檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，所述微流控芯片包括頂板(1)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(1)上的氣泵(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次相連；底板(2)上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)依次連接，底板(2)上檢測區(qū)(8)通過液體釋放通道(16)與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)連接。
【專利說明】
檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)NT-proBNP高靈敏定量檢測的方法，特別公開了一種檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了心腦血管疾病尤其是心力衰竭中NT-proBNP的快速準(zhǔn)確定量檢測，可廣泛用于基層醫(yī)院和診所，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前用于臨床檢測的BNP有NT-proBNP和BNP兩種。雖兩者有相同生物學(xué)來源，但生物學(xué)效應(yīng)和臨床意義不完全相同。心肌細(xì)胞受刺激后，產(chǎn)生初始基因產(chǎn)物前BNP前體，該肽的一個(gè)26氨基信號(hào)肽被立即切除，生成BNP前體(proBNP，108個(gè)氨基酸)，前體在內(nèi)切酶作用下裂解為無生物活性的NT-proBNP(76個(gè)氨基酸)和有活性的BNP(32個(gè)氨基酸hBNP清除主要通過與清除受體結(jié)合，半衰期短(22min)，體外穩(wěn)定性差;而NT-proBNP則主要由腎小球?yàn)V過，半衰期較長(120min)，體外穩(wěn)定性強(qiáng)。
[0003 ] BNP和NT-Prο BNP已廣泛用于臨床實(shí)踐，成為心衰診斷的生物標(biāo)志物。測定NT-proBNP主要方法有放射免疫法、電化學(xué)發(fā)光法和膠體金法等。放射免疫法存在放射線輻射和污染等問題。電化學(xué)發(fā)光法較放射免疫法更為敏感、準(zhǔn)確，精密，但成本昂貴，需要配套化學(xué)發(fā)光儀才能檢測。膠體金免疫層析法雖簡便快速，但靈敏度低、重復(fù)性差。
[0004]中國專利200720140928.5，公布了一種氮末端腦鈉肽前體/C-反應(yīng)蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，利用快速免疫層析法，定性檢測臨床標(biāo)本中NT-proBNP/C-反應(yīng)蛋白/肌鈣蛋白
I。該法靈敏度低、線性范圍窄。中國專利201010241048.3公布了一種免疫層析試紙條的測試使用及應(yīng)用這種測試方法的NT-proBNP快速定量試劑。其采用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料作為生物標(biāo)記物，檢測NT-proBNP，但仍未解決試紙條重復(fù)性差的缺陷。
[0005]因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方法，具有巨大發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。與熒光和吸收光相比，化學(xué)發(fā)光沒有外來激發(fā)光源背景信號(hào)干擾，交叉干擾小，靈敏度高、線性范圍寬。微流控芯片技術(shù)把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，可完成全過程分析。
[0006]針對(duì)現(xiàn)有NT-proBNP檢測方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化學(xué)發(fā)光方法利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光和微流控技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)NT-proBNP準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對(duì)現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光配套儀器昂貴、檢測時(shí)間長的問題，提供一種檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，通過集成化芯片(把除測試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場樣本中NT-proBNP的快速、準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0009]—種檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括頂板(I)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(I)上的氣栗(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次相連;底板(2)上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)依次連接，底板(2)上檢測區(qū)(8)通過液體釋放通道(16)與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)連接;所述標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)和磁顆粒包被區(qū)(7)中存儲(chǔ)預(yù)封裝試劑;所述標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)中存儲(chǔ)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體溶液；所述磁顆粒包被區(qū)(7)包被磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體；
[0010]所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集。
[0011 ]具體地，所述酶標(biāo)記抗NT-proBNP抗體使用的酶包含過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)0
[0012]具體地，所述發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體使用的發(fā)光劑包含吖啶酯和吖啶磺酰胺。
[00?3] 具體地，所述磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體優(yōu)選的磁顆粒為超順磁性顆粒，顆粒尺寸為0.1?ΙΟμπι，磁感應(yīng)強(qiáng)度為500?30000高斯。
