一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，包括脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后用hoechst33258工作液對(duì)細(xì)胞核染色，測(cè)定吸光度值；胞核染色后用PBS清洗，用尼羅紅工作液對(duì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行染色，測(cè)定吸光度值；定義一個(gè)新的用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值：校正尼羅紅OD值＝尼羅紅OD值/hoechst33258的OD值，用于反應(yīng)單位細(xì)胞分化程度；在熒光顯微鏡下對(duì)胞核和脂滴進(jìn)行觀察、拍照，并用Image?Pro Plus軟件merge胞核和脂滴圖片，用于評(píng)估脂肪細(xì)胞分化程度。本發(fā)明使用細(xì)胞總數(shù)對(duì)尼羅紅OD值進(jìn)行校正，消除由于細(xì)胞數(shù)目不同或細(xì)胞不均帶來(lái)的誤差；操作方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、雜質(zhì)少。
【專利說(shuō)明】
一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 研究動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化機(jī)制對(duì)于人類脂肪代謝紊亂性疾病治療具有重要意 義。在體外，動(dòng)物前脂肪細(xì)胞可以經(jīng)雞尾酒法(胰島素、地塞米松、IBMX)誘導(dǎo)分化最終形成 成熟脂肪細(xì)胞，這一過(guò)程中，細(xì)胞胞質(zhì)中甘油三脂不斷合成并逐漸積聚形成圓形脂滴。通過(guò) 脂滴的數(shù)量和積聚程度可以評(píng)估前體脂肪細(xì)胞分化程度。目前，一般使用親脂染料染色并 萃取檢測(cè)吸光度的方法對(duì)成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴進(jìn)行定量和定性。油紅〇可以將成熟脂肪 細(xì)胞中的脂滴染成紅色，同時(shí)，用異丙醇萃取后檢測(cè)吸光度可以對(duì)甘油三酯的多少進(jìn)行量 化。因此，一直以來(lái)油紅0染色被認(rèn)為是一種經(jīng)典的脂滴染色方法。但隨著細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)的 快速發(fā)展，實(shí)驗(yàn)精度的要求也越來(lái)越高，經(jīng)典的油紅〇染色法也暴露出了自身的一些缺陷， 如:①染色時(shí)細(xì)胞需要固定和反復(fù)清洗，時(shí)間長(zhǎng)且易破壞細(xì)胞層;②油紅〇工作液在使用前 需要過(guò)濾，否則染色后會(huì)出現(xiàn)油紅殘?jiān)绊懹^察;③染色后不易將多余染液洗盡，導(dǎo)致異 丙醇萃取后檢測(cè)出來(lái)的吸光度偏高；④飽和油紅〇液體保存太久顏色會(huì)變得深黑，影響使 用;⑤在長(zhǎng)時(shí)間操作過(guò)程中，揮發(fā)的異丙醇會(huì)影響實(shí)驗(yàn)者的健康。另外，用熒光染料尼羅紅 染色檢測(cè)吸光度值也可以用于定量脂滴的數(shù)量，相較油紅〇萃取法更加方便可行。尼羅紅或 油紅0測(cè)定的吸光度值反應(yīng)的是細(xì)胞總體的分化程度，適用于細(xì)胞數(shù)目相同的情況，然而實(shí) 際實(shí)驗(yàn)中，很難保證在分化成熟后不同實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞數(shù)目仍然相同，吸光度值高可能是分 化程度高，也可能是細(xì)胞數(shù)目多而分化程度一般，只能說(shuō)明甘油三脂總體含量多。
[0003] 因此，僅僅通過(guò)吸光度值來(lái)判斷細(xì)胞分化程度的高低是不夠全面的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，旨在解 決通過(guò)吸光度值來(lái)判斷細(xì)胞分化程度的高低是不夠全面的問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，所述評(píng) 估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法定義用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值:校 正尼羅紅0D值=尼羅紅0D值/hoechst33258的0D值，用于反應(yīng)單位細(xì)胞分化程度。
[0006] 進(jìn)一步，所述定義用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值之前需要：
[0007] 步驟一，脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后用h〇eChst33258工作液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，并測(cè)定 吸光度值；
