專利名稱：黃尿酸衍生物藥物組合物及其相關(guān)方法
黃尿酸衍生物藥物組合物及其相關(guān)方法
相關(guān)申請(qǐng)
本申請(qǐng)為2004年12月29日提交的美國(guó)申請(qǐng)US11/027，131的部 分繼續(xù)申請(qǐng)，將該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
利尿劑為用于治療各種醫(yī)學(xué)疾病的一組藥物，所述的疾病包括充 血性心力衰竭、高血壓、某些類型的肝和腎病和眼內(nèi)壓上升。利尿劑 通過腎的腎單位對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)鈉(Na+)起作用，以便增加Na+(和相關(guān)離子)和 體外水的腎排泄，且由此減少胞外流體(ECF)體積。 一般而言，Na+通 過膳食進(jìn)入ECF，并且在尿中以與攝取相同的量排泄。在正常成年人 中，進(jìn)入兩腎腎單位的超過99%的鈉(通過腎小球過濾)通過罐流體外 部的能量依賴性被轉(zhuǎn)運(yùn)并且返回到ECF中。當(dāng)這種攝取與排泄之間的 平衡紊亂(排泄低于攝取)時(shí)，鹽貯留發(fā)生。治療這種異常情況的主要 機(jī)理包括給予一種或多種減少Na+和水被腎重吸收的活性劑且由此增 加其在尿中的排泄。這些活性劑共同稱作利尿劑。最佳的情況是，強(qiáng) 力利尿劑應(yīng)為促尿鈉排泄藥(抑制鈉離子再吸收)，而并非尿鉀排泄藥 (抑制鉀離子再吸收)，因?yàn)殁涬x子缺失是不需要的副作用。包括在" 利尿劑"類型中的主要藥物通過抑制經(jīng)對(duì)腎單位具體部位上的管形上 皮細(xì)胞內(nèi)的特異性"載體"起作用將Na+ (和水)轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管液外而起 作用。后者隨使用的利尿劑的不同而改變。
存在幾種主要類型的利尿劑，包括髓袢利尿劑、噻嗪類利尿劑和 保鉀利尿劑。髓袢利尿劑，也稱作強(qiáng)效利尿劑對(duì)腎臟內(nèi)稠密向上的細(xì) 尿管袢起作用。實(shí)例包括呋塞米、布美他尼和托拉塞米。髄袢利尿劑 具有遠(yuǎn)大于其它類利尿劑的峰值利尿作用。該類起抑制電解質(zhì)重吸收 的作用，從而不僅導(dǎo)致鈉排泄，而且導(dǎo)致鉀、鈣和鎂排泄。認(rèn)為髓袢利尿劑為"耗鉀的"。例如，呋塞米常用于治療心力衰竭、肺水腫、高 血壓和中毒。令人遺憾的是，如果膳食鉀不足，那么可能產(chǎn)生低鉀血
并且這可以可能謙發(fā)心律失常(arrythmias) (Goodman和Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics, 10th Ed. ; Hardman， Limbird & Gilman， Eds. MacGraw-Hill, p. 772, 2001)。
噻嗪類利尿劑在腎臟的遠(yuǎn)端小管和連接段中起作用。實(shí)例包括氯 噻嗪、氯噻酮、氫氯噻嗪、吲達(dá)帕胺和美托拉宗。盡管噻嗪類導(dǎo)致細(xì) 胞外液的電解質(zhì)組成失調(diào)低于其他類利尿劑，但是這些藥物產(chǎn)生的利 尿強(qiáng)度也較低。該類包含許多磺胺類化學(xué)本體且由此可以產(chǎn)生那些磺 胺過敏反應(yīng)中的過敏反應(yīng)。盡管噻嚷類不會(huì)導(dǎo)致鈣排泄，但是鉀排泄 隨緊急給藥而增加。噻嗪類還可以誘發(fā)高血糖并且加重預(yù)先存在的糖 尿病。噻溱類利尿劑還可能導(dǎo)致血清膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)和甘 油三酯濃度增加。蓉溱類也稱作"耗鉀"利尿劑。
保鉀利尿劑可以通過幾種機(jī)理起作用。某些為類固醇結(jié)構(gòu)并且在 腎臟中的皮質(zhì)集合小管內(nèi)的醛甾酮敏感性細(xì)胞中起作用。這類藥物中 的成員為內(nèi)源性鹽皮質(zhì)激素類固醇的竟?fàn)幮赞卓箘?，諸如醛甾酮，它 起促進(jìn)鈉吸收和鉀排泄的作用。醛甾酮受體為在幾種組織，包括唾液 腺、結(jié)腸和腎臟的腎單位段中發(fā)現(xiàn)的可溶性胞質(zhì)蛋白。這類藥物中有 代表性的成員螺內(nèi)酯結(jié)合醛甾酮受體并且防止該受體接受活性成分構(gòu) 造。螺內(nèi)酯還增加鈣排泄。通常的副作用包括惡心、胃痙攣和腹瀉。 其它副作用包括內(nèi)分泌失調(diào)、男子女性型乳房(男性一側(cè)或兩側(cè)乳房異 常擴(kuò)大)、性欲改變、陽痿或多毛癥(體毛過度)。氨苯喋啶和阿米洛利 為抑制腎單^后段中鈉的電進(jìn)入的非類固醇保鉀利尿劑。氨苯喋啶和 阿米洛利導(dǎo)致鈉和氯化物排泄增加，但對(duì)鉀排泄幾乎沒有影響。氨苯 喋啶的副作用包括血鉀過多(血清鉀濃度增加)、惡心、嘔吐、腿痛性 痙車和頭暈。阿米洛利副作用還包括血鉀過多、惡心、嘔吐、腹瀉和頭痛。
其它類利尿劑包括滲透壓性利尿劑和碳酸肝酶抑制劑。滲透壓性 利尿劑，諸如甘露糖醇難以被腎小管重吸收。這類藥物難以進(jìn)行純鈉鹽重吸收。此外，甘露糖醇難以被胃腸道吸收且由此必須通過靜脈內(nèi) 給藥。其它滲透壓性利尿劑包括甘油、脲和異山梨醇。
碳酸酐酶抑制劑，諸如乙酰唑胺導(dǎo)致中度的鈉重吸收減少并且因 其作用機(jī)制而還可以導(dǎo)致鉀缺失和代謝性酸中毒。
利尿劑單獨(dú)或與其它藥物聯(lián)合用于治療高血壓(高血壓)。高血壓 可以加重心臟和動(dòng)脈工作負(fù)荷。如果病情持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間期限，那么心 臟和動(dòng)脈功能可能受損。這可以損害腦、心臟或腎臟的血管，從而導(dǎo) 致中風(fēng)、心力衰竭或腎衰竭。高血壓還可以增加心臟病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。
如果血壓得以適度控制，那么這些風(fēng)險(xiǎn)可以降低。The National Heart, Umg， and Blood Institute's (NHLBI) high blood pressure guidelines (JAMA， May 21， 2003; www. nhlbi. nih. gov)強(qiáng)調(diào)了研發(fā) 新的無上述藥典中的利尿劑的副作用的利尿藥的需求。
藥物組合物，包含
治療有效量的式I的化合物或其前體藥物或藥學(xué)上可接受的鹽:
其中Ri、 R2、 R3、 R5、 R6和R7獨(dú)立為X3R，其中R選自H、鹵素；
任選取代的糖、脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基； -P(O) (0Ra) (0Rb)和-NITRb，其中r和r獨(dú)立為H、任選取代的脂族化
合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；
Xi、 X2和X3獨(dú)立為-C(0)0-、 -OC(O)-、 -C(O)NH-、 -NHC(O)-、
-OC(O)NH-、-匪C(O)O-、 -0S(0)y-、 -S(O)y-、 -0-、 -NHC(O)-、
-NHC(0)0-、 -S(0)2NH-、鍵或不存在；其中y為0-3的整數(shù)；且
發(fā)明概述
9R4和R8獨(dú)立為H、 (-0);羥基；或任選取代的糖、脂族化合物、
環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或-P(O) (0Ra) (010或-MaRb,其中 r和W獨(dú)立為H或任選取代的脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基
或雜芳基；
和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了使用包含式I化合物的藥物組合物治療、控制和 預(yù)防高血壓、水腫、急性腎衰竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹 水、眼內(nèi)壓上升或腎病綜合征和其它相關(guān)疾病和病癥的方法。
附圖簡(jiǎn)述
附

圖1表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠靜脈內(nèi)(i. v.)給予(2 ug 劑量)合成黃尿酸8-0- P -D-糖苷的反應(yīng)的Na+尿排泄。
附圖2表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i.v.給予(2 ug劑量)合 成黃尿酸8-0- P -D-糖苷的反應(yīng)的Na+和K+尿排泄。
附圖3表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i. v.給予(2 ug劑量)合 成黃尿酸8-0- 0 -D-糖苷后尿中的Na+和K+濃度。
附圖4表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i. v.給予(2 ug劑量)合 成黃尿酸8-0-P-D-糖苷后的尿體積。
