，繼續(xù)反應(yīng)12小時。將一小份反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)所獲得的克隆，使用引物11.b-1/2FOR1和11.b-1/2REV11(分別為SEQ ID NO50和51)用PCR分析來對一個陽性克隆進(jìn)行鑒定。這些引物跨越了A1160和B3800片段，因此檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物就表明兩個片段已經(jīng)連上。陽性克隆的序列用列于SEQ ID NO50和51的引物進(jìn)行驗(yàn)證，這對引物能夠擴(kuò)增起始甲硫氨酸后從堿基100至1405。實(shí)施例32一種敲除小鼠的構(gòu)建為更精確地評價推定的小鼠αdcDNA編碼的蛋白的免疫學(xué)作用，設(shè)計(jì)了一種“敲除”小鼠，在這種小鼠中，編碼推定αd同源物的基因組DNA序列用同源重組破壞。這樣由被破壞的基因編碼的蛋白的意義就可以用編碼蛋白的缺乏來評價。“敲除”小鼠的制備在Deng等，《分子細(xì)胞生物學(xué)》13卷，2134-2140(1993)中介紹。
設(shè)計(jì)這樣的小鼠從構(gòu)建含有準(zhǔn)備用同源重組事件“敲除”的基因的質(zhì)粒開始。使用小鼠cDNA的一個750堿基對片段(相當(dāng)于SEQ IDNO45中核苷酸1985至2733)從一個λFIXII基因組文庫中鑒定一個編碼推定的小鼠αd同源物的小鼠基因組序列。初次的篩選產(chǎn)生了14個陽性克隆，其中7個用第二次篩選來證實(shí)。從兩個給出最強(qiáng)信號的噬菌斑獲得液體裂解物，并用傳統(tǒng)的方法分離λDNA。限制酶切圖譜和Southern分析證明了其中一個命名為14-1的克隆的正確性。用NotI消化分離插入DNA。將該片段克隆到Bluescript SKII+。
為鑒定一個約為9-14kb的限制酶切片段(據(jù)稱此長度為使同源重組事件的可能性最大)，用750bp cDNA探針進(jìn)行Southern雜交。在雜交前，對克隆14-1建立限制酶切圖譜。一個12kb的片段被鑒定為可能的候選物，并將該片段亞克隆到pBluescript SKII+中一個位置，使小鼠DNA的側(cè)翼為胸苷激酶編碼盒。用一種I結(jié)構(gòu)域探針(相當(dāng)于SEQ ID NO45中核苷酸454-1064)對該克隆進(jìn)一步分析表明，該克隆不含I結(jié)構(gòu)域編碼序列。
使用相同的I結(jié)構(gòu)域探針，對λFIXII基因組文庫進(jìn)行再次篩選。開始，檢測到了6個陽性克隆，其中一個在第二次篩選時保持陽性。由此克隆分離的DNA在Southern分析中與一種I結(jié)構(gòu)域探針反應(yīng)強(qiáng)烈。但用原來的750bp探針沒有檢測到任何反應(yīng)，這說明此克隆包括SEQ ID NO45的核苷酸1985-2773的5’區(qū)域。
另外，不能與750bp探針雜交可能表明，此克隆是整合素蛋白家族的另一種成員。為確定這種解釋是否正確，將13kb的插入子亞克隆到pBluescript SKII+。純化的DNA用相當(dāng)于SEQ ID NO52中的αdI結(jié)構(gòu)域核酸序列441-461、591-612、717-739和反向的898-918的引物進(jìn)行測序。僅在使用第一個4441-4461引物時獲得了序列信息，并且僅有I結(jié)構(gòu)域的5’-most外顯子被有效擴(kuò)增。I結(jié)構(gòu)域的剩余部分沒有被擴(kuò)增。因此，所獲得的克隆含有小鼠αd基因的外顯子6和該外顯子的5’和3’端的內(nèi)含子序列。外顯子7不在克隆中。測序后，制備了一個含有新霉素抗性和胸苷激酶基因的結(jié)構(gòu)。
將新霉素抗性(neor)基因以打斷基因組小鼠DNA的蛋白編碼序列的方式插入到所獲得的質(zhì)粒中。因此所獲得的質(zhì)粒在小鼠基因組DNA序列中含有一個neor基因，所有這些都位于一個胸腺激酶編碼區(qū)域。需要用這種方式構(gòu)建的質(zhì)粒來使同源重組優(yōu)于隨機(jī)重組(Chisaka等，《自然》，355卷，516-520頁(1992)。
另一種策略被用來制備適用于產(chǎn)生αd敲除小鼠的結(jié)構(gòu)。將兩套寡核苷酸引物交給Genome Systems，Inc.(St.Louis，MO)來對由胚胎干細(xì)胞基因組DNA制備的大插入文庫進(jìn)行高嚴(yán)格PCR分析。引物對應(yīng)于αd中I結(jié)構(gòu)域的第一個和最后一個外顯子。鑒定了三個克隆，其中兩個(命名為1117和1118)能與兩種引物反應(yīng)，另一個(命名為1119)只能用來自最后一個外顯子的引物擴(kuò)增。一個小鼠基因組αdDNA的鑒定從克隆1117和1118的細(xì)菌裂解物中按照廠商的指示(GenomeSystems，Inc.)制備質(zhì)粒DNA。αd插入子使用寡核苷酸madk.f1(SEQID NO104)和madk.r1(SEQ ID NO105)和madk.r2(SEQ ID NO106)用PCR進(jìn)行驗(yàn)證。madk.f1SEQ ID NO104TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCmadk.r1SEQ ID NO105GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGGmadk.r2SEQ ID NO106TAT AGC ATA GCA AAT GAT CC兩種質(zhì)粒分成小份用限制內(nèi)切酶BamHI、PstI、SacI、SalI、SmaI、XbaI和XhoI(Boehringer Mannheim)消化。將每個消化樣品在0.8％瓊脂糖凝膠上分開，并將多核苷酸轉(zhuǎn)移到Hybond-N+核酸轉(zhuǎn)移膜上(Amersham)進(jìn)行分析。印跡用32P隨機(jī)標(biāo)記引物DNA為探針進(jìn)行檢測，32P隨機(jī)標(biāo)記引物用1.6kb模板制備，該模板以寡核苷酸madfor1(SEQ ID NO107)和madrev1(SEQ ID NO108)為引物用PCR產(chǎn)生。madfor1 SEQ ID NO107ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATCmadrev1 SEQ ID NO108TCG AGA TCC ACC AAA CTG CAD雜交在含有50％甲酰胺的SSPE中在42℃過夜進(jìn)行。標(biāo)記的印跡在2XSSPE中在室溫洗滌5次。放射性標(biāo)記的帶用將印跡在KodakX-Omat放射性自顯影膠片上在-70℃曝光2小時來顯示。
從克隆1118鑒定了兩個感興趣的片段一個4.1kb的SacI片段和一個8.3kb的XbaI片段。將克隆1118的SacI和XbaI消化的全部樣品內(nèi)容物不經(jīng)進(jìn)一步純化連接到載體pBluescript KS+中，連接后，將全部反應(yīng)內(nèi)容物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1/λ SmR菌株的鈣-感受態(tài)細(xì)胞中。分離產(chǎn)生的克隆，在含有輔助病毒M13K07的200ul選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜來復(fù)制單鏈DNA。然后將取自每個孔的上清10ul點(diǎn)樣到Hybond+轉(zhuǎn)移膜上，用上面介紹的相同探針和程序進(jìn)行雜交。由9個陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并用Wizard Plus Miniprep DNA純化系統(tǒng)(Progema)從每個培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。用限制酶消化和PCR證實(shí)分離的質(zhì)粒中插入子的存在和大小。使用載體引物T3和T7以及對應(yīng)于小鼠αd序列的寡核苷酸引物對三個克隆進(jìn)行序列測定。這三個克隆與小鼠cDNA用Geneworks軟件進(jìn)行的序列比較表明，所有這三個克隆都同時含有小鼠αd的外顯子1和外顯子2。被稱為A的最長克隆是一個8280kb長的XbaI克隆。另兩個較短的克隆被稱為E和H，它們是相同的4112kb長的SacI克隆。選擇8280kb克隆進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)展。實(shí)施例33兔αd的克隆兔cDNA文庫的構(gòu)建和篩選大鼠和小鼠中人αd同源物的鑒定促進(jìn)了對兔同源物的研究，兔同源物在上文介紹的人類疾病的兔模型中將十分有用。
使用Invitrogen FastTrack試劑盒(San Diego，CA)以及試劑盒提供的試劑按照廠商推薦的程序從一個全兔脾臟中制備Poly A+RNA。從1.65克組織中，分離了73ug的Poly A+RNA。使用一個來自Stratagene(La Jolla，CA)的試劑盒來用兔脾RNA構(gòu)建一個ZAP表達(dá)cDNA文庫。將獲得的cDNA直接克隆到pBK-CMV噬菌粒載體的λ臂的EcoRI和XhoI位點(diǎn)。用Gigapack II Gold(Stratagene)將λ臂包裝到噬菌體顆粒中。所獲得的文庫的滴度估計(jì)為8×105顆粒，平均插入大小為1.2kb。
通過鋪板噬菌斑連片生長將文庫擴(kuò)增一次，收集細(xì)胞裂解物。將擴(kuò)增后的文庫按約30,000噬菌斑形成單位(pfu)每150mm大腸桿菌平板進(jìn)行鋪板，將產(chǎn)生的混合物在37℃溫育12-16小時使噬菌斑形成。將噬菌體DNA轉(zhuǎn)移到Hybond N+尼龍膜上(Amersham，ArlingtonHeights，Illinois)。膜用兩種隨機(jī)引物放射性標(biāo)記的小鼠αdPCR DNA探針的混合物進(jìn)行雜交。第一個探針用一個跨越SEQ ID NO52的核苷酸149-946的PCR產(chǎn)物制備。第二個探針來自跨越SEQ ID NO52的核苷酸2752-3651的PCR產(chǎn)物。探針用隨機(jī)引物標(biāo)記法(BoehringerMannheim Random Primed DNA Labeling Kit)進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)混合物通過一個Sephadex G-50柱來去除未摻入的核苷酸。雜交溶液由5XSSPE、5X Denhardts、1％SDS、40％甲酰胺和1×106dpm/ml標(biāo)記探針組成。雜交在42℃進(jìn)行16-18小時。濾膜在2X SSPE/0.1％ SDS中在室溫下充分洗滌，并在X-射線膠片上曝光來顯示任何雜交的噬菌斑。
鑒定了兩個明顯與人αd序列同源的克隆。克隆#2長約800bp，并與人αd的5’末端匹配。克隆#2包括一個起始甲硫氨酸和完整的前導(dǎo)序列?？寺?7長約1.5kb并包括一個起始甲硫氨酸?？寺?7的5’末端與克隆#2的5’末端重疊，而3’末端序列在I結(jié)構(gòu)域序列之后的一個位點(diǎn)終止。用引物步行法對克隆#7進(jìn)行完整的測序。克隆#7的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列分別列于SEQ ID NO100和101。
由克隆#2和克隆#7確定的兔αd的預(yù)測N末端氨基酸序列表明，該蛋白與人αd有73％的同一性，與小鼠αd有65％的同一性，與小鼠CD11b、人CD11b和人CD11c有58％的同一性。克隆#2的核酸序列列于SEQ IDNO92，其預(yù)測的氨基酸序列列于SEQ ID NO93。
使用標(biāo)記的兔克隆#7并對獲取該片段的cDNA文庫再次進(jìn)行篩選，來設(shè)法分離全長的兔αdcDNA。鑒定了25個另外的克隆，其中一個稱為克隆49的被確定為最大。用巢氏刪除技術(shù)對克隆49進(jìn)行完整的測序?？寺?9的核苷酸和氨基酸序列分別列于SEQ ID No102和103。因?yàn)榭寺?7和#49不重疊，設(shè)計(jì)寡核苷酸作為使用第一鏈兔脾cDNA的PCR中的引物，來分離丟失的序列。
這兩個部分克隆的推導(dǎo)氨基酸序列與其他白細(xì)胞整合素的氨基酸序列的關(guān)系介紹于表1。表1β2整合素家族成員在氨基酸水平的同一性百分比人αd兔#7 兔#49人αd1007480小鼠αd70 6774大鼠αd70 6673小鼠CD11a 隨機(jī) 2828小鼠CD11b 55 5953人CD11a 36 2828人CD11b 60 5855人CD11c 66 5962*如果＜25％同一性，僅為隨機(jī)排列，沒有意義。
分離了兔αd克隆，就可以表達(dá)該蛋白，既可以表達(dá)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面，也可以以可溶性的全長或截短形式表達(dá)。然后將該蛋白用作免疫原來制備單克隆抗體，來用于人疾病狀態(tài)的兔模型。實(shí)施例34猴αd的分離制備親和柱為制備一種能從猴脾臟中分離αd的親和柱，將抗人αd抗體212D和217L各10mg對含有0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3的偶聯(lián)緩沖液透析過夜。按照廠商推薦的程序制備約1.0g的CNBr Sepharose4B(Pharmacia，Piscataway NJ)，將1.0mL樹脂與每種透析的抗體混合。所產(chǎn)生的淤漿在4℃旋轉(zhuǎn)過夜進(jìn)行混合。在Beckman臺式離心機(jī)中在1000rpm離心5分鐘，獲取偶聯(lián)的樹脂。收集未吸附的上清部分，用分光光度計(jì)分析未偶聯(lián)蛋白的存在。結(jié)果顯示，所有可用的抗體都已與凝膠基質(zhì)結(jié)合。樹脂上的未偶聯(lián)的活性基團(tuán)用1M乙醇胺在室溫封閉2小時，樹脂在偶聯(lián)緩沖液中經(jīng)一系列高和低pH改變進(jìn)行洗滌，然后用含有0.1M NaC2H3·3H2O和0.5M NaCl、pH4.0的乙酸緩沖液進(jìn)行最后洗滌。所有的樹脂都在偶聯(lián)緩沖液中貯存于4℃。猴脾臟的制備雌性獼猴脾臟獲自華盛頓大學(xué)的Regional Primate Center。用100U/ml的膠原酶D(Sigma)注射脾組織，并將其切成小片。然后將組織片懸浮于小體積的含有50mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、pH8.0和1.0％Triton X-100的裂解緩沖液，并貯存于-70℃。加入蛋白酶抑制劑PLA(抑胃酶肽A、亮抑酶肽和抑酶肽的混合物，均來自Sigma)和4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟鹽酸(AEBSF)(NovaBiochem)以防止貯存過程中的蛋白酶解。貯存組織直到獲得6個獼猴脾臟。
將6個猴的脾臟混合，在一個Waring攪拌器中在含有25mMTris、0.15M NaCl、002％ NaN3。1.0％ Triton、1X PLA和0.1mM AEBSF的TSA裂解緩沖液中勻漿，共進(jìn)行三個循環(huán)，每次10秒鐘。收集裂解物，并在一個旋轉(zhuǎn)平臺上4℃放置1小時。然后在Beckman臺式離心機(jī)中以3000rpm離心15分鐘。收集上清，并棄去沉淀的細(xì)胞殘?jiān)?。共收集了總體積為550ml的裂解物，將裂解物在4℃與預(yù)先在1M乙醇胺中處理以封閉反應(yīng)位點(diǎn)的CNBr Sepharose溫育2小時。溫育后，離心移去樹脂，收集上清。親和純化和測序?qū)瓷鲜龇椒ㄖ苽涞钠⒘呀馕锓殖蓛砂?，分別與212D和217L制備的CNBr Sepharose凝膠混合。將產(chǎn)生的淤漿在4℃旋轉(zhuǎn)混合3天，然后在Beckman臺式離心機(jī)上以1500rpm離心10分鐘收集未吸附的部分，并保存。將凝膠轉(zhuǎn)移到一個15ml離心管中，在幾個體積的D-PBS中順序洗滌。將每種凝膠的100ul的小份在含有0.1M Tris-HCl、pH6.8、2％ SDS、20％甘油和0.002％溴酚藍(lán)、10％β-巰基乙醇(終濃度5％)的還原型樣品緩沖液中迅速煮沸，并上6.0％聚丙烯酰胺SDS凝膠(SDS-PAGE)，分析蛋白。凝膠用考馬斯染色，檢測到伴隨大量背景蛋白的、與αd和CD18分子量一致的蛋白。
為提高具有與αd相似分子量的蛋白的純化，將每種結(jié)合了蛋白的凝膠的兩個100ul小份用不同的方法進(jìn)行洗滌。在一種方法中，凝膠在含有150mM NaCl、10mM Tris、1.0％ Triton X100、pH8.0的緩沖液中洗滌數(shù)次。在第二種方法中，凝膠用相同方法進(jìn)行洗滌，但結(jié)合的蛋白在最后一次洗滌中用0.05M甘氨酸、pH2.4進(jìn)行洗脫。與前面一樣，洗脫蛋白在還原型樣品緩沖液中迅速煮沸，并在6.0％SDS-PAGE上分析。從在低pH甘氨酸緩沖液中洗滌的樹脂中，考馬斯染色僅檢測到與αd和CD18一致的蛋白，因此選擇這種方法。為分離用于測序的蛋白，剩余的CNBr Sepharose樹脂按前面的介紹洗滌四次，將約四分之三的樹脂懸浮于2ml的0.05M甘氨酸、pH2.4中，劇烈搖勻。離心3分鐘使樹脂沉淀，并收集未吸附的部分。然后將凝膠在甘氨酸緩沖液中再洗滌一次，將此次的洗滌物與前面的未結(jié)合部分混合。將此混合部分在4℃對D-PBS透析過夜，中間換液兩次。透析后，將樣品干燥使體積減少為1ml。
為進(jìn)行測序，將洗脫物在7.0％的分離膠上分開，按實(shí)施例2介紹的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon(PVDF)膜(Millipore Bedford，MA)上。簡而言之，將凝膠在去離子水中洗滌一次，并在含有10％甲醇的10mM環(huán)己胺-丙磺酸緩沖液pH10.5(CAPS)中平衡15至45分鐘。將PDVF膜在甲醇和去離子水中洗滌，然后在CAPS轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15至30分鐘。將蛋白在70伏轉(zhuǎn)移3小時轉(zhuǎn)移到PDVF膜上，然后將其在經(jīng)過過濾的0.1％ R250考馬斯染料中染色10分鐘。膜在50％甲醇/10％乙酸中洗滌脫色三次，每次洗滌10分鐘，在過濾水中再洗滌一次，并干燥。
從212D和217L偶聯(lián)的樹脂中都檢測到約150kD和95kD的主要蛋白帶，這兩條蛋白帶與前面在分析級凝膠上檢測到的蛋白一致。在來自217L偶聯(lián)樹脂的膜上觀察到了位于緊靠150kD蛋白下方的一條清晰度稍差的帶，但在膜干燥后檢測不到該帶。從每張膜上切下150kd帶，用Applied Biosystems(Foster City，CA)473型蛋白測序儀按照廠商推薦的程序直接測序。
結(jié)果顯示，用212D偶聯(lián)樹脂分離的猴蛋白的氨基端序列具有列于SEQ ID NO109的氨基酸序列。而用217L偶聯(lián)樹脂分離的蛋白的氨基端具有列于SEQ ID NO110的序列。SEQ ID NO110中的“X”表示一個未確定的殘基。212D-偶聯(lián)蛋白SEQ ID NO109NLDVEEPTIFQEDA217L偶聯(lián)蛋白 SEQ ID NO110NLDVEEPTIFXEDA猴序列與人αd及β2整合素家族中的的其他α鏈的氨基端序列的比較示于表2表2猴αd氨基端序列與人β2整合素α亞單位的比較蛋白SEQ ID NO 氨基端序列猴αd111 F N L D V E E P T I F Q E D A人αd112 F N L D V E E P T I F Q E D A G G人CD11c 113 F N L D T E E L T A F V D S A G人CD11h 114 F N L D T E N A M T F Q E N A R G基于序列同一性，結(jié)論為，212D和217L都能識別猴和人的αd。實(shí)施例35217L抗原的特征分析基于前面實(shí)施例中從猴脾臟中沉淀的蛋白的N末端序列，可以得出結(jié)論，212D和217L能識別猴和人的αd。但免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)分析和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，217L具有212D沒有的額外反應(yīng)特性。使用針對所有α鏈的抗體的FACS和ICC實(shí)驗(yàn)檢測到217L與CD11c(最密切相關(guān)的白細(xì)胞整合素α鏈)和CD11b的交叉反應(yīng)性。因此，可能217L還識別αd的構(gòu)象、糖基化或剪接變體或與αd有序列同源性的新α鏈。
結(jié)節(jié)病肺組織(見實(shí)施例18)中抗體217L識別的抗原具有獨(dú)特的分布，與CD11c的染色圖譜不重疊，這表明該抗原可能具有生物學(xué)意義。因此，為進(jìn)一步理解217L抗原的意義，需要對該蛋白和編碼該蛋白的DNA進(jìn)行分析，并采用不同的途徑來進(jìn)行。
使用抗體217L來從人樹突細(xì)胞或外周血中免疫沉淀一種蛋白復(fù)合物，接著對沉淀的蛋白進(jìn)行N末端測序。序列分析將揭示，在外周血細(xì)胞上識別的蛋白是否與αd具有氨基端同一性。然后將從樹突細(xì)胞或外周血細(xì)胞沉淀的蛋白用去糖基化酶處理，并與從其他來源沉淀的CD11c和αd進(jìn)行比較，來提供一級氨基酸序列的分子量比較。
此外，用整個αdcDNA在低嚴(yán)格條件下對由樹突細(xì)胞RNA制備的cDNA文庫進(jìn)行探針雜交。反應(yīng)克隆用對整個克隆長度核酸測序進(jìn)行分析，來確定克隆中是否存在非αd序列。實(shí)施例36測定αd治療用途的動物模型犬中的免疫組織學(xué)數(shù)據(jù)和大鼠與小鼠中的原位雜交已經(jīng)確定，在脾臟中，αd主要由紅髓和淋巴結(jié)中的巨噬細(xì)胞表達(dá)，αd在髓索和竇中被發(fā)現(xiàn)。其表達(dá)圖譜非常類似于已經(jīng)報(bào)道的、用兩種單克隆抗體F4/80和SK39確定的兩種鼠抗原的表達(dá)圖譜。而這些小鼠抗原的生化特征已經(jīng)證明，它們不同于αd，αd很可能確定了與小鼠抗原F4/80和SK39所確定的相同巨噬細(xì)胞亞群。
在小鼠中，SK-39陽性巨噬細(xì)胞已在脾紅髓和淋巴結(jié)索中被鑒別，在脾紅髓中，它們可能參與從循環(huán)中清除外源物質(zhì)。(Jutila等，《白細(xì)胞生物學(xué)雜志》，54卷，30-39頁)。SK-39陽性巨噬細(xì)胞也被報(bào)道位于急性和慢性炎癥的部位。而且，聚集在巰基乙酸誘發(fā)炎癥的腹膜腔中的單核細(xì)胞也表達(dá)SK39抗原?？偨Y(jié)來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，如果SK39+細(xì)胞也是αd+，那么這些細(xì)胞在脾中將負(fù)責(zé)清除外源物質(zhì)，并參與巨噬細(xì)胞起重要作用的炎癥。
雖然αd的功能還不清楚，特征研究得更清楚的其他β2整合素已被顯示參與非常廣泛的黏附事件，包括能促進(jìn)細(xì)胞遷移、加強(qiáng)吞噬、促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的事件，以及導(dǎo)致炎癥過程上調(diào)的所有事件。因此，很有可能，干預(yù)正常的αd功能也能干預(yù)巨噬細(xì)胞在其中起重要作用的炎癥。這樣的抗炎癥作用由下列因素產(chǎn)生i)阻止巨噬細(xì)胞在炎癥位點(diǎn)聚集，ii)阻止巨噬細(xì)胞在炎癥位點(diǎn)激活或iii)干擾巨噬細(xì)胞的效應(yīng)功能，這些效應(yīng)功能通過特異性的自身免疫應(yīng)答或作為細(xì)胞損傷的旁觀者而損傷正常細(xì)胞。
有證據(jù)表明巨噬細(xì)胞在疾病過程中起重要作用的疾病狀態(tài)包括多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、移植動脈粥樣硬化、某些類型的糖尿病和腸道炎癥疾病。下面將要討論的動物模型已經(jīng)顯示能復(fù)制這些人類疾病的許多方面。αd抑制劑的功能在這些模型系統(tǒng)中進(jìn)行了測試，以確定治療相應(yīng)人類疾病的可能性是否存在。移植動脈粥樣硬化心臟移植目前是治療性干預(yù)某些類型的晚期心臟疾病的一種可接受形式。由于使用環(huán)孢菌素A已經(jīng)使一年存活率提高到80％，產(chǎn)生漸進(jìn)性的移植動脈粥樣硬化已成為心臟移植存活一年后死亡的主要原因。最近的研究發(fā)現(xiàn)，心臟移植3年后明顯的動脈粥樣硬化的發(fā)生范圍為36-44％(Adams等《移植》53卷，1115-1119(1992)；Adams等《移植》56卷，794-799(1993))。
移植動脈粥樣硬化一般包括能影響整個冠狀血管壁的彌漫性、閉塞性、內(nèi)膜損害，并通常伴隨著脂沉積。雖然移植動脈粥樣硬化的病理仍不清楚，但它很可能與供體和受體的組織相容性差異相關(guān)，并且在本質(zhì)上是免疫性的。從組織學(xué)上講，變厚的內(nèi)膜區(qū)域主要是巨噬細(xì)胞組成，雖然偶爾也能見到T細(xì)胞。因此很可能表達(dá)αd的巨噬細(xì)胞在移植動脈粥樣硬化的誘導(dǎo)和/或發(fā)展中起重要的作用。在這種情況下，αd功能的單克隆抗體或小分子抑制劑(例如，可溶性的ICAM-R)可以為接受了心臟移植并有產(chǎn)生移植動脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的個體提供預(yù)防。
雖然心臟移植中的動脈粥樣硬化對生命造成了最大威脅，移植動脈粥樣硬化也見于其他的實(shí)體器官移植，包括腎臟和肝臟。αd阻斷試劑的治療性應(yīng)用能防止其他器官移植中的動脈粥樣硬化，減少移植失敗產(chǎn)生的并發(fā)癥。
大鼠移植動脈粥樣硬化的一個模型涉及越過最小組織相容性障礙的異體心臟同種移植。在Lewis心臟同種移植物移植到MHCI和II型匹配的F344受體時，80％的同種移植物至少存活3周，而25％的移植物無限存活。在此低級移植排斥過程中，在供體心臟內(nèi)形成動脈粥樣硬化。120天的同種移植物中的動脈損害一般有彌漫性的纖維狀內(nèi)膜增厚，與在排斥的人心臟同種移植物中發(fā)現(xiàn)的移植物動脈粥樣硬化損害的表現(xiàn)沒有區(qū)別。
大鼠用最小組織相容性抗原不匹配的心臟進(jìn)行移植，例如Lewis至F-344。向移植受體定期給予大鼠αd特異的單克隆抗體或αd的小分子抑制劑。處理被希望來減少在非排斥供體心臟中移植物動脈粥樣硬化的的發(fā)生。用αd單克隆抗體或小分子抑制劑處理大鼠可以不限于預(yù)防性處理。阻斷αd功能也可希望來減少巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和使移植物中動脈損害回復(fù)。甾醇飼養(yǎng)兔中的動脈粥樣硬化用一種含有甾醇補(bǔ)加物的致動脈粥樣硬化食物飼養(yǎng)約12-16周的兔會產(chǎn)生覆蓋大部分上行主動脈的腔表面的內(nèi)膜損害(Rosenfeld等《動脈粥樣硬化》7卷，9-23頁(1987)；Rosenfeld等《動脈粥樣硬化》7卷，24-34頁(1987))。在這些兔中見到的動脈粥樣硬化損害與在人中見到的相似。損害中含有大量的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞多數(shù)表達(dá)CD45RO，這是一種與記憶T細(xì)胞有關(guān)的標(biāo)記。約一半的浸潤T細(xì)胞也表達(dá)MHC II類抗原，而且有一些表達(dá)IL-2受體，這說明這些細(xì)胞大多處于活性狀態(tài)。
動脈粥樣硬化損害的一個方面在甾醇飼養(yǎng)的兔中發(fā)現(xiàn)，但在嚙齒動物模型中明顯沒有，這就是富含泡沫細(xì)胞的損害集聚。泡沫細(xì)胞型巨噬細(xì)胞據(jù)信是通過特異性受體攝取了氧化的低密度脂蛋白(LDL)而造成的。氧化的LDL顆粒被發(fā)現(xiàn)對某些細(xì)胞類型包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是有毒的。巨噬細(xì)胞攝取的可能有毒的、氧化的LDL顆粒作為一種激發(fā)物，驅(qū)使巨噬細(xì)胞活化，從而對動脈粥樣硬化損害有關(guān)的炎癥起作用。
已經(jīng)對兔αd制備了一種單克隆抗體，并用它處理了甾醇飼養(yǎng)的兔。處理包括預(yù)防性給予αd單克隆抗體或小分子抑制劑，來證明αd+的巨噬細(xì)胞參與疾病的進(jìn)程。另外的研究將證明針對αd的單克隆抗體或小分子抑制劑能夠使用一種致動脈粥樣硬化食物飼養(yǎng)的兔中檢測到的血管損害回復(fù)。胰島素依賴型糖尿病BB大鼠在鼠齡70-150天時會自發(fā)產(chǎn)生胰島素依賴型糖尿病。使用免疫組化技術(shù)，在疾病的早期可以檢測到MHC II+類ED1+巨噬細(xì)胞對胰島的浸潤。多數(shù)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為參與細(xì)胞殘?jiān)蛘＜?xì)胞的吞噬。在疾病發(fā)展時，更多的巨噬細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)浸潤到胰島中，雖然有相當(dāng)數(shù)量的T細(xì)胞以及后來的B細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)聚集在該位點(diǎn)(Hanenberg等，《糖尿病》32卷，126-134頁(1989))。
BB大鼠中糖尿病的發(fā)展似乎依賴于早期的巨噬細(xì)胞浸潤和隨后的T細(xì)胞聚集。用對巨噬細(xì)胞有毒的二氧化硅顆粒處理BB大鼠能夠有效地阻斷早期巨噬細(xì)胞對胰島的浸潤。在沒有了早期巨噬細(xì)胞浸潤時，接著的由淋巴細(xì)胞群體自身攻擊造成的組織損害就不會發(fā)生。用能阻斷T細(xì)胞相關(guān)的疾病期的單克隆抗體OX-19(大鼠CD5特異)或單克隆抗體OX-8(CD8特異)進(jìn)行給藥也能有效地抑制糖尿病的發(fā)展。
巨噬細(xì)胞在該模型的病理中所起的核心作用，使得用它來測試αd功能的抑制劑很有吸引力。遺傳上預(yù)定能產(chǎn)生胰島素依賴型糖尿病的大鼠用針對αd的單克隆抗體或小分子抑制劑處理，并評價疾病的發(fā)展。防止或延遲臨床癥狀開始就證明αd在巨噬細(xì)胞對胰島細(xì)胞的損害中起關(guān)鍵作用。炎癥性腸道疾病(Crohn’s病、潰瘍性結(jié)腸炎)用來研究炎癥性腸道疾病(IBD)的動物模型一般用有毒的刺激物(例如乙酸或三硝基苯磺酸/乙醇)經(jīng)直腸給藥來誘導(dǎo)。這些試劑誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥是化學(xué)或代謝損傷的結(jié)果，缺乏與人LBD相關(guān)的慢性或自發(fā)性復(fù)發(fā)炎癥。但一種最近介紹的使用漿膜下層注射由A型或D型鏈球菌純化的膚聚糖-多糖(PG-PS)聚合物的動物模型，似乎是更與人LBD生理相關(guān)的模型(Yamada等，《胃腸學(xué)》104卷，759-771頁(1993))。
在這個模型中，PG-PS注射到遠(yuǎn)結(jié)腸的漿膜下層。所產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答分兩個時期，最初是注射三天后的急性發(fā)作，接著3至4周后的自發(fā)性的慢性期。后期應(yīng)答在本質(zhì)上是肉牙腫性的，導(dǎo)致結(jié)腸增厚、黏附、結(jié)腸節(jié)和黏膜損傷。除了黏膜損傷，PG-PS結(jié)腸炎經(jīng)常導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、貧血和肉牙腫肝炎。該疾病的腸外癥狀使該模型能用來研究Crohn’s病，因?yàn)楹芏嗷加谢顒有訡rohn’s病的病人受到關(guān)節(jié)疾病和肝膽管炎癥的折磨。
肉牙腫損害是慢性炎癥的結(jié)果，慢性炎癥導(dǎo)致單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系細(xì)胞的聚集和隨后激活。在Crohn’s病和上述動物模型中存在肉牙腫損害，使其成為αd的單克隆抗體或αd功能的其他抑制劑的有吸引力的臨床靶。αd功能的抑制劑被希望來阻止與IBD相關(guān)的損害的形成或甚至逆轉(zhuǎn)疾病中所見的組織損害。關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)炎似乎是一種多因素的疾病過程，涉及多種炎癥細(xì)胞類型包括中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和吞噬性巨噬細(xì)胞。雖然已存在多種關(guān)節(jié)炎模型，鏈球菌細(xì)胞壁肽聚糖制備物能產(chǎn)生與人類疾病最相似的疾病。
在大鼠中，鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)外周關(guān)節(jié)炎癥，其特征是反復(fù)發(fā)作的疾病進(jìn)程和隨后緩解，并在幾個月后最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞(Cromartie等，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》146卷，1585-1602頁(1977)，Schwab等，《感染與免疫》59卷，4436-4442頁(1991))。在疾病的慢性期內(nèi)，單核的吞噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞據(jù)信在滑膜的破壞中起主要作用。而且，能抑制巨噬細(xì)胞聚集在滑膜中的試劑能有效地減少炎癥和關(guān)節(jié)炎的病理特征。
巨噬細(xì)胞在能導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的滑膜破壞中起核心作用預(yù)示著，針對αd的單克隆抗體或αd功能的抑制劑在治療這種疾病中有治療潛力。如同在前面介紹的其他模型一樣，預(yù)防性地給予αd單克隆抗體或小分子抑制劑，是被希望來阻止或減輕關(guān)節(jié)炎癥和防止滑膜破壞。干預(yù)αd功能的試劑也可通過阻止額外的巨噬細(xì)胞聚集到關(guān)節(jié)或阻斷巨噬細(xì)胞激活來減輕正在進(jìn)行的炎癥。最終結(jié)果是逆轉(zhuǎn)正在進(jìn)行的關(guān)節(jié)破壞并促進(jìn)組織修復(fù)。多發(fā)性硬化雖然多發(fā)性硬化(MS)的病理原因還不清楚，但一般都認(rèn)為，該疾病由能夠識別中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的自身抗原并激發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)。所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答導(dǎo)致額外的炎癥細(xì)胞包括對該病有作用的活化巨噬細(xì)胞的聚集。實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)是一種能夠復(fù)制MS的某些方面的動物模型。最近，能與炎癥性巨噬細(xì)胞上存在的CD11b/CD18反應(yīng)的單克隆抗體(Huitinga等《歐洲免疫學(xué)雜志》23卷，709-715頁(1993))已顯示能夠阻斷臨床和組織學(xué)的疾病。這些結(jié)果表明，αd的單克隆抗體或小分子抑制劑可能在阻斷EAE的炎癥應(yīng)答中有效。這樣的試劑也在MS的處理中有重要的治療性應(yīng)用。免疫復(fù)合物肺泡炎位于肺部的肺泡管、氣管、結(jié)締組織和胸膜間隙的肺泡巨噬細(xì)胞代表著肺抵抗吸入的環(huán)境物質(zhì)的第一道防線。應(yīng)答于物質(zhì)包括細(xì)菌來源的LPS、IFN-γ和免疫復(fù)合物的刺激，肺泡巨噬細(xì)胞釋放多種強(qiáng)炎癥介質(zhì)，包括高反應(yīng)性的氧自由基和氮中間物。雖然超氧陰離子、過氧化氫和一氧化氮(NO-)在清除病原物中有重要的功能，但這些物質(zhì)對正常的組織也能產(chǎn)生傷害。
在一個免疫復(fù)合物肺泡炎的大鼠模型中，從肺泡巨噬細(xì)胞釋放的NO-已顯示能介導(dǎo)多種肺損傷(Mulligan等，《美國科學(xué)院院報(bào)》88卷，638-6342(1991))。NO-也已在其他免疫復(fù)合物介導(dǎo)的損傷包括皮膚脈管炎(Mulligan等，上文)中被確認(rèn)為介質(zhì)，并在疾病例如腎小球腎炎中可能起作用。
NO-介導(dǎo)的組織損傷不限于有免疫復(fù)合物參與的炎癥。例如，被試劑如PMA、LPS或IFN-γ刺激的小神經(jīng)蝕質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生能殺死少突神經(jīng)蝕質(zhì)細(xì)胞水平的NO-(Merrill等《免疫》151卷，2132(1993))。胰島細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)對NO-敏感，而巨噬細(xì)胞釋放這種介質(zhì)已被認(rèn)為參與導(dǎo)致糖尿病的組織損傷(Kroncke等，《BBRC》175卷，752-758頁(1991))。更近一些時候，已經(jīng)最終證明了NO-釋放在內(nèi)毒素休克中起作用(MacMicking等，《細(xì)胞》81卷，641-650(1995))。當(dāng)被給予脂多糖(LPS)時，正常野生型小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的、進(jìn)行性的主動脈壓降低，導(dǎo)致死亡。但缺乏誘導(dǎo)的一氧化氮的小鼠在應(yīng)答于LPS時產(chǎn)生不太嚴(yán)重的動脈壓力降低，并在處理中全部存活。
體外試驗(yàn)表明，阻斷αd能有效地阻斷巨噬細(xì)胞(或通常表達(dá)αd的白細(xì)胞)活化的某些方面，如NO-釋放。用IFN-γ刺激的肺泡巨噬細(xì)胞在存在抗αd多克隆抗血清(在兔中針對一種αdI結(jié)構(gòu)域多肽制備)時被發(fā)現(xiàn)比用對照抗血清處理的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生明顯少的NO-分解產(chǎn)物--亞硝酸鹽/硝酸鹽。這個發(fā)現(xiàn)說明，針對αd特別是針對αdI結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體可能是一種潛在的抗炎癥試劑，并在MS、糖尿病、肺炎和內(nèi)毒素休克中有潛在應(yīng)用。而且，與影響多種白細(xì)胞類型功能的CD18相對，αd的有限分布使其成為比CD18更有吸引力的靶，來阻止巨噬細(xì)胞(或通常表達(dá)αd的白細(xì)胞)活化。
大鼠IgG免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的肺泡炎是廣泛使用的、理解急性肺損傷重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。這種損傷通過經(jīng)氣管插管向肺部注入抗牛血清白蛋白(BSA)抗體并接著靜脈注射BSA來誘導(dǎo)。肺部微氣管形成的免疫復(fù)合物導(dǎo)致補(bǔ)體激活和中性粒細(xì)胞聚集到肺部。很可能，肺部免疫復(fù)合物的形成之后接著是白細(xì)胞從血中外滲并接著穿過肺上皮。隨后釋放介質(zhì)包括自由基、TNF-α和一氧化氮(NO-)從參與疾病進(jìn)程的活化的內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中釋放。疾病的病理特征包括導(dǎo)致水腫和肺泡間隙存在大量紅細(xì)胞和PMNs的血管通透性增加。
在一個免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的肺泡炎大鼠模型中對針對αdI結(jié)構(gòu)域特異的多克隆抗血清進(jìn)行了檢測。抗αd多克隆抗血清與抗BSA在同一時間經(jīng)氣管插管導(dǎo)入肺中。接著肺部損傷通過靜脈給予BSA和少量的125I標(biāo)記的BSA(約800,000cpm)來誘導(dǎo)，后一種物質(zhì)用來定量測量肺損傷產(chǎn)生的水腫。使肺部損傷進(jìn)行4小時，損傷用肺通透性值來評價，肺通透性值被定義為肺部125I標(biāo)記的BSA與1.0ml血中存在的標(biāo)記量比較的比率。一般來說，陽性對照比率的通透性值的范圍在0.6到0.8之間，而陰性對照(未接受BSA的大鼠)具有的通透性值范圍是0.1-0.2。
初步研究表明，用抗αd多克隆抗血清處理能減少大于50％的肺通透性值，這表明肺損傷的大大緩解。以前，用抗CD18處理能減少60％的通透性值。這些發(fā)現(xiàn)表明αd可能是急性肺損傷過程中最重要的β2整合素，但不能精確確定抗血清阻止白細(xì)胞從血中滲出或穿過肺上皮的效果。
作為αd緩解肺損傷的另外證據(jù)，對支氣管肺泡吸出液中的TNF-α水平進(jìn)行了評價。用抗αd抗血清處理被發(fā)現(xiàn)能使TNF-α水平降低約4倍。TNF-α早已被視為急性肺炎中的重要介質(zhì)，并造成炎癥細(xì)胞聚集到炎癥部位、細(xì)胞激活和組織損傷。很可能，抗αd抗血清在免疫復(fù)合物肺泡炎的形成過程中阻止靜止的肺泡巨噬細(xì)胞活化，從而緩解TNF-α和NO-的釋放，并減少隨后由這些試劑導(dǎo)致的組織損傷和中性粒細(xì)胞聚集。LGL白血病的F344大鼠模型F344大鼠的LGL白血病最早在本世紀(jì)80年代早期至中期作為具有穩(wěn)定的NK細(xì)胞活性的移植性白血病被介紹。這種白血病被認(rèn)為可以作為人Tγ淋巴瘤和T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病的模型(Ward和Reynolds《美國病理學(xué)雜志》111卷，1-10頁(1982)；Stromberg《美國病理學(xué)雜志》119卷，517-519頁(1985)；Reynolds等，《免疫學(xué)雜志》132卷，534-540頁(1984))。這種模型能為研究LGL和NK細(xì)胞功能提供充足的細(xì)胞。最令人感興趣的是，如同實(shí)施例26中介紹的用倉鼠抗大鼠抗體205C通過FACS分析檢測到的那樣，這些細(xì)胞表面存在αd。為該發(fā)現(xiàn)，對αd在體外(例如，用前面介紹的細(xì)胞裂解試驗(yàn))和體內(nèi)的作用進(jìn)行了檢測。
LGL白血病的病理特征包括嚴(yán)重的脾大、白色斑點(diǎn)的肝臟、外周淋巴結(jié)增大和肺、腦和淋巴結(jié)中的點(diǎn)狀出血。因?yàn)棣羋存在于正常大鼠脾臟的紅髓(脾巨噬細(xì)胞上)，而LGL白血病的標(biāo)志是嚴(yán)重的脾大，因此可以假設(shè)，αd陽性的NK腫瘤細(xì)胞也可能“返巢”或限制于一種尚待確定的配體，并在此增生。為檢驗(yàn)這個假設(shè)，將腫瘤細(xì)胞放射性標(biāo)記，并與或不與αd抗體處理一起注射到受體大鼠中。三小時后取出這些動物的脾臟，檢測NK腫瘤細(xì)胞的存在。下面更完整地介紹所用的方法和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
在進(jìn)行每次實(shí)驗(yàn)前2至4周，將獲自LGL白血病大鼠的脾臟并按下面的介紹制備的腫瘤細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移到受體大鼠中。從前面的組織學(xué)研究和FACS分析已經(jīng)知道，腫瘤的快速增生和產(chǎn)生的脾大發(fā)生在過繼性轉(zhuǎn)移后約3到4周。在第一個實(shí)驗(yàn)中，從一個接受了腫瘤細(xì)胞4周的動物中取出脾臟。用剪刀將脾臟剪切成小片，并將小片在存在D-PBS的條件下通過一個目篩，制備成一種單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液收集到一個50ml離心管中，并在Beckman臺式離心機(jī)中在室溫下以1500rpm離心10分鐘。棄去上清，細(xì)胞在30ml D-PBS中重新懸浮。將約5.0ml這種細(xì)胞懸液鋪于5.0ml的Histopaque上，并將梯度在1500rpm離心30分鐘。從這些梯度中收集細(xì)胞層，合并，并用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將細(xì)胞數(shù)量調(diào)節(jié)為每個受體大鼠接受1.0×107細(xì)胞，并稍微多出一些以抵消洗滌和準(zhǔn)備注射過程中的細(xì)胞損失。將細(xì)胞懸浮于NK“測試培養(yǎng)基”(補(bǔ)加了抗生素的RPMI-1640，補(bǔ)加2％FBS)中，并用10mCi的51鉻在37℃標(biāo)記1小時。溫育后，用測試培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液的體積增加為50ml，并在1200rpm離心10分鐘沉淀細(xì)胞。棄去上清，細(xì)胞按介紹再洗滌兩次。將標(biāo)記的細(xì)胞按1×107細(xì)胞/ml懸浮，并在注射到受體大鼠之前，在存在或不存在抗大鼠αd抗體以及一種對照IgG1抗體的情況下進(jìn)行預(yù)溫育。將每只動物所用的最終抗體濃度調(diào)整為5.5mg/kg或約1mg/動物。每種條件下至少做4只動物。
將受體大鼠稱重，并經(jīng)皮下注射150至200ul的ACE溶液(含0.25ml氯胺酮、0.2ml ACE、0.8ml Rompin)進(jìn)行麻醉。對每種抗體處理，向動物經(jīng)靜脈注射1.0×107細(xì)胞。使用伽馬計(jì)數(shù)器檢測約300ul的每種細(xì)胞懸液來確定總的注射cpm/大鼠。允許標(biāo)記的NK細(xì)胞在大鼠中循環(huán)3小時，然后處死動物，用主動脈穿刺法抽取1.0ml的外周血。從每只動物取出脾臟，稱重，并用伽馬計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。為測定回到脾臟的細(xì)胞百分比，用每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)/脾臟除以注射到大鼠中的已知總cpm。為測定外周血中的cpm，假設(shè)血液占大鼠總重量的約6.0％，用1.0ml血中的cpm乘以6.0％的動物總重量來確定血液中的總cpm。然后將這個數(shù)據(jù)除以注射到每只動物中的總cpm，來獲得血液中保留的cpm的百分比。
在第一個實(shí)驗(yàn)中，使用了抗體226B、226G、226H、226I、20C5B(一種非阻斷性CD18抗體)和一種對照抗體?？贵w226B和226G與對照抗體和其他兩種226抗體相比，能明顯減少回到脾臟中的細(xì)胞數(shù)量。與對照抗體溫育后約7％至8％的標(biāo)記細(xì)胞回到脾臟，而與226B和226G溫育后約6％的細(xì)胞回到脾臟。血液中的總cpm的百分比在0.9％和1.4％之間，除了226B外，不同處理組之間的血液總cpm百分比沒有顯示明顯的差異，226B組比其他組的值低。
在第二個實(shí)驗(yàn)中，對上面確定的程序作了幾個調(diào)整。首先，對每種條件4只動物進(jìn)行了增加，第二，在過繼性轉(zhuǎn)移2.5周后而不是上面介紹的4周后，從荷瘤大鼠中取出脾臟。按準(zhǔn)確相同的方法制備NK細(xì)胞，并按上面確定的劑量與抗體226B或226G或一種對照抗體溫育后注射到受體動物中。同樣，允許標(biāo)記的細(xì)胞循環(huán)3小時，然后如上處死動物，收集血液和脾臟。此外，從兩個動物/環(huán)境中取出組織，測定腫瘤細(xì)胞的其他位置。這些組織包括肝臟、腦、胸腺、肺、長骨(為骨髓)和腎臟。
結(jié)果表明，在對照IgG1中，約32％的腫瘤細(xì)胞位于脾臟，而226B和226G中脾臟的標(biāo)記細(xì)胞都顯示減少的數(shù)量，分別為28％和29％。血液中細(xì)胞的百分比對每種抗體都相似，在血液中發(fā)現(xiàn)了3到4％的總cpm，226G抗體處理略少于其他兩組。
各處理組的組織分布相似，肝臟顯示27％的總cpm、腦0.05％、胸腺0.10％、肺15％、腎0.80％、長骨1.3％。