[0008] 步驟二，胞核染色后用PBS清洗，再用尼羅紅工作液對(duì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行染色，并測(cè)定 吸光度值。
[0009] 進(jìn)一步包括：
[0010] 第一步，前脂肪細(xì)胞分化，將孔板從培養(yǎng)箱取出，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗兩次；
[0011] 第二步，清洗后，每孔加入對(duì)應(yīng)體積的h〇echst33258工作液，20-25°C避光孵育 lOmin；
[0012] 第三步，棄染液，用PBS輕緩清洗一次，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/ 發(fā)射波長(zhǎng)= 352nm/461nm，檢測(cè)熒光強(qiáng)度；
[0013] 第四步，棄去染液并用PBS清洗兩次，每孔加入對(duì)應(yīng)量的PBS和尼羅紅工作液，20-25°C避光孵育5min;
[0014] 第五步，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)=485nm/572nm，檢測(cè) 熒光強(qiáng)度；
[0015] 第六步，將孔板置于熒光顯微鏡，在同一視野下，用藍(lán)色和紅色光道對(duì)胞核和脂滴 進(jìn)行觀察并拍照。
[0016] 進(jìn)一步，所述定義用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值之后需要:在熒光顯微 鏡下對(duì)胞核和脂滴進(jìn)行觀察、拍照，并用Image-Pro Plus軟件merge胞核和脂滴圖片，用于 評(píng)估脂肪細(xì)胞分化程度。
[0017] 本發(fā)明提供的評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，本發(fā)明定義一個(gè)新的 用于評(píng)估脂肪細(xì)胞分化程度的數(shù)值:校正尼羅紅0D值=尼羅紅0D值/hoechst 33258的0D 值。尼羅紅0D值反應(yīng)總的甘油三脂多少，Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光 染料，hoechst 33258的0D值反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。校正尼羅紅0D值排除分化成熟后試驗(yàn)組間細(xì) 胞數(shù)目的差異，用于反應(yīng)單位細(xì)胞分化程度。同時(shí)，使用Image-Pro Plus軟件merge同一視 野的胞核和脂滴圖片，比傳統(tǒng)的油紅〇染色圖片更能夠直觀觀察脂滴分布和細(xì)胞分布，并結(jié) 合校正尼羅紅0D值來(lái)評(píng)估脂肪細(xì)胞分化程度。
[0018] 本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單易行、雜質(zhì)少，更易于用戶觀察，可以在短時(shí) 間內(nèi)對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化程度進(jìn)行精確評(píng)估。因此，此發(fā)明更適用于當(dāng)前脂肪細(xì)胞分化的 工作。本發(fā)明提供一種快速精確評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法。該方法操作 簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確度高、耗時(shí)少、重復(fù)性好，能夠有效反應(yīng)脂肪細(xì)胞分化程度，為前體脂肪細(xì)胞分化 研究提供有效的檢測(cè)方法。
[0019] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0020] 1)本發(fā)明使用hoechst33258染液。hoechst33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒 光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低，可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。比經(jīng)典的蘇木精染色 更加方便快捷，容易操作，且雜質(zhì)少，便于觀察。同時(shí)用hoechst33258染色后可以測(cè)定吸光 度值，直接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目。
[0021] 2)本發(fā)明使用尼羅紅工作液對(duì)脂滴進(jìn)行染色。與經(jīng)典的油紅0染色法相比，尼羅紅 染色不用固定細(xì)胞、且雜質(zhì)少、染色時(shí)間短，同時(shí)使用尼羅紅的0D值可以避免油紅0萃取法 未清洗干凈或萃取不夠帶來(lái)的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，方便快捷，準(zhǔn)確度較高。