[0014]優(yōu)選地，所述磁顆粒為超順磁性顆粒，包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，顆粒尺寸為I?3μπι，磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000?8000高斯。
[0015]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐溫_20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl緩沖液。
[0016]本發(fā)明所述微流控芯片制備方法如下:
[0017]步驟I)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，這兩種抗體可相同或不同；
[0018]步驟2)將酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液放入頂板的存儲(chǔ)池中，密封，將磁顆粒標(biāo)記抗體溶液放入底板的包被區(qū)中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池中，密封，用膠帶(19和20)密封頂板和底板，并組裝成微流控芯片。
[0019]本發(fā)明提供的檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片是一種以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)氮末端腦鈉肽快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測的新方法。[°02°] 這種方法是將抗NT-proBNP抗體修飾酶，抗NT-proBNP抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測樣本中是否含有NT-ProBNP，并準(zhǔn)確分析其含量。
[0021]本發(fā)明中所述的發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于I年時(shí)應(yīng)分開，如圖3所示分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (24),通過預(yù)混合通道(25)混合均勻。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例采用過氧化氫酶。
[0022]本發(fā)明所述發(fā)光劑與發(fā)光基底液作用后，不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例采用吖啶酯。發(fā)光基底液包含H2O2溶液和堿性溶液，可合并成堿性H2O2溶液，注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)穩(wěn)定性不好時(shí)，H2O2溶液和堿性溶液應(yīng)分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A( 23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)，通過預(yù)混合通道(25)混合均勻，如圖3所不O
[0023]本發(fā)明采用的標(biāo)記方法包含化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將抗NT-proBNP抗體連接到酶/發(fā)光劑或磁顆粒表面，得到抗體標(biāo)記的酶/發(fā)光劑或抗體標(biāo)記的磁顆粒。
[0024]本發(fā)明的NT-proBNP抗體包含單克隆抗體和多克隆抗體。該抗體可與NT-proBNP結(jié)合(如雙抗體夾心法)。其中酶/發(fā)光劑標(biāo)記的抗體與磁顆粒標(biāo)記的抗體可以相同，也可以不同。
[0025]本發(fā)明的酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液和磁顆粒標(biāo)記抗體溶液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，且磁顆粒標(biāo)記抗體溶液還包含糖類。其中HRP標(biāo)記的配體，緩沖體系中不能含有NaN3; ALP標(biāo)記配體，緩沖體系不能是磷酸體系。
[0026]本發(fā)明的微流控芯片如圖1所示，包含頂板結(jié)構(gòu)(I)和底板結(jié)構(gòu)(2)，以膠帶(19和20)密封后，組裝形成微流控芯片。頂板和底板的成型材料為聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、環(huán)氧樹脂等，膠帶可為雙面膠或單面膠，其中雙面膠可用兩片單面膠替代。如圖1所示，頂板結(jié)構(gòu)由氣栗(3)、加樣口(4)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)、蓋子(11)、樣本填充區(qū)(12)和樣本混合區(qū)(13)組成。底板結(jié)構(gòu)由過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、檢測區(qū)(8)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(1)、清洗區(qū)(14)、廢液池(15)和液體釋放通道(16)。如圖2所示，在發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池區(qū)域，以及磁鐵滑軌區(qū)域，在頂板上需留出存儲(chǔ)池和磁鐵滑軌的讓位孔(分別為17和18)，在雙膠帶上應(yīng)留出存儲(chǔ)池和樣本混合液流入過濾區(qū)時(shí)的讓位孔(分別為21和22)。
[0027]本發(fā)明的存儲(chǔ)池為液體密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡膠、鋁箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可為同種材料組成，也可為多種材料組合而成。在物理擠壓下，存儲(chǔ)池可局部破裂，從而把密封的液體釋放出來。其中酶標(biāo)配體存儲(chǔ)池、清洗液存儲(chǔ)池、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池可采用相同或不同材料和方法制作。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，酶標(biāo)配體存儲(chǔ)池、清洗液存儲(chǔ)池、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池均采用塑料和彈性橡膠密封而成。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，酶標(biāo)配體存儲(chǔ)池采用塑料和彈性橡膠密封而成，而清洗液存儲(chǔ)池、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池采用高阻隔薄膜密封而成。
