采用非干擾性蛋白質(zhì)染劑的hcp抗血清驗(yàn)證的制作方法
【專利說明】采用非干擾性蛋白質(zhì)染劑的HCP抗血清驗(yàn)證
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年11月12日提交的61/903, 234號(hào)美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先 權(quán)，該文的全部內(nèi)容通過引用納入本文用于所有目的。
【背景技術(shù)】
[0003] 生物物質(zhì)藥物或生物物質(zhì)，例如治療性蛋白質(zhì)，一般源自宿主細(xì)胞。例如，可以通 過遺傳學(xué)方式工程改造宿主細(xì)胞，以生成治療性重組蛋白。又如，所述生物物質(zhì)可以是內(nèi) 源性非重組蛋白。所述宿主細(xì)胞可經(jīng)收獲并裂解，然后可通過多種方法從污染性宿主細(xì)胞 組分純化所述生物物質(zhì)?；蛘?，該生物物質(zhì)可由宿主細(xì)胞分泌進(jìn)入條件培養(yǎng)基，收取該培養(yǎng) 基，并從條件培養(yǎng)基中的污染物質(zhì)純化所述生物物質(zhì)。宿主細(xì)胞污染物包括宿主細(xì)胞蛋白 (HCP)〇
[0004] HCP污染物可能會(huì)具有不希望的作用，即便在極低的濃度下也是如此。例如，它們 會(huì)干擾所述生物物質(zhì)的功能。又如，HCP污染物會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)對(duì)該生物物質(zhì)的過敏反應(yīng) 或排斥。因此，相信將全部、基本全部或大部分HCP污染移除，能夠減少不希望的作用。
[0005] 因此，生物物質(zhì)的質(zhì)量控制測(cè)試通常包括：用以顯示HCP污染物已被充分移除的 測(cè)試，足以使HCP污染處于較低、允許的水平。低水平污染物的檢測(cè)可采用免疫化學(xué)試驗(yàn)來 進(jìn)行，其一般具有低檢測(cè)限制。例如，ELISA可聯(lián)合多克隆抗體混合物使用，該抗體混合物 開發(fā)成對(duì)多種可能HCP具有反應(yīng)性。多克隆抗體混合物的開發(fā)需要對(duì)識(shí)別的可能靶標(biāo)的數(shù) 量，以及所述試驗(yàn)的靈敏度和特異度進(jìn)行優(yōu)化。因此，在采用多克隆抗體混合物之前，需要 通過證明其能以可接受的靈敏度和特異度檢測(cè)足夠數(shù)量的HCP來對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。
[0006] HCP試驗(yàn)驗(yàn)證可通過二維（2-D)電泳和western印跡來進(jìn)行。例如，兩等份的樣品 可在兩個(gè)不同的2-D電泳凝膠上通過尺寸和等電點(diǎn)各自分離。一個(gè)凝膠可用高靈敏總蛋白 質(zhì)染劑（例如銀、鋅、銅或考馬斯G-250染劑）染色，并觀察染色斑點(diǎn)的數(shù)量，以確定樣品中 總蛋白的大致數(shù)量。第二個(gè)凝膠可轉(zhuǎn)移至western印跡膜，并用候選多克隆抗體混合物探 測(cè)。總蛋白質(zhì)染劑和western印跡所檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的比較能夠確定該抗體混合物的特異 度和靈敏度。
[0007] 因此，該技術(shù)需要能夠以合理的信心確認(rèn)凝膠圖像和印跡圖像之間鑒定的特征/ 斑點(diǎn)是否對(duì)應(yīng)相同的蛋白質(zhì)。具體而言，當(dāng)凝膠和印跡圖像中的相同對(duì)應(yīng)位置上存在某一 特征時(shí)，擬為匹配。然而，當(dāng)所述多個(gè)圖像或圖像內(nèi)多個(gè)個(gè)體特征彼此不配準(zhǔn)時(shí)，對(duì)于匹配 的指定會(huì)變得復(fù)雜。如下原因可能造成凝膠圖像和印跡圖像或其中的特征之間缺乏配準(zhǔn)： 電泳、轉(zhuǎn)移和染色中的不一致，并且，所述圖像可能因?yàn)槟z的收縮和膨脹而具有不同尺 寸。這些不一致的原因等等會(huì)造成不正確或模糊的匹配。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種驗(yàn)證多克隆抗體混合物的改進(jìn)的方法，所述多克隆抗體混合物用 于檢測(cè)生物樣品中的污染性宿主細(xì)胞蛋白（HCP)。在一些實(shí)施方式中，所述方法對(duì)于總蛋白 質(zhì)染色和western印跡檢測(cè)無需分別的2-D凝膠。