附圖5表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i.v.給予(10 ug劑量) 合成黃尿酸8-0- P -D-糖苷的反應(yīng)的Na+排泄。
附圖6表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i.v.給予(lO ug劑量) 合成黃尿酸8-0- P -D-糖苷的反應(yīng)的Na+和K+尿排泄。
附圖7表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i.v.給予(lO ug劑量) 合成黃尿酸8-0- P -D-糖苷后尿中的Na+和K+濃度。
附圖8表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠i.v.給予(lO ug劑量) 合成黃尿酸8-0- p -D-糖苷后的尿體積。
附圖9表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠口服(p. o.)給予合成黃尿 酸8-0- P -D-糖苷(10 ug)，隨后口服給予呋塞米(100 ug)的反應(yīng)的Na+ 尿排泄。附圖IO表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠口服(p. o.)給予合成黃 尿酸8-0-P-D-糖苷(IO ug)，隨后口服給予呋塞米(IOO ug)的反應(yīng)的 Na+和K+尿排泄。
附圖ll表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠口服(p. o.)給予合成黃 尿酸8-0-P-D-糖苷(IO ug)，隨后口服給予呋塞米(IOO ug)的反應(yīng)的 尿中Na+和K+尿濃度。
附圖12表示對(duì)正常Sprague Dawley大鼠口服(p. o.)給予合成黃 尿酸8-0-P-D-糖苷(IO ug)，隨后口服給予呋塞米(IOO ug)后的尿體 積。
附圖13表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-p-D-糖苷(3 ug)，隨后口服給予呋塞米(20 ug)的反應(yīng)的Na+ 尿排泄。
附圖14表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-p-D-糖苷(3 ug)，隨后口服給予呋塞米(20 ug)的反應(yīng)的Na+ 和K+尿排泄。
附圖15表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-P-D-糖苷(3 ug)，隨后口服給予呋塞米(20 ug)的反應(yīng)的Na+ 和K+尿濃度。
附圖16表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-p-D-糖苷(3 ug)，隨后口服給予呋塞米(20 ug)的反應(yīng)的尿體 積，
附圖17表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-硫酸鹽(2 ug)的反應(yīng)的Na+尿排泄。
附圖18表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-硫酸鹽(2 ug)的反應(yīng)的Na+和K+尿排泄。
附圖19表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-硫酸鹽(2 ug)的反應(yīng)的尿中Na+和K+尿濃度。
附圖20表示對(duì)尿毒癥Sprague Dawley大鼠i.v.給予分離的黃尿 酸8-0-硫酸鹽(2 ug)的反應(yīng)的尿體積。附圖21表示通過口服給藥對(duì)正常Sprague Dawley大鼠給予合成 的黃尿酸8-0-硫酸鹽(20. 0 ug)的反應(yīng)的Na+尿排泄。
附圖22表示通過口服給藥對(duì)正常Sprague Dawley大鼠給予合成 的黃尿酸8-0-硫酸鹽(20. Q ug)的反應(yīng)的Na+和K+尿排泄。
附圖23表示通過口服給藥對(duì)正常Sprague Dawley大鼠給予合成 的黃尿酸8-0-硫酸鹽(20. 0 ug)的反應(yīng)的尿中Na+和K+濃度。
附圖24表示通過口服給藥對(duì)正常Sprague Dawley大鼠給予合成 的黃尿酸8-0-硫酸鹽(20. 0 ug)的反應(yīng)的尿體積。
附圖25表示正常Sprague Dawley大鼠對(duì)呋塞米(0. 5 mg， i.v.) 的反應(yīng)的Na+和K+尿排泄。
附圖26表示正常Sprague Dawley大鼠對(duì)呋塞米(0. 5 mg， i.v.) 的反應(yīng)的尿排泄率。
發(fā)明詳述
除非另作陳述，否則應(yīng)使用本文所用的下列定義 術(shù)語"任選取代的"可以與術(shù)語"取代或未被取代的"互換使用，除 非另作陳述，否則任選取代的基團(tuán)可以在基團(tuán)的每一可取代的位置上 具有取代基并且取代彼此各自獨(dú)立。此外，允許取代基的組合或變化 形式，只要這類組合產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物。此外，除非另作陳述，否則 獨(dú)立地選擇官能基。如果"任選取代的"改變了通過逗號(hào)分隔開的一系 列基團(tuán)(例如"任選取代的A， B或C";或"A， B或C任選被…取代")， 那么意指基團(tuán)各自.(例如A， B和C)任選被取代。 ，
本文所用的術(shù)語"脂族化合物"或"脂族基團(tuán)"意指完全飽和或包含 一個(gè)或多個(gè)不飽和單元的直鏈或支鏈Ci-i2烴鏈或完全飽和或包含一
個(gè)或多個(gè)不飽和單元，但并非芳族的單環(huán)C3-8烴或雙環(huán)Cg-i2烴(本
文也稱作"碳環(huán)"或"環(huán)烷基")，它具有與分子的剩余部分的單一連接 點(diǎn)，其中所述雙環(huán)環(huán)系中的任意各環(huán)具有3-7個(gè)成員。例如，合適的 烷基包括，但不限于直鏈或支鏈或烷基、鏈烯基、炔基及其雜化物， 諸如(環(huán)烷基)烷基、(環(huán)烯基)烷基或(環(huán)烷基)鏈烯基。
12術(shù)語"烷氧基"，"羥基烷基"，"烷氧基烷基"和"烷氧羰基"在單獨(dú)
或作為加大部分的組成部分使用時(shí)包括包含1 - 12個(gè)碳原子的直鏈和 支鏈。術(shù)語"鏈烯基"和"炔基"在單獨(dú)或作為加大部分的組成部分使用 時(shí)包括包含2 - 12個(gè)碳原子的直鏈和支鏈。
在術(shù)語"卣代烷基"，"囟代鏈烯基"和"面代烷氧基"的情況中意指 可以被一個(gè)或多個(gè)卣原子取代的烷基、鏈烯基或烷氧基。本文所用的 術(shù)語"卣素(halogen)"或"卣素(halo)"意指F、 Cl、 Br或I。
術(shù)語"雜原子"意指氮、氧或硫并且包括氮和硫的任意氧化形式和 任意堿性氮的季胺化形式。術(shù)語"芳基"在單獨(dú)或與其它術(shù)語聯(lián)用時(shí)意 指帶有總計(jì)5-14個(gè)環(huán)成員的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)碳環(huán)系，其中在該系 統(tǒng)中至少一個(gè)環(huán)為芳族的并且其中該系統(tǒng)中的各環(huán)包含3-8個(gè)環(huán)成 員。術(shù)語"芳基"可以與術(shù)語"芳基環(huán)"互換使用。術(shù)語"芳烷基"意指被 芳基取代的烷基。本文所用的術(shù)語"芳烷氧基"意指被芳基取代的烷氧基。
本文所用的術(shù)語"雜環(huán)烷基"，"雜環(huán)"，"雜環(huán)基"或"雜環(huán)化合物" 意指帶有5-14個(gè)環(huán)成員的單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)環(huán)系，其中一個(gè)或多個(gè) 環(huán)成員為雜原子，其中該系統(tǒng)中的各環(huán)包含3-7個(gè)環(huán)成員并且為非芳 族的。