[0028]本發(fā)明的過濾區(qū)包含濾血膜，其中濾血膜可通過物理孔徑或生物/化學(xué)試劑使液體與細(xì)胞分離，實(shí)現(xiàn)血漿與紅細(xì)胞分離，血漿流到磁顆粒包被區(qū)，而紅細(xì)胞停留在濾血膜上，從而減少紅細(xì)胞對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。其中所述生物/化學(xué)試劑包含凝血?jiǎng)┑龋墒辜t細(xì)胞間連接，形成凝塊，增大尺寸，更容易被濾血膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻擋。
[0029]本發(fā)明的微流控芯片，當(dāng)存在發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)，應(yīng)在底板上增加發(fā)光基底液預(yù)混合通道(25)，該預(yù)混合通道可為蛇形通道或上下結(jié)構(gòu)混合通道，如圖3所示。
[0030]在一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)封入HRP標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，包被區(qū)包被磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體(與酶標(biāo)抗體不同)，以磁微粒酶促化學(xué)發(fā)光法檢測NT-proBNP。另一個(gè)實(shí)施例中，標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)封入吖啶酯標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，包被區(qū)包被磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體(與吖啶酯標(biāo)記抗體不同)，以磁微粒酶促化學(xué)發(fā)光法檢測NT-proBNP。
[0031]本發(fā)明的清洗液，用于清洗磁顆粒，去除非特異性吸附的NT-proBNP、酶或發(fā)光劑標(biāo)記物及其他影響檢測結(jié)果的物質(zhì)。清洗液主要包含緩沖體系、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，其中緩沖體系包含但不限于硼酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl和醋酸鹽等。清洗液pH 6.0?10.0，當(dāng)檢測樣本為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性時(shí)，pH范圍可放寬。其中蛋白質(zhì)包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙稀基卩比略燒酬等。
[0032]作為優(yōu)選，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，清洗液為包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300的pH7.0 Tris_HCl緩沖液。另一個(gè)實(shí)施例中，清洗液為牛血清白蛋白、吐溫20、曲拉通X-100和Proclin30(^9pH7.4磷酸鹽緩沖液。
[0033]本發(fā)明的樣本體積在10?500μ1，優(yōu)選20?ΙΟΟμΙ。作為優(yōu)選，在實(shí)施例中加樣體積為50μ1。
[0034]本發(fā)明的微流控芯片為快速檢測，檢測時(shí)間應(yīng)小于30分鐘，作為優(yōu)選，實(shí)施例中采用15分鐘。
[0035]本發(fā)明的抗體儀器包含擠壓氣栗和存儲(chǔ)池，磁鐵移動(dòng)，發(fā)光檢測系統(tǒng)等功能，應(yīng)可包含擠壓裝置、磁鐵及移動(dòng)裝置、檢測系統(tǒng)、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。
[0036]本發(fā)明所述微流控芯片的測試流程包括:
[0037]步驟I)將全血樣本滴入加樣口(4)后，微流控芯片放入配套儀器中，從標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)釋放酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，擠壓氣栗(3)使樣本經(jīng)樣本填充區(qū)(I 2)和酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體在樣本混合區(qū)(13)混合均勻，然后注入底板過濾區(qū)(6)；
[0038]步驟2)樣本經(jīng)過濾區(qū)后，溶解磁顆粒包被區(qū)(7)包被的磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，充分反應(yīng)后磁鐵收集磁顆粒，清洗液存儲(chǔ)池(9)釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，移至檢測區(qū)，發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)釋放發(fā)光基底液，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)NT-proBNP的定量檢測。
[0039]本發(fā)明可應(yīng)用于心血管疾病尤其是心力衰竭中NT-proBNP的定量檢測。
[0040]本發(fā)明的核心是采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)在微流控芯片實(shí)現(xiàn)NT-proBNP的快速、高靈敏度、準(zhǔn)確定量檢測。
[0041]微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動(dòng)完成分析全過程。
[0042]本發(fā)明在微流控芯片將檢測過程所需的所有試劑組分(酶標(biāo)抗體、磁顆粒標(biāo)記抗體、清洗液、發(fā)光基底液等)均集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并通過巧妙溝道設(shè)計(jì)，在配套儀器的操作下，實(shí)現(xiàn)微流控芯片的一鍵式檢測(只需按開始鍵就能實(shí)現(xiàn)檢測，無需復(fù)雜操作)，實(shí)現(xiàn)全血分離、免疫反應(yīng)、清洗分離、化學(xué)發(fā)光檢測，從而避免了現(xiàn)有微流控芯片中結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡單、檢測時(shí)操作復(fù)雜等不足和缺陷。還克服了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀只能進(jìn)行血清或血漿檢測，而不能對(duì)全血樣本進(jìn)行檢測的缺點(diǎn)。
[0043]由于磁顆粒易沉淀，傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀采用手工混合，并以持續(xù)振蕩維持磁顆粒的懸浮狀態(tài)，但微流控芯片內(nèi)磁顆?；炀僮麟y以在小型便攜儀器中實(shí)現(xiàn)。