[0022] 3)本發(fā)明定義一個(gè)新的用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值:校正尼羅紅0D值 =尼羅紅0D值/hoechst33258的0D值。尼羅紅0D值反應(yīng)總的甘油三脂多少，Hoechst33258 是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，hoechst 33258的0D值反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。校正尼羅 紅0D值排除分化成熟后試驗(yàn)組間細(xì)胞數(shù)目的差異，用于反應(yīng)單位細(xì)胞分化程度。與傳統(tǒng)的 油紅0萃取法和測(cè)定總尼羅紅0D值法相比，使用hoechst33258的0D值校正可以排除分化后 細(xì)胞數(shù)目的差異，避免假陰性和假陽(yáng)性的干擾，更能夠客觀反應(yīng)脂肪細(xì)胞真實(shí)的分化程度。
[0023] 4)本發(fā)明使用Image-Pro Plus軟件merge同一視野的胞核和脂滴圖片，比傳統(tǒng)的 油紅0染色圖片更能夠直觀觀察脂滴分布和細(xì)胞分布。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法流程圖。
[0025] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同時(shí)間點(diǎn)3T3-L1誘導(dǎo)分化尼羅紅0D值示意圖。
[0026]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同時(shí)間點(diǎn)3T3-L1誘導(dǎo)分化校正尼羅紅0D值示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0028] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0029] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法包括以 下步驟：
[0030] S101:前脂肪細(xì)胞分化到實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間點(diǎn)后，將孔板取出培養(yǎng)箱，小心吸去培養(yǎng) 液，PBS清洗兩次，注意不要損壞底層細(xì)胞；
[0031] S102:清洗后，每孔加入相應(yīng)體積的hoechst33258工作液(見表1)，室溫(20-25°C) 避光孵育5min;
[0032] S103:棄染液，用PBS輕緩清洗一次，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā) 射波長(zhǎng)= 352nm/461nm，檢測(cè)熒光強(qiáng)度；
[0033] S104:棄去多余染液并用roS輕緩清洗兩次，每孔加入對(duì)應(yīng)量的roS和尼羅紅工作 液(見表1)，室溫(20-25°C)避光孵育5min;
[0034] S105:將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)= 485nm/572nm，檢測(cè)熒 光強(qiáng)度；
[0035] S106:將孔板置于熒光顯微鏡下，在同一視野下，用藍(lán)色和紅色光道對(duì)胞核和脂滴 進(jìn)行觀察并拍照；
[0036] S107:定義一個(gè)新的用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值:校正尼羅紅0D值= 尼羅紅0D值/hoechst33258的0D值，用于反應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)組之間單位細(xì)胞分化程度；
[0037] S108:使用Image-Pro Plus軟件merge胞核和脂滴圖片，并結(jié)合校正尼羅紅0D值來(lái) 評(píng)估脂肪細(xì)胞分化程度。
[0038]表1.孔板對(duì)應(yīng)試劑添加量
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。
[0041 ] 實(shí)施例1:
[0042]用雞尾酒法誘導(dǎo)小鼠前體脂肪細(xì)胞系3T3-L1，誘導(dǎo)分化后2、4、6、8、10天用于實(shí) 驗(yàn)，用h〇echst33258和尼羅紅染色，并分別檢測(cè)其吸光度值。詳細(xì)步驟如下：
[0043]步驟1: 3T3-L1于96孔板中誘導(dǎo)分化到時(shí)間點(diǎn)，從培養(yǎng)箱中取出孔板，小心吸去培 養(yǎng)液，注意槍頭不要觸及底層細(xì)胞；
[0044] 步驟2:roS清洗兩次（200ul/孔），動(dòng)作盡量輕緩，清洗后，每孔加入h〇echst33258 工作液，室溫(20-25°〇避光孵育511^11;
[0045]步驟3:棄染液，用PBS輕緩清洗一次，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā) 射波長(zhǎng)=352nm/461nm，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0046] 步驟4:棄去染液并用roS清洗兩次，每孔加入200ulPBS，加入5ul尼羅紅工作液，室 溫（20-25°〇避光孵育511^11;
[0047]步驟5:孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置485nm/572nm波長(zhǎng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度;并計(jì)算校正 尼羅紅0D值；