[0009] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于驗(yàn)證包含多克隆抗體混合物的免疫學(xué)檢測(cè)試 劑的方法，所述多克隆抗體混合物用于檢測(cè)生物樣品中的污染性宿主細(xì)胞蛋白（HCP)，所述 方法包括：提供包含HCP的生物樣品；通過表觀分子量和等電點(diǎn)來分離HCP;將分離的HCP 轉(zhuǎn)移至膜，由此產(chǎn)生結(jié)合至膜的HCP;采用非干擾性總蛋白質(zhì)染劑對(duì)結(jié)合至膜的HCP染色， 由此用所述非干擾性總蛋白質(zhì)染劑檢測(cè)所述膜上的宿主細(xì)胞蛋白（HCP)位置；觀察并記錄 非干擾性總蛋白質(zhì)染劑測(cè)得的該膜上的HCP位置；使該膜與所述多克隆抗體混合物接觸， 由此使來自多克隆抗體混合物的抗體與結(jié)合至膜的HCP相結(jié)合；檢測(cè)與該膜結(jié)合的來自所 述多克隆抗體混合物的抗體，由此采用所述多克隆抗體混合物檢測(cè)該膜上的HCP位置；觀 察并記錄所述多克隆抗體混合物測(cè)得的該膜上的HCP位置；和，比較非干擾性總蛋白質(zhì)染 劑測(cè)得的HCP位置和所述多克隆抗體混合物測(cè)得的位置，由此驗(yàn)證用于檢測(cè)生物樣品中污 染性宿主細(xì)胞蛋白HCP的多克隆抗體混合物。
[0010] 在一些方面中，在使所述膜與多克隆抗體混合物接觸之前，所述非干擾性總蛋白 質(zhì)染劑從所述膜基本移除。例如，可通過將膜接觸封閉溶液來使所述非干擾性總蛋白質(zhì)染 劑從所述膜基本移除。在一些情況中，所述封閉溶液包含血清白蛋白、明膠或酪蛋白的緩沖 溶液；血清或脫脂奶；或含有親水性或兩親性合成聚合物的無蛋白封閉溶液。
[0011] 在一些方面中，所述非干擾性總蛋白質(zhì)染劑檢測(cè)western印跡膜上包含至少約 0. 25ng-至少約1、2、5或10ng的蛋白質(zhì)的HCP位置。在一些情況中，所述非干擾性總蛋白 質(zhì)染劑包含金屬有機(jī)螯合物。例如，所述金屬有機(jī)螯合物可包含釕。在一些情況中，包含釕 的金屬有機(jī)螯合物是SYPRORuby蛋白質(zhì)染劑。在一些情況中，包含釕的金屬有機(jī)螯合物是 三（紅菲繞啉）fTn(rutheniumIItris(bathophenanthroline))的橫化的衍生物。例 如，三（紅菲繞啉）舒II的磺化的衍生物可以是三（紅菲繞啉二磺酸）舒II(ruthenium IItris(bathophenanthrolinedisulfonate))〇
[0012] 在一些方面中，所述非干擾性總蛋白質(zhì)染劑包含阿扎菲酮（azaphilone)，該阿扎 菲酮與伯胺反應(yīng)產(chǎn)生焚光化合物。例如，該阿扎菲酮可以是黑附球菌酮（epicocconone) 〇
[0013] 在一些方面中，對(duì)通過非干擾性總蛋白質(zhì)染劑測(cè)得的該膜上HCP位置的觀察如下 進(jìn)行：用電磁輻射（例如，紫外光、可見光或紅外光）照射膜，并檢測(cè)熒光。
[0014] 在一些方面中，對(duì)與該膜結(jié)合的來自所述多克隆抗體混合物的抗體的檢測(cè)包括： 使膜接觸第二檢測(cè)試劑以檢測(cè)結(jié)合的抗體。在一些情況中，所述第二檢測(cè)試劑是二抗。在 一些情況中，所述二抗帶有標(biāo)記，例如，所述二抗可用酶、熒光團(tuán)、放射性同位素、生物素、親 和素或鏈酶親和素標(biāo)記。所述酶可以是，例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。所述熒光團(tuán) 可以是，例如，花青染料、DyLight染料、AlexaFluor染料、焚光納米顆?；蚍俟獾鞍?。