術(shù)語"雜芳基"在單獨(dú)或與其它術(shù)語聯(lián)用時(shí)意指帶有總計(jì)5 - 14個(gè) 環(huán)成員的單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)環(huán)系，并且其中1)在該系統(tǒng)中至少一個(gè) 環(huán)為芳族的；2)在該系統(tǒng)中至少一個(gè)環(huán)包含一個(gè)或多個(gè)雜原子；和 3)在該系統(tǒng)中各環(huán)包含3-7個(gè)環(huán)成員。術(shù)語"雜芳基"可以與術(shù)語" 雜芳基環(huán)"或術(shù)語"雜芳族化合物"互換使用。雜芳基環(huán)的實(shí)例包括2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-異嗜唑基、4-異-惡唑基、5-異喵唑基、2-噃二唑基、5-"惡二唑基、2-唾唑基、4-喝唑基、5--惡唑基、l-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、1-吡唑基、3—比喳基、4-吡喳基、2-他咬基、3-p比咬基、4-吡咬基、2-嘧啶基、4-嘧啶基> 5-嘧啶基、3-噠溱基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-漆唑基、5-四唑基、2-三唑基、5-三唑基、2-瘞吩基、3-噢吩基、啼唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯 并三唑基、苯并噻唑基、苯并喁唑基、苯并咪唑基、異喹啉基、吲唑 基、異吲哚基、吖啶基和苯并異哺唑基。術(shù)語"雜芳烷基"意指被雜芳 基取代的烷基。術(shù)語"雜芳基烷氧基"意指被雜芳基取代的烷氧基。
芳基(包括芳烷基、芳烷氧基、芳氧基烷基等)或雜芳基(包括雜芳 烷基、雜芳基烷氧基等)可以包含一個(gè)或多個(gè)取代基。芳基、雜芳基、
芳烷基或雜芳烷基的不飽和碳原子上的合適的取代基選自囟素；卣 代烷基；-CF3; -R'; -OR9; -SR9; 1 ，2-亞曱二氧基；1 ，2-亞乙二氧
基；被保護(hù)的0H(諸如酰氧基)；苯基(Ph);被R'取代的Ph; -O(Ph); 被R9取代的-0- (Ph); -CH2 (Ph);被!^取代的-CH2 (Ph); -CH2CH2 (Ph); 被R9取代的-CH2CH2(Ph) ; -N02 ; -CN; -NRY。 ； -NR'CO))!^ -NR9C(0)NITR"; -NR9C02R1Q; -NR^lTC (0) R11; -NR9-NR1QC (0) NRUR1: -NR9NR"C02R11; -C(0)C(0)R9; -C (0) CH2C (0) R9; -CO2R9; -C(0)Rs -C (0) NRY° ; -OC (0) NRY。 ； -S (0) 2R9 ; -S02NRY。 ； -S (0) R9 -NRSSOsM'Y1 ; -NR9S02R10 ; -C(=s)NRY° ; -C (-NH)-NR9!^ -(CH2) yNHC (0) R9; - (CH2) yR9; - (CH2) y冊(cè)C (0) NHR9; - (CH2) y冊(cè)C (0) OR9; -(CH2) yNHS (0) R9; - (CH2) yNHS02R9或—(CH2) yNHC (0) CH ((V) Z-R9) (R10)， 其中R9， R1。， RU和R"獨(dú)立地選自氫、任選取代的C 1-6脂族化合物、
未被取代的5-6元雜芳基或雜環(huán)、苯基(Ph)、 -O(Ph)或 -CH2 (Ph)-CH2 (Ph)，其中y為0-6; z為0-1;且V為連接基。當(dāng)R9，
Rie, RH或R"為Ci-6脂族化合物時(shí)，它可以被一個(gè)或多個(gè)取代基取代， 所述的取代基選自-NH2、 -NH(Ci-4脂族化合物)、-N(Ci-4脂族化合 物)2、 -S(O) (Cw脂族化合物)、-S02(Ci-4脂族化合物)、卣素、(Cl-4 脂族化合物)，-OH、 -0-(Ci-4脂族化合物)、-N02、 -CN、 -C02H、 -C02 (Ci-4脂族化合物)、-0 (離素Ci-4脂族化合物)或-卣代(Ci-4脂 族化合物)；其中Ci-4脂族化合物各自未被取代。
脂族基團(tuán)或非芳族雜環(huán)可以包含一個(gè)或多個(gè)取代基。從上述對(duì)芳 上的合適的取代基=0、 -S、 -NNHR13、 =NNR13R14、 一N—、 =NNHC(0)R13、=卵11(:02(烷基)、-NNHS02 (烷基)或-NR13，其中R"和R"獨(dú)立地選自氬 和任選取代的Ci-6脂族化合物。當(dāng)R"或R"為Ci-6脂族化合物時(shí)， 它可以被一個(gè)或多個(gè)選自-冊(cè)2、 -NH(Ci-4脂族化合物)、-N(Ci-4脂族 化合物)2、囟素、-0H、 -0-(Ci-4脂族化合物)、-N02、 -CN、 -C02H、 -C02 (C1一4脂族化合物)、-0 (卣代Ci一4脂族化合物)或-鹵代(Ci-4脂 族化合物)的取代基取代；其中Ci—4脂族化合物各自未被取代。
非芳族雜環(huán)的氮上的取代基選自-R15、 -NR"R16、 -C(O)R15、 -C02R15、 一C(O)C(O)R15、 -C(0)CH2C(0)R15、 -S02R15、 -S02NR15R16、 -C (=S) NR15R16、 -C(-NH)NR"R"或-NR"S02R";其中R"和R"獨(dú)立為選自氫、任選取代 的Ci-6脂族化合物、任選取代的苯基(Ph)、任選取代的-O(Ph)、任選 取代的-CH2 (Ph)、任選取代的-CH2CH2 (Ph)或未被取代的5-6元雜芳基 或雜環(huán)。當(dāng)R"或R"為Ci-6脂族基團(tuán)或苯基環(huán)，它可以被一個(gè)或多個(gè) 取代基取代，所述的取代基選自-NH2、-NH (Ci-4脂族化合物)、-N(Ci-4 脂族化合物)2、卣素、-(Ci-4脂族化合物)、-OH、 -0-(Ci-4脂族化合 物)、-N02、 -CN、 -C02H、 -C02 (C卜4脂族化合物)、一0(面代Ci-4月旨 族化合物)或-卣代(Ci-4脂族化合物)；其中Ci-4脂族化合物各自未 被取代。
術(shù)語"糖"定義了由具有一般實(shí)驗(yàn)通式(CH20)n的一個(gè)或多個(gè)單元
構(gòu)成的碳水化合物或糖。根據(jù)單元或氨基糖的數(shù)量的不同，將糖進(jìn)一 步定義為單糖、二糖或多糖，只要一個(gè)或多個(gè)氧原子被氮原子取代。 還可以將糖分類為脫氧糖，只要一個(gè)或多個(gè)羥基被氫原子取代。
例如，糖取代基可以進(jìn)一步在任意伯或仲羥基上被烷基、烷氧基
烷基、芳基、雜芳基、醚、酯、縮醛、碳酸酯或氨基甲酸酯取代。
術(shù)語"單糖"定義了單一碳水化合物或糖單位。單糖類的兩個(gè)家族 為醛糖類或酮糖類，趁糖類在碳鏈的末端上羰基作為醛，此時(shí)將單糖 書寫為線性開鏈通式。如果羰基位于碳鏈的任意其它位置上，那么單 糖為酮并且稱作酮醣。三碳單糖類為丙糖類甘油醛類，醛糖和二幾 基丙酮，酮醣。除二羥基丙酮外，單糖類具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心。 前綴D-或L-意指最遠(yuǎn)離羰基碳的手性碳的碳原子的構(gòu)型。在主鏈上帶有4， 5， 6和7個(gè)碳原子的單糖類分別稱作丁糖類、戊糖類、戊糖類 和庚糖類。它們各自以兩個(gè)系列存在丁醛糖類和酮丁糖類、戊醛糖 類和戊酮糖類、己醛糖類和己酮糖類、庚醛糖類和庚酮糖類。丁糖類 包括赤鮮糖和蘇糖。戊糖類包括核糖、阿拉伯糖、木糖和來蘇糖。己 糖類包括阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳 糖和塔羅糖。在主鏈上帶有5個(gè)或5個(gè)以上碳的單糖類通常作為環(huán)狀 或環(huán)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，其中羰基沿鏈與羥基之一形成共價(jià)鍵。6元環(huán)化合物 稱作吡喃糖類，5元環(huán)化合物為呋喃糖類。6元環(huán)的形成是因醛類和醇 類形成包含不對(duì)稱碳原子的半-縮醛類的反應(yīng)所致。將圍繞C-l碳的一 種構(gòu)型描述為a-型并且將另一種構(gòu)型描述為p-型。
術(shù)語"二糖"意指包含彼此共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)單糖的分子部分。二糖
類包括麥芽糖[葡萄糖-葡萄糖]、乳糖[半乳糖-葡萄糖]和蔗糖[果糖-葡萄糖]。
術(shù)語"多糖"包括彼此共價(jià)結(jié)合的多個(gè)單糖單元。多糖類包括淀粉、 透明質(zhì)酸、直鏈淀粉、支鏈淀粉、葡聚糖、環(huán)糊精和糖原。
術(shù)語"氨基糖"意指碳水化合物分子，其中一個(gè)或多個(gè)羥基被氨基 取代。它包括單糖葡糖胺和胞壁酸和多糖殼多糖。氨基可以被乙酰化 以便包括N-乙?；?D-葡萄糖胺和N-乙?；?D-胞壁酸。
術(shù)語"脫氧糖"意指碳水化合物分子，其中 一個(gè)或多個(gè)羥基被氫取 代。它們包括例如L-鼠李糖(6-脫氧-L-甘露糖)、L-巖藻糖(6-脫氧 -L-半乳糖)和D-巖藻糖(萬年青糖)，
術(shù)語"治療"意指治療哺乳動(dòng)物，特別是人的病理性疾病并且包括 (i)預(yù)防易感疾病，但尚未診斷為該病的受試者發(fā)生病理性疾病，且 由此治療構(gòu)成了對(duì)疾病的預(yù)防性治療；(ii)抑制病理性疾病，即阻止 其發(fā)展；(iU)緩解病理性疾病，即導(dǎo)致病理性疾病退化；或(iv)緩 解由病理性疾病介導(dǎo)的情況。
術(shù)語"治療有效量"意指如上所述在對(duì)有這類治療需要的哺乳動(dòng)物 給藥時(shí)足以進(jìn)行治療的本發(fā)明化合物的用量。治療有效量根據(jù)受試者 和所治療疾病情況、受試者體重和年齡、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方式等的不同而改變，它們易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。
