一種唾液中丙烯醛-dna加合物的測(cè)定方法
【專利摘要】一種唾液中丙烯醛?DNA加合物的測(cè)定方法，即α?Acr?dG和γ?Acr?dG的測(cè)定方法，包括采用OG?500唾液采集管收集唾液，對(duì)唾液進(jìn)行DNA提取，DNA溶液進(jìn)行酶水解并依次加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)和DNA水解酶。水解液經(jīng)Strata?X小柱固相萃取，收集洗脫液，室溫下氮吹至干，復(fù)溶于100μL的30%甲醇水溶液，引入LC?MS/MS系統(tǒng)分析，可準(zhǔn)確檢測(cè)出α?Acr?dG和γ?Acr?dG的含量水平。本發(fā)明采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過(guò)程中引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性、準(zhǔn)確性和靈敏度。通過(guò)色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了目標(biāo)物的分離度。
【專利說(shuō)明】
一種唾液中丙烯醛-DN A加合物的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明屬于唾液樣本的理化檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及唾液DNA中a-Acr-dG和y -Acr-dG加合物的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)測(cè)定 唾液中主要丙烯醛-DNA加合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙烯醛是一種活潑的a，不飽和醛，廣泛存在于環(huán)境基質(zhì)中，主要產(chǎn)生于有機(jī)物 的不完全燃燒，如工業(yè)廢氣、卷煙煙氣、機(jī)動(dòng)車尾氣和烹飪油煙等。丙烯醛具有兩個(gè)親電基 團(tuán)，不需要經(jīng)過(guò)機(jī)體的代謝就能與體內(nèi)親核物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，如DNA中的堿基，產(chǎn)生DNA加合 物。研究最多的為丙烯醛與鳥(niǎo)嘌呤的加合(Acr-dG)，g卩6-羥基-1，N 2-丙醇_2'_鳥(niǎo)嘌呤(a-Acr-dG)和8-羥基-1，N2-丙醇-2'-鳥(niǎo)嘌呤（y -Acr-dG)。y -Acr-dG是主要的結(jié)構(gòu)形式，含量 高于a-Acr-dG，兩者都可引起基因突變，以G-T突變?yōu)橹?a-Acr-dG突變概率高于y -Acr-dG)〇
[0003] 唾液是一種非侵入式的樣本采集方式，對(duì)受試者不造成影響樣本易獲得，是現(xiàn)成 可用的DNA來(lái)源?？谇皇菬煔獾扔泻Τ煞种苯颖┞兜陌衅鞴?，相關(guān)研究表明唾液中DNA的損 傷與口腔癌相關(guān)。唾液中較豐富的細(xì)胞類型為口腔上皮細(xì)胞與白細(xì)胞，因其生命周期較短， 唾液中DNA加合物的含量更加能顯示致癌物的近期暴露情況，唾液在檢測(cè)卷煙和食品致癌 物產(chǎn)生的DNA加合物方面具有很大的應(yīng)用前景。
[0004] 目前，關(guān)于DNA加合物的分析檢測(cè)方法報(bào)道的較多，主要有32P-后標(biāo)記技術(shù)、酶聯(lián)免 疫技術(shù)(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC-UV)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)。其中 LC-MS/MS由于其較高的靈敏度和選擇性被廣泛應(yīng)用于DNA加合物的檢測(cè)分析。目前，在唾液 中a-Acr-dG和y -Acr-dG的同時(shí)分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 技術(shù)建立的唾液中丙烯醛-DNA加合物(a-Acr-dG和y-Acr-dG)的測(cè)定方法。該方法具有準(zhǔn) 確、靈敏度高等特點(diǎn)，可用于唾液DNA中丙烯醛-DNA加合物的定性定量分析。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的： 一種唾液中丙稀醛-DNA加合物的測(cè)定方法，即a-Acr-dG和y -Acr-dG的測(cè)定方法，包括 以下具體步驟： a、唾液采集:用Oragene ? DNA唾液采集器(0G-500)對(duì)人體唾液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化采集。
[0007] b、唾液DNA的提?。篛ragene唾液混合液于50 °C水浴孵育至少lh后，加入Oragene 凈化液，渦旋振蕩，冰浴孵育10 min;于室溫下離心;移取上層清液于一新的微量離心管中， 加入純乙醇，輕輕震蕩數(shù)秒;靜置使DNA分子完全沉淀，離心并去上清液;加入70%的乙醇水 溶液清洗DNA團(tuán)塊。用超純水復(fù)溶DNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測(cè) DNA的含量，對(duì)于雙鏈DNA-個(gè)吸收單位相當(dāng)于50 yg/mL。
