一種中緬樹鼩脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞樣本制作領域，具體涉及一種中緬樹鼩脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法。本發(fā)明方法利用4％多聚甲醛進行細胞固定，0.05％Tween進行細胞打孔，制作中緬樹鼩脂肪細胞流式樣本。使用本發(fā)明方法，能有效解決一般情況下細胞通透時造成的大量脂肪細胞破碎，以及離心轉速對固定的脂肪細胞造成的破碎的問題，成功制作出符合流式上機要求的脂肪細胞樣品，為細胞檢測技術提供方法依據(jù)。
【專利說明】
一種中緬樹齣脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及細胞樣本制作領域，具體涉及一種中緬樹駒脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法。
【背景技術】
[0002]流式細胞術自20世紀60年代開始發(fā)展起來，主要應用于生命科學的基礎研究，尤其是細胞生物學、免疫學和分子生物學，是細胞與分子生物學、單克隆抗體技術、生物技術、熒光化學、激光技術、光電子物理、流體力學、計算機技術等多學科領域共同發(fā)展的結晶。它不僅能夠快速定量分析細胞群的物理化學特征，還能通過這些特征精確分選細胞，主要分為流式細胞分析和流式細胞分選兩部分。80年代后期開始應用于臨床，并通過對外周血CD4+T細胞的檢測來監(jiān)測HIV患者疾病的進展，開啟了用于臨床醫(yī)學的新紀元?，F(xiàn)在，流式細胞術不僅能夠輔助多種疾病的判斷，同時為生物學發(fā)展提供了新技術。
[0003]細胞因子是由非免疫細胞或免疫細胞合成和分泌的小分子多肽，在調節(jié)機體多種細胞的分化、生長和功能，調節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應答起著十分重要的作用。檢測細胞因子對于闡明機體免疫應答機制的發(fā)生、發(fā)展和臨床治療具有重要意義。隨著研究進展，僅僅對細胞進行活性的檢測和定量已不能滿足需要。目前，在單細胞水平上研究細胞因子的表達能力越來越受到重視。應用流式細胞儀結合間接免疫熒光法，可在單細胞水平上正確、客觀地檢測細胞內多個細胞因子，進行多參數(shù)相關分析，是一種有效地在單細胞水平研究細胞因子的方法(Pala P,H us sell J,0 penshaw P J.Flow cytomety measure-mentof intracellular cytoki nes[J].Tmmu noI M ethods，2000，243(1-2):107-124)。
[0004]自流式細胞術發(fā)展以來多應用于免疫學、腫瘤學、血液、細胞凋亡、細菌學，而實驗動物也多為小鼠等嚙齒類動物?，F(xiàn)有技術方案對于脂肪細胞的研究也多數(shù)集中于前體脂肪細胞的分化機制及特異性分子標記物，而缺少流式細胞術對于成熟脂肪細胞的分析、分選。
[0005]此外，現(xiàn)有實驗方案一般利用0.1%Triton-100進行細胞通透，但由于脂肪細胞的細胞膜較易破碎，利用0.1 %Triton-100進行細胞通透時會使樣品中的大量脂肪細胞破碎，從而影響后續(xù)的實驗結果，不適合脂肪細胞的流式細胞樣品制作，不能得到理想的實驗結果。且現(xiàn)有實驗方案中離心速度一般在1000-1500rpm，1min，這一轉速對脂肪細胞來說轉速過大，特別是對已固定后的細胞來說轉速過大，會使細胞大量破碎，影響實驗操作。

【發(fā)明內容】

[0006]針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是在于提供一種中緬樹駒脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法，有效解決一般實驗方案中0.1 %Triton-100進行細胞通透時造成的大量脂肪細胞破碎，以及離心轉速對固定的脂肪細胞造成的破碎的問題，成功制作出符合流式上機要求的脂肪細胞樣品。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案予以解決:
[0008]—種中緬樹駒脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0009](I)動物斷頸處死后，分別取下樹駒肩胛、耳后、腋下褐色脂肪組織，與腹部大網(wǎng)膜、腹股溝白色脂肪組織，隨后泡在磷酸緩沖液(phosphate buffer solut1n，PBS)中，將組織上沾著的毛洗掉；
[0010](2)將組織置于2mL的離心管中，加ImL 0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪將組織剪碎，約Imm3大小，將剪碎的組織塊轉移至15mL離心管中，胰酶補至4mL，放入37°C水浴鍋中溫浴，每隔1min搖晃一次，顯微鏡下觀察組織塊消化成單細胞的程度，共50-70分鐘;若樣品較為粘稠，100rpm離心1min仍不能離下沉淀，則補PBS至1mL離心，1500rpm，lOmin，棄上清液，保留沉淀；
[0011](3)將步驟(2)中留取的沉淀用1mL PBS重懸一下，將大的組織塊剔除，離心100rpm, 1min，棄上清液，留少量I3BS將松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL離心管中，血細胞經(jīng)過離心后貼壁較牢，因此可將血細胞剔除，重復用PBS洗一次；
[0012](4)4%預冷的多聚甲醛將細胞重懸，4°C固定過夜，并將固定過夜的細胞用移液槍重懸起來，剔除大的組織塊，離心100rpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀；
[0013](5)將步驟(4)留取的沉淀用ImL PBS重懸，離心，lOOOrpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀；
[0014](6)在步驟(5)留取的沉淀中加Im L含0.05%的Tween細胞打孔劑，將細胞重懸，打孔30min;
[0015](7)離心800rpm，10min，棄上清液，保留沉淀，并用I3BS洗一遍細胞，加50-100yL的PBS混勻細胞，加入適量的UCPl—抗，室溫孵育40min;
[0016](8)加 PBS 至 ImL 混勾，離心 800rpm，lOmin，加 PBS 洗一遍；