術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"包括，但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周 知的鹽，例如本發(fā)明化合物的 一-鹽(例如堿金屬和銨鹽)和多鹽(例如 二-或三-鹽)。例如，式I化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，其中可交換的
基團(tuán)，諸如-OH或-NH-上的氫被藥學(xué)上可接受的陽離子(例如鈉、鉀或 銨離子)取代并且可以便利地由相應(yīng)的式I的化合物通過例如與合適 的堿反應(yīng)制備。在化合物為足以形成穩(wěn)定的無毒性酸或堿式鹽的情況 中，化合物作為鹽給藥是合適的。藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例為與形成 生理可接受的陰離子的酸形成的有機(jī)酸加成的鹽，例如甲苯磺酸鹽、 甲磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、苯 甲酸鹽、抗壞血酸鹽、ct-酮戊二酸鹽和ot-磷酸甘油。還可以形成合 適的無機(jī)酸鹽，包括鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽。 可以使用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟獲得藥學(xué)上可接受的鹽，例 如，通過使諸如胺這類足夠堿性的化合物與合適的酸反應(yīng)而生成生理 可接受的陰離子。還可以制備羧酸的堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)或堿土 金屬(例如釣)鹽。
本文所用的術(shù)語"疾病"、"病癥"或"疾病情況"意指已知利尿藥或 藥物組合物的治療性給藥在其治療中起作用的任意疾病或其它有害情 況或疾病。這類疾病或疾病情況包括，但不限于高血壓、水腫、急性 腎衰竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹水、眼壓或腎病綜合征和 因那些疾病導(dǎo)致或加劇的并發(fā)癥。
本文所用的術(shù)語"利尿劑"意指用于促進(jìn)尿形成和排泄的藥物或其 它物質(zhì)。
本文所用的術(shù)語"高血壓"意指特征在于血壓升高的病癥。 "抗體"意指稱作免疫球蛋白的糖基化蛋白家族中的成員，它們可 以特異性與抗原結(jié)合。
"抗原"意指引起抗體形成的化合物。
"抗原決定簇"或"抗原決定部位"意指抗原的抗體確切識(shí)別部位。 該術(shù)語可以與"表位"互換使用。
17"栽體"意指高分子量(大分子)聚合物，通常為蛋白質(zhì)，抗原或半 抗原可以與之結(jié)合或綴合以便有利于抗體形成。如果需要，載體可以 在其結(jié)構(gòu)中摻入標(biāo)記。
"綴合物"意指抗原或半抗原與載體通過化學(xué)方式結(jié)合；共軛物也 可以包含其它基團(tuán)。
"ELISA"意指酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，其使用與固相結(jié)合的抗體或抗原 和酶-抗原或酶-抗體綴合物以便檢測(cè)和定量存在于樣品中的抗原或抗 體的量。有關(guān)ELISA技術(shù)的描述可以在D. P. Sites等的Chapter 22 of the 4th Edition of Basic and Clinical Immunology中找到， 該文獻(xiàn)由Lange Medical Publications of Los Altos, Calif在1982 年出版，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
"EMIT"意指酶-放大免疫測(cè)定技術(shù)，其使用(1)酶-標(biāo)記的半抗 原；(2)針對(duì)半抗原的特異性抗體；(3)預(yù)處理試劑；(4)緩沖的-酶底物；和(5)檢測(cè)樣品中未知的用量的標(biāo)準(zhǔn)品。有關(guān)EMIT技術(shù)的描 述可k乂在E. T. Maggio的Enzyme Immunoassay中找至!j，特另，J是在pp. 141-150， 234-5，和242-3上，該文獻(xiàn)由CRC Press, Inc., Boca Raton, FIa.在1980年出版。將這些材料引入作為參考。
"表位"意指由抗體特異性識(shí)別的分子部分。它也稱作決定蔟。
"熒光免疫測(cè)定"意指基于抗體的測(cè)定，其中所測(cè)定的種類結(jié)合， 取代用抗體-配體復(fù)合物中熒光種類標(biāo)記的物質(zhì)或與之竟?fàn)幮越Y(jié)合，在 譯測(cè)定的某些實(shí)施方案中，分離所述的復(fù)合物并且焚光種類的存在或 不存在得到了所測(cè)定種類的量的測(cè)量值。在其它實(shí)施方案中，所述的 復(fù)合物具有不同于.未復(fù)合的熒光種類的熒光特性，使得可以在不分離 該復(fù)合物的情況下檢測(cè)其形成。有關(guān)熒光免疫測(cè)定技術(shù)的描述可以在 "A Review < f Fluoroimmunoassay and Immunofluorometric Assay", D. S. Smith等(1981) Ann. Clin. Biochem. (1981) 18:253-274中 找到，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
"半抗原"意指通常為低分子量的化合物，它在結(jié)合較大分子時(shí)可 以引起抗體形成。"標(biāo)記"意指分子中可檢測(cè)的基團(tuán)。在常用的標(biāo)記中有用于放射性
免疫測(cè)定的放射性種類、用于熒光免疫測(cè)定的熒光種類和用于ELISA
和EMIT方法的酶促種類等。
"配體"意指具有抗體合并部位并且可以結(jié)合受體的任意分子。 "標(biāo)準(zhǔn)品"意指以用于定量不同樣品未知濃度的相同特異性分子的
已知濃度存在的特異性分子樣品。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的某些化合物可以以互
變體形式存在，所有這類化合物的互變體形式均屬于本發(fā)明的范圍。
除非另作陳述，否則本文所述的結(jié)構(gòu)還指包括該結(jié)構(gòu)的所有立體 化學(xué)形式；即每個(gè)不對(duì)稱中心的R和S構(gòu)型。因此，本發(fā)明化合物的 單一立體化學(xué)異構(gòu)體和對(duì)映體和非對(duì)映體混合物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。 除非另作陳述，否則本文所述的結(jié)構(gòu)還指包括僅在存在的一個(gè)或多個(gè) 同位素富含的原子上不同的化合物。例如，具有除由氘或氚取代氫或
由"C-或"c-富含的碳取代碳外的存在結(jié)構(gòu)的化合物均屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含式I的化合物的藥物組合物。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物包含式I的化合物，中Ri、 R3、 R5、 R6 和R7獨(dú)立為H、卣素或低級(jí)烷基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Xi不存在且 R4為(-0);或X1為鍵且R4為羥基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，XiR4為 -OC(O)CH3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，R2為-C(0)0R，其中R優(yōu)選為H或
任選取代的烷基，其中烷基可以為曱基、乙基、丁基、辛基或十一基。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，R2為-C(0)NHR，其中R優(yōu)選為H或任選取代的
烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X2為-0-且Rg為任選取代的糖，優(yōu)
選單糖選自己醛吡喃糖、戊醛吡喃糖、戊醛呋喃糖或酮糖。在其它實(shí) 施方案中，R8為D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-巖藻糖或L-鼠李
糖。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R8為D-葡萄糖。在一個(gè)具體的實(shí)施方