在第三個實(shí)驗(yàn)中，增加每種條件下的動物數(shù)量(n＝6或7)來設(shè)法檢測上面三個處理組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，使用取自實(shí)驗(yàn)前兩周用腫瘤細(xì)胞注射的動物的脾臟，并用上面介紹的相同方法進(jìn)行制備。細(xì)胞用相同的方式進(jìn)行標(biāo)記，注射到動物中并允許循環(huán)3小時。在本實(shí)驗(yàn)中，由于使用的動物數(shù)量大，而只從動物收集血液樣品和脾臟。
結(jié)果與第二次實(shí)驗(yàn)一致，在對照組中約30％的標(biāo)記細(xì)胞被觀察到回到脾臟，而在226B抗體處理的細(xì)胞只有25％、在226G抗體處理的細(xì)胞中只有27％發(fā)現(xiàn)于脾臟中。血液值同樣在各組間沒有顯示主要的差異，在對照組中約17％的總cmp發(fā)現(xiàn)于血中，而226B和226G處理組分別發(fā)現(xiàn)15.8％和14.75％。
為確定3小時是否是檢測處理組間差異的最佳時間點(diǎn)，在第四次實(shí)驗(yàn)中作了很小的調(diào)整。同樣，用同樣的方法分離和制備細(xì)胞，用于注射到受體動物中，除了將另外一種抗CD18抗體20C5B加入到待測抗體的序列中。此外，每個條件只用4只動物。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞在注射后僅允許循環(huán)30分鐘，在該時間點(diǎn)上從動物抽取血液和取出脾臟。
在30分鐘時間點(diǎn)上，脾臟中的總cpm從在第二次實(shí)驗(yàn)和第三次實(shí)驗(yàn)中觀察到的值減少到12％至13％。在脾樣品中所有的處理組沒有明顯的差異，雖然抗體226B處理組的四只動物中的兩只具有略低的值。所有組間的血液值同樣相似，在血液中發(fā)現(xiàn)約6至7％的總cmp。各血液組之間的唯一明顯差異是來自226B和226G抗體處理動物的數(shù)值較大的擴(kuò)散。這些發(fā)現(xiàn)表明，αd在白血病細(xì)胞返巢至脾臟中起作用。實(shí)驗(yàn)表明，返巢需要數(shù)小時，而用αd特異性單克隆抗體的最大抑制發(fā)生在3小時。多發(fā)性硬化和動脈粥樣硬化的獼猴模型免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫沉淀顯示，單克隆抗體212D和217L能與獼猴脾細(xì)胞交叉反應(yīng)。該識別的特異性被來自獼猴脾的一種αd種同源物的免疫沉淀和氨基端測序所證實(shí)(實(shí)施例34)。由于以前的這些觀察，這兩種抗體被用來對獲自實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)或動脈粥樣硬化研究的獼猴的組織進(jìn)行染色。這兩種疾病的標(biāo)志都是吞噬性巨噬細(xì)胞浸潤到病灶中，在EAE是攝取髓磷脂堿性蛋白(MBP)，在動脈粥樣硬化是低密度脂蛋白。MBP或脂堆積巨噬細(xì)胞可以用形態(tài)學(xué)或用Oil Red(ORO)或抗體Ham56(Dako，Carpinteria，CA)染色來鑒別。這些研究中所用的方法相同于實(shí)施例18中介紹來分析αd在人組織中表達(dá)特征所用的方法。
來自患EAE的獼猴腦的切片的特征是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤。αd在表達(dá)位于病灶中巨噬細(xì)胞的一個亞群，這些巨噬細(xì)胞能用ORO染色，表明以前攝取了MBP。ORO染色陰性的病灶也為αd表達(dá)陰性。這個結(jié)果表明了ORO染色和αd的直接聯(lián)系。用抗體217K、217I和217H也觀察到相似的結(jié)果。
動脈硬化病灶獲自用高脂肪食物飼養(yǎng)的獼猴的胸主動脈或腹主動脈。在人中病灶發(fā)生在兩個位置，但產(chǎn)生病理的病灶更通常位于腹主動脈。本研究中試驗(yàn)的病灶被分為5個不同的階段(I至V)和正常。階段(IV/V)病灶來自腹主動脈，其余來自胸主動脈。
早期病灶(I/II)顯示很少的巨噬細(xì)胞浸潤和低水平或沒有αd表達(dá)。在后期病灶中，泡沫細(xì)胞浸潤增大，并且檢測到αd表達(dá)。
在兩個組織中，其他白細(xì)胞整合素α鏈亞單位的染色圖譜與αd表達(dá)重疊但不相同。最顯著的是，非αd白細(xì)胞整合素的α亞單位的表達(dá)在用抗αd抗體不能染色的淋巴細(xì)胞上檢測到。
這些結(jié)果表明，在兩種動物模型中，αd表達(dá)可能是吞噬性巨噬細(xì)胞的特征。但還不清楚，αd是否直接參與吞噬或某些下游過程例如抗原遞呈。實(shí)施例37αd在臨床前模型中的表達(dá)為評價αd在不同疾病狀態(tài)中的不同表達(dá)，來自動物疾病模型的組織切片用按上面介紹的方法(實(shí)施例22)制備的抗αd多克隆血清染色。來自正常和疾病大鼠的組織被切成6um厚，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)載玻片上在室溫空氣干燥過夜。干燥后，切片貯存于-70℃?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，載玻片從-70℃取出，在50℃放置約5分鐘。將切片在冷(4℃)丙酮(Stephens Scientific)中在室溫下固定10分鐘，并在室溫干燥。每個切片用150ul含有30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、5％正常羊血清(Vector Laboratories)和1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Company)的1X TBS中在室溫下封閉30分鐘。然后溫和地從切片上吸出溶液。將兔多克隆血清和取自同一兔的免疫前血清在封閉溶液中分別稀釋為蛋白濃度34ug/ml和38.5ug/ml，并分別取100ul加入到每個切片上，37℃放置30分鐘。從切片上吸出血清，并通過在1X TBS中洗滌三次以去除未結(jié)合的抗體，每次5分鐘。最后一個洗滌后吸去多余的TBS。來自一個Elite兔IgG Vectastain ABC試劑盒(Vector)的生物素化的羊抗兔抗體按照廠商推薦的程序進(jìn)行制備，并將所獲得的溶液100ul用于每個切片，37℃放置15分鐘。載玻片在1X TBS中洗滌兩次，每次洗滌5分鐘，然后將在5％正常大鼠血清和1％BSA中1∶100稀釋的鏈親和素-金接合物(Goldmark Biologicals)用于每個切片，室溫放置1小時。載玻片用TBS洗滌三次，每次洗滌5分鐘，并加入100ul含1％戊二醛(Sigma)的TBS緩沖液，室溫5分鐘。載玻片再在TBS中洗滌三次，每次洗滌5分鐘，并在無菌去離子水中洗滌5次，每次洗滌3分鐘。將多余的液體從每個載玻片上吸去，在每張切片上加兩滴銀加強(qiáng)和起始溶液(Goldmark Biologicals)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20-30分鐘，然后將切片在無菌去離子水中充分漂洗，在室溫下空氣干燥過夜，并用Cytoseal 60(VWR)封固。作為對照，切片用識別CD11a、CD11b、CD11c和CD18的單克隆抗體在同一實(shí)驗(yàn)中用相同的方法進(jìn)行標(biāo)記。
用αd多克隆血清和針對CD11a、CD11b、CD11c和CD18的單克隆抗體標(biāo)記，顯示了αd與其他α亞單位中觀察到的不同的染色圖譜。
在正常肺組織中，αd表達(dá)在支氣管的呼吸上皮(但不是肺泡間隙的上皮)上和似乎是氣隙中肺泡巨噬細(xì)胞的單個細(xì)胞上被檢測到。用多克隆血清觀察到的信號明顯高于用免疫前血清對照觀察到的背景信號水平。在肺肉牙腫組織中，在給予多糖24和96小時后，用αd染色肺泡區(qū)域的呼吸上皮檢測到不同的信號，并且在似乎是氣管巨噬細(xì)胞的部分上檢測到更強(qiáng)的信號。在來自從疾病中恢復(fù)的動物(多糖給藥后16天處死)的肺組織中，用αd抗體沒有觀察到信號。在這些組織中，用免疫前血清觀察到極少的背景信號。
使用來自抗原誘導(dǎo)的哮喘模型的大鼠肺組織，用αd抗體在支氣管和肺泡隙的呼吸上皮中檢測到了非常強(qiáng)的信號。該信號明顯高于免疫前血清中的背景信號水平。臨床前模型---單核細(xì)胞增生利斯特氏菌證據(jù)表明，脾紅髓中αd陽性巨噬細(xì)胞參與從循環(huán)中清除受損的血紅細(xì)胞和其他顆粒。很可能細(xì)菌物質(zhì)也由脾紅髓中的αd陽性巨噬細(xì)胞從循環(huán)中清除。不需要一種抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答誘導(dǎo)的非感染性物質(zhì)將由紅髓巨噬細(xì)胞直接清除。相反，機(jī)會感染性物質(zhì)由紅髓巨噬細(xì)胞清除的確需要為消滅細(xì)菌而產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此有可能紅髓巨噬細(xì)胞上表達(dá)的αd通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞從紅髓移動到邊緣區(qū)或通過作為參與導(dǎo)致T細(xì)胞激活的巨噬細(xì)胞/T細(xì)胞相互作用的輔助分子而起作用來幫助調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞/T細(xì)胞相互作用。
為研究αd在對感染性物質(zhì)免疫應(yīng)答中的作用，使用一個單核細(xì)胞增生利斯特氏菌小鼠模型對αd在脾臟中的表達(dá)進(jìn)行了評價。對已經(jīng)吞噬了細(xì)菌的紅髓巨噬細(xì)胞上的αd表達(dá)進(jìn)行了檢測。針對αd的抗體也在此模型中進(jìn)行了檢測，來確定αd在誘導(dǎo)針對單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的T細(xì)胞應(yīng)答中所起的作用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對上面列出的說明性實(shí)施例作各種修改和變化。因此本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求限定。序列表(1)一般信息(i)申請人Gallatin，W.MichaelVan der Vieren，Monica(ii)發(fā)明題目新型人β2整合素α亞單位(iii)序列數(shù)114(iv)通信地址(A)收件人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道233 South Wacker Drive，6300 Sear Tower(C)城市Chicgo(D)州Illinois(E)國家美國(F)郵政編碼60606-6402(v)電腦可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)電腦IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類
(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/173,497(B)申請日23-DEC-1993(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/286,889(B)申請日5-AUG-1994(vii)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/362,652(B)申請日21-DEC-1994(viii)律師/代理人信息(A)姓名Williams Jr.，Joseph A.
(B)注冊號碼38，659(C)參考/摘要號碼27866/32684(iX)電信聯(lián)絡(luò)信息(A)電話312-474-6300(B)傳真312-474-0448(C)電報(bào)25-3856(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度3726堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3..3485(xi)序列描述SEQ ID N01TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT47Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA 95Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala20 25 30GGC GGC TTT GGG CAG AGC GTG GTG CAG TTC GGT GGA TCT CGA CTC GTG 143Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val35 40 45GTG GGA GCA CCC CTG GAG GTG GTG GCG GCC AAC CAG ACG GGA CGG CTG 191Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu50 55 60TAT GAC TGC GCA GCT GCC ACC GGC ATG TGC CAG CCC ATC CCG CTG CAC 239Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His65 70 75ATC CGC CCT GAG GCC GTG AAC ATG TCC TTG GGC CTG ACC CTG GCA GCC 287Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala80 85 90 95TCC ACC AAC GGC TCC CGG CTC CTG GCC TGT GGC CCG ACC CTG CAC AGA 335Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg100 105 110GTC TGT GGG GAG AAC TCA TAC TCA AAG GGT TCC TGC CTC CTG CTG GGC 383Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly115 120 125TCG CGC TGG GAG ATC ATC CAG ACA GTC CCC GAC GCC ACG CCA GAG TGT 431Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys130 135 140CCA CAT CAA GAG ATG GAC ATC GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGA AGC479Pro His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser145 150 155ATT GAC CAA AAT GAC TTT AAC CAG ATG AAG GGC TTT GTC CAA GCT GTC527Ile Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Iys Gly Phe Val Gln Ala Val160 165 170 175ATG GGC CAG TTT GAG GGC ACT GAC ACC CTG TTT GCA CTG ATG CAG TAC575Met Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr180 185 190TCA AAC CTC CTG AAG ATC CAC TTC ACC TTC ACC CAA TTC CGG ACC AGC623Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser195 200 205CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG671Pro Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu210 215 220ACG TTC ACG GCC ACG GGC ATC CTG ACA GTG GTG ACA CAG CTA TTT CAT719Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His225 230 235CAT AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATT GTC ATC767His Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile240 245 250 255ACA GAT GGG CAG AAG TAC AAA GAC CCC CTG GAA TAC AGT GAT GTC ATC815Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile260 265 270CCC CAG GCA GAG AAG GCT GGC ATC ATC CGC TAC GCT ATC GGG GTG GGA863Pro Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly275 280 285CAC GCT TTC CAG GGA CCC ACT GCC AGG CAG GAG CTG AAT ACC ATC AGC911His Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser290 295 300TCA GCG CCT CCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GAC AAC TTT GCA GCC959Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala305 310 315CTT GGC AGC ATC CAG AAG CAG CTG CAG GAG AAG ATC TAT GCA GTT GAG 1007Leu Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu320 325 330 335GGA ACC CAG TCC AGG GCA AGC AGC TCC TTC CAG CAC GAG ATG TCC CAA 1055Gly Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln340 345 350GAA GGC TTC AGC ACA GCC CTC ACA ATG GAT GGC CTC TTC CTG GGG GCT 1103Glu Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala355 360 365GTG GGG AGC TTT AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC CTG TAT CCC CCA AAT 1151Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn370 375 380ATG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGG 1199Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg385 390 395GAC TCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GAG CTA GCC CTG TGG AAG GGG GTA 1247Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val400 405 410 415CAG AAC CTG GTC CTG GGG GCC CCC CGC TAC CAG CAT ACC GGG AAG GCT 1295Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala420 425 430GTC ATC TTC ACC CAG GTG TCC AGG CAA TGG AGG AAG AAG GCC GAA GTC 1343Val Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val435 440 445ACA GGG ACG CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC TGC TCC GTG 1391Thr Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val450 455 460GAT GTG GAC AGC GAT GGC AGC ACC GAC CTG ATC CTC ATT GGG GCC CCC 1439Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro465 470 475CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG GGC CAG GTG TCC GTG TGT CCC TTG 1487His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu480 485 490 495CCT AGG GGG CAG AGG GTG CAG TGG CAG TGT GAC GCT GTT CTC CGT GGT 1535Pro Arg Gly Gln Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly500 505 510GAG CAG GGC CAC CCC TGG GGC CGC TTT GGG GCA GCC CTG ACA GTG TTG 1583Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu515 520 525GGG GAT GTG AAT GAG GAC AAG CTG ATA GAC GTG GCC ATT GGG GCC CCG 1631Gly Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro530 535 540GGA GAG CAG GAG AAC CGG GGT GCT GTC TAC CTG TTT CAC GGA GCC TCA 1679Gly Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser545 550 555GAA TCC GGC ATC AGC CCC TCC CAC AGC CAG CGG ATT GCC AGC TCC CAG 1727Glu Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln560 565 570 575CTC TCC CCC AGG CTG CAG TAT TTT GGG CAG GCG CTG AGT GGG GGT CAG 1775Leu Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln580 585 590GAC CTC ACC CAG GAT GGA CTG ATG GAC CTG GCC GTG GGG GCC CGG GGC 1823Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly595 600 605CAG GTG CTC CTG CTC AGG AGT CTG CCG GTG CTG AAA GTG GGG GTG GCC 1871Gln Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala610 615 620ATG AGA TTC AGC CCT GTG GAG GTG GCC AAG GCT GTG TAC CGG TGC TGG 1919Met Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp625 630 635GAA GAG AAG CCC AGT GCC CTG GAA GCT GGG GAC GCC ACC GTC TGT CTC 1967Glu Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu640 645 650 655ACC ATC CAG AAA AGC TCA CTG GAC CAG CTA GGT GAC ATC CAA AGC TCT 2015Thr Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser660 665 670GTC AGG TTT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGT CGT CTG ACT TCT CGT GCC 2063Val Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala675 680 685ATT TTC AAT GAA ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG 2111Ile Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu690 695 700GGA CTG GGG ATT CAC TGT GAA ACC CTG AAG CTG CTT TTG CCA GAT TGT 2159Gly Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys705 710 715GTG GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC AAC TTC TCA CTG 2207Val Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu720 725 730 735GTG AGA GAG CCC ATC CCC TCC CCC CAG AAC CTG CGT CCT GTG CTG GCC 2255Val Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala740 745 750GTG GGC TCA CAA GAC CTC TTC ACT GCT TCT CTC CCC TTC GAG AAG AAC 2303Val Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn755 760 765TGT GGG CAA GAT GGC CTC TGT GAA GGG GAC CTG GGT GTC ACC CTC AGC 2351Cys Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser770 775 780TTC TCA GGC CTG CAG ACC CTG ACC GTG GGG AGC TCC CTG GAG CTC AAC 2399Phe Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn785 790 795GTG ATT GTG ACT GTG TGG AAC GCA GGT GAG GAT TCC TAC GGA ACC GTG 2447Val Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val800 805 810 815GTC AGC CTC TAC TAT CCA GCA GGG CTG TCG CAC CGA CGG GTG TCA GGA 2495Val Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly820 825 830GCC CAG AAG CAG CCC CAT CAG AGT GCC CTG CGC CTG GCA TGT GAG ACA 2543Ala Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr835 840 845GTG CCC ACT GAG GAT GAG GGC CTA AGA AGC AGC CGC TGC AGT GTC AAC 2591Val Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn850 855 860CAC CCC ATC TTC CAT GAG GGC TCT AAC GGC ACC TTC ATA GTC ACA TTC 2639His Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe865 870 875GAT GTC TCC TAC AAG GCC ACC CTG GGA GAC AGG ATG CTT ATG AGG GCC 2687Asp Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala880 885 890 895AGT GCA AGC AGT GAG AAC AAT AAG GCT TCA AGC AGC AAG GCC ACC TTC 2735Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe900 905 910CAG CTG GAG CTC CCG GTG AAG TAT GCA GTC TAC ACC ATG ATC AGC AGG 2783Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg915 920 925CAG GAA GAA TCC ACC AAG TAC TTC AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG 2831Gln Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys930 935 940AAA ATG AAA GAG GCT GAG CAT CGA TAC CGT GTG AAT AAC CTC AGC CAG 2879Lys Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln945 950 955CGA GAT CTG GCC ATC AGC ATT AAC TTC TGG GTT CCT GTC CTG CTG AAC 2927Arg Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn960 965 970 975GGG GTG GCT GTG TGG GAT GTG GTC ATG GAG GCC CCA TCT CAG AGT CTC 2975Gly Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu980 985 990CCC TGT GTT TCA GAG AGA AAA CCT CCC CAG CAT TCT GAC TTC CTG ACC 3023Pro Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr995 10001005CAG ATT TCA AGA AGT CCC ATG CTG GAC TGC TCC ATT GCT GAC TGC CTG 3071Gln Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu101010151020CAG TTC CGC TGT GAC GTC CCC TCC TTC AGC GTC CAG GAG GAG CTG GAT 3119Gln Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp102510301035TTC ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG 3167Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu1040104510501055CAG AAG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GAA ATT ACG TTC GAC ACA 3215Gln Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr106010651070TCC GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG 3263Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln107510801085ATG GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC 3311Met Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile109010951100ATC ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA 3359Ile Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr110511101115GCC ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AAG GAA ATG 3407Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met1120112511301135CTG GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC 3455Leu Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe114011451150AGC TGT GTG GCC CCA AAT GTG CCT TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT 3505Ser Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser11551160TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA 3566CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG 3625AGATAGAGAT TGTAATGTTT TTACATATCT GTCCATCTTT TTCAGCAATG ACCCACTTTT 3685TACAGAAGCA GGCATGGTGC CAGCATAAAT TTTCATATGC T 3726(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度1161氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His Gly1 5 10 15Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala Gly20 25 30Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val35 40 45Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr50 55 60Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His Ile65 70 75 80Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser85 90 95Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg Val100 105 110Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser115 120 125Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys Pro130 135 140His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile145 150 155 160Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val Met165 170 175Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr Ser180 185 190Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser Pro
195 200 205Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu Thr210 215 220Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His His225 230 235 240Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Tle Val Ile Thr245 250 255Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro260 265 270Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly His275 280 285Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser Ser290 295 300Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala Leu305 310 315 320Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu Gly325 330 335Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu340 345 350Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala Val355 360 365Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Met370 375 380Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp385 390 395 400Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val Gln405 410 415Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala Val420 425 430Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val Thr435 440 445Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp450 455 460Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro His465 470 475 480Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu Pro485 490 495Arg Gly Gln Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu500 505 510Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly515 520 525Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly530 535 540Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser Glu545 550 555 560Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln Leu565 570 575Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln Asp580 585 590Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly Gln595 600 605Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala Met610 615 620Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp Glu625 630 635 640Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr645 650 655Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val660 665 670Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile675 680 685Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly690 695 700Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val705 710 715 720Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val725 730 735Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val740 745 750Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys755 760 765Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe770 775 780Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val785 790 795 800Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val805 810 815Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Ala820 825 830Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Val835 840 845Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His850 855 860Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp865 870 875 880Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala Ser885 890 895Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gln900 905 910Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gln915 920 925Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys Lys930 935 940Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln Arg945 950 955 960Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly965 970 975Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu Pro980 985 990Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr Gln995 10001005Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu Gln101010151020Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp Phe1025103010351040Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gln104510501055Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser106010651070Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln Met107510801085Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile Ile109010951100Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Ala1105111011151120Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu112511301135Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser114011451150Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Lys Ser11551160(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度1153氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ala Leu Arg Val Leu Leu Leu Thr Ala Leu Thr Leu Cys His Gly1 5 10 15Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg20 25 30Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Leu Gln Gly Ser Arg Val Val Val35 40 45Gly Ala Pro Gln Glu Ile Val Ala Ala Asn Gln Arg Gly Ser Leu Tyr50 55 60Gln Cys Asp Tyr Ser Thr Gly Ser Cys Glu Pro Ile Arg Leu Gln Val65 70 75 80Pro Val Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Thr85 90 95Thr Ser Pro Pro Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Gln Thr100 105 110Cys Ser Glu Asn Thr Tyr Val Lys Gly Leu Cys Phe Leu Phe Gly Ser115 120 125Asn Leu Arg Gln Gln Pro Gln Lys Phe Pro Glu Ala Leu Arg Gly Cys130 135 140Pro Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser145 150 155 160Ile Ile Pro His Asp Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val165 170 175Met Glu Gln Leu