[0008] c、DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2緩沖液(pH=7)中，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo)，加入30U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h， 隨后加入0.008U磷酸二酯酶I和15U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h。水解液經(jīng)Strata-X固 相萃取，收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100此30%甲醇水溶液，即為樣品待測(cè)液。此過(guò)程 的目的是為了使雙鏈DNA酶解成單核苷酸狀態(tài)，通過(guò)固相萃取和氮吹濃縮純化分離并富集 所需的DNA加合物。所述混合內(nèi)標(biāo)為10 ng/mL的[15N5]a-Acr_dG和[15N5] y-Acr-dG。
[0009] d、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇分別配制不同濃度的丙烯醛-DNA加合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液。
[0010] e、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶 液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰 面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。
[0011] 色譜條件：選取Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色譜柱（4 ? 6 X 150 mm，3 ym)，流動(dòng)相體系選取A: 0.01%甲酸甲醇和B: 10 mM乙酸銨水溶液，洗脫條件為梯度洗 脫：0-2 min:25% A，2-17 min:35% A，17-25 min:25% A;流速為0.38 mL/min。分析時(shí)間為 25 min，進(jìn)樣量為5 yL。
[0012] 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V， 離子源溫度：550°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi，干燥氣為75 psi，碰撞氣為9 口81，射入電壓：10￥，碰撞能：96￥，駐留時(shí)間：10〇1118 (^(^-(16的定量離子對(duì)為324.3/ 208.2，定性離子對(duì)為324.3/190.1，內(nèi)標(biāo)[15N 5]Acr-dG的離子對(duì)329.2/213.2。
[0013]本發(fā)明方法的線性范圍和檢出限： 將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS/MS，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)。 〇-八(^-(16和丫-八(^-(16標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)為0.02,0.05,0.1，0.2,0.3,0.5，1.0和2.0 1^/1111，目 標(biāo)物的線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。利用加標(biāo)稀釋得到方法的定量限和檢出限，目標(biāo) 峰十倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，三倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限。分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 及定量限和檢出限見(jiàn)表1。
[0014] 表1目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及L0D和L0Q
本發(fā)明方法加標(biāo)回收率和重復(fù)性： 采取唾液DNA樣本中加標(biāo)的方法獲得方法的加標(biāo)回收率，總共選取了三個(gè)添加水平，每 個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定3次，得到的方法的回收率和重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表2。目標(biāo)物的回收率在 95.3%-110.7%之間，RSD小于4%，證明方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性結(jié)果較好。
[0015] 表2分析物的加標(biāo)回收率和重復(fù)性
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對(duì)唾液中丙烯醛-DNA加合物的 色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)LC -MS/MS的相關(guān)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明 方法具有如下優(yōu)良效果： ①與傳統(tǒng)的液相色譜方法比較，由于選取了串聯(lián)質(zhì)譜，使得方法的選擇性和靈敏度提 高，更有利于唾液中低含量的丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定。
[0016] ②本方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0017] ③本發(fā)明方法采用穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)定量分析物可以減少樣品前處理過(guò)程中 引起的誤差，串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準(zhǔn)確性和靈敏度。通過(guò)色譜柱以及 洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過(guò)程，縮短了色譜分析的時(shí)間，減少了有機(jī) 溶劑的消耗量。