[0015] 在一些方面中，對(duì)所述多克隆抗體混合物測(cè)得的該膜上的HCP位置的觀察如下進(jìn) 行：使膜接觸化學(xué)發(fā)光基質(zhì)，并記錄化學(xué)發(fā)光。在一些情況中，所述膜進(jìn)一步與化學(xué)發(fā)光增 強(qiáng)劑接觸，例如，所述增強(qiáng)劑可以是3-(吩噻嗪-10-基）丙烷-1-磺酸鹽）。
[0016] 在一些方面中，非干擾性總蛋白質(zhì)染劑或多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置采用 基于電荷耦合裝置（CCD)或基于互補(bǔ)性金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS)的相機(jī)觀察。
[0017] 在一些方面中，非干擾性總蛋白質(zhì)染劑和多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置采用 成像系統(tǒng)觀察并記錄。例如，所述成像系統(tǒng)可包含計(jì)算機(jī)、CCD或CMOS相機(jī)以及軟件，用于 觀察并記錄非干擾性總蛋白質(zhì)染劑和多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置。
[0018] 在任何前述實(shí)施方式、方面、情況或示例中，所述比較可包括：將非干擾性總蛋白 質(zhì)染劑測(cè)得的HCP位置與所述多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置進(jìn)行匹配并確定匹配率， 其中，當(dāng)HCP位置在western印跡膜上處于相同或等同的位置上時(shí)，這樣的HCP位置是匹配 的。在一些情況中，所述匹配率是：多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置的數(shù)量除以所述多克 隆抗體混合物或所述非干擾性總蛋白質(zhì)染劑可測(cè)得的HCP位置的總數(shù)。在一些情況中，如 果匹配率是至少約0. 2、0. 47、0. 5或0. 75或是約1，則所述多克隆抗體混合物通過驗(yàn)證。
[0019] 在一些情況中，所述成像系統(tǒng)包含將所述非干擾性總蛋白質(zhì)染劑測(cè)得的HCP位置 與所述多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置做比較的裝置。
[0020] 在一些情況中，所述成像系統(tǒng)包含如下裝置：該裝置將非干擾性總蛋白質(zhì)染劑測(cè) 得的HCP位置與所述多克隆抗體混合物測(cè)得的HCP位置匹配，由此確定匹配的HCP位置的 數(shù)量。在一些情況中，所述成像系統(tǒng)還包括如下裝置：該裝置用于將匹配的HCP位置的數(shù)量 與非干擾性總蛋白質(zhì)染劑測(cè)得的HCP位置做比較。
[0021] 在任何前述實(shí)施方式、方面、情況或示例中，如果所述多克隆抗體混合物測(cè)得的 HCP位置與所述非干擾性總蛋白質(zhì)染劑或所述多克隆抗體混合物測(cè)得的總HCP位置的比率 是至少約0. 2、0. 47、0. 5或0. 75或是約1，則所述多克隆抗體混合物可通過驗(yàn)證。
[0022] 附圖的簡要說明
[0023] 圖1描述重復(fù)2DE凝膠之間可能的變異性。采用相同的條件，通過進(jìn)行平行2DE 來解析CH0分泌蛋白樣品，然后采用Oriole?熒光凝膠染劑進(jìn)行總蛋白質(zhì)染色（左圖）。采 用roQuestTM2-D分析軟件進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并將2DE重復(fù)凝膠與參比'主凝膠'相匹配，以及 將2DE重復(fù)凝膠彼此匹配（右圖和下方表格）。