[0048] 步驟6:將孔板置于熒光顯微鏡，在同一視野下，用藍(lán)色和紅色光道對(duì)胞核和脂滴 進(jìn)行觀察并拍照。
[0049] 從如圖3的結(jié)果中，可以清晰地觀察到各個(gè)時(shí)間點(diǎn)3T3-L1誘導(dǎo)分化脂滴分布及細(xì) 胞密度分布，從merge以后的圖片中觀察更加直觀。誘導(dǎo)分化6天、8天、10天，3T3-L1細(xì)胞中 脂滴呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。檢測(cè)吸光度后可見，總尼羅紅0D值在第2天比第4天高，第8天比第10天 高，而校正后尼羅紅0D值可見，第2天比第4天低，第8天比第10天低，細(xì)胞平均分化程度隨時(shí) 間均勻平緩增加，更加符合前體脂肪細(xì)胞分化規(guī)律，而僅僅通過(guò)尼羅紅0D值則不能全面反 應(yīng)細(xì)胞分化程度，因?yàn)樵诩?xì)胞分化后每個(gè)孔之間會(huì)存在生長(zhǎng)速度不同，營(yíng)養(yǎng)供給差異，細(xì)胞 狀態(tài)也不一樣，因此，通過(guò)校正尼羅紅0D值可以規(guī)避掉這一缺陷，消除由于細(xì)胞數(shù)目不同或 細(xì)胞不均帶來(lái)的誤差。本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單易行、雜質(zhì)少，更易于用戶觀 察，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)前體脂肪細(xì)胞平均分化程度進(jìn)行精確評(píng)估。因此，本發(fā)明更適用于當(dāng) 前脂肪細(xì)胞分化的研究工作。
[0050] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，其特征在于，所述評(píng)估動(dòng)物前體 脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法定義用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值:校正尼羅紅0D 值=尼羅紅0D值/hoechst33258的0D值，用于反應(yīng)單位細(xì)胞分化程度。2. 如權(quán)利要求1所述的評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，其特征在于，所述 定義用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值之前需要： 步驟一，脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后用h〇echst33258工作液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，并測(cè)定吸光 度值； 步驟二，胞核染色后用PBS清洗，再用尼羅紅工作液對(duì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行染色，并測(cè)定吸光 度值。3. 如權(quán)利要求2所述的評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，其特征在于，進(jìn)一 步包括： 第一步，前脂肪細(xì)胞分化，將孔板從培養(yǎng)箱取出，吸去培養(yǎng)液，PBS清洗兩次； 第二步，清洗后，每孔加入對(duì)應(yīng)體積的h〇echst33258工作液，20-25°C避光孵育lOmin; 第三步，棄染液，用PBS輕緩清洗一次，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射 波長(zhǎng)= 352nm/461nm，檢測(cè)熒光強(qiáng)度； 第四步，棄去染液并用PBS清洗兩次，每孔加入對(duì)應(yīng)量的roS和尼羅紅工作液，20-25°C 避光孵育5min; 第五步，將孔板置于熒光酶標(biāo)儀中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)= 485nm/572nm，檢測(cè)熒光 強(qiáng)度； 第六步，將孔板置于熒光顯微鏡，在同一視野下，用藍(lán)色和紅色光道對(duì)胞核和脂滴進(jìn)行 觀察并拍照。4. 如權(quán)利要求1所述的評(píng)估動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞分化程度的檢測(cè)方法，其特征在于，所述 定義用于評(píng)估脂肪細(xì)胞平均分化程度的數(shù)值之后需要:在熒光顯微鏡下對(duì)胞核和脂滴進(jìn)行 觀察、拍照，并用Image-Pro Plus軟件merge胞核和脂滴圖片，用于評(píng)估脂肪細(xì)胞分化程度。
【文檔編號(hào)】G01N15/10GK106092862SQ201610398881
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】張進(jìn)威, 馬繼登, 李明洲, 李學(xué)偉, 龍科任
【申請(qǐng)人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)