案中，式I的化合物為黃尿酸8-0-l3-D-糖苷。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，X2為-O-且Rs為-CH2CO2R或-CH2C (0)匪R,其中R優(yōu)選為H或任選取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳 基。
按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述的藥物組合物包含式I的化 合物，其中X2R8為?；?、磷酸酯、膦酸、膦酸烷基酯或硫酸鹽基。在
一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的化合物為黃尿酸8-0-硫酸鹽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物，包含治療有效量的式I表示 的化合物與一種或多種額外的利尿化合物或心血管藥；和藥學(xué)上可接 受的載體。
本文所述的藥物組合物用于治療或預(yù)防高血壓、水肺、急性腎衰 竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹水、眼內(nèi)壓或腎病綜合征和因 那些疾病導(dǎo)致或因其加劇的并發(fā)癥。
根據(jù)所治療或預(yù)防的具體疾病的不同，可以將通常為治療或預(yù)防 該病給予的額外治療劑與本發(fā)明的化合物一起給藥。例如，在治療高 血壓的過程中，可以將一種或多種額外的利尿化合物或心血管藥與本 發(fā)明的化合物聯(lián)用以便治療高血壓。額外的利尿劑選自髓袢利尿劑、 噻溱類利尿劑、保鉀利尿劑、碳酸酐酶抑制劑和滲透壓性利尿劑。心 血管藥選自血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、p -腎上腺素能阻滯劑、鈣通道阻滯劑、膽固醇改變藥物、降甘油三酯劑、 降c-反應(yīng)蛋白質(zhì)劑、降高半胱氨酸劑、阿司匹林及其衍生物、離子移 變劑、抗心律失常藥和血液稀釋劑(抗凝血?jiǎng)?。這些活性劑包括，但 不限于呋塞米、布美他尼、托塞米、依地尼酸、氯噻溱、氫氯噻溱、 輝內(nèi)酯、阿米洛利、氨苯喋啶、乙酰唑胺、醋甲唑胺、二氯磺胺、氫 氟噻嗪、甲氯噻嗪、吲達(dá)帕胺、美托拉宗、泊利噻喚、氯噻酮、多佐 胺、布林唑胺、甘油、甘露糖、脲、賴諾普利、莫昔普利、依那普利、 厄貝沙坦、纈沙坦、氯沙坦、納多洛爾、普萘洛爾、阿替洛爾、瘞嗎 絳爾和比索洛爾。
可以將式I的化合物配制成藥物組合物并且以各種適合于選擇的 給藥途徑的形式對(duì)哺乳動(dòng)物宿主，諸如人體患者給藥，例如通過口服、 非腸道、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、局部或皮下途徑。因此，可以將本發(fā)明的化合物與藥學(xué)上可接受的媒介物，諸如惰性稀釋劑或可同化的可食用載 體一起通過全身，例如通過口服給藥。可以將它們包封在硬或軟殼膠 嚢中，可以將它們壓制成片劑或?qū)⑵渲苯訐饺牖颊呱攀车氖澄?。為?進(jìn)行口服治療給藥，可以將活性化合物與 一種或多種賦形劑互補(bǔ)并且 以可攝取的片劑、含片、藥片、膠嚢、酏劑、混懸液、糖漿劑、糯米
紙嚢劑等的形式使用。這類組合物和制劑應(yīng)包含至少0. 1°/ 的活性化合
物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比可以改變并且便利地占指定單位劑
型重量的約2-約60%?；钚曰衔镌谶@類治療上有用的組合物中的量 能夠獲得有效劑量水平。
片劑、含片、丸劑、膠嚢等還可以包含下列成分粘合劑，諸如 西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩 解劑，諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂； 和增甜劑，諸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或可以加入矯味劑， 諸如薄荷、冬青油或櫻桃香料。當(dāng)單位劑型為膠囊時(shí)，它除包含上述 類型的物質(zhì)外，還可以包含液體載體，諸如植物油或聚乙二醇?？梢?存在各種其它物質(zhì)作為包衣材料，否則就用于改變固體單位劑型的物
理形式。例如，可以用明膠、蠟、蟲膠或糖等給片劑、丸劑或膠囊包
衣。糖漿劑或酏劑可以包含活性化合物、作為增甜劑的蔗糖或果糖、
作為防腐劑的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯、染料和諸如櫻
桃或橙香料逸類矯味劑。當(dāng)然，用于制備任意單位劑型的任意材料均 應(yīng)為藥學(xué)上可接受的并且在使用量上基本上為無毒性的。此外，可以
將活性化合物摻入緩釋制劑和裝置。
還可以通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)，經(jīng)輸注或注射給予活性化合物?？?以制備在水中的任選與無毒性表面活性劑混合的活性化合物或其鹽的 溶液。還可以制備在甘油、液體聚乙二醇類、三醋精及其混合物和油 中的分散體。在一般儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑包含防止微生物生 長(zhǎng)的防腐劑。適合于注射或輸注的藥物劑型可以包括無菌水溶液或分 散液或包含適合于臨時(shí)制備無菌可注射或可輸注溶液或分散液的任選 包嚢在脂質(zhì)體中的無菌粉末。在所有情況中，最終的劑型在制備和儲(chǔ)存條件下應(yīng)為無菌的、流體的和穩(wěn)定的。液體載體或媒介物可以為溶
劑或液體分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二 醇、液體聚乙二醇類等)、植物油、無毒性的甘油酯類及其合適的混合 物。例如，可以通過維持分散液的所需顆粒大小或通過使用表面活性 劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢杂酶鞣N抗菌劑和抗真菌劑預(yù)防微生物的作 用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。 在許多情況中，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖類、緩沖劑或氯化鈉?？梢?通過在組合物中使用延緩吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠延長(zhǎng)可注射 組合物的吸收。
通過將活性化合物以所需量摻入后于上述各種其它組分的合適的 溶劑，如果需要，隨后進(jìn)行無菌過濾來制備無菌可注射溶液。就制備 無菌可注射溶液的無菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍 干燥技術(shù)，它們可以產(chǎn)生存在于上述無菌過濾溶液中的活性組分+任 意額外所需組分的粉末。就局部給藥而言，可以以純的形式施用本發(fā) 明的化合物，即此時(shí)它們?yōu)橐后w。然而， 一般需要將它們作為與可以 為共同或液體的皮膚病學(xué)可接受載體的組合物或制劑施用于皮膚。
有用的固體載體包括固體細(xì)粉，諸如滑石粉、粘土、微晶纖維素、 二氧化硅、氧化鋁等。有用的液體載體包括水、醇類或乙二醇類或水-醇/乙二醇摻合物，其中可以借助于無毒性表面活性劑以有效水平溶解 或分散本發(fā)明的化合物。可以加入諸如香料這類佐劑和額外的抗微生 物劑以便優(yōu)化用于指定應(yīng)用的特性?？梢詮奈諌|中施用所得的液體 組合物，將其用于浸漬繃帶和其它敷料或使用泵型或氣溶膠噴霧劑噴 在受侵害的區(qū)域上。
還可以將增稠劑，諸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯類、 脂肪醇類、改性纖維素或改性的礦物與液體載體一起使用以便形成可 直接施用于使用者皮膚的可分散的糊劑、軟骨劑、皂等。
可以用于將本發(fā)明化合物遞送至皮膚的有用的皮膚病學(xué)組合物的 實(shí)例披露在Jacquet等(美國(guó)專利US4， 608, 392) 、 Geria(美國(guó)專利 US4， 992， 478) 、 Smith等(美國(guó)專利US4， 559， 157)和Wortzman(美國(guó)專
22利US4， 820， 508)中。
還可以制備通過鼻和咽喉或支氣管組織納米吸收的合適的劑型的 本發(fā)明組合物，并且可以便利地釆用粉末或液體噴霧劑或吸入劑、錠 劑、涂咽劑等劑型。就眼或耳用藥物而言，可以將制劑制成單個(gè)膠囊， 液體或半固體劑型，或可以作為滴劑等使用?？梢耘渲圃谑杷曰蛴H 水性基質(zhì)中的局部施用制劑，諸如軟骨劑、霜?jiǎng)⑾磩?、涂布劑、?末等。
就獸藥而言，例如，可以將組合物配制成在長(zhǎng)效或速釋基質(zhì)中的 乳房?jī)?nèi)用制劑。
可以通過比較動(dòng)物模型的體外活性和體內(nèi)活性來測(cè)定本發(fā)明化合 物的有用的劑量。本領(lǐng)域中已知從小鼠的有效劑量外推至人體的有效 劑量的方法；例如，參見美國(guó)專利US4， 938，949。