Lys Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr180 185 190Ser Glu Glu Phe Arg Ile His Phe Thr Phe Lys Glu Phe Gln Asn Asn195 200 205Pro Asn Pro Arg Ser Leu Val Lys Pro Ile Thr Gln Leu Leu Gly Arg210 215 220Thr His Thr Ala Thr Gly Ile Arg Lys Val Val Arg Glu Leu Phe Asn225 230 235 240Ile Thr Asn Gly Ala Arg Lys Asn Ala Phe Lys Ile Leu Val Val Ile245 250 255Thr Asp Gly Glu Lys Phe Gly Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile260 265 270Pro Glu Ala Asp Arg Glu Gly Val Ile Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly275 280 285Asp Ala Phe Arg Ser Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ala290 295 300Ser Lys Pro Pro Arg Asp His Val Phe Gln Val Asn Asn Phe Glu Ala305 310 315 320Leu Lys Thr Ile Gln Asn Gln Leu Arg Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu325 330 335Gly Thr Gln Thr Gly Ser Ser Ser Ser Phe Glu His Glu Met Ser Gln340 345 350Glu Gly Phe Ser Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Pro Leu Leu Ser Thr355 360 365Val Gly Ser Tyr Asp Trp Ala Gly Gly Val Phe Leu Tyr Thr Ser Lys370 375 380Glu Lye Ser Thr Phe Ile Asn Met Thr Arg Val Asp Ser Asp Met Asn385 390 395 400Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ala Ala Ala Ile Ile Leu Arg Asn Arg Val405 410 415Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Leu Val420 425 430Ala Met Phe Arg Gln Asn Thr Gly Met Trp Glu Ser Asn Ala Asn Val435 440 445Lys Gly Thr Gln Ile Gly Ala Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val450 455 460Asp Val Asp Ser Asn Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro465 470 475 480His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu485 490 495Pro Arg Gly Gln Arg Ala Arg Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Tyr Gly500 505 510Glu Gln Gly Gln Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu515 520 525Gly Asp Val Asn Gly Asp Lys Leu Thr Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro530 535 540Gly Glu Glu Asp Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Thr Ser545 550 555 560Gly Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Gly Ser Lys565 570 575Leu Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln580 585 590Asp Leu Thr Met Asp Gly Leu Val Asp Leu Thr Val Gly Ala Gln Gly595 600 605His Val Leu Leu Leu Arg Ser Gln Pro Val Leu Arg Val Lys Ala Ile610 615 620Met Glu Phe Asn Pro Arg Glu Val Ala Arg Asn Val Phe Glu Cys Asn625 630 635 640Asp Gln Val Val Lys Gly Lys Glu Ala Gly Glu Val Arg Val Cys Leu645 650 655His Val Gln Lys Ser Thr Arg Asp Arg Leu Arg Glu Gly Gln Ile Gln660 665 670Ser Val Val Thr Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Ser Gly Arg Pro His Ser675 680 685Arg Ala Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Ser Thr Arg Arg Gln Thr Gln690 695 700Val Leu Gly Leu Thr Gln Thr Cys Glu Thr Leu Lys Leu Gln Leu Pro705 710 715 720Asn Cys Ile Glu Asp Pro Val Ser Pro Ile Val Leu Arg Leu Asn Phe725 730 735Ser Leu Val Gly Thr Pro Leu Ser Ala Phe Gly Asn Leu Arg Pro Val740 745 750Leu Ala Glu Asp Ala Gln Arg Leu Phe Thr Ala Leu Phe Pro Phe Glu755 760 765Lys Asn Cys Gly Asn Asp Asn Ile Cys Gln Asp Asp Leu Ser Ile Thr770 775 780Phe Ser Phe Met Ser Leu Asp Cys Leu Val Val Gly Gly Pro Arg Glu785 790 795 800Phe Asn Val Thr Val Thr Val Arg Asn Asp Gly Glu Asp Ser Tyr Arg805 810 815Thr Gln Val Thr Phe Phe Phe Pro Leu Asp Leu Ser Tyr Arg Lys Val820 825 830Ser Thr Leu Gln Asn Gln Arg Ser Gln Arg Ser Trp Arg Leu Ala Cys835 840 845Glu Ser Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Gly Ala Leu Lys Ser Thr Ser850 855 860Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Pro Glu Asn Ser Glu Val Thr Phe865 870 875 880Asn Ile Thr Phe Asp Val Asp Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asn Lys Leu885 890 895Leu Leu Lys Ala Asn Val Thr Ser Glu Asn Asn Met Pro Arg Thr Asn
900 905 910Lys Thr Glu Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met915 920 925Val Val Thr Ser His Gly Val Ser Thr Lys Tyr Leu Asn Phe Thr Ala930 935 940Ser Glu Asn Thr Ser Arg Val Met Gln His Gln Tyr Gln Val Ser Asn945 950 955 960Leu Gly Gln Arg Ser Leu Pro Ile Ser Leu Val Phe Leu Val Pro Val965 970 975Arg Leu Asn Gln Thr Val Ile Trp Asp Arg Pro Gln Val Thr Phe Ser980 985 990Glu Asn Leu Ser Ser Thr Cys His Thr Lys Glu Arg Leu Pro Ser His995 10001005Ser Asp Phe Leu Ala Glu Leu Arg Lys Ala Pro Val Val Asn Cys Ser101010151020Ile Ala Val Cys Gln Arg Ile Gln Cys Asp Ile Pro Phe Phe Gly Ile1025103010351040Gln Glu Glu Phe Asn Ala Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Asp Trp104510501055Tyr Ile Lys Thr Ser His Asn His Leu Leu Ile Val Ser Thr Ala Glu106010651070Ile Leu Phe Asn Asp Ser Val Phe Thr Leu Leu Pro Gly Gln Gly Ala107510801085Phe Val Arg Ser Gln Thr Glu Thr Lys Val Glu Pro Phe Glu Val Pro109010951100Asn Pro Leu Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu1105111011151120Leu Ala Leu Ile Thr Ala Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg112511301135Gln Tyr Lys Asp Met Met Ser Glu Gly Gly Pro Pro Gly Ala Glu Pro114011451150Gln(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度1163氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Thr Arg Thr Arg Ala Ala Leu Leu Leu Phe Thr Ala Leu Ala Thr1 5 10 15Ser Leu Gly Phe Asn Leu Asp Thr Glu Glu Leu Thr Ala Phe Arg Val20 25 30Asp Ser Ala Gly Phe Gly Asp Ser Val Val Gln Tyr Ala Asn Ser Trp35 40 45Val Val Val Gly Ala Pro Gln Lys Ile Ile Ala Ala Asn Gln Ile Gly50 55 60Gly Leu Tyr Gln Cys Gly Tyr Ser Thr Gly Ala Cys Glu Pro Ile Gly65 70 75 80Leu Gln Val Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu85 90 95Ala Ser Thr Thr Ser Pro Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val100 105 110His His Glu Cys Gly Arg Asn Met Tyr Leu Thr Gly Leu Cys Phe Leu115 120 125Leu Gly Pro Thr Gln Leu Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Gln Glu130 135 140Cys Pro Arg Gln Glu Gln Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly145 150 155 160Ser Ile Ser Ser Arg Asn Phe Ala Thr Met Met Asn Phe Val Arg Ala165 170 175Val Ile Ser Gln Phe Gln Arg Pro Ser Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln180 185 190Phe Ser Asn Lys Phe Gln Thr His Phe Thr Phe Glu Glu Phe Arg Arg195 200 205Thr Ser Asn Pro Leu Ser Leu Leu Ala Ser Val His Gln Leu Gln Gly210 215 220Phe Thr Tyr Thr Ala Thr Ala Ile Gln Asn Val Val His Arg Leu Phe225 230 235 240His Ala Ser Tyr Gly Ala Arg Arg Asp Ala Ile Lys Ile Leu Ile Val245 250 255Ile Thr Asp Gly Lys Lys Glu Gly Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Asp Val260 265 270Ile Pro Met Ala Asp Ala Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val275 280 285Gly Leu Ala Phe Gln Asn Arg Asn Ser Trp Lys Glu Leu Asn Asp Ile290 295 300Ala Ser Lys Pro Ser Gln Glu His Ile Phe Lys Val Glu Asp Phe Asp305 310 315 320Ala Leu Lys Asp Ile Gln Asn Gln Leu Lys Glu Lys Ile Phe Ala Ile325 330 335Glu Gly Thr Glu Thr Ile Ser Ser Ser Ser Phe Glu Leu Glu Met Ala340 345 350Gln Glu Gly Phe Ser Ala Val Phe Thr Pro Asp Gly Pro Val Leu Gly355 360 365Ala Val Gly Ser Phe Thr Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro370 375 380Asn Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met385 390 395 400Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly405 410 415Val Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Ile Gly Lys420 425 430Ala Val Ile Phe Ile Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Met Lys Ala Glu435 440 445Val Ile Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser450 455 460Val Asp Val Asp Thr Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala465 470 475 480Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro485 490 495Leu Pro Arg Gly Trp Arg Arg Trp Trp Cys Asp Ala Val Leu Tyr Gly500 505 510Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu515 520 525Gly Asp Val Asn Gly Asp Lys Leu Thr Asp Val Val Ile Gly Ala Pro530 535 540Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Val Leu545 550 555 560Gly Pro Ser Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Gly Ser Gln565 570 575Leu Ser Ser Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln580 585 590Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly595 600 605Gln Val Leu Leu Leu Arg Thr Arg Pro Val Leu Trp Val Gly Val Ser610 615 620Met Gln Phe Ile Pro Ala Glu Ile Pro Arg Ser Ala Phe Glu Cys Arg625 630 635 640Glu Gln Val Val Ser Glu Gln Thr Leu Val Gln Ser Asn Ile Cys Leu645 650 655Tyr Ile Asp Lys Arg Ser Lys Asn Leu Leu Gly Ser Arg Asp Leu Gln660 665 670Ser Ser Val Thr Leu Asp Leu Ala Leu Ala Pro Gly Arg Leu Ser Pro675 680 685Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Lys Asn Arg Ser Leu Ser Arg Val Arg690 695 700Val Leu Gly Leu Lys Ala His Cys Glu Asn Phe Asn Leu Leu Leu Pro705 710 715 720Ser Cys Val Glu Asp Ser Val Ile Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe725 730 735Thr Leu Val Gly Lys Pro Leu Leu Ala Phe Arg Asn Leu Arg Pro Met740 745 750Leu Ala Ala Leu Ala Gln Arg Tyr Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu755 760 765Lys Asn Cys Gly Ala Asp His Ile Cys Gln Asp Asn Leu Gly Ile Ser770 775 780Phe Ser Phe Pro Gly Leu Lys Ser Leu Leu Val Gly Ser Asn Leu Glu785 790 795 800Leu Asn Ala Glu Val Met Val Trp Asn Asp Gly Glu Asp Ser Tyr Gly805 810 815Thr Thr Ile Thr Phe Ser His Pro Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Tyr Val820 825 830Ala Glu Gly Gln Lys Gln Gly Gln Leu Arg Ser Leu His Leu Thr Cys835 840 845Cys Ser Ala Pro Val Gly Ser Gln Gly Thr Trp Ser Thr Ser Cys Arg850 855 860Ile Asn His Leu Ile Phe Arg Gly Gly Ala Gln Ile Thr Phe Leu Ala865 870 875 880Thr Phe Asp Val Ser Pro Lys Ala Val Gly Leu Asp Arg Leu Leu Leu885 890 895Ile Ala Asn Val Ser Ser Glu Asn Asn Ile Pro Arg Thr Ser Lys Thr900 905 910Ile Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Ile Val Val915 920 925Ser Ser His Glu Gln Phe Thr Lys Tyr Leu Asn Phe Ser Glu Ser Glu930 935 940Glu Lys Glu Ser His Val Ala Met His Arg Tyr Gln Val Asn Asn Leu945 950 955 960Gly Gln Arg Asp Leu Pro Val Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Glu965 970 975Leu Asn Gln Glu Ala Val Trp Met Asp Val Glu Val Ser His Pro Gln980 985 990Asn Pro Ser Leu Arg Cys Ser Ser Glu Lys Ile Ala Pro Pro Ala Ser995 10001005Asp Phe Leu Ala His Ile Gln Lys Asn Pro Val Leu Asp Cys Ser Ile101010151020Ala Gly Cys Leu Arg Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln1025103010351040Glu Glu Leu Asp Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val104510501055Arg Gln Ile Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile106010651070Ile Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe107510801085Met Arg Ala Gln Thr Ile Thr Val Leu Glu Lys Tyr Lys Val His Asn109010951100Pro Ile Pro Leu Ile Val Gly Ser Ser Ile Gly Gly Leu Leu Leu Leu1105111011151120Ala Leu Ile Thr Ala Val Leu Tyr Lys Val Gly Phe Phe Lys Arg Gln112511301135Tyr Lys Glu Met Met Glu Glu Ala Asn Gly Gln Ile Ala Pro Glu Asn114011451150Gly Thr Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Glu Lys11551160(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQID NO5Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Met Val Phe Gln1 5 10(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6TTYAAYYTGG AYGTNGARGA RCCNATGGTN TTYCA35(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO7TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCCAA 36(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO8TTCAACCTGG ACGTNGAASA NCCCATGGTC TTCCAA 36(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9TTYAAYYTNG AYGTNGARGA RCC 23(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TTYAAYYTGG ACGTNGAAGA 20(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TGRAANACCA TNGGYTC17(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12TTGGAAGACC ATNGGYTC 18(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13ATTAACCCTC ACTAAAG17(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14AATACGACTC ACTATAG17(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Val Phe Gln Glu Xaa Gly Ala Gly Pne Gly Gln1 5 10(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Leu Tyr Asp Xaa Val Ala Ala Thr Gly Leu Xaa Gln Pro Ile1 5 10(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長度12氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO17Pro Leu Glu Tyr Xaa Asp Val Ile Pro Gln Ala Glu1 5 10(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長度10氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Phe Gln Glu Gly Phe Ser Xaa Val Leu Xaa1 5 10(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO19Thr Ser Pro Thr Phe Ile Xaa Met Ser Gln Glu Asn Val Asp1 5 10(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Val Xaa Gln Thr Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO21Leu Asp Xaa Lys Pro Xaa Asp Thr Ala1 5(2)SEQ ID NO22信息
(i)序列特征(A)長度7氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Phe Gly Glu Gln Phe Ser Glu1 5(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO23RAANCCYTCY TGRAAACTYT C(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度1006堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO24TTCAACCTGG ACGTGGAGGA GCCCATGGTG TTCAAGAGGA TGGAGCTGGC TTTGGACAGA 60GCGTGGCCCA GCTTGGCGGA TCTAGACTCG TGGTGGGAGC CCCCCTGGAG GTGGTGGCGG120TCAACCAAAC AGGAAGGTTG TATGACTGTG TGGCTGCCAC TGGCCTTGTC AACCCATACC180CCTGCACACA CCCCCAGATG CTGTGAACAT GTCCCTGGGT CTCTCCCTGT CAGCCGCCGC240CAGTCGCCCC TGGCTGCTGG CCTGTGGCCC AACCATGCAC AGAGCCTGTG GGGAGAATAT300GTATGCAGAA GGCTTTTGCC TCCTGTTGGA CTCCCATCTG CAGACCATTT GGACAGTACC360TGCTGCCCTA CCAGAGTGTC CAAGTCAAGA GATGGACATT GTCTTCCTGA TTGATGGTTC420TGGCAGTATG AGCAAAGTGA CTTTAAACAA ATGAAGGATT TGTGAGAGCT GTGATGGGAC480AGTTTGAGGG CACCCAAACC CTGTTCTCAC TGATACAGTA TCCCACCTCC CTGAAGATCC540ACTTCACCTT CACGCAATTC CAGAGCAGCT GGAACCCTCT GAGCCTGGTG GATCCCATTG600TCCAACTGGA CGGCCTGACA TATACAGCCA CGGGCATCCG GAAAGTGGTG GAGGAACTGT660TTCATAGTAA GAATGGGGCC CGTAAAAGTG CCAAGAAGAT CCTCATTGTC ATCACAGATG720GCAAAAATAC AAAGACCCCC TGGAGTACGA GGACGTATCC CCAGGCAGAG AGAGCGGATC780ATCCGCTATG CCATTGGGGT GGGAGATGCT TTCTGGAAAC CCAGTGCCAA GCAGGAGCTG840GACAACATTG GCTCAGAGCC GGCTCAGGAC CATGTGTTCA GGGTGGACAA CTTTGCAGCA900CTCAGCAGCA TCCAGGAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTTTG CACTCGAAGG AACCCAGTCG960ACGACAAGTA GCTCTTTCCA ACATGAGATG TTCCAAGAAG GGTTCA 1006(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO25CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO26CCACTGTCAG GATGCCCGTG 20(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO27AGTTACGAAT TCGCCACCAT GGCTCTACGG GTGCTTCTTC TG 42(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長度42堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO28AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACTCGGACT GTGCTTCTTC TG 42(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO29AGTTACGAAT TCGCCACCAT GACCTTCGGC ACTGTG36(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO30TTGCTGACTG CCTGCAGTTC 20(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO31GTTCTGACGC GTAATGGCAT TGTAGACCTC GTCTTC36(2)SEQ ID NO32信息(i)序列特征(A)長度36堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO32ACGTATGCAG GATCCCATCA AGAGATGGAC ATCGCT36(2)SEQ ID NO33信息(i)序列特征(A)長度37堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO33ACTGCATGTC TCGAGGCTGA AGCCTTCTTG GGACATC 37(2)SEQ ID NO34信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO34TATAGACTGC TGGGTAGTCC CCAC 24(2)SEQ ID NO35信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO35TGAAGATTGG GGGTAAATAA CAGA 24(2)SEQ ID NO36信息(i)序列特征(A)長度3528堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..3456(xi)序列描述SEQ ID NO36GGC TGG GCC CTG GCT TCC TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG GAA 48Gly Trp Ala Leu Ala Ser Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Glu1 5 10 15CCC ATC GTG TTC AGA GAG GAT GCA GCC AGC TTT GGA CAG ACT GTG GTG 96Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val20 25 30CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG 144Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val
35 40 45GCA GTC AAC CAA ACA GGA CGG TTG TAT GAC TGT GCA CCT GCC ACT GGC 192Ala Val Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly50 55 60ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG 240Met Cys Gln Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu Glu Ala Val Asn Met65 70 75 80TCC CTG GGC CTG TCT CTG GTG ACT GCC ACC AAT AAC GCC CAG TTG CTG 288Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Ala Thr Asn Asn Ala Gln Leu Leu85 90 95GCT TGT GGT CCA ACT GCA CAG AGA GCT TGT GTG AAG AAC ATG TAT GCG 336Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg Ala Cys Val Lys Asn Met Tyr Ala100 105 110AAA GGT TCC TGC CTC CTT CTC GGC TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA 384Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala115 120 125GTC CCT GCC TCC ATG CCA GAG TGT CCA AGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT 432Val Pro Ala Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gln Glu Met Asp Ile Ala130 135 140TTC CTG ATT GAT GGT TCT GGC AGC ATT AAC CAA AGG GAC TTT GCC CAG 480Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gln Arg Asp Phe Ala Gln145 150 155 160ATG AAG GAC TTT GTC AAA GCT TTG ATG GGA GAG TTT GCG AGC ACC AGC 528Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Thr Ser165 170 175ACC TTG TTC TCC CTG ATG CAA TAC TCG AAC ATC CTG AAG ACC CAT TTT 576Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe180 185 190ACC TTC ACT GAA TTC AAG AAC ATC CTG GAC CCT CAG AGC CTG GTG GAT 624Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro Gln Ser Leu Val Asp195 200 205CCC ATT GTC CAG CTG CAA GGC CTG ACC TAC ACA GCC ACA GGC ATC CGG 672Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Ile Arg210 215 220ACA GTG ATG GAA GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGG TCC CGT AAA AGT 720Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser225 230 235 240GCC AAG AAG ATC CTC CTT GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TAC AGA GAC 768Ala Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Arg Asp
245 250 255CCC CTG GAG TAT AGT GAT GTC ATT CCC GCC GCA GAC AAA GCT GGC ATC816Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Ala Gly Ile260 265 270ATT CGT TAT GCT ATT GGG GTG GGA GAT GCC TTC CAG GAG CCC ACT GCC864Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe Gln Glu Pro Thr Ala275 280 285CTG AAG GAG CTG AAC ACC ATT GGC TCA GCT CCC CCA CAG GAC CAC GTG912Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val290 295 300TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC ATC CAG AGG CAA CTT960Phe Lys Val Gly Asn Phe Ala Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Leu305 310 315 320CAG GAG AAA ATC TTC GCC ATT GAG GGA ACT CAA TCA AGG TCA AGT AGT 1008Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu Gly Thr Gln Ser Arg Ser Ser Ser325 330 335TCC TTT CAG CAC GAG ATG TCA CAA GAA GGT TTC AGT TCA GCT CTC ACA 1056Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr340 345 350TCG GAT GGA CCC GTT CTG GGG GCC GYG GGA AGC TTC AGC TGG TCC GGA 1104Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala Xaa Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly355 360 365GGT GCC TTC TTA TAT CCC CCA AAT ACG AGA CCC ACC TTT ATC AAC ATG 1152Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met370 375 380TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGA GAC TCC TAC CTG GGT TAC TCC ACC 1200Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr385 390 395 400GCA GTG GCC TTT TGG AAG GGG GTT CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCG 1248Ala Val Ala Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro405 410 415CGT CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA GCC AGG 1296Arg His Gln His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ala Arg420 425 430CAT TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC 1344His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr435 440 445TTC GGG GCC TCT CTC TGT TCT GTG GAC GTG GAT AGA GAT GGC AGC ACY 1392Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa450 455 460GAC CTG GTC CTG ATC GGA GCC CCC CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG 1440Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly465 470 475 480GGG CAG GTC TCA GTG TKC CCC GTG CCC GGT GTG AGG GGC AGG TGG CAG 1488Gly Gln Val Ser Val Xaa Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln485 490 495TGT GAG GCC ACC CTC CAC GGG GAG CAG GRC CAT CCT TGG GGC CGC TTT 1536Cys Glu Ala Thr Leu His Gly Glu Gln Xaa His Pro Trp Gly Arg Phe500 505 510GGG GTG GCT CTG ACA GTG CTG GGG GAC GTA AAC GGG GAC AAT CTG GCA 1584Gly Val Ala Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Ala515 520 525GAC GTG GCT ATT GGT GCC CCT GGA GAG GAG GAG AGC AGA GGT GCT GTC 1632Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ala Val530 535 540TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC ATG CCC TCA CCC AGC 1680Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser545 550 555 560CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC TCC CTG AGA CTG CAG TAT TTT GGG 1728Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu Ser Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly565 570 575CAG TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAC CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC 1776Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp580 585 590CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC GTA CTG CTG CTC AGG AGT CTG CCT 1824Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro595 600 605CTG CTG AAA GTG GAG CTC TCC ATA AGA TTC GCC CCC ATG GAG GTG GCA 1872Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Ala Pro Met Glu Val Ala610 615 620AAG GCT GTG TAC CAG TGC TGG GAA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT 1920Lys Ala Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala625 630 635 640GGA GAG GCC ACT GTC TGT CTC ACT GTC CAC AAA GGC TCA CCT GAC CTG 1968Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys Gly Ser Pro Asp Leu645 650 655TTA GGT AAT GTC CAA GGC TCT GTC AGG TAT GAT CTG GCG TTA GAT CCG 2016Leu Gly Asn Val Gln Gly Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro660 665 670GGC CGC CTG ATT TCT CGT GCC ATT TTT GAT GAG ACT AAG AAC TGC ACT 2064Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr675 680 685TTG ACG