[0018] ④本方法采用Oragene ? DNA唾液采集器(0G-500)對(duì)人體唾液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化采集， DNA的提取量較多。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1丙烯醛-DNA加合物的總離子流圖。
[0020]圖2實(shí)際唾液樣本中丙烯醛-DNA加合物及其內(nèi)標(biāo)的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)例做進(jìn)一步描述，但并不是限制本發(fā)明。
[0022] 一種唾液中丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其測(cè)試過(guò)程是用0G-500唾液采集管收 集唾液，對(duì)唾液進(jìn)行DNA的提取，DNA溶液進(jìn)行酶水解并依次加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)和DNA水解 酶。水解液經(jīng)Strata-X小柱固相萃取，收集洗脫液，室溫下氮吹至干，復(fù)溶于100此的30%甲 醇水溶液，引入LC-MS/MS系統(tǒng)分析。
[0023]實(shí)例 1: 1.儀器與試劑： AB SCIEX三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)加州應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Agilent 1200高效 液相色譜(美國(guó)安捷倫公司），NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛科技公司），恒 溫培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛科技公司），氮?dú)鉂饪s干燥儀(瑞典拜泰齊公司），Milli-Q水純化系統(tǒng) (德國(guó)默克集團(tuán)），Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)采集與處理軟件。
[0024]脫氧核糖核酸酶I、堿性磷酸酶（美國(guó)紐英倫生物技術(shù)公司），磷酸二酯酶I、乙酸 銨、甲酸、和小牛胸腺DNA(美國(guó)西格瑪公司），甲醇(韓國(guó)德山試劑公司），Strata-X聚合物小 柱（33 ym，30 mg/lmL，廣東菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司），0ragene.DNA唾液采集器(0G- 500,加拿大 DNA Genotek公司）。標(biāo)準(zhǔn)品a-Acr-dG、y-Acr_dG和內(nèi)標(biāo)物[15N5]a-Acr_dG、 [15N5] y-Acr-dG。試劑均為色譜純。
[0025] 2 ?樣品處理： 唾液采集:用Oragene ? DNA唾液采集器(0G-500)對(duì)人體唾液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化采集。
[0026] 唾液DNA的提取:Oragene唾液混合液于50 °C水浴孵育至少lh后，加入Oragene凈 化液，渦旋振蕩，冰浴孵育10 min;于室溫下離心;移取上層清液于一新的微量離心管中，加 入純乙醇，輕輕震蕩數(shù)秒;靜置使DNA分子完全沉淀，離心并去上清液;加入70%的乙醇水溶 液清洗DNA團(tuán)塊。用超純水復(fù)溶DNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測(cè)DNA 的含量，對(duì)于雙鏈DNA-個(gè)吸收單位(0D)相當(dāng)于50 yg/mL。
[0027] DNA的酶水解及純化富集：將上述DNA溶于500 yL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2 緩沖液(pH=7)中，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo);加入30U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，隨后加 入0.008U磷酸二酯酶I和15U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h。水解液經(jīng)Strata-X固相萃 取，收集洗脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100此30%甲醇水溶液，即為樣品待測(cè)液。所述混合內(nèi) 標(biāo)為 10 ng/mL的[15N5]a-Acr_dG和[15N5]y-Acr_dG。
[0028] 3.測(cè)定方法:吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和前處理之后的唾液DNA樣品各5 yL，注入 LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分離分析，測(cè)得樣本中丙烯醛-DNA加合物的含量。
[0029]實(shí)例2:如實(shí)施例1所述，利用本研究建立的方法對(duì)5個(gè)唾液樣本中丙烯醛-DNA加合 物進(jìn)行了檢測(cè)(每個(gè)樣本平行檢測(cè)三次）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和峰面積計(jì)算獲得各個(gè)樣品中DNA 加合物的濃度，根據(jù)公式：