一般而言，本發(fā)明化合物在液體組合物，諸如洗劑中的濃度在約 0. l-25wt-%，優(yōu)選約0.5-10 wt-%。在半固體或固體組合物，諸如凝 膠或粉末中的濃度在約0. 1-5 wt-%，優(yōu)選約0. 5-2. 5 wt-%。
無論是液體，還是固體，每單位劑量的組合物可以包含0. 1% — 99% 的活性物質(zhì)(化合物I或其鹽)，優(yōu)選的范圍在約10-60%。以組合物的 總重為基準(zhǔn)，組合物一般包含約15mg-約1， 500 mg重量的活性組分； 然而， 一般而言，優(yōu)選使用的劑量在約250 mg-l，OOO mg。在非腸道 給藥中，單位劑量通常為在適度酸化的無菌水溶液中或指定用于溶液 的可溶性粉冬形式的純化合物?？梢越o予用于注射、輸注或攝入的單 一劑量，即每天1-3次，以便對(duì)成年人產(chǎn)生約0.5-50 mg/kg的水平。
抗體的產(chǎn)生
本說明書中進(jìn)一步包括生產(chǎn)能夠同源性識(shí)別黃尿酸-8-O- P -D-糖 苷的抗體的方法。這類抗體可以包括，但不限于多克隆抗體、單克隆 抗體(mAbs)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(aV)2片段、
Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體和任意上述的表位結(jié) 合片段。例如，這類抗體可以用于檢測(cè)生物樣品中的黃尿酸-8-O- P -D-糖苷，或者用作抑制異常黃尿酸-8-0-p-D-糖苷活性的方法。因此， 這類抗體可以作為疾病治療方法的組成部分使用，和/或可以作為診斷 技術(shù)的組成部分使用，由此可以測(cè)試患者的異常黃尿酸-8-0-p-D-糖 苷水平。
為了生產(chǎn)抗體，可以通過使用例如水溶性碳二亞胺，諸如EDC活 化黃尿酸-8-0- P -0-糖苷的羧基形成黃尿酸-8-0- P -D-糖苷生物綴合 物免疫原而產(chǎn)生黃尿酸-8-O- p -D-糖苷與例如載體蛋白，諸如KLH或 卵清蛋白的綴合物。例如，可以通過在輔助方案中注射黃尿酸-8-0-P 糖苷生物綴合物免疫原給各種宿主動(dòng)物免疫接種。這類宿主動(dòng)物 包括家兔、小鼠、大鼠、山羊和小雞等。各種佐劑可以用于增加免疫 反應(yīng)，這取決于宿主種類，包括，但不限于弗氏(完全和不完全)；礦 物凝膠，諸如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，諸如溶血卵磷脂、普盧蘭尼 克多元醇類、聚陰離子、肽類、油乳劑、鑰孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚 和可能有用的人佐劑，諸如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌 (Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體為來源于免疫接種抗原，諸如黃尿酸-8-0- P -D-糖苷 生物綴合物免疫原的動(dòng)物血清的抗體分子異源群體。為了生產(chǎn)多克隆 抗體，可以通過注射補(bǔ)充了也如上所述的佐劑的黃尿酸-8-0-p-D-糖 苷生物綴合物免疫原給諸如如上所述的那些宿主動(dòng)物免疫接種。
使用宿主動(dòng)物生產(chǎn)針對(duì)抗原的多克隆抗體的方法一般為本領(lǐng)域公 知的。在典型制備中，將黃尿酸-8-O-p-D-糖苷生物綴合物免疫原中 的一種或多種導(dǎo)入哺乳動(dòng)物或鳥類宿主。合適的宿主包括例如猴、 牛、家兔、大鼠、小鼠等。該步驟通常通過皮下注射作為在已經(jīng)用例 如弗氏完全佐劑乳化的鹽水中的溶液進(jìn)行。隨后的動(dòng)物抗體滴度遵循 ELISA。在幾周后，將加強(qiáng)注射在例如弗氏不完全佐劑中的黃尿酸-8-0-P-D-糖苷生物綴合物免疫原用于增加抗體滴度。通過在約1個(gè)月后對(duì) 動(dòng)物釆血收集抗體。使全血在25X:下凝塊幾小時(shí)。加入硫酸銨水溶液 以便獲得40%重量的水溶液和IgG級(jí)分沉淀。通過離心收集沉淀并且 重新懸浮于鹽水和緩沖溶液中至所需濃度。可以進(jìn)一步將純化的抗體級(jí)分用于診斷測(cè)定系統(tǒng)中。這類修飾以
包括連接酶，諸如lipozyme、乳過氧化物酶、堿性磷酸酶和用于ELISA 測(cè)定的其它酶?？梢杂脽晒獠糠中揎椏贵w。最好的情況是在抗體和抗 原結(jié)合時(shí)幹滅或強(qiáng)化熒光。這些用于測(cè)定抗體-抗原相互作用程度的技 術(shù)為本領(lǐng)域中公知的。本說明書中的黃尿酸-8-O-p-D-糖苷、黃尿酸 -8-0- P -D-糖苷綴合物和抗體也用于檢測(cè)和診斷各種鈉失衡病癥，特 別是提供用于測(cè)定技術(shù)，諸如ELISA或EMIT的校準(zhǔn)液的高度純的物質(zhì)。 可以通過經(jīng)在培養(yǎng)物中的連續(xù)細(xì)胞系提供生產(chǎn)抗體分子的任意技 術(shù)獲得對(duì)特定抗原而言為同型抗體群的單克隆抗體。它們包括，但不 限于(K5hler和Milstein， Nature, 256: 495-7 (1975);和美國(guó)專利 US4， 376， 110)的雜交瘤技術(shù)、人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等， Immunology Today, 4: 72 (1983) 5 Cote等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-30 (1983))和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中,Alan R. Liss， Inc., New York, pp. 77-96 (1985))。這類抗體可以屬于任意免疫球蛋白類型，包括IgG、 IgM、 IgE、 IgA、 IgD及其任意的亞類?？梢栽隗w外或體內(nèi)培養(yǎng)本說明 書中產(chǎn)生mAb的雜交瘤。體內(nèi)高滴度mAbs的產(chǎn)生使得它成為目前優(yōu)選 的生產(chǎn)方法。
此外，可以使用為生產(chǎn)"嵌合抗體"研發(fā)的技術(shù)(Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci.， 81 : 6851-6855 (1984); Takeda等，Nature, 314: 452-54 (1985)),通過下列步驟進(jìn)行剪接來自具有合適的抗原同 摔性的小鼠抗體分子的基因與來自具有合適的生物活性的人抗體分子 的基因。嵌合抗體為不同部分來源于不同動(dòng)物種類的分子，諸如那些 具有可變區(qū)來源于鼠mAb和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。
或者，可以釆用對(duì)生產(chǎn)單鏈抗體描述的技術(shù)(美國(guó)專利 US4，946， 778; Bird, Science 242: 423—26 (1988); Huston等，Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 85: 5879-83 (1988);和Ward等，Nature, 334: 544-46 (1989))生產(chǎn)基因-單鏈抗體。 一般通過經(jīng)氨基酸橋連接Fv 區(qū)的重鏈和輕鏈片段形成單鏈抗體，得到單鏈多肽。
25可以通過公知技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別特異性表位的抗體片段。例如，這類 片段包括，但不限于可以通過對(duì)抗體分子進(jìn)行胃蛋白酶消化產(chǎn)生的
F(ab02片段和通過還原F(ab')2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段?；?者，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，Science, 246: 1275-81 (1989)) 以便能夠快速和易于鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
根據(jù)綴合的便利性、更新率和測(cè)定未知物(分析物)的生理溶液的 不同，可以廣泛改變用于診斷試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或試劑盒的酶。選擇的有 代表性的酶包括在美國(guó)專利US3，817， 837中發(fā)現(xiàn)的水解酶、核酸酶、 酰胺酶、酯酶等，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
標(biāo)記如本文所述用于診斷試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或試劑盒的抗體的方法和 儀器可以在美國(guó)專利US4， 366，241中找到，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
診斷