[0017](9)按1:2000的比例加入二抗，避光，室溫孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至ImL，即可。
[0018]本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)技術方案中會對脂肪細胞造成大量損傷，使脂肪細胞大量破碎，而無法制作出合格的流式樣品。本發(fā)明方法制作的中緬樹駒脂肪組織流式樣品效果較好，且對冷馴化下中緬樹駒脂肪細胞進行對比分析，為細胞檢測技術提供方法依據(jù)。
【附圖說明】
[0019]以下結合附圖與【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0020]圖1為70%酒精固定對細胞散射光的影響，其中:A-0.1 % Tri ton-100通透，B-0.05% Tween 通透；
[0021 ] 圖2為4 %多聚甲醛固定對細胞散射光的影響，其中:A-0.I % Triton-100通透，B-0.05% Tween 通透；
[0022]圖3為冷馴化Od中緬樹駒脂肪細胞“典型”WAT流式分析圖；
[0023]圖4為冷馴化28d中緬樹駒脂肪細胞“典型”WAT流式分析圖；
[0024]圖5為冷馴化49d中緬樹駒脂肪細胞“典型”WAT流式分析圖；
[0025]圖6為冷馴化49d中緬樹駒脂肪細胞“典型”BAT流式分析圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于該實施例。
[0027]為順利制備中緬樹駒脂肪細胞流式樣品，首先選擇具有UCPl表達的褐色脂肪細胞進行樣本分析，并選取固定劑為70%酒精或4%多聚甲醛，打孔劑為0.1%Triton-100或0.05%Tween，進彳丁組合探討最佳方案。其中利用70%酒精進彳丁細胞固定后，再用0.1%Tri ton-100或0.05 % Tween進行細胞打孔，發(fā)現(xiàn)染色效果不好，基本沒有細胞被染上(參照圖1)。而利用4%多聚甲醛進行固定后，再用0.05%Tween進行打孔，發(fā)現(xiàn)其染色效果較好，約有70.40%的細胞被染色(參照圖2)。因此本發(fā)明方法利用4%多聚甲醛進行細胞固定，
0.05% Tween進行細胞打孔，制作中緬樹駆]脂肪細胞流式樣本。
[0028]實施例
[0029]實施例1白色脂肪細胞的流式分析
[0030]對照組中緬樹駒腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT顯示出單一的Rl群，且沒有UCPl表達(參照圖3)。冷馴化4周后，中緬樹駒腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT顯示出單一的Rl群，用UCPI抗體標記后，有5.70 %的細胞顯示為陽性。冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCPI表達陽性的細胞群(參照圖4)。冷馴化7周后，樹駒腹部大網(wǎng)膜、腹股溝“典型” WAT中出現(xiàn)了新的細胞群R2群。其中Rl群用UCPl抗體標記后，有69.64%的細胞顯示為陽性。冷馴化使WAT Rl中出現(xiàn)UCPl表達陽性的細胞群。冷馴化新生成的R2群用UCPl抗體標記后，有95.28%的細胞顯示為陽性。冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCPl表達陽性的細胞群(參照圖5)。
[0031 ]實施例2褐色脂肪細胞的流式分析
[0032 ] 冷馴化7周后，樹駒肩胛、耳后、腋下BAT中Rl群用UCPI抗體標記后，有67.82 %的細胞顯示為陽性。R2群用UCPl抗體標記后，有94.99%的細胞顯示為陽性。這說明冷馴化增加了樹駒BAT中UCPI的表達，BAT產熱活性增強(參照圖6)。
【主權項】
1.一種中緬樹駒脂肪細胞的流式細胞樣品制作方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)動物斷頸處死后，分別取下樹駒肩胛、耳后、腋下褐色脂肪組織，與腹部大網(wǎng)膜、腹股溝白色脂肪組織，隨后將其泡在PBS中，并將組織上沾著的毛洗掉； (2)將上述組織置于2mL的離心管中，加ImL0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪將組織剪碎，約Imm3大小，將剪碎的組織塊轉移至15mL離心管中，加入胰酶補至4mL，放入37 °C水浴鍋中溫浴，每隔1min搖晃一次，顯微鏡下觀察組織塊消化成單細胞的程度，共50-70分鐘;若樣品較為粘稠，100rpm離心1min仍不能離下沉淀，則補PBS至1mL離心，1500rpm，1min，棄上清液，保留沉淀； (3)將步驟(2)中留取的沉淀用1mLPBS重懸一下，將大的組織塊剔除，離心100rpm，1min，棄上清液，留少量PBS將松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL離心管中，將血細胞剔除，重復用PBS洗一次； (4)用4%預冷的多聚甲醛將上述細胞重懸，4°C固定過夜，并將固定過夜的細胞用移液槍重懸起來，剔除大的組織塊，離心100rpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀； (5)將步驟(4)留取的沉淀用ImLPBS重懸，離心，100rpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀； (6)在步驟(5)留取的沉淀中加ImL含0.05%的Tween細胞打孔劑，將細胞重懸，打孔30min； (7)離心800rpm，1min，棄上清液，保留沉淀，并用PBS洗一遍細胞，加50_100yL的PBS混勻細胞，加入適量的UCPl—抗，室溫孵育40min; (8)加PBS至ImL混勾，離心800rpm，1min，加PBS洗一遍； (9)按1:2000的比例加入二抗，避光，室溫孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至ImL，即可。
【文檔編號】G01N15/14GK105890942SQ201610189049
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月30日
【發(fā)明人】王政昆, 朱萬龍, 孫舒然, 高文榮
【申請人】云南師范大學