[0044]本發(fā)明將磁顆粒包被、干燥于微流控芯片溝道中，并設(shè)計(jì)了磁鐵主動(dòng)驅(qū)動(dòng)磁顆粒(而傳統(tǒng)微流控芯片一般采用流體驅(qū)動(dòng)或電驅(qū)動(dòng))，從而使磁顆粒復(fù)溶，并在微流控芯片不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)免疫反應(yīng)、清洗、發(fā)光。此設(shè)計(jì)不僅解決了磁顆粒應(yīng)用于微流控芯片時(shí)易沉淀、重復(fù)性差等問題，還實(shí)現(xiàn)了更可控的免疫反應(yīng)和物理清洗，提高了靈敏度和重復(fù)性。其中磁鐵磁性和磁顆粒尺寸對(duì)檢測效果了明顯影響，本發(fā)明選擇磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500?30000高斯，優(yōu)選1000?8000高斯;磁顆粒尺寸為0.1?10μ??，優(yōu)選I?3μηι。
[0045]本發(fā)明中微流控芯片配套儀器與微流控芯片無液體接觸，無需要清洗的部件，避免了傳統(tǒng)大型化學(xué)發(fā)光儀需要攪拌或加樣、清洗等操作而產(chǎn)生的交叉干擾及污染。
[0046]所以本發(fā)明并非簡單疊加磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，而是通過液體密封設(shè)計(jì)、溝道設(shè)計(jì)，把檢測所需所有化學(xué)組分集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并以磁鐵主動(dòng)驅(qū)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)一鍵式的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測，從而在便攜配套儀器中實(shí)現(xiàn)NT-proBNP的快速、高靈敏度、準(zhǔn)確定量檢測。
[0047]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下:
[0048]I)本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光方法，具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。
[0049]2)本發(fā)明采用磁顆粒技術(shù)，具有磁富集功能，增強(qiáng)并放大信號(hào);并能利用磁鐵把磁顆粒轉(zhuǎn)移區(qū)域(如由包被區(qū)-清洗區(qū)-檢測區(qū))，減少樣本基質(zhì)的影響。
[0050]3)本發(fā)明采用微流控芯片技術(shù)，把樣本混合、反應(yīng)、分離和檢測集成在芯片上，并把反應(yīng)所需的所有試劑組分集成到芯片上。
[0051]4)本發(fā)明操作簡便，檢測時(shí)，只需加入樣本，蓋上蓋子，把芯片放入小型便攜配套儀器中即可。
[0052]5)本發(fā)明配套儀器是小型便攜儀器，儀器只與芯片發(fā)生物理接觸，芯片內(nèi)液體不與儀器接觸，不會(huì)污染儀器而產(chǎn)生交叉干擾。
【附圖說明】
[0053]圖1為微流控芯片主體結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為頂板，2為底板，3為氣栗，4為加樣口，5為標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池，6為過濾區(qū)，7為磁顆粒包被區(qū)，8為檢測區(qū)，9為清洗液存儲(chǔ)池，10為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池，11為蓋子，12為樣本填充區(qū)，13為樣本混合區(qū)，14為清洗區(qū)，15為廢液池，16為液體釋放通道，17為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(于頂板)，18為磁鐵滑軌讓位孔。
[0054]圖2為完整微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為頂板，2為底板，19為雙面膠帶，20為單面膠帶，21為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(于雙面膠帶)，22為混合液流入過濾區(qū)時(shí)的讓位孔。
[0055]圖3為雙發(fā)光基底液的微流控芯片底板結(jié)構(gòu)示意圖，其中23為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A，24為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B，25為預(yù)混合通道。
【具體實(shí)施方式】
[0056]本發(fā)明公開了一種檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0057]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0058]實(shí)施例1:酶促化學(xué)發(fā)光測定NT-proBNP
[0059](— )抗體標(biāo)記
[0060]取5yg HRP溶解于ImL蒸餾水中，再加入0.2mL0.1M新配Na14溶液，室溫避光反應(yīng)20min后，以ImM pH4.4醋酸鈉緩沖液透析純化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0，加入1yg抗NT-proBNP單抗，室溫避光反應(yīng)2h。加0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液，混勻，于4 °C反應(yīng)2h ο將上述溶液裝入透析袋，以0.15M pH7.4 PBS透析，4 °C過夜，得到HRP標(biāo)記NT-proBNP 抗體。
[0061 ] 向磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(尺寸為2μπΟ、1yg EDC和15yg NHS溶液和10?30yg抗NT-proBNP單抗(與HRP標(biāo)記的抗體不同)溶液，混合均勾并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體。
[0062](二)微流控芯片組裝
[0063]HRP標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液中含0.2%牛血清白蛋白、0.I %吐溫20和0.02%Proclin30(^tlpH7.4 Tris-HCl緩沖液;磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液為包含0.5 %牛血清白蛋白、I %葡萄糖、0.2 %吐溫20和0.02 %Procl in300的pH7.4 Tris_HCl緩沖液。