GGA AGG AAG ACT CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA GTG 2112Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val690 695 700AAG CTG CTT TTG CCG GAC TGT GTG GAA GAT GCA GTG AGC CCT ATC ATC 2160Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile705 710 715 720CTG CGC CTC AAC TTT TCC CTG GTG AGA GAC TCT GCT TCA CCC AGG AAC 2208Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser Ala Ser Pro Arg Asn725 730 735CTG CAT CCT GTG CTG GCT GTG GGC TCA CAA GAC CAC ATA ACT GCT TCT 2256Leu His Pro Val Leu Ala Val Gly Ser Gln Asp His Ile Thr Ala Ser740 745 750CTG CCG TTT GAG AAG AAC TGT AAG CAA GAA CTC CTG TGT GAG GGG GAC 2304Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp755 760 765CTG GGC ATC AGC TTT AAC TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GTG GTG GGA 2352Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly770 775 780GGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTC ACT GTG TGG AAT GAG GGT GAG 2400Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu785 790 795 800GAC AGC TAT GGA ACT TTA GTC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GGG CTA TCT 2448Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser805 810 815TAC CGA CGG GTA ACA GGG ACT CAG CAA CCT CAT CAG TAC CCA CTA CGC 2496Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gln Gln Pro His Gln Tyr Pro Leu Arg820 825 830TTG GCC TGT GAG GCT GAG CCC GCT GCC CAG GAG GAC CTG AGG AGC AGC 2544Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Ala Ala Gln Glu Asp Leu Arg Ser Ser835 840 845AGC TGT AGC ATT AAT CAC CCC ATC TTC CGA GAA GGT GCA AAG ACC ACC 2592Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Thr Thr850 855 860TTC ATG ATC ACA TTC GAT GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTA GGA GAC AGG 2640Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg865 870 875 880TTG CTT CTG AGG GCC AAA GCC AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT GAT ACC 2688Leu Leu Leu Arg Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr885 890 895AAC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTC CCA GTG AAG TAC ACC GTC TAT 2736Asn Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr900 905 910ACC CTG ATC AGT AGG CAA GAA GAT TCC ACC AAC CAT GTC AAC TTT TCA 2784Thr Leu Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser915 920 925TCT TCC CAC GGG GGG AGA AGG CAA GAA GCC GCA CAT CGC TAT CGT GTG 2832Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gln Glu Ala Ala His Arg Tyr Arg Val930 935 940AAT AAC CTG AGT CCA CTG AAG CTG GCC GTC AGA GTT AAC TTC TGG GTC 2880Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Ala Val Arg Val Asn Phe Trp Val945 950 955 960CCT GTC CTT CTG AAC GGT GTG GCT GTG TGG GAC GTG ACT CTG AGC AGC 2928Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser965 970 975CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGC GTG TCC CAG ATG AAA CCT CCT CAG AAT 2976Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Met Lys Pro Pro Gln Asn980 985 990CCC GAC TTT CTG ACC CAG ATT CAG AGA CGT TCT GTG CTG GAC TGC TCC 3024Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser995 10001005ATT GCT GAC TGC CTG CAC TCC CGC TGT GAC ATC CCC TCC TTG GAC ATC 3072Ile Ala Asp Cys Leu His Ser Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile101010151020CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC CTC AGC TTC GGC TGG 3120Gln Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp1025103010351040GTC AGT CAG ACA TTG CAG GAA AAG GTG TTG CTT GTG AGT GAG GCT GAA 3168Val Ser Gln Thr Leu Gln Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Ala Glu104510501055ATC ACT TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG CTG CCA GGA CAG GAG GCA 3216Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala106010651070TTT CTG AGA GCC CAG GTG GAG ACA ACG TTA GAA GAA TAC GTG GTC TAT 3264Phe Leu Arg Ala Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr107510801085GAG CCC ATC TTC CTC GTG GCG GGC AGC TCG GTG GGA GGT CTG CTG TTA 3312Glu Pro Ile Phe Leu Val Ala Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu109010951100CTG GCT CTC ATC ACA GTG GTA CTG TAC AAG CTT GGC TYC TYC AAA CGT 3360Leu Ala Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg1105111011151120CAG TAC AAA GAA ATG CTG GAC GGC AAG GCT GCA GAT CCT GTC ACA GCC 3408Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala Asp Pro Val Thr Ala112511301135GGC CAG GCA GAT TTC GGC TGT GAG ACT CCT CCA TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA 3463Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser114011451150CTCTCCTGCC TATCTCTGNA ATGAAGATTG GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA3523CGAGT3528(2)SEQ ID NO37信息(i)序列特征(A)長度1151氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO37Gly Trp Ala Leu Ala Ser Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Glu1 5 10 15Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val20 25 30Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val35 40 45Ala Val Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly50 55 60Met Cys Gln Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu Glu Ala Val Asn Met65 70 75 80Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Ala Thr Asn Asn Ala Gln Leu Leu
85 90 95Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg Ala Cys Val Lys Asn Met Tyr Ala100 105 110Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala115 120 125Val Pro Ala Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gln Glu Met Asp Ile Ala130 135 140Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gln Arg Asp Phe Ala Gln145 150 155 160Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Thr Ser165 170 175Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe180 185 190Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro Gln Ser Leu Val Asp195 200 205Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Ile Arg210 215 220Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser225 230 235 240Ala Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Arg Asp245 250 255Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Ala Gly Ile260 265 270Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe Gln Glu Pro Thr Ala275 280 285Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val290 295 300Phe Lys Val Gly Asn Phe Ala Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Leu305 310 315 320Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu Gly Thr Gln Ser Arg Ser Ser Ser325 330 335Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr340 345 350Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala Xaa Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly
355 360 365Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met370 375 380Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr385 390 395 400Ala Val Ala Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro405 410 415Arg His Gln His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ala Arg420 425 430His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr435 440 445Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa450 455 460Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly465 470 475 480Gly Gln Val Ser Val Xaa Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln485 490 495Cys Glu Ala Thr Leu His Gly Glu Gln Xaa His Pro Trp Gly Arg Phe500 505 510Gly Val Ala Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Ala515 520 525Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ala Val530 535 540Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser545 550 555 560Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu Ser Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly565 570 575Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp580 585 590Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro595 600 605Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Ala Pro Met Glu Val Ala610 615 620Lys Ala Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala625 630 635 640Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys Gly Ser Pro Asp Leu645 650 655Leu Gly Asn Val Gln Gly Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro660 665 670Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr675 680 685Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val690 695 700Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile705 710 715 720Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser Ala Ser Pro Arg Asn725 730 735Leu His Pro Val Leu Ala Val Gly Ser Gln Asp His Ile Thr Ala Ser740 745 750Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp755 760 765Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly770 775 780Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu785 790 795 800Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser805 810 815Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gln Gln Pro His Gln Tyr Pro Leu Arg820 825 830Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Ala Ala Gln Glu Asp Leu Arg Ser Ser835 840 845Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Thr Thr850 855 860Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg865 870 875 880Leu Leu Leu Arg Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr885890 895Asn Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr
900 905 910Thr Leu Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser915 920 925Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gln Glu Ala Ala His Arg Tyr Arg Val930 935 940Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Ala Val Arg Val Asn Phe Trp Val945 950 955 960Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser965 970 975Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Met Lys Pro Pro Gln Asn980 985 990Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser995 10001005Ile Ala Asp Cys Leu His Ser Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile101010151020Gln Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp1025103010351040Val Ser Gln Thr Leu Gln Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Ala Glu104510501055Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala106010651070Phe Leu Arg Ala Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr107510801085Glu Pro Ile Phe Leu Val Ala Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu109010951100Leu Ala Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg1105111011151120Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala Asp Pro Val Thr Ala112511301135Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser114011451150(2)SEQ ID NO38信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO38GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G21(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO39GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO40TGTAAAACGA CGGCCAGT18(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO41GGAAACAGCT ATGACCATG 19(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO42GGACATGTTC ACTGCCTCTA GG 22(2)SEQ ID NO43信息(i)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO43GGCGGACAGT CAGACGACTG TCCTG25(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特征(A)長度38堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA
(xi)序列描述SEQ ID NO44CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特征(A)長度3519堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置52..3519(xi)序列描述SEQ ID NO45GCTTTCTGAA GGTTCCAGAA TCGATAGTGA ATTCGTGGGC ACTGCTCAGA T ATG GTC57Met Val1CGT GGA GTT GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT TCC TGT CAT105Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser Cys His5 10 15GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG GAT GCA153Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu Asp Ala20 25 30GCC AGC TTC GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG201Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val35 40 45 50GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA CAG TCG249Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly Gln Ser55 60 65TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA CTG CAC297Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu Leu His70 75 80ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG GTG GCT345Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Ala85 90 95GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA CAG AGA393Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg100 105 110GCT TGT GCA AAG AAC ATG TAT GCA AAA GGT TCC TGC CTC CTT CTG GGC441Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly115 120 125 130TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC ATG CCA GAG TGT489Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro Glu Cys135 140 145CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGC TCC GGC AGC537Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser150 155 160ATT GAT CAA AGT GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA GCT TTG585Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu165 170 175ATG GGC CAG TTG GCG AGC ACC AGC ACC TCG TTC TCC CTG ATG CAA TAC 633Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met Gln Tyr180 185 190TCA AAC ATC CTG AAG ACT CAT TTT ACC TTC ACG GAA TTC AAG AGC AGC 681Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys Ser Ser195 200 205210CTG AGC CCT CAG AGC CTG GTG GAT GCC ATC GTC CAG CTC CAA GGC CTG 729Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu215 220 225ACG TAC ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG CTA TTT CAT 777Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu Phe His230 235 240AGC AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CTA ATT GTC ATC 825Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile245 250 255ACA GAT GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CAT GTC ATC 873Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His Val Ile260 265 270CCT GAA GCA GAG AAA GCT GGG ATC ATT CGC TAT GCT ATA GGG GTG GGA 921Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly275 280 285 290GAT GCC TTC CGG GAA CCC ACT GCC CTA CAG GAG CTG AAC ACC ATT GGC 969Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr Ile Gly295 300 305TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT GTA GCA1017Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe Val Ala310 315 320CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC ATT GAA1065Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu325 330 335GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG TCA CAA1113Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln340 345 350GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG GGG GCT1161Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala355 360 365 370GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC TCA AAT 1209Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Ser Asn375 380 385ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT ATG AGG 1257Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp Met Arg390 395 400GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG GGG GTC 1305Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys Gly Val405 410 415CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT 1353His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly Lys Val420 425 430GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC 1401Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val435 440 445 450AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT TCT GTG 1449Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val455 460 465GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA GTC CCC 1497Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly Val Pro470 475 480CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC CCC ATG 1545His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Met485 490 495CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT GGG GAG 1593Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His Gly Glu500 505 510CAG GGC CAT CCT TGG GGC CGC TTT GGG GCG GCT CTG ACA GTG CTA GGG 1641Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly515 520 525 530GAC GTG AAT GGG GAC AGT CTG GCG GAT GTG GCT ATT GGT GCA CCC GGA 1689Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly535 540 545GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA 1737Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg550 555 560CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC 1785Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu565 570 575TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT GGG GGT CAG GAC 1833Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp580 585 590CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC 1881Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His595 600 605 610GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC TCC ATT 1929Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile Ser Ile615 620 625AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC TGG GGA 1977Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys Trp Gly630 635 640AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT CTC ACT 2025Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr645 650 655GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC TCT GTC 2073Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser Ser Val660 665 670AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT GCC ATT 2121Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile675 680 685 690TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT CTG GGG 2169Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly695 700 705CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC TGT GTG 2217Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val710 715 720GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC CTG GCA 2265Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser Leu Ala725 730 735GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT GTG GGC 2313Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val Gly740 745 750TCA CAA GAC CAT GTA ACA GCT TCT TTC CCG TTT GAG AAG AAC TGT GAG 2361Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn Cys Glu755 760 765 770GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG 2409Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu775 780 785GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG 2457Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu790 795 800GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACC TTA ATC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GAG 2505Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu805 810 815CTA TCT TAC CGA CGG GTG ACA AGA GCC CAG CAA CCT CAT CCG TAC CCA 2553Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg Ala Gln Gln Pro His Pro Tyr Pro820 825 830CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG CCC ACG GGC CAG GAG AGC CTG AGG 2601Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Thr Gly Gln Glu Ser Leu Arg835 840 845 850AGC AGC AGC TGT AGC ATC AAT CAC CCC ATC TTC CGA GAA GGT GCC AAG 2649Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys855 860 865GCC ACC TTC ATG ATC ACA TTT GAT GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTG GGA 2697Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly870 875 880GAC AGG TTG CTT CTG AGG GCC AGC GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT 2745Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro885 890 895GAA ACC AGC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTT CCG GTG AAG TAC ACG 2793Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr900 905 910GTC TAT ACC GTG ATC AGT AGG CAG GAA GAT TCT ACC AAG CAT TTC AAC 2841Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn915 920 925 930TTC TCA TCT TCC CAC GGG GAG AGA CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT 2889Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg Gln Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr935 940 945CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC 2937Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Thr Leu Ala Ile Ser Val Asn Phe950 955 960TGG GTC CCC ATC CTT CTG AAT GGT GTG GCC GTG TGG GAT GTG ACT CTG 2985Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu965 970 975AGG AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGT GTG TCA CAG AGG GAA CCT CCT 3033Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Arg Glu Pro Pro980 985 990CAA CAT TCC GAC CTT CTG ACC CAG ATC CAA GGA CGC TCT GTG CTG GAC 3081Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln Ile Gln Gly Arg Ser Val Leu Asp995 100010051010TGC GCC ATC GCC GAC TGC CTG CAC CTC CGC TGT GAC ATC CCC TCC TTG 3129Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu101510201025GGC ACC CTG GAT GAG CTT GAC TTC ATT CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC 3177Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe103010351040GGC TGG ATC AGT CAG ACA TTG CAG AAA AAG GTG TTG CTC CTG AGT GAG 3225Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu104510501055GCT GAA ATC ACA TTC AAC ACA TCT GTG TAT TCC CAG CTG CCG GGA CAG 3273Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln106010651070GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG TCA ACG ATG CTA GAA GAA TAC GTG 3321Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val1075108010851090GTC TAT GAG CCC GTC TTC CTC ATG GTG TTC AGC TCA GTG GGA GGT CTG 3369Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu109511001105CTG TTA CTG GCT CTC ATC ACT GTG GCG CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC 3417Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe111011151120AAA CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG GAT CTA CCA TCT GCA GAT CCT GAC 3465Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Leu Pro Ser Ala Asp Pro Asp112511301135CCA GCC GGC CAG GCA GAT TCC AAC CAT GAG ACT CCT CCA CAT CTC ACG 3513Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr114011451150TCC TAG 3519Ser1155(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特征(A)長度1155氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO46Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser1 5 10 15Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu20 25 30Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg35 40 45Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly50 55 60Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu65 70 75 80Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu85 90 95Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala100 105 110Gln Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu115 120 125Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro130 135 140Glu Cys Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser145 150 155 160Gly Ser Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys165 170 175Ala Leu Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met180 185 190Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys195 200 205Ser Ser Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln210 215 220Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu225 230 235 240Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile245 250 255Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His260 265 270Val Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly275 280 285Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr290 295 300Ile Gly Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe305 310 315 320Val Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala325 330 335Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met340 345 350Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu355 360 365Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro370 375 380Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Mer Ser Gln Glu Asn Glu Asp385 390 395 400Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys405 410 415Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly420 425 430Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser435 440 445Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys450 455 460Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly465 470 475 480Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys485 490 495Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His500 505 510Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val515 520 525Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala530 535 540Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala545 550 555 560Ser Arg Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser565 570 575Gln Leu Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly580 585 590Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln595 600 605Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile610 615 620Ser Ile Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys625 630 635 640Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys645 650 655Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser660 665 670Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg675 680 685Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr690 695 700Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp705 710 715 720Cys Val Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser725 730 735Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala740 745 750Val Gly Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn755 760 765Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln Val770 775 780Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Trp785 790 795 800Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro805 810 815Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg Ala Gln Gln Pro His Pro
820 825 830Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Thr Gly Gln Glu Ser835 840 845Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Ile Phe Arg Glu Gly850 855 860Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala Phe865 870 875 880Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn885 890 895Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val Lys900 905 910Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Lys His915 920 925Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg Gln Lys Glu Ala Glu His930 935 940Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Thr Leu Ala Ile Ser Val945 950 955 960Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp Val965 970 975Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Arg Glu980 985 990Pro Pro Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln Ile Gln Gly Arg Ser Val995 10001005Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His Leu Arg Cys Asp Ile Pro101010151020Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Lys Gly Asn Leu1025103010351040Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln Lys Lys Val Leu Leu Leu104510501055Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu Pro106010651070Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val Ser Thr Met Leu Glu Glu107510801085Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met Val Phe Ser Ser Val Gly
109010951100Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Tyr Lys Leu Gly1105 1110 11151120Phe Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Leu Pro Ser Ala Asp112511301135Pro Asp Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn His Glu Thr Pro Pro His1140 11451150Leu Thr Ser1155(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特征(A)長度49堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO47AGTTACGGAT CCGGCACCAT GACCTTCGGC ACTGTGATCC TCCTGTGTG49(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO48GCTGGACGAT GGCATCCAC 19(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特征
(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO49GTAGAGTTAC GGATCCGGCA CCAT 24(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO50GCAGCCAGCT TCGGACAGAC20(2)SEQ ID NO51信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO51CCATGTCCAC AGAACAGAGA G 21(2)SEQ ID NO52信息(i)序列特征(A)長度3803堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..3486(xi)序列描述SEQ ID NO52ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT TCC48Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser1 5 10 15TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG96Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu20 25 30GAT GCA GCC AGC TTC GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA 144Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg35 40 45CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA 192Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly50 55 60CAG TCG TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA 240Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu65 70 75 80CTG CAC ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG 288Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu85 90 95GTG GCT GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA 336Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala100 105 110CAG AGA GCT TGT GCA AAG AAC ATG TAT GCA AAA GGT TCC TGC CTC CTT 384Gln Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu115 120 125CTG GGC TCC AGC TTG CAG TTC ATC CAG GCA ATC CCT GCT ACC ATG CCA 432Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro130 135 140GAG TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGC TCC 480Glu Cys Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser145 150 155 160GGC AGC ATT GAT CAA AGT GAC TTT ACC CAG ATG AAG GAC TTC GTC AAA 528Gly Ser Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys165 170 175GCT TTG ATG GGC CAG TTG GCG AGC ACC AGC ACC TCG TTC TCC CTG ATG 576Ala Leu Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met180 185 190CAA TAC TCA AAC ATC CTG AAG ACT CAT TTT ACC TTC ACG GAA TTC AAG 624Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys195 200 205AGC AGC CTG AGC CCT CAG AGC CTG GTG GAT GCC ATC GTC CAG CTC CAA 672Ser Ser Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln210 215 220GGC CTG ACG TAC ACA GCC TCG GGC ATC CAG AAA GTG GTG AAA GAG CTA720Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu225 230 235 240TTT CAT AGC AaG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATA CTA ATT768Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile245 250 255GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAA TTC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGA CAT816Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His260 265 270GTC ATC CCT GAA GCA GAG AAA GCT GGG ATC ATT CGC TAT GCT ATA GGG864Val Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly275 280 285GTG GGA GAT GCC TTC CGG GAA CCC ACT GCC CTA CAG GAG CTG AAC ACC912Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr290 295 300ATT GGC TCA GCT CCC TCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GGC AAT TTT960Ile Gly Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe305 310 315 320GTA GCA CTT CGC AGC ATC CAG CGG CAA ATT CAG GAG AAA ATC TTT GCC 1008Val Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala325 330 335ATT GAA GGA ACC GAA TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG 1056Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met340 345 350TCA CAA GAA GGT TTC AGC TCA GCT CTC TCA ATG GAT GGA CCA GTT CTG 1104Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu355 360 365GGG GCT GTG GGA GGC TTC AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC TTG TAC CCC 1152Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro370 375 380TCA AAT ATG AGA TCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAC GAG GAT 1200Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp385 390 395 400ATG AGG GAC GCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GCA CTG GCC TTT TGG AAG 1248Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys405 410 415GGG GTC CAC AGC CTG ATC CTG GGG GCC CCT CGC CAC CAG CAC ACG GGG 1296Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly420 425 430AAG GTT GTC ATC TTT ACC CAG GAA TCC AGG CAC TGG AGG CCC AAG TCT 1344Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser435 440 445GAA GTC AGA GGG ACA CAG ATC GGC TCC TAC TTT GGG GCA TCT CTC TGT 1392Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys450 455 460TCT GTG GAC ATG GAT AGA GAT GGC AGC ACT GAC CTG GTC CTG ATT GGA 1440Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly465 470 475 480GTC CCC CAT TAC TAT GAG CAC ACC CGA GGG GGG CAG GTG TCG GTG TGC 1488Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys485 490 495CCC ATG CCT GGT GTG AGG AGC AGG TGG CAT TGT GGG ACC ACC CTC CAT 1536Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His500 505 510GGG GAG CAG GGC CAT CCT TGG GGC CGC TTT GGG GCG GCT CTG ACA GTG 1584Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val515 520 525CTA GGG GAC GTG AAT GGG GAC AGT CTG GCG GAT GTG GCT ATT GGT GCA 1632Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala530 535 540CCC GGA GAG GAG GAG AAC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC 1680Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala545 550 555 560TCG AGA CAG GAC ATC GCT CCC TCG CCT AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC 1728Ser Arg Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser565 570 575CAG CTC TTC CTG AGG CTC CAA TAT TTT GGG CAG TCA TTA AGT GGG GGT 1776Gln Leu Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly580 585 590CAG GAC CTT ACA CAG GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG 1824Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln595 600 605GGG CAC GTG CTG CTG CTT AGG AGT CTG CCT TTG CTG AAA GTG GGG ATC 1872Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile610 615 620TCC ATT AGA TTT GCC CCC TCA GAG GTG GCA AAG ACT GTG TAC CAG TGC 1920Ser Ile Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys625 630 635 640TGG GGA AGG ACT CCC ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACC GTC TGT 1968Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys645 650 655CTC ACT GTC CGC AAA GGT TCA CCT GAC CTG TTA GGT GAT GTC CAA AGC 2016Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser660 665 670TCT GTC AGG TAT GAT CTG GCG TTG GAT CCG GGC CGT CTG ATT TCT CGT 2064Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ils Ser Arg675 680 685GCC ATT TTT GAT GAG ACG AAG AAC TGC ACT TTG ACC CGA AGG AAG ACT 2112Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr690 695 700CTG GGG CTT GGT GAT CAC TGC GAA ACA ATG AAG CTG CTT TTG CCA GAC 2160Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp705 710 715 720TGT GTG GAG GAT GCA GTG ACC CCT ATC ATC CTG CGC CTT AAC TTA TCC 2208Cys Val Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser725 730 735CTG GCA GGG GAC TCT GCT CCA TCC AGG AAC CTT CGT CCT GTG CTG GCT 2256Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala740 745 750GTG GGC TCA CAA GAC CAT GTA ACA GCT TCT TTC CCG TTT GAG AAG AAC 2304Val Gly Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn755 760 765TGT AAG CAG GAG CTC CTG TGT GAG GGG AAC CTG GGC GTC AGC TTC AAC 2352Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn770 775 780TTC TCA GGC CTG CAG GTC TTG GAG GTA GGA AGC TCC CCA GAG CTC ACT 2400Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr785 790 795 800GTG ACA GTA ACA GTT TGG AAT GAG GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACC TTA 2448Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu805 810 815ATC AAG TTC TAC TAC CCA GCA GAG CTA TCT TAC CGA CGG GTG ACA AGA 2496Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg820 825 830GCC CAG CAA CCT CAT CCG TAC CCA CTA CGC CTG GCA TGT GAG GCT GAG 2544Ala Gln Gln Pro His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu835 840 845CCC ACG GGC CAG GAG AGC CTG AGG AGC AGC AGC TGT AGC ATC AAT CAC 2592Pro Thr Gly Gln Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His850 855 860CCC ATC TTC CGA GAA GGT GCC AAG GCC ACC TTC ATG ATC ACA TTT GAT 2640Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp865 870 875 880GTC TCC TAC AAG GCC TTC CTG GGA GAC AGG TTG CTT CTG AGG GCC AGC 2688Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser885 890 895GCA AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT GAA ACC AGC AAG ACT GCC TTC CAG 2736Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln900 905 910CTG GAG CTT CCG GTG AAG TAC ACG GTC TAT ACC GTG ATC AGT AGG CAG 2784Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln915 920 925GAA GAT TCT ACC AAG CAT TTC AAC TTC TCA TCT TCC CAC GGG GAG AGA 2832Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg930 935 940CAG AAA GAG GCC GAA CAT CGA TAT CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA TTG 2880Gln Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu945 950 955 960ACG CTG GCC ATC AGC GTT AAC TTC TGG GTC CCC ATC CTT CTG AAT GGT 2928Thr Leu Ala Ile Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly965 970 975GTG GCC GTG TGG GAT GTG ACT CTG AGG AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC 2976Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser980 985 990TGT GTG TCA CAG AGG GAA CCT CCT CAA CAT TCC GAC CTT CTG ACC CAG 3024Cys Val Ser Gln Arg Glu Pro Pro Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln995 10001005ATC CAA GGA CGC TCT GTG CTG GAC TGC GCC ATC GCC GAC TGC CTG CAC 3072Ile Gln Gly Arg Ser Val Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His101010151020CTC CGC TGT GAC ATC CCC TCC TTG GGC ACC CTG GAT GAG CTT GAC TTC 3120Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe1025103010351040ATT CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC GGC TGG ATC AGT CAG ACA TTG CAG 3168Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln104510501055AAA AAG GTG TTG CTC CTG AGT GAG GCT GAA ATC ACA TTC AAC ACA TCT 3216Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser106010651070GTG TAT TCC CAG CTG CCG GGA CAG GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG 3264Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val107510801085TCA ACG ATG CTA GAA GAA TAC GTG GTC TAT GAG CCC GTC TTC CTC ATG 3312Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met109010951100GTG TTC AGC TCA GTG GGA GGT CTG CTG TTA CTG GCT CTC ATC ACT GTG 3360Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val1105111011151120GCG CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGT CAG TAT AAA GAG ATG CTG 3408Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu112511301135GAT CTA CCA TCT GCA GAT CCT GAC CCA GCC GGC CAG GCA GAT TCC AAC 3456Asp Leu Pro Ser Ala Asp Pro Asp Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn114011451150CAT GAG ACT CCT CCA CAT CTC ACG TCC TAGGAATCTA CTTTCCTGTA 3503His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr Ser11551160TATCTCCACA ATTACGAGAT TGGTTTTGCT TTTGCCTATG AATCTACTGG CATGGGAACA 3563AGTTCTCTTC AGCTCTGGGC TAGCCTGGGA AACTTCCCAG AAATGATGCC CTACCTCCTG 3623AGCTGGGAGA TTTTTATGGT TTGCCCATGT GTCAGATTTC AGTGCTGATC CACTTTTTTT 3683GCAAGAGCAG GAATGGGGTC AGCATAAATT TACATATGGA TAAGAACTAA CACAAGACTG 3743AGTAATATGC TCAATATTCA ATGTATTGCT TGTATAAATT TTTAAAAAAT AAAATGAAAN 3803(2)SEQ ID NO53信息(i)序列特征(A)長度1161氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO53Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser1 5 10 15Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu20 25 30Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg35 40 45Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly50 55 60Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu65 70 75 80Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu85 90 95Val Ala Asp Thr Asn Asn Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala100 105 110Gln Arg Ala Cys Ala Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu115 120 125Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Ile Pro Ala Thr Met Pro130 135 140Glu Cys Pro Gly Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser145 150 155 160Gly Ser Ile Asp Gln Ser Asp Phe Thr Gln Met Lys Asp Phe Val Lys165 170 175Ala Leu Met Gly Gln Leu Ala Ser Thr Ser Thr Ser Phe Ser Leu Met180 185 190Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys195 200 205Ser Ser Leu Ser Pro Gln Ser Leu Val Asp Ala Ile Val Gln Leu Gln210 215 220Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Ser Gly Ile Gln Lys Val Val Lys Glu Leu225 230 235 240Phe His Ser Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile245 250 255Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Phe Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Arg His260 265 270Val Ile Pro Glu Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly275 280 285Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Pro Thr Ala Leu Gln Glu Leu Asn Thr290 295 300Ile Gly Ser Ala Pro Ser Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe305 310 315 320Val Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Phe Ala325 330 335Ile Glu Gly Thr Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met340 345 350Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Ser Met Asp Gly Pro Val Leu355 360 365Gly Ala Val Gly Gly Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro370 375 380Ser Asn Met Arg Ser Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Glu Asp385 390 395 400Met Arg Asp Ala Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Leu Ala Phe Trp Lys405 410 415Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly420 425 430Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ser Arg His Trp Arg Pro Lys Ser435 440 445Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys450 455 460Ser Val Asp Met Asp Arg Asp Gly Ser Thr Asp Leu Val Leu Ile Gly465 470 475 480Val Pro His Tyr Tyr Glu His Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys485 490 495Pro Met Pro Gly Val Arg Ser Arg Trp His Cys Gly Thr Thr Leu His500 505 510Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val515 520 525Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Ser Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala530 535 540Pro Gly Glu Glu Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala545 550 555 560Ser Arg Gln Asp Ile Ala Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser565 570 575Gln Leu Phe Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly580 585 590Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln595 600 605Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Gly Ile610 615 620Ser Ile Arg Phe Ala Pro Ser Glu Val Ala Lys Thr Val Tyr Gln Cys625 630 635 640Trp Gly Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys645 650 655Leu Thr Val Arg Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asp Val Gln Ser660 665 670Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg675 680 685Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr690 695 700Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Met Lys Leu Leu Leu Pro Asp705 710 715 720Cys Val Glu Asp Ala Val Thr Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Leu Ser725 730 735Leu Ala Gly Asp Ser Ala Pro Ser Arg Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala740 745 750Val Gly Ser Gln Asp His Val Thr Ala Ser Phe Pro Phe Glu Lys Asn755 760 765Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asn Leu Gly Val Ser Phe Asn770 775 780Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Glu Val Gly Ser Ser Pro Glu Leu Thr785 790 795 800Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu805 810 815Ile Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Glu Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Arg820 825 830Ala Gln Gln Pro His Pro Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu
835 840 845Pro Thr Gly Gln Glu Ser Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His850 855 860Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Ala Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp865 870 875 880Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Ser885 890 895Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Glu Thr Ser Lys Thr Ala Phe Gln900 905 910Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Val Ile Ser Arg Gln915 920 925Glu Asp Ser Thr Lys His Phe Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Glu Arg930 935 940Gln Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu945 950 955 960Thr Leu Ala Ile Ser Val Asn Phe Trp Val Pro Ile Leu Leu Asn Gly965 970 975Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Arg Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser980 985 990Cys Val Ser Gln Arg Glu Pro Pro Gln His Ser Asp Leu Leu Thr Gln9951000 1005Ile Gln Gly Arg Ser Val Leu Asp Cys Ala Ile Ala Asp Cys Leu His101010151020Leu Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Gly Thr Leu Asp Glu Leu Asp Phe1025103010351040Ile Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Ile Ser Gln Thr Leu Gln104510501055Lys Lys Val Leu Leu Leu Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asn Thr Ser106010651070Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val107510801085Ser Thr Met Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Val Phe Leu Met109010951100Val Phe Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val1105111011151120Ala Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu112511301135Asp Leu Pro Ser Ala Asp Pro Asp Pro Ala Gly Gln Ala Asp Ser Asn114011451150His Glu Thr Pro Pro His Leu Thr Ser11551160(2)SEQ ID NO54信息(i)序列特征(A)長度3597堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置40..3525(xi)序列描述SEQ ID NO54AGCTTTACAG CTCTCTACTT CTCAGTGCAC TGCTCAGTG ATG GCC GGT GGA GTT 54Met Ala Gly Gly Val1 5GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GTC CTG GCT TCC TGT CAT GGG TCT AAC 102Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Val Leu Ala Ser Cys His Gly Ser Asn10 15 20CTG GAT GTG GAG GAA CCC ATC GTG TTC AGA GAG GAT GCA GCC AGC TTT 150Leu Asp Val Glu Glu Pro Ile Val Phe Arg Glu Asp Ala Ala Ser Phe25 30 35GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA CTC GTG GTG GGA GCC 198Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala40 45 50CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA CGG TTG TAT GAC TGT 246Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly Arg Leu Tyr Asp Cys55 60 65GCA CCT GCC ACT GGC ATG TGC CAG CCC ATC GTA CTG CGC AGT CCC CTA 294Ala Pro Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Val Leu Arg Ser Pro Leu70 75 80 85GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG GTG ACT GCC ACC AAT 342Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Val Thr Ala Thr Asn90 95 100AAC GCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA CAG AGA GCT TGT GTG 390Asn Ala Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala Gln Arg Ala Cys Val105 110 115AAG AAC ATG TAT GCG AAA GGT TCC TGC CTC CTT CTC GGC TCC AGC TTG 438Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly Ser Ser Leu120 125 130CAG TTC ATC CAG GCA GTC CCT GCC TCC ATG CCA GAG TGT CCA AGA CAA 486Gln Phe Ile Gln Ala Val Pro Ala Ser Met Pro Glu Cys Pro Arg Gln135 140 145GAG ATG GAC ATT GCT TTC CTG ATT GAT GGT TCT GGC AGC ATT AAC CAA 534Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Asn Gln150 155 160 165AGG GAC TTT GCC CAG ATG AAG GAC TTT GTC AAA GCT TTG ATG GGA GAG 582Arg Asp Phe Ala Gln Met Lys Asp Phe Val Lys Ala Leu Met Gly Glu170 175 180TTT GCG AGC ACC AGC ACC TTG TTC TCC CTG ATG CAA TAC TCG AAC ATC 630Phe Ala Ser Thr Ser Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Ile185 190 195CTG AAG ACC CAT TTT ACC TTC ACT GAA TTC AAG AAC ATC CTG GAC CCT 678Leu Lys Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys Asn Ile Leu Asp Pro200 205 210CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATT GTC CAG CTG CAA GGC CTG ACC TAC ACA 726Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Thr215 220 225GCC ACA GGC ATC CGG ACA GTG ATG GAA GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT 774Ala Thr Gly Ile Arg Thr Val Met Glu Glu Leu Phe His Ser Lys Asn230 235 240 245GGG TCC CGT AAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC CTT GTC ATC ACA GAT GGG 822Gly Ser Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Leu Val Ile Thr Asp Gly250 255 260CAG AAA TAC AGA GAC CCC CTG GAG TAT AGT GAT GTC ATT CCC GCC GCA 870Gln Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile Pro Ala Ala265 270 275GAC AAA GCT GGC ATC ATT CGT TAT GCT ATT GGG GTG GGA GAT GCC TTC 918Asp Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe280 285 290CAG GAG CCC ACT GCC CTG AAG GAG CTG AAC ACC ATT GGC TCA GCT CCC 966Gln Glu Pro Thr Ala Leu Lys Glu Leu Asn Thr Ile Gly Ser Ala Pro295 300 305CCA CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTA GGC AAC TTT GCA GCA CTT CGC AGC1014Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe Ala Ala Leu Arg Ser310 315 320 325ATC CAG AGG CAA CTT CAG GAG AAA ATC TTC GCC ATT GAG GGA ACT CAA1062Ile Gln Arg Gln Leu Gln Glu Lys Ile Phe Ala Ile Glu Gly Thr Gln330 335 340TCA AGG TCA AGT AGT TCC TTT CAG CAC GAG ATG TCA CAA GAA GGT TTC1110Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe345 350 355AGT TCA GCT CTC ACA TCG GAT GGA CCC GTT CTG GGG GCC GTG GGA AGC1158Ser Ser Ala Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu Gly Ala Val Gly Ser360 365 370TTC AGC TGG TCC GGA GGT GCC TTC TTA TAT CCC CCA AAT ACG AGA CCC1206Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn Thr Arg Pro375 380 385ACC TTT ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGA GAC TCC TAC1254Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr390 395 400 405CTG GGT TAC TCC ACC GCA GTG GCC TTT TGG AAG GGG GTT CAC AGC CTG1302Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Val Ala Phe Trp Lys Gly Val His Ser Leu410 415 420ATC CTG GGG GCC CCG CGT CAC CAG CAC ACG GGG AAG GTT GTC ATC TTT1350Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly Lys Val Val Ile Phe425 430 435ACC CAG GAA GCC AGG CAT TGG AGG CCC AAG TCT GAA GTC AGA GGG ACA1398Thr Gln Glu Ala Arg His Trp Arg Pro Lys Ser Glu Val Arg Gly Thr440 445 450CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCT CTC TGT TCT GTG GAC GTG GAT1446Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val Asp Val Asp455 460 465AGA GAT GGC AGC ACY GAC CTG GTC CTG ATC GGA GCC CCC CAT TAC TAT1494Arg Asp Gly Ser Xaa Asp Leu Val Leu Ile Gly Ala Pro His Tyr Tyr470 475 480 485GAG CAG ACC CGA GGG GGG CAG GTC TCA GTG TTC CCC GTG CCC GGT GTG1542Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Phe Pro Val Pro Gly Val490 495 500AGG GGC AGG TGG CAG TGT GAG GCC ACC CTC CAC GGG GAG CAG GGC CAT 1590Arg Gly Arg Trp Gln Cys Glu Ala Thr Leu His Gly Glu Gln Gly His505 510 515CCT TGG GGC CGC TTT GGG GTG GCT CTG ACA GTG CTG GGG GAC GTA AAC 1638Pro Trp Gly Arg Phe Gly Val Ala Leu Thr Val Leu Gly Asp Val Asn520 525 530GGG GAC AAT CTG GCA GAC GTG GCT ATT GGT GCC CCT GGA GAG GAG GAG 1686Gly Asp Asn Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly Glu Glu Glu535 540 545AGC AGA GGT GCT GTC TAC ATA TTT CAT GGA GCC TCG AGA CTG GAG ATC 1734Ser Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ile550 555 560 565ATG CCC TCA CCC AGC CAG CGG GTC ACT GGC TCC CAG CTC TCC CTG AGA 1782Met Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser Gln Leu Ser Leu Arg570 575 580CTG CAG TAT TTT GGG CAG TCA TTG AGT GGG GGT CAG GAC CTT ACA CAG 1830Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly Gln Asp Leu Thr Gln585 590 595GAT GGC CTG GTG GAC CTG GCC GTG GGA GCC CAG GGG CAC GTA CTG CTG 1878Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln Gly His Val Leu Leu600 605 610CTC AGG AGT CTG CCT CTG CTG AAA GTG GAG CTC TCC ATA AGA TTC GCC 1926Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glu Leu Ser Ile Arg Phe Ala615 620 625CCC ATG GAG GTG GCA AAG GCT GTG TAC GAG TGC TGG GAA AGG ACT CCC 1974Pro Met Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Thr Pro630 635 640 645ACT GTC CTC GAA GCT GGA GAG GCC ACT GTC TGT CTC ACT GTC CAC AAA 2022Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys Leu Thr Val His Lys650 655 660GGC TCA CCT GAC CTG TTA GGT AAT GTC CAA GGC TCT GTC AGG TAT GAT 2070Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asn Val Gln Gly Ser Val Arg Tyr Asp665 670 675CTG GCG TTA GAT CCG GGC CGC CTG ATT TCT CGT GCC ATT TTT GAT GAG 2118Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg Ala Ile Phe Asp Glu680 685 690ACT AAG AAC TGC ACT TTG ACG GGA AGG AAG ACT CTG GGG CTT GGT GAT 2166Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Gly Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Asp695 700 705CAC TGC GAA ACA GTG AAG CTG CTT TTG CCG GAC TGT GTG GAA GAT GCA 2214His Cys Glu Thr Val Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Ala710 715 720 725GTG AGC CCT ATC ATC CTG CGC CTC AAC TTT TCC CTG GTG AGA GAC TCT 2262Val Ser Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe Ser Leu Val Arg Asp Ser730 735 740GCT TCA CCC AGG AAC CTG CAT CCT GTG CTG GCT GTG GGC TCA CAA GAC 2310Ala Ser Pro Arg Asn Leu His Pro Val Leu Ala Val Gly Ser Gln Asp745 750 755CAC ATA ACT GCT TCT CTG CCG TTT GAG AAG AAC TGT AAG CAA GAA CTC 2358His Ile Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys Lys Gln Glu Leu760 765 770CTG TGT GAG GGG GAC CTG GGC ATC AGC TTT AAC TTC TCA GGC CTG CAG 2406Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Gln775 780 785GTC TTG GTG GTG GGA GGC TCC CCA GAG CTC ACT GTG ACA GTC ACT GTG 2454Val Leu Val Val Gly Gly Ser Pro Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val790 795 800 805TGG AAT GAG GGT GAG GAC AGC TAT GGA ACT TTA GTC AAG TTC TAC TAC 2502Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Tyr810 815 820CCA GCA GGG CTA TCT TAC CGA CGG GTA ACA GGG ACT CAG CAA CCT CAT 2550Pro Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Gly Thr Gln Gln Pro His825 830 835CAG TAC CCA CTA CGC TTG GCC TGT GAG GCT GAG CCC GCT GCC CAG GAG 2598Gln Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu Pro Ala Ala Gln Glu840 845 850GAC CTG AGG AGC AGC AGC TGT AGC ATT AAT CAC CCC ATC TTC CGA GAA 2646Asp Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His Pro Tle Phe Arg Glu855 860 865GGT GCA AAG ACC ACC TTC ATG ATC ACA TTC GAT GTC TCC TAC AAG GCC 2694Gly Ala Lys Thr Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp Val Ser Tyr Lys Ala870 875 880 885TTC CTA GGA GAC AGG TTG CTT CTG AGG GCC AAA GCC AGC AGT GAG AAT 2742Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asn890 895 900AAT AAG CCT GAT ACC AAC AAG ACT GCC TTC CAG CTG GAG CTC CCA GTG 2790Asn Lys Pro Asp Thr Asn Lys Thr Ala Phe Gln Leu Glu Leu Pro Val905 910 915AAG TAC ACC GTC TAT ACC CTG ATC AGT AGG CAA GAA GAT TCC ACC AAC 2838Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Leu Ile Ser Arg Gln Glu Asp Ser Thr Asn920 925 930CAT GTC AAC TTT TCA TCT TCC CAC GGG GGG AGA AGG CAA GAA GCC GCA 2886His Val Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Gly Arg Arg Gln Glu Ala Ala935 940 945CAT CGC TAT CGT GTG AAT AAC CTG AGT CCA CTG AAG CTG GCC GTC AGA 2934His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu Lys Leu Ala Val Arg950 955 960 965GTT AAC TTC TGG GTC CCT GTC CTT CTG AAC GGT GTG GCT GTG TGG GAC 2982Val Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly Val Ala Val Trp Asp970 975 980GTG ACT CTG AGC AGC CCA GCA CAG GGT GTC TCC TGC GTG TCC CAG ATG 3030Val Thr Leu Ser Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser Cys Val Ser Gln Met985 990 995AAA CCT CCT CAG AAT CCC GAC TTT CTG ACC CAG ATT CAG AGA CGT TCT 3078Lys Pro Pro Gln Asn Pro Asp Phe Leu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Ser100010051010GTG CTG GAC TGC TCC ATT GCT GAC TGC CTG CAC TTC CGC TGT GAC ATC 3126Val Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu His Phe Arg Cys Asp Ile101510201025CCC TCC TTG GAC ATC CAG GAT GAA CTT GAC TTC ATT CTG AGG GGC AAC 3174Pro Ser Leu Asp Ile Gln Asp Glu Leu Asp Phe Ile Leu Arg Gly Asn1030103510401045CTC AGC TTC GGC TGG GTC AGT CAG ACA TTG CAG GAA AAG GTG TTG CTT 3222Leu Ser Phe Gly Trp Val Ser Gln Thr Leu Gln Glu Lys Val Leu Leu105010551060GTG AGT GAG GCT GAA ATC ACT TTC GAC ACA TCT GTG TAC TCC CAG CTG 3270Val Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser Val Tyr Ser Gln Leu106510701075CCA GGA CAG GAG GCA TTT CTG AGA GCC CAG GTG GAG ACA ACG TTA GAA 3318Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val Glu Thr Thr Leu Glu108010851090GAA TAC GTG GTC TAT GAG CCC ATC TTC CTC GTG GCG GGC AGC TCG GTG 3366Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Ile Phe Leu Val Ala Gly Ser Ser Val109511001105GGA GGT CTG CTG TTA CTG GCT CTC ATC ACA GTG GTA CTG TAC AAG CTT 3414Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val Val Leu Tyr Lys Leu1110111511201125GGC TTC TYC AAA CGT CAG TAC AAA GAA ATG CTG GAC GGC AAG GCT GCA 3462Gly Phe Xaa Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu Asp Gly Lys Ala Ala113011351140GAT CCT GTC ACA GCC GGC CAG GCA GAT TTC GGC TGT GAG ACT CCT CCA 3510Asp Pro Val Thr Ala Gly Gln Ala Asp Phe Gly Cys Glu Thr Pro Pro114511501155TAT CTC GTG AGC TAGGAATCCA CTCTCCTGCC TATCTCTGCA ATGAAGATTG 3562Tyr Leu Val Ser1160GTCCTGCCTA TGAGTCTACT GGCATGGGAA CGAGT3597(2)SEQ ID NO55信息(i)序列特征(A)長度1161氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO55Met Ala Gly Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Val Leu Ala Serl 5 10 15Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Ile Val Phe Arg Glu20 25 30Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg35 40 45Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly50 55 60Arg Leu Tyr Asp Cys Ala Pro Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Val65 70 75 80Leu Arg Ser Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu85 90 95Val Thr Ala Thr Asn Asn Ala Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Ala100 105 1l0Gln Arg Ala Cys Val Lys Asn Met Tyr Ala Lys Gly Ser Cys Leu Leu115 120 125Leu Gly Ser Ser Leu Gln Phe Ile Gln Ala Val Pro Ala Ser Met Pro
130 135 140Glu Cys Pro Arg Gln Glu Met Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser145 150 155 160Gly Ser Ile Asn Gln Arg Asp Phe Ala Gln Met Lys Asp Phe Val Lys165 170 175Ala Leu Met Gly Glu Phe Ala Ser Thr Ser Thr Leu Phe Ser Leu Met180 185 190Gln Tyr Ser Asn Ile Leu Lye Thr His Phe Thr Phe Thr Glu Phe Lys195 200 205Asn Ile Leu Asp Pro Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Gln210 215 220Gly Leu Thr Tyr Thr Ala Thr Gly Ile Arg Thr Val Met Glu Glu Leu225 230 235 240Phe His Ser Lys Asn Gly Ser Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Leu245 250 255Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Arg Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp260 265 270Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly275 280 285Val Gly Asp Ala Phe Gln Glu Pro Thr Ala Leu Lys Glu Leu Asn Thr290 295 300Ile Gly Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Gly Asn Phe305 310 315 320Ala Ala Leu Arg Ser Ile Gln Arg Gln Leu Gln Glu Lys Ile Phe Ala325 330 335Ile Glu Gly Thr Gln Ser Arg Ser Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met340 345 350Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Ala Leu Thr Ser Asp Gly Pro Val Leu355 360 365Gly Ala Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro370 375 380Pro Asn Thr Arg Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp385 390 395 400Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Ala Val Ala Phe Trp Lys
405 410 415Gly Val His Ser Leu Ile Leu Gly Ala Pro Arg His Gln His Thr Gly420 425 430Lys Val Val Ile Phe Thr Gln Glu Ala Arg His Trp Arg Pro Lys Ser435 440 445Glu Val Arg Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys450 455 460Ser Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Ser Xaa Asp Leu Val Leu Ile Gly465 470 475 480Ala Pro His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Phe485 490 495Pro Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Trp Gln Cys Glu Ala Thr Leu His500 505 510Gly Glu Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Val Ala Leu Thr Val515 520 525Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Asn Leu Ala Asp Val Ala Ile Gly Ala530 535 540Pro Gly Glu Glu Glu Ser Arg Gly Ala Val Tyr Ile Phe His Gly Ala545 550 555 560Ser Arg Leu Glu Ile Met Pro Ser Pro Ser Gln Arg Val Thr Gly Ser565 570 575Gln Leu Ser Leu Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ser Leu Ser Gly Gly580 585 590Gln Asp Leu Thr Gln Asp Gly Leu Val Asp Leu Ala Val Gly Ala Gln595 600 605Gly His Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Leu Leu Lys Val Glu Leu610 615 620Ser Ile Arg Phe Ala Pro Met Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Gln Cys625 630 635 640Trp Glu Arg Thr Pro Thr Val Leu Glu Ala Gly Glu Ala Thr Val Cys645 650 655Leu Thr Val His Lys Gly Ser Pro Asp Leu Leu Gly Asn Val Gln Gly660 665 670Ser Val Arg Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Ile Ser Arg
675 680 685Ala Ile Phe Asp Glu Thr Lys Asn Cys Thr Leu Thr Gly Arg Lys Thr690 695 700Leu Gly Leu Gly Asp His Cys Glu Thr Val Lys Leu Leu Leu Pro Asp705 710 715 720Cys Val Glu Asp Ala Val Ser Pro Ile Ile Leu Arg Leu Asn Phe Ser725 730 735Leu Val Arg Asp Ser Ala Ser Pro Arg Asn Leu His Pro Val Leu Ala740 745 750Val Gly Ser Gln Asp His Ile Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn755 760 765Cys Lys Gln Glu Leu Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Ile Ser Phe Asn770 775 780Phe Ser Gly Leu Gln Val Leu Val Val Gly Gly Ser Pro Glu Leu Thr785 790 795 800Val Thr Val Thr Val Trp Asn Glu Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Leu805 810 815Val Lys Phe Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr Arg Arg Val Thr Gly820 825 830Thr Gln Gln Pro His Gln Tyr Pro Leu Arg Leu Ala Cys Glu Ala Glu835 840 845Pro Ala Ala Gln Glu Asp Leu Arg Ser Ser Ser Cys Ser Ile Asn His850 855 860Pro Ile Phe Arg Glu Gly Ala Lys Thr Thr Phe Met Ile Thr Phe Asp865 870 875 880Val Ser Tyr Lys Ala Phe Leu Gly Asp Arg Leu Leu Leu Arg Ala Lys885 890 895Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Asp Thr Asn Lys Thr Ala Phe Gln900 905 910Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Thr Val Tyr Thr Leu Ile Ser Arg Gln915 920 925Glu Asp Ser Thr Asn His Val Asn Phe Ser Ser Ser His Gly Gly Arg930 935 940Arg Gln Glu Ala Ala His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Pro Leu945 950 955 960Lys Leu Ala Val Arg Val Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly965 970 975Val Ala Val Trp Asp Val Thr Leu Ser Ser Pro Ala Gln Gly Val Ser980 985 990Cys Val Ser Gln Met Lys Pro Pro Gln Asn Pro Asp Phe Leu Thr Gln995 10001005Ile Gln Arg Arg Ser Val Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu His101010151020Phe Arg Cys Asp Ile Pro Ser Leu Asp Ile Gln Asp Glu Leu Asp Phe1025103010351040Ile Leu Arg Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Ser Gln Thr Leu Gln104510501055Glu Lys Val Leu Leu Val Ser Glu Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser106010651070Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Leu Arg Ala Gln Val107510801085Glu Thr Thr Leu Glu Glu Tyr Val Val Tyr Glu Pro Ile Phe Leu Val109010951100Ala Gly Ser Ser Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Val1105111011151120Val Leu Tyr Lys Leu Gly Xaa Xaa Lys Arg Gln Tyr Lys Glu Met Leu112511301135Asp Gly Lys Ala Ala Asp Pro Val Thr Xaa Gly Gln Ala Asp Phe Gly114011451150Cys Glu Thr Pro Pro Tyr Leu Val Ser11551160(2)SEQ ID NO56信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO56CCTGTCATGG GTCTAACCTG20(2)SEQ ID NO57信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO57AGGTTAGACC CATGACAGG 19(2)SEQ ID NO58信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO58GGCCTTGCAG CTGGACAATG20(2)SEQ ID NO59信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO59CCAAAGCTGG CTGCATCCTC TC 22(2)SEQ ID NO60信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO60CCGCCTGCCA CTGGCGTGTG C 21(2)SEQ ID NO61信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO61CCCAGATGAA GGACTTCGTC AA 22(2)SEQ ID NO62信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO62GCTGGGATCA TTCGCTATGC20(2)SEQ ID NO63信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO63CAATGGATGG ACCAGTTCTG G 21(2)SEQ ID NO64信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO64CAGATCGGCT CCTACTTTGG20(2)SEQ ID NO65信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO65CATGGAGCCT CGAGACAGG 19(2)SEQ ID NO66信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO66CCACTGTCCT CGAAGCTGGA G 21(2)SEQ ID NO67信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO67CTTCGTCCTG TGCTGGCTGT GGGCTC 26(2)SEQ ID NO68信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO68CGCCTGGCAT GTGAGGCTGA G 21(2)SEQ ID NO69信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO69CCGTGATCAG TAGGCAGGAA G 21(2)SEQ ID NO70信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO70GTCACAGAGG GAACCTCC 18(2)SEQ ID NO71信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO71GCTCCTGAGT GAGGCTGAAA TCA23(2)SEQ ID NO72信息(i)序列特征(A)長度23堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO72GAGATGCTGG ATCTACCATC TGC23(2)SEQ ID NO73信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO73CTGAGCTGGG AGATTTTTAT GG 22(2)SEQ ID NO74信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO74GTGGATCAGC ACTGAAATCT G 21(2)SEQ ID NO75信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO75CGTTTGAAGA AGCCAAGCTT G 21(2)SEQ ID NO76信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO76CACAGCGGAG GTGCAGGCAG20(2)SEQ ID NO77信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO77CTCACTGCTT GCGCTGGC 18(2)SEQ ID NO78信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO78CGGTAAGATA GCTCTGCTGG 20(2)SEQ ID NO79信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO79GAGCCCACAG CCAGCACAGG20(2)SEQ ID NO80信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO80GATCCAACGC CAGATCATAC C 21(2)SEQ ID NO81信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO81CACGGCCAGG TCCACCAGGC20(2)SEQ ID NO82信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO82CACGTCCCCT AGCACTGTCA G 21(2)SEQ ID NO83信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO83TTGACGAAGT CCTTCATCTG GG22(2)SEQ ID NO84信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO84GAACTGCAAG CTGGAGCCCA G 21(2)SEQ ID NO85信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO85CTGGATGCTG CGAAGTGCTA C 21(2)SEQ ID NO86信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO86GCCTTGGAGC TGGACGATGG C 21(2)SEQ ID NO87信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO87GTAAGATCTC CAGAGTGTCC AAGACAAGAG ATG 33(2)SEQ ID NO88信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO88CTTCTCGAGT GTGAGAGCTG AACTGAAACC TTC 33(2)SEQ ID NO89信息(i)序列特征(A)長度32堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO89CGCTGTACG TCAGAGTTGA GTCCAAATAT GG 32(2)SEQ ID NO90信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO90GGTGACACTA TAGAATAGGG C 21(2)SEQ ID NO91信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO91AAGCAGGAGCTCCTGTGT 18(2)SEQ ID NO92信息(i)序列特征(A)長度852堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置61..852(xi)序列描述SEQ ID NO92TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60ATG GCC CTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT TAC CAC108Met Ala Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15GGA TTC AAC TTG GAC GTG ATG AGC GGT GAT CTT CCA GGA AGA CGC AGC156Gly Phe Asn Leu Asp Val Met Ser Gly Asp Leu Pro Gly Arg Arg Ser20 25 30GGG CTT CGG GCA GAG CGT GAT GCA GTT TGG GGA TCT CGA CTC GTG GTG204Gly Leu Arg Ala Glu Arg Asp Ala Val Trp Gly Ser Arg Leu Val Val