計(jì)算 獲得各個(gè)樣品中DNA加合物相對(duì)于核苷酸的含量，結(jié)果乘以108換算成DNA加合物個(gè)數(shù)/108個(gè) 核苷酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
[0030]表3唾液樣本中丙烯醛-DNA加合物的含量
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種唾液中丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定方法，即唾液中6-羥基-I，N2-丙醇-2'-鳥(niǎo)嘌呤 (α-Acr-dG)和8-羥基-1，N 2-丙醇-2'-鳥(niǎo)嘌呤（γ-Acr-dG)的測(cè)定方法，其特征在于:包括以 下具體步驟： a、 唾液采集:用Oragene · DNA唾液采集器(0G-500)對(duì)人體唾液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化采集； b、 唾液DNA的提取:Oragene唾液混合液于50°C水浴孵育至少Ih后，加入Oragene凈化 液，渦旋振蕩，冰浴孵育10 min;于室溫下離心;移取上層清液于一新的微量離心管中，加入 純乙醇，輕輕震蕩數(shù)秒;靜置使DNA分子完全沉淀，離心并去上清液;加入70%的乙醇水溶液 清洗DNA團(tuán)塊；用超純水復(fù)溶DNA;用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)在260nm處檢測(cè)DNA的 含量，對(duì)于雙鏈DNA-個(gè)吸收單位(OD)相當(dāng)于50 yg/mL; (3、0嫩的酶水解及純化富集：將上述0嫩溶于500以1^的10 111]\11^8-!1(：1/5 111]\11%(：12緩 沖液中，加入20 yL混合內(nèi)標(biāo);添加30U脫氧核糖核酸酶I，在37°C中孵育2h，隨后加入0.008U 磷酸二酯酶I和15U堿性磷酸酶在37°C中繼續(xù)孵育2h;水解液經(jīng)Strata-X固相萃取，收集洗 脫液液氮吹至干，復(fù)溶于100 yL 30%甲醇水溶液，即為樣品待測(cè)液； d、 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：用甲醇配制不同濃度的丙烯醛-DNA加合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； e、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定，吸取配制好的不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注 入LC-MS/MS系統(tǒng)，得到線性回歸方程，對(duì)樣品待測(cè)液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的 比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測(cè)液中分析物的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液中丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其特征在于：步驟c中 所述的混合內(nèi)標(biāo)為 10 ng/mL的[15N5]a-Acr_dG和[15地]y-Acr-dG。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液中丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其特征在于：步驟e中 選取Thermo Acclaim? Polar Advantage II C18 色譜柱，規(guī)格4.6X 150 mm，3 μπι，流動(dòng)相 體系選取A: 0.01%甲酸甲醇和B: 10 mM乙酸銨水溶液，梯度洗脫，分析時(shí)間為25 min，進(jìn)樣量 為5 μι。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的唾液中丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其特征在于:梯度洗脫 程序：0-2 min:25% A，2-17 min:35% A，17-25 min:25% A;流速為0.38 mL/min;流速為 0.38 mL/min〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的唾液中丙烯醛-DNA加合物的測(cè)定方法，其特征在于：步驟e中 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器的條件：電噴霧離子源ESI，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描方式；噴霧電壓：5500 V，離子源溫度:550°C，氣簾氣的量為20 psi，霧化氣為70 psi，干燥氣為75 psi，碰撞氣為9 口81，射入電壓：10￥，碰撞能：9 6￥，駐留時(shí)間：10〇1118^(^-(16的定量離子對(duì)為324.3/ 208.2，定性離子對(duì)為324.3/190.1，內(nèi)標(biāo)[ 15N5]Acr-dG的離子對(duì)329.2/213.2。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK105911167SQ201610227444
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月13日
【發(fā)明人】胡清源, 陳歡, 侯宏衛(wèi), 劉魯娟, 張小濤, 朱欣潮, 張森
【申請(qǐng)人】國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心