[0064]將HRP標(biāo)抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0065]清洗液為0.3 %牛血清白蛋白、0.2 %曲拉通X-100和0.02% Procl in300的pH7.0Tri s-HCl緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池。發(fā)光基底液分為HRP底物(魯米諾的雙氧水溶液)和堿性增強(qiáng)液(苯衍生物的堿性溶液)，分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)中，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板過濾區(qū)中，將存儲(chǔ)池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0066](三)樣本檢測
[0067]用正常人血楽作稀釋液，將NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、lOOOng/ml和5000ng/ml。
[0068]將50μ1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為6000高斯)中，儀器擠出HRP標(biāo)記單抗，并使樣本和HRP標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成HRP標(biāo)記單抗-NT-proBNP抗原-磁顆粒標(biāo)記單抗的三明治結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。清洗液存儲(chǔ)池釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光基底液釋放，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度?？倷z測時(shí)間15min。每個(gè)樣本分別用3個(gè)微流控芯片測定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0069]將50μ1全血樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中NT-proBNP濃度。
[0070]檢測原理為:當(dāng)全血加入微流控芯片后，全血先與HRP標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)后，混合了HRP標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有NT-proBNP，則形成HRP標(biāo)記抗體-NT-proBNP-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，再發(fā)光基底液作用下發(fā)光，儀器檢測系統(tǒng)測試發(fā)光信號(hào)。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血樣中NT-proBNP濃度。樣本中NT-proBNP含量越高，則發(fā)光信號(hào)越強(qiáng)。[°071 ]結(jié)果表明，其最低檢測限為1.0pg/ml，最低定量限為10pg/ml，定量檢測范圍為1.0?35000pg/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99 ；在檢測范圍內(nèi)，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng);且批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于10%?？蔀樾墓Ｐ乃ゼ膊≡\斷提供參考。
[0072]實(shí)施例2:直接化學(xué)發(fā)光測定NT-proBNP
[0073](一)抗體標(biāo)記
[0074]向磷酸緩沖液中加入適量活化的吖啶酯和10yg抗NT-proBNP單抗溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。透析后，得到吖啶酯標(biāo)記NT-proBNP抗體。
[0075]向Iml 1mM pH7.4磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(尺寸為Ιμπι)、1yg EDC和15ygNHS溶液和20yg鏈霉親和素，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。以磁鐵吸附富集，去除未反應(yīng)的鏈霉親和素，得到磁顆粒標(biāo)記鏈霉親和素。
[0076]將1yg抗NT-proBNP單抗加入5yL0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin溶液中，反應(yīng)I h。以超濾離心管純化，去除未反應(yīng)的生物素。得到生物素化抗NT-proBNP抗體。
[0077]通過親和素-生物素間的相互作用，把抗NT-proBNP抗體連接到磁顆粒表面，得到磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體。其中親和素標(biāo)記的磁顆粒和生物素化的抗體比例為1:1O4。
[0078](二)微流控芯片組裝
[0079]吖啶酯標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.05 %吐溫20和0.05 %Proclin30(^^pH7.4磷酸緩沖液;磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液為包含0.2 %牛血清白蛋白、0.1%酪蛋白、2%蔗糖、0.2%吐溫20、0.1%曲拉通父-100和0.02%卩抓(31111300的？!17.4磷酸緩沖液。將口丫啶酯標(biāo)記抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0080]清洗液為0.3%牛血清白蛋白、0.1 %吐溫20、0.2%曲拉通X-100和0.02%Proclin300的pH7.0磷酸鹽緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池。發(fā)光基底液分為包含H2O2溶液和堿性溶液，分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板過濾區(qū)中，將存儲(chǔ)池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0081](三)樣本檢測
[0082]用正常人血楽作稀釋液，將NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、lOOOng/ml和5000ng/ml。
[0083]將50μ1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為2000高斯)中，儀器擠出吖啶酯標(biāo)記單抗，并使樣本和吖啶酯標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成吖啶酯標(biāo)記抗體-NT-proBNP抗原-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治夾心結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。清洗液存儲(chǔ)池釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光激發(fā)液釋放，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度?？倷z測時(shí)間15min。每個(gè)樣本分別用3個(gè)微流控芯片測定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0084]將50μ1全血樣本滴入加樣口，15min內(nèi)儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中NT-proBNP濃度。