本發(fā)明進(jìn)一步包括對(duì)可以用于建立與鈉失衡病癥的相關(guān)性的人體 液(全血、尿、csf、血清、血漿、目艮淚(ocular)、糞便、汗)中的黃 尿酸-8-0- P -D-糖苷進(jìn)行定量。這類病癥可以包括高血壓(低腎素、低 血管緊張素)、充血性心力衰竭(水腫)、腎病綜合征、肝硬化 (cirrosis )、月經(jīng)前期水肺、周期性水腫和心源性休克。黃尿酸-8-0-P-D-糖苷定量可以證實(shí)有用的其它臨床情況包括手術(shù)后環(huán)境和戰(zhàn)場(chǎng) 環(huán)境，其中給予患者過多的流體；和保鉀與呋塞米給藥。黃尿酸-8-0-P-D-糖苷定量還可以用于"逃逸綜合征"，其中胂瘤不適當(dāng)?shù)卦鲩L(zhǎng)，影 響醛甾酮；然后是鈉排泄減少，從而導(dǎo)致在心血管系統(tǒng)中增加2升的 流體潴留。此時(shí)，因?qū)е铝黧w和鈉缺失和由此維持2升的超負(fù)荷狀態(tài) 而發(fā)生"逃逸"。提出了超負(fù)荷流體狀態(tài)導(dǎo)致黃尿酸-8-0-p-D-糖苷增 加，由此通過刺激鈉排泄和伴隨的流體丟失而導(dǎo)致"逃逸"。
各種方法可以用于診斷與黃尿酸-8-0-p-D-糖苷過量或缺乏相關(guān)
的疾病情況。
例如，可以通過使用預(yù)包裝的診斷試劑盒進(jìn)行本文所述的方法，該試劑盒包含至少一種本文所述的特異性抗體試劑，例如，它可以便 利地在臨床環(huán)境中使用，以便診斷表現(xiàn)出疾病癥狀或處于發(fā)生疾病風(fēng) 險(xiǎn)中的患者。
在下述診斷中可以使用任意的人體生物樣品或組織。例如，可以 使用血液、尿、唾液、腦脊髓液、血清、血漿、眼淚、糞便或汗。
用于檢測(cè)生物樣品中黃尿酸-8-0- P -D-糖苷的診斷方法可以包 括例如免疫測(cè)定，諸如包括固相酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的異相酶 免疫測(cè)定；和包括酶放大免疫測(cè)定技術(shù)(EM I T)的溶液相同相酶免疫測(cè) 定?？梢酝ㄟ^高效液相色i普法(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)或任選例如通 過固相提取對(duì)尿樣進(jìn)行預(yù)處理的毛細(xì)管電泳-質(zhì)鐠(CE-MS)測(cè)定黃尿酸 -8-0-p-D-糖普。此外，可以研發(fā)表面等離振子共振(SPR)技術(shù)，其中 基于芯片的光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)用于研究黃尿酸-8-0- p -D-糖苷結(jié)合 靶膜分子的的功能特性，其中黃尿酸-8-0- P -D-糖普源來自不純的混 合物，諸如血清、尿和細(xì)胞培養(yǎng)基。SPR技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)和表征不同細(xì) 胞類型中的黃尿酸-8-0- p -D-糖苷的膜受體。
黃尿酸-8-0-p-D-糖苷的免疫測(cè)定一般包括孵育生物樣品，諸
如生物流體、組織提取物、新鮮收集的細(xì)胞或已經(jīng)在有能夠鑒定黃尿 酸一8一0—P一D一糖苷的可檢測(cè)標(biāo)記的抗體存在下的組織培養(yǎng)物中孵育的
細(xì)胞；并且通過本領(lǐng)域眾所周知的許多技術(shù)檢測(cè)結(jié)合抗體。
可以使生物樣品接觸并且固定在固相支持體或載體上，諸如硝化 纖維或其它能夠固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇苄缘鞍椎墓滔嘀С煮w。然 后用合適的緩沖液洗滌支持體，隨后用可檢測(cè)標(biāo)記的基因-特異性抗體 處理。然后用緩沖液第二次洗滌固相支持體以便除去未結(jié)合的抗體。 然后可以通過常規(guī)方式檢測(cè)固相支持體上結(jié)合的標(biāo)記的量。
術(shù)語"固相支持體或載體"用以包括能夠結(jié)合抗原或抗體的任意支 持體。眾所周知的支持體或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、葡聚 糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰胺類、輝長(zhǎng)巖和磁 石。就本說明書至的目的而言，載體的性質(zhì)可以為可溶至一定程度的 或不溶性的。支持體材料實(shí)際上可以具有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要偶聯(lián)的分子能夠結(jié)合抗原或抗體。因此，支持體構(gòu)型可以為珠的球形 或在試管的內(nèi)表面為圓柱形，在外表面為柱形?；蛘?，表面可以為平 坦的，為片、試驗(yàn)帶等。優(yōu)選的支持體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù) 人員了解許多其它合適的結(jié)合抗體或抗原的載體或能夠通過使用超過 實(shí)驗(yàn)確定。
實(shí)際上，微量滴定板常用于許多免疫測(cè)定。可以通過非共價(jià)或共
價(jià)結(jié)合固定錨定的成分?？梢员憷赝ㄟ^用黃尿酸-8-0- P -D-糖苷生 物綴合物涂敷固體表面并且干燥進(jìn)行非共價(jià)結(jié)合?；蛘?，對(duì)黃尿酸 一8一0— p -D-糖苷具有特異性的固定化抗體，優(yōu)選單克隆抗體可以用于 錨定固體表面。預(yù)先制備表面并且儲(chǔ)存。為了進(jìn)行本試驗(yàn)，將未固定 的成分加入到包含錨定成分的涂敷的表面上。在反應(yīng)完成后，在任何 形成的復(fù)合物保持固定在固體表面上的條件下除去未反應(yīng)的成分(例 如通過洗滌)。可以按照許多方式對(duì)錨定在固體表面上的復(fù)合物進(jìn)行檢 測(cè)。如果預(yù)先標(biāo)記了預(yù)先未固定的成分，那么檢測(cè)表面上固定的標(biāo)記 表明形成復(fù)合物。如果預(yù)先未標(biāo)記預(yù)先未固定的成分，那么，例如， 間接標(biāo)記可以用于使用對(duì)預(yù)先未固定的成分具有特異性的標(biāo)記抗體檢 測(cè)表面上錨定的復(fù)合物(由此可以使用標(biāo)記的抗-Ig抗體直接標(biāo)記或 間接標(biāo)記抗體)。
例如，竟?fàn)幮砸种茰y(cè)定通常用于測(cè)定小分析物，諸如黃尿酸-8-0-p-D-糖苷，因?yàn)榫範(fàn)幮砸种茰y(cè)定僅需要結(jié)合一種抗體而非如標(biāo)準(zhǔn) ELISA反式中的兩種。由于在兩種抗體嘗試同時(shí)結(jié)合小分子時(shí)出現(xiàn)位 阻的可能性，所以夾心式測(cè)定方式并不切實(shí)可行，因此，優(yōu)選竟?fàn)幮?抑制測(cè)定。在連續(xù)竟?fàn)幮砸种茰y(cè)定中，如幾小時(shí)測(cè)定的步驟加入樣品 和綴合的分析物，而在傳統(tǒng)的竟?fàn)幮砸种茰y(cè)定中，同時(shí)共同孵育這些 試劑。
在連續(xù)的竟?fàn)幮砸种茰y(cè)定方式中，將單克隆抗體(MAb)包被在96-孔微量滴定板上。當(dāng)加入樣品時(shí)，Mab俘獲樣品外部游離的分析物。 在下一步中，加入用生物素或HRP標(biāo)記的已知量的分析物。然后還嘗 試標(biāo)記的分析物結(jié)合吸附在平板上的Mab，然而，因通過存在的來自樣品的預(yù)先結(jié)合的分析物結(jié)合Mab而抑制了標(biāo)記的分析物。這意味著 如果單克隆抗體已經(jīng)結(jié)合了另作樣品的未標(biāo)記的分析物，那么標(biāo)記的 分析物無法由平板上的單克隆抗體結(jié)合。樣品中未標(biāo)記的分析物的量 與標(biāo)記的分析物產(chǎn)生的信號(hào)成反比。信號(hào)越弱，則樣品中存在的未標(biāo) 記的分析物越多?？梢允褂眠B續(xù)稀釋的未標(biāo)記的分析物標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo) 準(zhǔn)曲線。然后在夾心式ELISA方式中進(jìn)行時(shí)，讀出樣品值。
傳統(tǒng)的竟?fàn)幮砸种茰y(cè)定方式需要同時(shí)加入標(biāo)記的(綴合的分析物) 和未標(biāo)記的分析物(來自樣品)。標(biāo)記的和未標(biāo)記的分析物隨后同時(shí)竟 爭(zhēng)平板上單克隆俘獲抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。類似于連續(xù)竟?fàn)幮砸种品绞剑?著色的信號(hào)與樣品中未標(biāo)記的靶分析物濃度成正比。
可以過氧化物酶底物，諸如TMB對(duì)標(biāo)記的分析物進(jìn)行檢測(cè)，可以 使用在微量滴定平板讀出器上讀取。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(l個(gè)空白和 7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品)和3個(gè)對(duì)照組，96-孔微量滴定板方式可以一式三份測(cè)試 21份樣品并且一式兩份測(cè)試37份樣品。