[0024] 圖2描述SDS-PAGE凝膠化學(xué)條件對(duì)于2DE之后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的影響。通過 第一向IEF進(jìn)行大鼠肝臟裂解物的相同、平行分離之后，樣品在含有指定凝膠化學(xué)條件的 第二向SDS-PAGE中進(jìn)一步解析。之后，所有2DE凝膠經(jīng)處理供于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 采用Tran:s:-Bte_Turbo?系統(tǒng)進(jìn)行。轉(zhuǎn)移至膜的蛋白質(zhì)通過S?p_>⑩Ruby染色觀察， 而未轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)通過對(duì)轉(zhuǎn)移后的2DE凝膠進(jìn)行考馬斯染色來觀察。
[0025] 圖3描述采用相同膜方法對(duì)開發(fā)用于檢測(cè)宿主細(xì)胞蛋白（HCP)的抗體進(jìn)行評(píng)估的 工作流。
[0026] 圖4描述采用相同膜2DE和western印跡分析針對(duì)CH0總蛋白（圖A)和CH0分 泌蛋白（圖B)進(jìn)行的抗CH0抗體評(píng)價(jià)。通過就各樣品比較轉(zhuǎn)移后的Oriole?染色的2DE 凝膠與類似染色的重復(fù)2DE凝膠，來監(jiān)測(cè)總蛋白質(zhì)染色和western印跡的蛋白質(zhì)向PVDF膜 的轉(zhuǎn)移效率。
[0027] 圖5描述重疊分析來產(chǎn)生總蛋白質(zhì)染色和western印跡圖像之間的匹配率。CH0 分泌蛋白（左圖）和CH0總蛋白（右圖）的匹配率采用上文指示的公式和TOQuest?軟件 產(chǎn)生。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] I.定義
[0030] 在本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一個(gè)"，"一種"和"該"、"所述" 包含復(fù)數(shù)指示物，除非上下文中有明確的另外說明。
[0031] 除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 所理解的同樣含義。參見例如Lackie，DICTIONARYOFCELLANDMOLECULARBIOLOGY(《細(xì)胞 分子生物學(xué)詞典》），埃爾斯威爾出版社（Elsevier)(第4版2007) ;Sambrook等，MOLECULAR CLONING,ALABORATORYMANUAL(《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》），冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（冷泉 港，紐約1989)。本發(fā)明的實(shí)踐中可以使用與本文所述類似或等價(jià)的任何方法、裝置和材料。 本文提供的定義是用來幫助理解本文經(jīng)常用到的某些術(shù)語，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
[0032] 本文中所用的短語一種或多種"宿主細(xì)胞蛋白"（HCP)等，指的是存在于生物物質(zhì) 制備物中的污染性宿主細(xì)胞組分（例如，蛋白質(zhì)）。HCP可通過多種方法檢測(cè)，包括但不限 于，免疫學(xué)檢測(cè)或采用總蛋白質(zhì)染劑。
[0033] 本文中所用的"宿主細(xì)胞蛋白位置"或"HCP位置"指在凝膠中或膜上測(cè)得的宿主細(xì) 胞蛋白的物理位置，其中，蛋白質(zhì)基于一種或多種物理化學(xué)性質(zhì)，例如表觀分子量（例如， 尺寸）和/或等電點(diǎn)被物理分離。
[0034] 若在兩份不同的分離（例如，兩塊不同的聚丙烯酰胺凝膠，兩張不同的膜，或凝膠 和膜）中在相同位置處檢測(cè)到某HCP，或者根據(jù)兩種或不同的檢測(cè)方案在相同位置處檢測(cè) 到某HCP(例如，通過總蛋白質(zhì)染劑和免疫學(xué)檢測(cè)在相同位