[0085]檢測原理為:當(dāng)全血加入微流控芯片后，全血先與吖啶酯標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)后，混合了吖啶酯標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有NT-proBNP，貝Ij形成吖啶酯標(biāo)記抗體-NT-proBNP-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，發(fā)光基底液釋放，經(jīng)混合后與吖啶酯作用產(chǎn)生直接化學(xué)發(fā)光，儀器檢測系統(tǒng)測試發(fā)光信號(hào)。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血漿中NT-proBNP濃度。血漿中NT-proBNP含量越高，則發(fā)光信號(hào)越強(qiáng)。
[0086]結(jié)果表明，其最低檢測限為5.0pg/ml，最低定量限為20pg/ml，定量檢測范圍為5.0?35000pg/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99 ；在檢測范圍內(nèi)，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng);且批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于10%?？蔀樾墓Ｐ乃ゼ膊≡\斷提供參考。
[0087]實(shí)施例3:磁微粒顆粒尺寸篩選
[0088]其他的實(shí)驗(yàn)條件參見實(shí)施例2，磁顆粒尺寸和磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度按照以下方案進(jìn)行。
[0089]顆粒尺寸為0.1μπι、0.5μηι、0.7μηι、1μηι、2.4μηι、3μηι、ΙΟμπι。磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500高斯、1000尚斯、4000尚斯、8000尚斯、12000尚斯、30000尚斯。分別以這八種磁鐵分別驅(qū)動(dòng)七種尺寸的磁顆粒。
[O(M)] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:0.Ιμπι磁顆粒和500高斯磁鐵組合使用時(shí)，其最低檢測限為40pg/ml，定量檢測范圍為40?20000pg/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.90;批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于
20 %。即:化學(xué)發(fā)光信號(hào)較弱，靈敏度不高，重復(fù)性較差。
[0091]ΙΟμπι磁顆粒和30000高斯磁鐵組合使用時(shí)，其最低檢測限為50pg/ml，定量檢測范圍為50?15000pg/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.92;批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于20%。即:陰性樣本信號(hào)較高(清洗不充分)，線性范圍不寬。
[0092]I?3μπι的磁顆粒為和1000?8000高斯的磁鐵組合使用時(shí)，其最低檢測限均小于30?8/!111，定量檢測范圍可達(dá)到30?3000(^8/1111，線性相關(guān)系數(shù)1?2>0.95;批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于12%。滿足為臨床心梗心衰疾病診斷提供參考的需要。
[0093]根據(jù)以上結(jié)果，磁顆粒尺寸優(yōu)選I?3μηι，磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)選1000?8000高斯?？筛鶕?jù)磁顆粒所用尺寸，進(jìn)一步確定磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度。
[0094]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括頂板(I)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(I)上的氣栗(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次相連;底板(2)上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)依次連接，底板(2)上檢測區(qū)(8)通過液體釋放通道(16)與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)連接;所述標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)和磁顆粒包被區(qū)(7)中存儲(chǔ)預(yù)封裝試劑;所述標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)中存儲(chǔ)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體溶液；所述磁顆粒包被區(qū)(7)包被磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體;所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集。2.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，磁顆粒尺寸為0.1?ΙΟμπι，與磁顆粒匹配的磁感應(yīng)強(qiáng)度為500-30000高斯。3.如權(quán)利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁顆粒為超順磁性顆粒，磁顆粒尺寸為I?3μπι，與磁顆粒匹配的磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000-8000高斯。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK205484063SQ201520828567
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年10月26日
【發(fā)明人】王東, 李泉
【申請(qǐng)人】深圳華邁興微醫(yī)療科技有限公司