35 40 45GGA GCC CCC CTG GCG GTG GTG TCG GCC AAC CAC ACA GGA CGG CTG TAC252Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr50 55 60GAG TGT GCG CCT GCC TCC GGC ACC TGC ACG CCC ATT TTC CCA TTC ATG300Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met65 70 75 80CCC CCC GAA GCC GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCC CTG GCA GCC TCC348Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser85 90 95CCC AAC CAT TCC CAG CTG CTG GCT TGT GGC CCG ACC GTG CAT AGA GCC396Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala100 105 110TGC GGG GAG GAC GTG TAC GCC CAG GGT TTC TGT GTG CTG CTG GAT GCC444Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala115 120 125CAC GCA CAG CCC ATC GGG ACT GTG CCA GCT GCC CTG CCC GAG TGC CCA492His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro130 135 140GAT CAA GAG ATG GAC ATT GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGC AGC ATT540Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile145 150 155 160AGC TCA AAT GAC TTC CGC AAG ATG AAG GAC TTT GTC AGA GCT GTG ATG588Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val Met165 170 175GAC CAG TTC AAG GAC ACC AAC ACC CAG TTC TCG CTG ATG CAG TAC TCC636Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser180 185 190AAT GTG CTG GTG ACA CAT TTC ACC TTC AGC AGC TTC CGG AAC AGC TCC684Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser195 200 205AAT CCT CAG GGC CTA GTG GAG CCC ATT GTG CAG CTG ACA GGC CTC ACG732Asn Pro Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly Leu Thr210 215 220TTC ACG GCC ACA GGG ATC CTG AAA GTG GTG ACA GAG CTG TTT CAA ACC780Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gln Thr225 230 235 240AAG AAC GGG GCC CGC GAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATC GTC ATC ACA828Lys Asn Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr245 250 255GAT GGG CAG AAG TAC AAA GCG GCA852Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Ala Ala260(2)SEQ ID NO93信息(i)序列特征(A)長度264氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO93Met Ala Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15Gly Phe Asn Leu Asp Val Met Ser Gly Asp Leu Pro Gly Arg Arg Ser20 25 30Gly Leu Arg Ala Glu Arg Asp Ala Val Trp Gly Ser Arg Leu Val Val35 40 45Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr50 55 60Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met65 70 75 80Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser85 90 95Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala100 105 110Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala115 120 125His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro130 135 140Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile145 150 155 160Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val Met165 170 175Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser180 185 190Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser195 200 205Asn Pro Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly Leu Thr210 215 220Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gln Thr225 230 235 240Lys Asn Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr245 250 255Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Ala Ala260(2)SEQ ID NO94信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO94CTGGTCTGGA GGTGCCTTCC TG 22(2)SEQ ID NO95信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO95CCTGAGCAGG AGCACCTGGC C 21(2)SEQ ID NO96信息(i)序列特征
(A)長度2499堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO96ATGACCTTCG GCACTGTGCT TCTTCTGAGT GTCCTGGCTT CTTATCATGG ATTCAACCTG 60GATGTGGAGG AGCCTACGAT CTTCCAGGAG GATGCAGGCG GCTTTGGGCA GAGCGTGGTG 120CAGTTCGGTG GATCTCGACT CGTGGTGGGA GCACCCCTGG AGGTGGTGGC GGCCAACCAG 180ACGGGACGGC TGTATGACTG CGCAGCTGCC ACCGGCATGT GCCAGCCCAT CCCGCTGCAC 240ATCCGCCCTG AGGCCGTGAA CATGTCCTTG GGCCTGACCC TGGCAGCCTC CACCAACGGC 300TCCCGGCTCC TGGCCTGTGG CCCGACCCTG CACAGAGTCT GTGGGGAGAA CTCATACTCA 360AAGGGTTCCT GCCTCCTGCT GGGCTCGCGC TGGGAGATCA TCCAGACAGT CCCCGACGCC 420ACGCCAGAGT GTCCACATCA AGAGATGGAC ATCGTCTTCC TGATTGACGG CTCTGGAAGC 480ATTGACCAAA ATGACTTTAA CCAGATGAAG GGCTTTGTCC AAGCTGTCAT GGGCCAGTTT 540GAGGGCACTG ACACCCTGTT TGCACTGATG CAGTACTCAA ACCTCCTGAA GATCCACTTC 600ACCTTCACCC AATTCCGGAC CAGCCCGAGC CAGCAGAGCC TGGTGGATCC CATCGTCCAA 660CTGAAAGGCC TGACGTTCAC GGCCACGGGC ATCCTGACAG TGGTGACACA GCTATTTCAT 720CATAAGAATG GGGCCCGAAA AAGTGCCAAG AAGATCCTCA TTGTCATCAC AGATGGGCAG 780AAGTACAAAG ACCCCCTGGA ATACAGTGAT GTCATCCCCC AGGCAGAGAA GGCTGGCATC 840ATCCGCTACG CTATCGGGGT GGGACACGCT TTCCAGGGAC CCACTGCCAG GCAGGAGCTG 900AATACCATCA GCTCAGCGCC TCCGCAGGAC CACGTGTTCA AGGTGGACAA CTTTGCAGCC 960CTTGGCAGCA TCCAGAAGCA GCTGCAGGAG AAGATCTATG CAGTTGAGGG AACCCAGTCC 1020AGGGCAAGCA GCTCCTTCCA GCACGAGATG TCCCAAGAAG GCTTCAGCAC AGCCCTCACA 1080ATGGATGGCC TCTTCCTGGG GGCTGTGGGG AGCTTTAGCT GGTCTGGAGG TGCCTTCCTG 1140TATCCCCCAA ATATGAGCCC CACCTTCATC AACATGTCTC AGGAGAATGT GGACATGAGG 1200GACTCTTACC TGGGTTACTC CACCGAGCTA GCCCTGTGGA AGGGGGTACA GAACCTGGTC 1260CTGGGGGCCC CCCGCTACCA GCATACCGGG AAGGCTGTCA TCTTCACCCA GGTGTCCAGG 1320CAATGGAGGA AGAAGGCCGA AGTCACAGGG ACGCAGATCG GCTCCTACTT CGGGGCCTCC 1380CTCTGCTCCG TGGATGTGGA CAGCGATGGC AGCACCGACC TGATCCTCAT TGGGGCCCCC 1440CATTACTATG AGCAGACCCG AGGGGGCCAG GTGTCCGTGT GTCCCTTGCC TAGGGGGAGG 1500GTGCAGTGGC AGTGTGACGC TGTTCTCCGT GGTGAGCAGG GCCACCCCTG GGGCCGCTTT1560GGGGCAGCCC TGACAGTGTT GGGGGATGTG AATGAGGACA AGCTGATAGA CGTGGCCATT1620GGGGCCCCGG GAGAGCAGGA GAACCGGGGT GCTGTCTACC TGTTTCACGG AGCCTCAGAA1680TCCGGCATCA GCCCCTCCCA CAGCCAGCGG ATTGCCAGCT CCCAGCTCTC CCCCAGGCTG1740CAGTATTTTG GGCAGGCGCT GAGTGGGGGT CAGGACCTCA CCCAGGATGG ACTGATGGAC1800CTGGCCGTGG GGGCCCGGGG CCAGGTGCTC CTGCTCAGGA GTCTGCCGGT GCTGAAAGTG1860GGGGTGGCCA TGAGATTCAG CCCTGTGGAG GTGGCCAAGG CTGTGTACCG GTGCTGGGAA1920GAGAAGCCCA GTGCCCTGGA AGCTGGGGAC GCCACCGTCT GTCTCACCAT CCAGAAAAGC1980TCACTGGACC AGCTAGGTGA CATCCAAAGC TCTGTCAGGT TTGATCTGGC ACTGGACCCA2040GGTCGTCTGA CTTCTCGTGC CATTTTCAAT GAAACCAAGA ACCCCACTTT GACTCGAAGA2100AAAACCCTGG GACTGGGGAT TCACTGTGAA ACCCTGAAGC TGCTTTTGCC AGTGAGGACT2160TTGGGTTCTG GGAAGGGGGA GAGAGGAGGA GCCCAAGGCT GGCCTGGAGC ACCCCCGTTC2220TCTGCTGAGC GAGGTGGGAA GGGTTAGGAT GTTGGGGCTG GAGAGAGGGA CATTAGGGCA2280GGAGAACCTG GCTCCACGGC TTGGAGGGAG CACTGTCAGG GCAGTGGGGA GTGGATGCAG2340TGGAGGAGGA CTTGTGGTGG AGCGTAGAGA GGACAGCAGG TTCTTGAAAG CCTGTTCTCT2400CTCAGGATTG TGTGGAGGAT GTGGTGAGCC CCATCATTCT GCACCTCAAC TTCTCACTGG2460TGAGAGAGCC CATCCCCTCC CCCCAGAACC TGCGTCCTG 2499(2)SEQ ID NO97信息(i)序列特征(A)長度3596堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO97TTTAACTGCA CCAACTTTAA AATACGCTAT TGGAGCTGGA ATTACCGCGG CTGCTGGCAC 60CAGACTTGCC CTCCAATGGA TCCTCGTTAA AGGATTTAAA GTGGACTCAT TCCAATTACA 120GGGCCTCGAA AGAGTCCTGT ATTGTTATTT TTCGTCACTA CCTCCCCGGG TCGGGAGTGG 180GTAATTTGCG CGCCTGCTGC CTTCCTTGGA TGTGGTAGCC GTTTCTCAGG CTCCCTCTCC 240GGAATCGAAC CCTGATTCCC CGTCACCCGT GGTCACCATG GTAGGCACGT GCAGTTCGGT 300GGATCTCGAC TCGTGGTGGG AGCACCCCTG GAGGTGGTGG CGGCCAACCA GACGGGACGG 360CTGTATGACT GCGCAGCTGC CACCGGCATG TGCCAGCCCA TCCCGCTGCA CATCCGCCCT 420GAGGCCGTGA ACATGTCCTT GGGCCTGACC CTGGCAGCCT CCACCAACGG CTCCCGGCTC 480CTGGCCTGTG GCCCGACCCT GCACAGAGTC TGTGGGGAGA ACTCATACTC AAAGGGTTCC 540TGCCTCCTGC TGGGCTCGCG CTGGGAGATC ATCCAGACAG TCCCCGACGC CACGCCAGAG 600TGTCCACATC AAGAGATGGA CATCGTCTTC CTGATTGACG GCTCTGGAAG CATTGACCAA 660AATGACTTTA ACCAGATGAA GGGCTTTGTC CAAGCTGTCA TGGGCCAGTT TGAGGGCACT 720GACACCCTGT TTGCACTGAT GCAGTACTCA AACCTCCTGA AGATCCACTT CACCTTCACC 780CAATTCCGGA CCAGCCCGAG CCAGCAGAGC CTGGTGGATC CCATCGTCCA ACTGAAAGGC 840CTGACGTTCA CGGCCACGGG CATCCTGACA GTGGTGACAC AGCTATTTCA TCATAAGAAT 900GGGGCCCGAA AAAGTGCCAA GAAGATCCTC ATTGTCATCA CAGATGGGCA GAAGTACAAA 960GACCCCCTGG AATACAGTGA TGTCATCCCC CAGGCAGAGA AGGCTGGCAT CATCCGCTAC 1020GCTATCGGGG TGGGACACGC TTTCCAGGGA CCCACTGCCA GGCAGGAGCT GAATACCATC 1080AGCTCAGCGC CTCCGCAGGA CCACGTGTTC AAGGTGGACA ACTTTGCAGC CCTTGGCAGC 1140ATCCAGAAGC AGCTGCAGGA GAAGATCTAT GCAGTTGAGG GAACCCAGTC CAGGGCAAGC 1200AGCTCCTTCC AGCACGAGAT GTCCCAAGAA GGCTTCAGCA CAGCCCTCAC AATGGATGGC 1260CTCTTCCTGG GGGCTGTGGG GAGCTTTAGC TGGTCTGGAG GTGCCTTCCT GTATCCCCCA 1320AATATGAGCC CCACCTTCAT CAACATGTCT CAGGAGAATG TGGACATGAG GGACTCTTAC 1380CTGGGTTACT CCACCGAGCT AGCCCTGTGG AAGGGGGTAC AGAACCTGGT CCTGGGGGCC 1440CCCCGCTACC AGCATACCGG GAAGGCTGTC ATCTTCACCC AGGTGTCCAG GCAATGGAGG 1500AAGAAGGCCG AAGTCACAGG GACGCAGATC GGCTCCTACT TCGGGGCCTC CCTCTGCTCC 1560GTGGATGTGG ACAGCGATGG CAGCACCGAC CTGATCCTCA TTGGGGCCCC CCATTACTAT 1620GAGCAGACCC GAGGGGGCCA GGTGTCCGTG TGTCCCTTGC CTAGGGGGAG GGTGCAGTGG 1680CAGTGTGACG CTGTTCTCCG TGGTGAGCAG GGCCACCCCT GGGGCCGCTT TGGGGCAGCC 1740CTGACAGTGT TGGGGGATGT GAATGAGGAC AAGCTGATAG ACGTGGCCAT TGGGGCCCCG 1800GGAGAGCAGG AGAACCGGGG TGCTGTCTAC CTGTTTCACG GAGCCTCAGA ATCCGGCATC 1860AGCCCCTCCC ACAGCCAGCG GATTGCCAGC TCCCAGCTCT CCCCCAGGCT GCAGTATTTT 1920GGGCAGGCGC TGAGTGGGGG TCAGGACCTC ACCCAGGATG GACTGATGGA CCTGGCCGTG 1980GGGGCCCGGG GCCAGGTGCT CCTGCTCAGG AGTCTGCCGG TGCTGAAAGT GGGGGTGGCC 2040ATGAGATTCA GCCCTGTGGA GGTGGCCAAG GCTGTGTACC GGTGCTGGGA AGAGAAGCCC 2100AGTGCCCTGG AAGCTGGGGA CGCCACCGTC TGTCTCACCA TCCAGAAAAG CTCACTGGAC 2160CAGCTAGGTG ACATCCAAAG CTCTGTCAGG TTTGATCTGG CACTGGACCC AGGTCGTCTG 2220ACTTCTCGTG CCATTTTCAA TGAAACCAAG AACCCCACTT TGACTCGAAG AAAAACCCTG 2280GGACTGGGGA TTCACTGTGA AACCCTGAAG CTGCTTTTGC CAGATTGTGT GGAGGATGTG 2340GTGAGCCCCA TCATTCTGCA CCTCAACTTC TCACTGGTGA GAGAGCCCAT CCCCTCCCCC 2400CAGAACCTGC GTCCTGTGCT GGCCGTGGGC TCACAAGACC TCTTCACTGC TTCTCTCCCC 2460TTCGAGAAGA ACTGTGGGCA AGATGGCCTC TGTGAAGGGG ACCTGGGTGT CACCCTCAGC 2520TTCTCAGGCC TGCAGACCCT GACCGTGGGG AGCTCCCTGG AGCTCAACGT GATTGTGACT 2580GTGTGGAACG CAGGTGAGGA TTCCTACGGA ACCGTGGTCA GCCTCTACTA TCCAGCAGGG 2640CTGTCGCACC GACGGGTGTC AGGAGCCCAG AAGCAGCCCC ATCAGAGTGC CCTGCGCCTG 2700GCATGTGAGA CAGTGCCCAC TGAGGATGAG GGCCTAAGAA GCAGCCGCTG CAGTGTCAAC 2760CACCCCATCT TCCATGAGGG CTCTAACGGC ACCTTCATAG TCACATTCGA TGTCTCCTAC 2820AAGGCCACCC TGGGAGACAG GATGCTTATG AGGGCCAGTG CAAGCAGTGA GAACAATAAG 2880GCTTCAAGCA GCAAGGCCAC CTTCCAGCTG GAGCTCCCGG TGAAGTATGC AGTCTACACC 2940ATGATCAGCA GGCAGGAAGA ATCCACCAAG TACTTCAACT TTGCAACCTC CGATGAGAAG 3000AAAATGAAAG AGGCTGAGCA TCGATACCGT GTGAATAACC TCAGCCAGCG AGATCTGGCC 3060ATCAGCATTA ACTTCTGGGT TCCTGTCCTG CTGAACGGGG TGGCTGTGTG GGATGTGGTC 3120ATGGAGGCCC CATCTCAGAG TCTCCCCTGT GTTTCAGAGA GAAAACCTCC CCAGCATTCT 3180GACTTCCTGA CCCAGATTTC AAGAAGTCCC ATGCTGGACT GCTCCATTGC TGACTGCCTG 3240CAGTTCCGCT GTGACGTCCC CTCCTTCAGC GTCCAGGAGG AGCTGGATTT CACCCTGAGG 3300GGCAATCTCA GTTTCGGCTG GGTCCGCGAG ACATTGCAGA AGAAGGTGTT GGTCGTGAGT3360GTGGCTGAAA TTACGTTCGA CACATCCGTG TACTCCCAGC TTCCAGGACA GGAGGCATTT3420ATGAGAGCTC AGATGGAGAT GGTGCTAGAA GAAGACGAGG TCTACAATGC CATTCCCATC3480ATCATGGGCA GCTCTGTGGG GGCTCTGCTA CTGCTGGCGC TCATCACAGC CACACTGTAC3540AAGCTTGGCT TCTTCAAACG CCACTACAAG GAAATGCTGG AGGACAAGCC TGAAGACACT3600GCCACATTCA GTGGGGACGA TTTCAGCTGT GTGGCCCCAA ATGTGCCTTT GTCCTAATAA3660TCCACTTTCC TGTTTATCTC TACCACTGTG GGCTGGACTT GCTTGCAACC ATAAATCAAC3720TTACATGGAA ACAACTTCTG CATAGATCTG CACTGGCCTA AGCAACCTAC CAGGTGCTAA3780GCACCTTCTC GGAGAGATAG AGATTGTCAA TGTTTTTACA TATCTGTCCA TCTTTTTCAG3840CAATGACCCA CTTTTTACAG AAGCAGGCAT GGTGCCAGCA TAAATTTTCA TATGCTTAAG3900AATTGTCACA TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA CTTTAG3956(2)SEQ ID NO98信息(i)序列特征(A)長度3785堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..3486(xi)序列描述SEQ ID NO98ATG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT 48Met Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA 96Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala20 25 30GGC GGC TTT GGG CAG AGC GTG GTG CAG TTC GGT GGA TCT CGA CTC GTG144Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val35 40 45GTG GGA GCA CCC CTG GAG GTG GTG GCG GCC AAC CAG ACG GGA CGG CTG 192Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu50 55 60TAT GAC TGC GCA GCT GCC ACC GGC ATG TGC CAG CCC ATC CCG CTG CAC 240Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His65 70 75 80ATC CGC CCT GAG GCC GTG AAC ATG TCC TTG GGC CTG ACC CTG GCA GCC 288Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala85 90 95TCC ACC AAC GGC TCC CGG CTC CTG GCC TGT GGC CCG ACC CTG CAC AGA 336Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg100 105 110GTC TGT GGG GAG AAC TCA TAC TCA AAG GGT TCC TGC CTC CTG CTG GGC 384Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly115 120 125TCG CGC TGG GAG ATC ATC CAG ACA GTC CCC GAC GCC ACG CCA GAG TGT 432Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys130 135 140CCA CAT CAA GAG ATG GAC ATC GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT GGA AGC 480Pro His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser145 150 155 160ATT GAC CAA AAT GAC TTT AAC CAG ATG AAG GGC TTT GTC CAA GCT GTC 528Ile Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val165 170 175ATG GGC CAG TTT GAG GGC ACT GAC ACC CTG TTT GCA CTG ATG CAG TAC 576Met Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr180 185 190TCA AAC CTC CTG AAG ATC CAC TTC ACC TTC ACC CAA TTC CGG ACC AGC 624Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser195 200 205CCG AGC CAG CAG AGC CTG GTG GAT CCC ATC GTC CAA CTG AAA GGC CTG 672Pro Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu210 215 220ACG TTC ACG GCC ACG GGC ATC CTG ACA GTG GTG ACA CAG CTA TTT CAT 720Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His225 230 235 240CAT AAG AAT GGG GCC CGA AAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATT GTC ATC 768His Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile245 250 255ACA GAT GGG CAG AAG TAC AAA GAC CCC CTG GAA TAC AGT GAT GTC ATC 816Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile260 265 270CCC CAG GCA GAG AAG GCT GGC ATC ATC CGC TAC GCT ATC GGG GTG GGA 864Pro Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly275 280 285CAC GCT TTC CAG GGA CCC ACT GCC AGG CAG GAG CTG AAT ACC ATC AGC 912His Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser290 295 300TCA GCG CCT CCG CAG GAC CAC GTG TTC AAG GTG GAC AAC TTT GCA GCC 960Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala305 310 315 320CTT GGC AGC ATC CAG AAG CAG CTG CAG GAG AAG ATC TAT GCA GTT GAG1008Leu Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu325 330 335GGA ACC CAG TCC AGG GCA AGC AGC TCC TTC CAG CAC GAG ATG TCC CAA1056Gly Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln Gis Glu Met Ser Gln340 345 350GAA GGC TTC AGC ACA GCC CTC ACA ATG GAT GGC CTC TTC CTG GGG GCT1104Glu Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala355 360 365GTG GGG AGC TTT AGC TGG TCT GGA GGT GCC TTC CTG TAT CCC CCA AAT1152Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn370 375 380ATG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG GAG AAT GTG GAC ATG AGG1200Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg385 390 395 400GAC TCT TAC CTG GGT TAC TCC ACC GAG CTA GCC CTG TGG AAG GGG GTA1248Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val405 410 415CAG AAC CTG GTC CTG GGG GCC CCC CGC TAC CAG CAT ACC GGG AAG GCT1296Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala420 425 430GTC ATC TTC ACC CAG GTG TCC AGG CAA TGG AGG AAG AAG GCC GAA GTC1344Val Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val435 440 445ACA GGG ACG CAG ATC GGC TCC TAC TTC GGG GCC TCC CTC TGC TCC GTG1392Thr Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val450 455 460GAT GTG GAC AGC GAT GGC AGC ACC GAC CTG ATC CTC ATT GGG GCC CCC 1440Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro465 470 475 480CAT TAC TAT GAG CAG ACC CGA GGG GGC CAG GTG TCC GTG TGT CCC TTG 1488His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu485 490 495CCT AGG GGG AGG GTG CAG TGG CAG TGT GAC GCT GTT CTC CGT GGT GAG 1536Pro Arg Gly Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu500 505 510CAG GGC CAC CCC TGG GGC CGC TTT GGG GCA GCC CTG ACA GTG TTG GGG 1584Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly515 520 525GAT GTG AAT GAG GAC AAG CTG ATA GAC GTG GCC ATT GGG GCC CCG GGA 1632Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly530 535 540GAG CAG GAG AAC CGG GGT GCT GTC TAC CTG TTT CAC GGA GCC TCA GAA 1680Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser Glu545 550 555 560TCC GGC ATC AGC CCC TCC CAC AGC CAG CGG ATT GCC AGC TCC CAG CTC 1728Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln Leu565 570 575TCC CCC AGG CTG CAG TAT TTT GGG CAG GCG CTG AGT GGG GGT CAG GAC 1776Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln Asp580 585 590CTC ACC CAG GAT GGA CTG ATG GAC CTG GCC GTG GGG GCC CGG GGC CAG 1824Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly Gln595 600 605GTG CTC CTG CTC AGG AGT CTG CCG GTG CTG AAA GTG GGG GTG GCC ATG 1872Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala Met610 615 620AGA TTC AGC CCT GTG GAG GTG GCC AAG GCT GTG TAC CGG TGC TGG GAA 1920Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp Glu625 630 635 640GAG AAG CCC AGT GCC CTG GAA GCT GGG GAC GCC ACC GTC TGT CTC ACC 1968Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr645 650 655ATC CAG AAA AGC TCA CTG GAC CAG CTA GGT GAC ATC CAA AGC TCT GTC 2016Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val660 665 670AGG TTT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGT CGT CTG ACT TCT CGT GCC ATT 2064Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile675 680 685TTC AAT GAA ACC AAG AAC CCC ACT TTG ACT CGA AGA AAA ACC CTG GGA 2112Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly690 695 700CTG GGG ATT CAC TGT GAA ACC CTG AAG CTG CTT TTG CCA GAT TGT GTG 2160Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val705 710 715 720GAG GAT GTG GTG AGC CCC ATC ATT CTG CAC CTC AAC TTC TCA CTG GTG 2208Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val725 730 735AGA GAG CCC ATC CCC TCC CCC CAG AAC CTG CGT CCT GTG CTG GCC GTG 2256Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val740 745 750GGC TCA CAA GAC CTC TTC ACT GCT TCT CTC CCC TTC GAG AAG AAC TGT 2304Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys755 760 765GGG CAA GAT GGC CTC TGT GAA GGG GAC CTG GGT GTC ACC CTC AGC TTC 2352Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe770 775 780TCA GGC CTG CAG ACC CTG ACC GTG GGG AGC TCC CTG GAG CTC AAC GTG 2400Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val785 790 795 800ATT GTG ACT GTG TGG AAC GCA GGT GAG GAT TCC TAC GGA ACC GTG GTC 2448Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val805 810 815AGC CTC TAC TAT CCA GCA GGG CTG TCG CAC CGA CGG GTG TCA GGA GCC 2496Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Ala820 825 830CAG AAG CAG CCC CAT CAG AGT GCC CTG CGC CTG GCA TGT GAG ACA GTG 2544Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Val835 840 845CCC ACT GAG GAT GAG GGC CTA AGA AGC AGC CGC TGC AGT GTC AAC CAC 2592Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His850 855 860CCC ATC TTC CAT GAG GGC TCT AAC GGC ACC TTC ATA GTC ACA TTC GAT 2640Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp865 870 875 880GTC TCC TAC AAG GCC ACC CTG GGA GAC AGG ATG CTT ATG AGG GCC AGT 2688Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala Ser885 890 895GCA AGC AGT GAG AAC AAT AAG GCT TCA AGC AGC AAG GCC ACC TTC CAG 2736Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gln900 905 910CTG GAG CTC CCG GTG AAG TAT GCA GTC TAC ACC ATG ATC AGC AGG CAG 2784Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gln915 920 925GAA GAA TCC ACC AAG TAC TTC AAC TTT GCA ACC TCC GAT GAG AAG AAA 2832Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys Lys930 935 940ATG AAA GAG GCT GAG CAT CGA TAC CGT GTG AAT AAC CTC AGC CAG CGA 2880Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln Arg945 950 955 960GAT CTG GCC ATC AGC ATT AAC TTC TGG GTT CCT GTC CTG CTG AAC GGG 2928Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly965 970 975GTG GCT GTG TGG GAT GTG GTC ATG GAG GCC CCA TCT CAG AGT CTC CCC 2976Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu Pro980 985 990TGT GTT TCA GAG AGA AAA CCT CCC CAG CAT TCT GAC TTC CTG ACC CAG 3024Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr Gln995 10001005ATT TCA AGA AGT CCC ATG CTG GAC TGC TCC ATT GCT GAC TGC CTG CAG 3072Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu Gln101010151020TTC CGC TGT GAC GTC CCC TCC TTC AGC GTC CAG GAG GAG CTG GAT TTC 3120Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp Phe1025103010351040ACC CTG AAG GGC AAT CTC AGT TTC GGC TGG GTC CGC GAG ACA TTG CAG 3168Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gln104510501055AAG AAG GTG TTG GTC GTG AGT GTG GCT GAA ATT ACG TTC GAC ACA TCC 3216Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser106010651070GTG TAC TCC CAG CTT CCA GGA CAG GAG GCA TTT ATG AGA GCT CAG ATG 3264Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln Met107510801085GAG ATG GTG CTA GAA GAA GAC GAG GTC TAC AAT GCC ATT CCC ATC ATC 3312Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile Ile109010951100ATG GGC AGC TCT GTG GGG GCT CTG CTA CTG CTG GCG CTC ATC ACA GCC 3360Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Ala1105111011151120ACA CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAA CGC CAC TAC AAG GAA ATG CTG 3408Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu112511301135GAG GAC AAG CCT GAA GAC ACT GCC ACA TTC AGT GGG GAC GAT TTC AGC 3456Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser114011451150TGT GTG GCC CCA AAT GTG CCT TTG TCC TAATAATCCA CTTTCCTGTT 3503Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser11551160TATCTCTACC ACTGTGGGCT GGACTTGCTT GCAACCATAA ATCAACTTAC ATGGAAACAA 3563CTTCTGCATA GATCTGCACT GGCCTAAGCA ACCTACCAGG TGCTAAGCAC CTTCTCGGAG 3623AGATAGAGAT TGTCAATGTT TTTACATATC TGTCCATCTT TTTCAGCAAT GACCCACTTT 3683TTACAGAAGC AGGCATGGTG CCAGCATAAA TTTTCATATG CTTAAGAATT GTCACATGAA 3743AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAACTTT AG3785(2)SEQ ID NO99信息(i)序列特征(A)長度1161氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO99Met Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15Gly Phe AGn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala20 25 30Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val35 40 45Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu
50 55 60Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His65 70 75 80Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Thr Leu Ala Ala85 90 95Ser Thr Asn Gly Ser Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Leu His Arg100 105 110Val Cys Gly Glu Asn Ser Tyr Ser Lys Gly Ser Cys Leu Leu Leu Gly115 120 125Ser Arg Trp Glu Ile Ile Gln Thr Val Pro Asp Ala Thr Pro Glu Cys130 135 140Pro His Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser145 150 155 160Ile Asp Gln Asn Asp Phe Asn Gln Met Lys Gly Phe Val Gln Ala Val165 170 175Met Gly Gln Phe Glu Gly Thr Asp Thr Leu Phe Ala Leu Met Gln Tyr180 185 190Ser Asn Leu Leu Lys Ile His Phe Thr Phe Thr Gln Phe Arg Thr Ser195 200 205Pro Ser Gln Gln Ser Leu Val Asp Pro Ile Val Gln Leu Lys Gly Leu210 215 220Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Thr Val Val Thr Gln Leu Phe His225 230 235 240His Lys Asn Gly Ala Arg Lys Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile245 250 255Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Glu Tyr Ser Asp Val Ile260 265 270Pro Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly275 280 285His Ala Phe Gln Gly Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ser290 295 300Ser Ala Pro Pro Gln Asp His Val Phe Lys Val Asp Asn Phe Ala Ala305 310 315 320Leu Gly Ser Ile Gln Lys Gln Leu Gln Glu Lys Ile Tyr Ala Val Glu325 330 335Gly Thr Gln Ser Arg Ala Ser Ser Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln340 345 350Glu Gly Phe Ser Thr Ala Leu Thr Met Asp Gly Leu Phe Leu Gly Ala355 360 365Val Gly Ser Phe Ser Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Asn370 375 380Met Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Glu Asn Val Asp Met Arg385 390 395 400Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr Glu Leu Ala Leu Trp Lys Gly Val405 410 415Gln Asn Leu Val Leu Gly Ala Pro Arg Tyr Gln His Thr Gly Lys Ala420 425 430Val Ile Phe Thr Gln Val Ser Arg Gln Trp Arg Lys Lys Ala Glu Val435 440 445Thr Gly Thr Gln Ile Gly Ser Tyr Phe Gly Ala Ser Leu Cys Ser Val450 455 460Asp Val Asp Ser Asp Gly Ser Thr Asp Leu Ile Leu Ile Gly Ala Pro465 470 475 480His Tyr Tyr Glu Gln Thr Arg Gly Gly Gln Val Ser Val Cys Pro Leu485 490 495Pro Arg Gly Arg Val Gln Trp Gln Cys Asp Ala Val Leu Arg Gly Glu500 505 510Gln Gly His Pro Trp Gly Arg Phe Gly Ala Ala Leu Thr Val Leu Gly515 520 525Asp Val Asn Glu Asp Lys Leu Ile Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gly530 535 540Glu Gln Glu Asn Arg Gly Ala Val Tyr Leu Phe His Gly Ala Ser Glu545 550 555 560Ser Gly Ile Ser Pro Ser His Ser Gln Arg Ile Ala Ser Ser Gln Leu565 570 575Ser Pro Arg Leu Gln Tyr Phe Gly Gln Ala Leu Ser Gly Gly Gln Asp580 585 590Leu Thr Gln Asp Gly Leu Met Asp Leu Ala Val Gly Ala Arg Gly Gln595 600 605Val Leu Leu Leu Arg Ser Leu Pro Val Leu Lys Val Gly Val Ala Met610 615 620Arg Phe Ser Pro Val Glu Val Ala Lys Ala Val Tyr Arg Cys Trp Glu625 630 635 640Glu Lys Pro Ser Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ala Thr Val Cys Leu Thr645 650 655Ile Gln Lys Ser Ser Leu Asp Gln Leu Gly Asp Ile Gln Ser Ser Val660 665 670Arg Phe Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg Leu Thr Ser Arg Ala Ile675 680 685Phe Asn Glu Thr Lys Asn Pro Thr Leu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Gly690 695 700Leu Gly Ile His Cys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Leu Pro Asp Cys Val705 710 715 720Glu Asp Val Val Ser Pro Ile Ile Leu His Leu Asn Phe Ser Leu Val725 730 735Arg Glu Pro Ile Pro Ser Pro Gln Asn Leu Arg Pro Val Leu Ala Val740 745 750Gly Ser Gln Asp Leu Phe Thr Ala Ser Leu Pro Phe Glu Lys Asn Cys755 760 765Gly Gln Asp Gly Leu Cys Glu Gly Asp Leu Gly Val Thr Leu Ser Phe770 775 780Ser Gly Leu Gln Thr Leu Thr Val Gly Ser Ser Leu Glu Leu Asn Val785 790 795 800Ile Val Thr Val Trp Asn Ala Gly Glu Asp Ser Tyr Gly Thr Val Val805 810 815Ser Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser His Arg Arg Val Ser Gly Ala820 825 830Gln Lys Gln Pro His Gln Ser Ala Leu Arg Leu Ala Cys Glu Thr Val835 840 845Pro Thr Glu Asp Glu Gly Leu Arg Ser Ser Arg Cys Ser Val Asn His850 855 860Pro Ile Phe His Glu Gly Ser Asn Gly Thr Phe Ile Val Thr Phe Asp865 870 875 880Val Ser Tyr Lys Ala Thr Leu Gly Asp Arg Met Leu Met Arg Ala Ser885 890 895Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Ala Ser Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gln900 905 910Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Thr Met Ile Ser Arg Gln915 920 925Glu Glu Ser Thr Lys Tyr Phe Asn Phe Ala Thr Ser Asp Glu Lys Lys930 935 940Met Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn Asn Leu Ser Gln Arg945 950 955 960Asp Leu Ala Ile Ser Ile Asn Phe Trp Val Pro Val Leu Leu Asn Gly965 970 975Val Ala Val Trp Asp Val Val Met Glu Ala Pro Ser Gln Ser Leu Pro980 985 990Cys Val Ser Glu Arg Lys Pro Pro Gln His Ser Asp Phe Leu Thr Gln995 10001005Ile Ser Arg Ser Pro Met Leu Asp Cys Ser Ile Ala Asp Cys Leu Gln101010151020Phe Arg Cys Asp Val Pro Ser Phe Ser Val Gln Glu Glu Leu Asp Phe1025103010351040Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Gly Trp Val Arg Glu Thr Leu Gln104510501055Lys Lys Val Leu Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr Phe Asp Thr Ser106010651070Val Tyr Ser Gln Leu Pro Gly Gln Glu Ala Phe Met Arg Ala Gln Met107510801085Glu Met Val Leu Glu Glu Asp Glu Val Tyr Asn Ala Ile Pro Ile Ile109010951100Met Gly Ser Ser Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ile Thr Ala1105111011151120Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg His Tyr Lys Glu Met Leu112511301135Glu Asp Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Phe Ser Gly Asp Asp Phe Ser114011451150Cys Val Ala Pro Asn Val Pro Leu Ser11551160(2)SEQ ID NO100信息
(i)序列特征(A)長度1318堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置17..1255(xi)序列描述SEQ ID NO100AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT 49Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser1 5 10TAC CAC GGA TTC AAC TTG GAC GTG GAT GAG CCG GTG ATC TTC CAG GAA 97Tyr His Gly Phe Asn Leu Asp Val Asp Glu Pro Val Ile Phe Gln Glu15 20 25GAC GCA GCG GGC TTC GGG CAG AGC GTG ATG CAG TTT GGA GGA TCT CGA145Asp Ala Ala Gly Phe Gly Gln Ser Val Met Gln Phe Gly Gly Ser Arg30 35 40CTC GTG GTG GGA GCC CCC CTG GCG GTG GTG TCG GCC AAC CAC ACA GGA193Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly45 50 55CGG CTG TAC GAG TGT GCG CCT GCC TCC GGC ACC TGC ACG CCC ATT TTC241Arg Leu Tyr Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe60 65 70 75CCA TTC ATG CCC CCC GAA GCC GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCC CTG289Pro Phe Met Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu80 85 90GCA GCC TCC CCC AAC CAT TCC CAG CTG CTG GCT TGT GGC CCG ACC GTG337Ala Ala Ser Pro Asn His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val95 100 105CAT AGA GCC TGC GGG GAG GAC GTG TAC GCC CAG GGT TTC TGT GTG CTG385His Arg Ala Cys Gly Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu110 115 120CTG GAT GCC CAC GCA CAG CCC ATC GGG ACT GTG CCA GCT GCC CTG CCC433Leu Asp Ala His Ala Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro125 130 135GAG TGC CCA GAT CAA GAG ATG GAC ATT GTC TTC CTG ATT GAC GGC TCT481Glu Cys Pro Asp Gln Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser140 145 150 155GGC AGC ATT AGC TCA AAT GAC TTC CGC AAG ATG AAG GAC TTT GTC AGA529Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg160 165 170GCT GTG ATG GAC CAG TTC AAG GAC ACC AAC ACC CAG TTC TCG CTG ATG577Ala Val Met Asp Gln Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met175 180 185CAG TAC TCC AAT GTG CTG GTG ACA CAT TTC ACC TTC AGC AGC TTC CGG625Gln Tyr Ser Asn Val Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg190 195 200AAC AGC TCC AAT CCT CAG GGC CTA GTG GAG CCC ATT GTG CAG CTG ACA673Asn Ser Ser Asn Pro Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr205 210 215GGC CTC ACG TTC ACG GCC ACA GGG ATC CTG AAA GTG GTG ACA GAG CTG721Gly Leu Thr Phe Thr Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu220 225 230 235TTT CAA ACC AAG AAC GGG GCC CGC GAA AGT GCC AAG AAG ATC CTC ATC769Phe Gln Thr Lys Asn Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile240 245 250GTC ATC ACA GAT GGG CAG AAG TAC AAA GAC CCC CTG CAC TAC AGT GCT817Val Ile Thr Asp Gly Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu His Tyr Ser Ala255 260 265GTC ATC CCA CAG GCA GAG CAG GCG GGC ATC ATC CGC TAC GCC ATC GGG865Val Ile Pro Gln Ala Glu Gln Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly270 275 280GTG GGG GAC GCG TTC CAG AAA CCC ACA GCC AGG CAG GAG CTG GAC ACC913Val Gly Asp Ala Phe Gln Lys Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asp Thr285 290 295ATC GCC TCC GAG CCG CCC GAC GCC CAC GTG TTC CAG GTG GAC AAT TTC961Ile Ala Ser Glu Pro Pro Asp Ala His Val Phe Gln Val Asp Asn Phe300 305 310 315TCA GCA CTC AGC AGC ATC CAA AAG CAG CTG TAT GAC AGG ATC TTT GCC 1009Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln Lys Gln Leu Tyr Asp Arg Ile Phe Ala320 325 330GTC GAG GGA ACC CTG TCA TCG GCA AGC ACC TCC TTC CAG CAT GAG ATG 1057Val Glu Gly Thr Leu Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Gln His Glu Met335 340 345TCC CAA GAG GGC TTC AGC TCA CTT CTC ACC ACG GAA GGA CCG GTG CTG 1105Ser Gln Glu Gly Phe Ser Ser Leu Leu Thr Thr Glu Gly Pro Val Leu350 355 360GGG GCT GTG GGC AGC TTC GAT TGG TCC GGG GGT GCT TTC CTG TAC CCC 1153Gly Ala Val Gly Ser Phe Asp Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro365 370 375CCC GGC GGG AGC CCC ACC TTC ATC AAC ATG TCT CAG CAG AAC GTG GAC 1201Pro Gly Gly Ser Pro Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Gln Asn Val Asp380 385 390 395ATG AGG GAC TCC TAC CTG GGT GAG GAA GGG GTG GGG GTG GGG ACA GGT 1249Met Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Val Gly Val Gly Thr Gly400 405 410GGG AGC TGAGGCTTGG GGTGGGGTGG GGCTGGGCTG GGAGGGGAGG GAAGAGGAGG 1305Gly SerGGAGAGGCAA AGA 1318(2)SEQ ID NO101信息(i)序列特征(A)長度413氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO101Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His Gly Phe Asn1 5 10 15Leu Asp Val Asp Glu Pro Val Ile Phe Gln Glu Asp Ala Ala Gly Phe20 25 30Gly Gln Ser Val Met Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val Val Gly Ala35 40 45Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly Arg Leu Tyr Glu Cys50 55 60Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe Pro Phe Met Pro Pro65 70 75 80Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Ser Pro Asn85 90 95His Ser Gln Leu Leu Ala Cys Gly Pro Thr Val His Arg Ala Cys Gly100 105 110Glu Asp Val Tyr Ala Gln Gly Phe Cys Val Leu Leu Asp Ala His Ala115 120 125Gln Pro Ile Gly Thr Val Pro Ala Ala Leu Pro Glu Cys Pro Asp Gln130 135 140Glu Met Asp Ile Val Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Ser145 150 155 160Asn Asp Phe Arg Lys Met Lys Asp Phe Val Arg Ala Val Met Asp Gln165 170 175Phe Lys Asp Thr Asn Thr Gln Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Asn Val180 185 190Leu Val Thr His Phe Thr Phe Ser Ser Phe Arg Asn Ser Ser Asn Pro195 200 205Gln Gly Leu Val Glu Pro Ile Val Gln Leu Thr Gly Leu Thr Phe Thr210 215 220Ala Thr Gly Ile Leu Lys Val Val Thr Glu Leu Phe Gln Thr Lys Asn225 230 235 240Gly Ala Arg Glu Ser Ala Lys Lys Ile Leu Ile Val Ile Thr Asp Gly245 250 255Gln Lys Tyr Lys Asp Pro Leu His Tyr Ser Ala Val Ile Pro Gln Ala260 265 270Glu Gln Ala Gly Ile Ile Arg Tyr Ala Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe275 280 285Gln Lys Pro Thr Ala Arg Gln Glu Leu Asp Thr Ile Ala Ser Glu Pro290 295 300Pro Asp Ala His Val Phe Gln Val Asp Asn Phe Ser Ala Leu Ser Ser305 310 315 320Ile Gln Lys Gln Leu Tyr Asp Arg Ile Phe Ala Val Glu Gly Thr Leu325 330 335Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Gln His Glu Met Ser Gln Glu Gly Phe340 345 350Ser Ser Leu Leu Thr Thr Glu Gly Pro Val Leu Gly Ala Val Gly Ser355 360 365Phe Asp Trp Ser Gly Gly Ala Phe Leu Tyr Pro Pro Gly Gly Ser Pro370 375 380Thr Phe Ile Asn Met Ser Gln Gln Asn Val Asp Met Arg Asp Ser Tyr385 390 395 400Leu Gly Glu Glu Gly Val Gly Val Gly Thr Gly Gly Ser405 410(2)SEQ ID NO102信息(i)序列特征(A)長度1484堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..1482(xi)序列描述SEQ ID NO102GAT GTC CAG AGC TCC ATC AGC TAT GAT CTG GCA CTG GAC CCA GGC CGC 48Asp Val Gln Ser Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg1 5 10 15CTG GTC TCT CGG GCC ATT TTT CAA GAG ACC CAG AAC CAG ACT TTA ACT 96Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Gln Asn Gln Thr Leu Thr20 25 30CGA AGG AAG ACC CTG GGG CTG GGG CGT CAC TGT GAA ACC ATG AGG CTA 144Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu35 40 45CTT TTG CCA GAC TGC GTA GAG GAC GTG GTG AAC CCC ATC GTC CTG CAC 192Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His50 55 60CTC AAC TTC TCC CTG GAG GGA CAG CCA ATC CTC TCA TCC CAG AAT CTG 240Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gln Pro Ile Leu Ser Ser Gln Asn Leu65 70 75 80CGC CCT GTG CTG GCC ACG GGC TCG CAG GAC CAC TTC ATT GCC TCC CTC 288Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp His Phe Ile Ala Ser Leu
85 90 95CCC TTT GAG AAG AAC TGC GGA CAA GAT CGC CTG TGT GAG GGG GAC CTG336Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu100 105 110AGC ATC AGC TTC AAC TTC TCG GGC TTG AAT ACC CTG CTG GTG GGG CTC384Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu115 120 125TCC CTG GAG CTC ACA GTG ACA GTG ACC GTG CGG AAT GAG GGC GAG GAC432Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp130 135 140TCC TAT GGG ACC GCC ATC ACC CTC TAC TAC CCA GCA GGG CTA TCC TAC480Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr145 150 155 160AGG CGG GTG TCG GGC CAG ACA CAA CCC TGG CAG CGC CCC CTG CAC CTC528Arg Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Pro Trp Gln Arg Pro Leu His Leu165 170 175GCA TGT GAG GCT GTA CCT ACC GAG AGC GAG GGC TTG AGG AGT ACC AGC576Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser180 185 190TGC AGC GTC AAC CAC CCC ATC TTC CAA GGG GGT GCT CAG GGC ACT TTC624Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ala Gln Gly Thr Phe195 200 205GTA GTC AAG TTC GAT GTC TCC TCC AAG GCC AGC CTG GGT GAC AGG TTG672Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu210 215 220CTC ATG GGG GCC AGT GCC AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT GCG AGC AAC720Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn225 230 235 240AAG ACC TCC TTT GAG CTG GAA CTG CCA GTG AAA TAC GCT GTC TAC ATG768Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met245 250 255ATG ATC ACA AGG CAC GAA GGC TCC ACC AGG TTC TTC AAC TTT TCC ACT816Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr260 265 270TCC GCT GAG AAG AGC AGC AAA GAG GCC GAG CAC CGC TAT CGG GTG AAC864Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn275 280 285AAC CTG AGT CTG CGA GAT GTG GCC GTC AGC GTG GAC TTC TGG GCC CCC912Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro290 295 300GTG CAG CTG AAC GGA GCA GCT GTG TGG GAC GTG GCG GTG GAG GCC CCT 960Val Gln Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro305 310 315 320GCC CAG AGC CTG CCC TGT GCG CGG GAG AGG GAA CCT CCG AGG ACC TCT 1008Ala Gln Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser325 330 335GAC CTG AGC CGG GTC CCG GGG AGT CCC GTG CTG GAC TGC AGC GTT GCG 1056Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala340 345 350CAC TGC CTG AGG TTC CGC TGC CAC ATC CCC TCC TTC AGC GCC AAG GAG 1104His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu355 360 365GAG CTC CAC TTC ACC CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC GCC TGG GTC AGC 1152Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Ala Trp Val Ser370 375 380CAG ATG CTG CAA AAG AAG GTG TCG GTG GTG AGT GTG GCC GAG ATC ACC 1200Gln Met Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr385 390 395 400TTC AAC AGG GCC GTG TAC TCC CAA GTT CCG GGC GAG GAG CCC TTT ATG 1248Phe Asn Arg Ala Val Tyr Ser Gln Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met405 410 415AGA GCC CAG GTG GAG ACG GTG CTG GAG GAG TAT GAG GAG CAC GAC CCC 1296Arg Ala Gln Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro420 425 430GTC CCC CTG GTG GTG GGC AGC TGT GTG GGC GGC CTG CTG CTG CTG GCT 1344Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala435 440 445CTC ATC TCA GCC ACC CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAG CGC CGG TAC 1392Leu Ile Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr450 455 460AAG GAG ATG CTG GGC GAG AAA CCG GGA GAC GCG GCC ACC TTC CCC GGG 1440Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Phe Pro Gly465 470 475 480GAG GAC GCC AGC TGC GGG GCT TCA GAT TTG CCT TTG TCC CAG 1482Glu Asp Ala Ser Cys Gly Ala Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gln485 490TG 1484(2)SEQ ID NO103信息(i)序列特征(A)長度494氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO103Asp Val Gln Ser Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg1 5 10 15Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Gln Asn Gln Thr Leu Thr20 25 30Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu35 40 45Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His50 55 60Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gln Pro Ile Leu Ser Ser Gln Asn Leu65 70 75 80Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp His Phe Ile Ala Ser Leu85 90 95Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu100 105 110Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu115 120 125Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp130 135 140Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr145 150 155 160Arg Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Pro Trp Gln Arg Pro Leu His Leu165 170 175Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser180 185 190Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ala Gln Gly Thr Phe195 200 205Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu
210 215 220Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn225 230 235 240Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met245 250 255Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr260 265 270Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn275 280 285Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro290 295 300Val Gln Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro305 310 315 320Ala Gln Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser325 330 335Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala340 345 350His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu355 360 365Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Ala Trp Val Ser370 375 380Gln Met Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr385 390 395 400Phe Asn Arg Ala Val Tyr Ser Gln Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met405 410 415Arg Ala Gln Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro420 425 430Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala435 440 445Leu Ile Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr450 455 460Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Phe Pro Gly465 470 475 480Glu Asp Ala Ser Cys Gly Ala Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gln485 490(2)SEQ ID NO104信息
(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO104TGTCCAGGAC AAGAGATGGA CATTGC262)SEQ ID NO105信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO105GAGCTATTTC ATAGCAAGAA TGGG 242)SEQ ID NO106信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO106TATAGCATAG CGAATGATCC 202)SEQ ID NO107信息(i)序列特征
(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO107ATGGTCCGTG GAGTTGTGAT C 212)SEQ ID NO108信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO108TCGAGATCCA CCAAACTGCA C 21(2)SEQ ID NO109信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO109Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala1 5 10(2)SEQ ID NO110信息(i)序列特征(A)長度14氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO110Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Xaa Glu Asp Ala1 5 10(2)SEQ ID NO111信息(i)序列特征(A)長度15氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO111Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO112信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO112Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala Gly1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO113信息(i)序列特征(A)長度16氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO113Phe Asn Leu Asp Thr Glu Glu Leu Thr Ala Phe Val Asp Ser Ala Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO114信息(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO114Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg1 5 10 15Gly
權(quán)利要求
1.一種鑒定αd與VCAM-1之間結(jié)合的調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括以下步驟a)將αd和VCAM-1在存在或不存在一種推定的調(diào)節(jié)劑化合物的情況下接觸，b)檢測αd與VCAM-1之間的結(jié)合，并c)視αd與VCAM-1之間的結(jié)合在存在推定調(diào)節(jié)劑的情況下與不存在推定調(diào)節(jié)劑的情況下的結(jié)合相比是減少還是增加，來鑒定一種推定的調(diào)節(jié)劑。
2.權(quán)利要求1的方法，該方法在一種含有可溶性的αd和一種可溶性的VCAM-1的宿主細(xì)胞中進(jìn)行，其中減少或增加的結(jié)合通過測量宿主細(xì)胞中結(jié)合依賴的表型改變來定量，所說的表型改變是一種表達(dá)中的改變或一個報(bào)告基因產(chǎn)物造成的。
3.一種鑒定調(diào)節(jié)αd與VCAM-1之間結(jié)合的化合物的方法，該方法包括以下步驟a)將αd或其一種片段、或VCAM-1或其一種片段固化在一種固相支持物上，b)用一種可檢測的試劑標(biāo)記未固化的結(jié)合伙伴，c)將所說的固化的結(jié)合伙伴與所說的標(biāo)記的結(jié)合伙伴在存在或不存在一種能夠與αd或VCAM-1特異性反應(yīng)的推定調(diào)節(jié)劑化合物的情況下接觸，d)檢測所說的固化結(jié)合伙伴與所說的標(biāo)記結(jié)合伙伴之間的結(jié)合，并e)將那些影響所說的固化的結(jié)合伙伴與所說的標(biāo)記結(jié)合伙伴之間結(jié)合的化合物鑒定為調(diào)節(jié)化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中αd或VCAM-1固化在用一種熒光試劑包被或浸沒的固相支持物上，所說的非固化的結(jié)合伙伴用一種能激發(fā)所說的熒光試劑的化合物標(biāo)記，并且αd與αd結(jié)合伙伴的相互作用通過從所說的熒光試劑的光發(fā)射來檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定與VCAM－1結(jié)合的α
文檔編號G01N33/50GK1246869SQ98802282
公開日2000年3月8日 申請日期1998年10月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月3日
發(fā)明者W·M·加勒廷, M·范德維倫 申請人:艾科斯有限公司