作為另一個(gè)實(shí)例，用于本說明書的抗體或抗體片段可以用于定量 或定性檢測(cè)存在的黃尿酸-8-0-p-D-糖苷。例如，可以通過應(yīng)用與光 學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或熒光檢測(cè)偶聯(lián)的熒光標(biāo)記抗體(參見下文) 的免疫熒光技術(shù)進(jìn)行。
另外，如在免疫熒光或免疫電子顯微術(shù)中，用于本說明書的抗體 (或其片段)以組織學(xué)方式應(yīng)用于原位檢測(cè)黃尿酸-8-0- P -D-糖苷?？?以通過從環(huán)狀中取出組織樣本并且將其施用于本說明書中的標(biāo)記抗體 來進(jìn)行原位檢測(cè)。優(yōu)選通過將標(biāo)記的抗體(或片段)涂布在生物樣品上 施用抗體(或片段)。通過使用這類操作步驟，不僅能夠測(cè)定存在的黃 尿酸-8-0-p-D-糖苷，而且能夠測(cè)定其在檢驗(yàn)組織中的分布。使用本 說明書披露的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解任意各種方法(諸如染色 操作步驟)可以改變以便進(jìn)行這類原位檢測(cè)。
和最佳測(cè)定條件。
可檢測(cè)地標(biāo)記基因肽-特異性抗體的方式之一通過將其與酶連接并且在酶免疫測(cè)定(EIA)中使用它來進(jìn)行(Voller， Ric Clin Lab， 8:289-98 (1978) ["The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Diagnostic Horizons 2: 1-7， 1978， Microbiological Associates Quarterly Publication， Walkersvi 1 le， Md. ] j Voller等，J. Clin. Pathol. ， 31 :507-20 (1978) ; Butler, Meth. EnzymoL， 73:482-523 (1981); Maggio(ed. )， Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton， FIa. (1980); Ishikawa等，(eds.) Enzyme Immunoassay, Igaku-Shoin， Tokyo (1981))。結(jié)合抗體的酶與合適的底物，優(yōu)選顯色 底物以如可通過分光光度法、熒光法或視覺方式檢測(cè)的化學(xué)部分的方 式反應(yīng)。可以用于檢測(cè)標(biāo)記抗體的酶包括，但不限于蘋果酸脫氫酶、 葡萄球菌核酸酶、5-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、oc-磷酸甘 油、脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬 酰胺酶、葡萄糖氧化酶、p-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化 氫酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶?？梢酝ㄟ^ 使用酶的顯色底物的比色法進(jìn)行檢測(cè)。還可以通過與類似制備的標(biāo)準(zhǔn) 品比較的底物的酶促反應(yīng)程度的視覺比較進(jìn)行檢測(cè)。
還可以使用任意各種其它免疫測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。例如，通過放射性 標(biāo)記抗體或抗體片段，能夠通過使用放射性免疫測(cè)定(RIA)檢測(cè)黃尿酸 -8-0- p -D-糖苷{(diào)例如，參見Weintraub， B. ， Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986}。 可以 通過諸如使用Y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過放射自顯影術(shù)這類方式檢 測(cè)放射性同位素。
還能夠用熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體接觸適當(dāng)波長(zhǎng) 的光時(shí)，其存在可以因熒光而奪得檢測(cè)。在最常用的熒光標(biāo)記化合物 中有異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、 鄰苯二醛和熒光胺。
還可以使用熒光發(fā)射金屬，諸如i"Eu或鑭系的其它元素可檢測(cè)地 標(biāo)記抗體?？梢允褂弥T如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺-四乙酸(EDTA)這類金屬螯合基團(tuán)結(jié)合這些金屬。
還可以通過使抗體與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)可檢測(cè)地標(biāo)記抗體。然
體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例為魯米諾、異氨基 苯二酰肼、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶銀鹽和草酸酯。
同樣，生物發(fā)光化合物可以用于標(biāo)記本說明書中的抗體。生物發(fā) 光為生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光，其中催化蛋白增加了化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 的效率。通過檢測(cè)存在的發(fā)光測(cè)定生物發(fā)光蛋白的存在。用于標(biāo)記目 的的重要室生物發(fā)光化合物為熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。
在本申請(qǐng)的上下文中，將各種參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng) 稱作鑒定的引證文獻(xiàn)。將本申請(qǐng)中這些參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利 說明書披露的內(nèi)容引入本說明書作為參考，以便更完整地描述本說明 書涉及的本領(lǐng)域的狀態(tài)。
因黃尿酸-8-O-p-D-糖苷的尺寸較小而可以使用酶放大免疫測(cè)定 技術(shù)(EMIT)。各種EMIT方法可以用于定性和定量測(cè)定，例如通過Dias 等所述的方法(參見Dias等，"The EMIT Cyclosporine Assay: development of application protocols for the Boehringer Mannheim Hitachi 911 and 917 analyzers" Clin. Biochem. 1997 Mar; 30 (2): 155-62)。臨床環(huán)境中EMIT的優(yōu)點(diǎn)包括(1)最少或無 樣品制備；(2)小的樣品大?。?3)與其它方法，諸如HPLC和RIA 極佳的相關(guān)性；(4)因無需分類游離和結(jié)合酶標(biāo)記而快速的時(shí)間(少于 l分鐘)，易于適合于最一般的化學(xué)分析儀。
表面等離振子共振(SPR)也可以用于檢測(cè)作為與固定化黃尿酸 -8-0- P -D-糖苷特異性抗體的溶液相相互作用物的黃尿酸-8-0- P -D-糖苷。McDonne 11和R i ch等的技術(shù)可以用于SPR法的發(fā)展(McDonne 11 ， J.M. ， "Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Current Opinion in Chemical Biology, 2001. 5 (5): p. 572-577; Rich, R丄， 等，"High—resolution and high—throughput protocols for
31measuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE'1 Analytical Biochemistry, 2001. 296 (2): p. 197-207)?？梢詷?gòu)建 各種流通細(xì)胞并且與商購(gòu)SPR生物傳感器，諸如具有商標(biāo)Biocore的 儀器一起的置于線上?？梢詫⑻禺愋钥贵w固定在形成流動(dòng)細(xì)胞的一側(cè) 壁的SPR-活性金包被的載玻片上；并且注射在含水緩沖液中的分析物 黃尿酸-8-O-p-D-糖苷以便流過流動(dòng)的細(xì)胞。當(dāng)光(可見或近紅外)通 過載玻片照射和以接近所謂的"表面等離振子共振"條件的角度和波長(zhǎng) 照射在金表面時(shí)，金的光學(xué)反射率極為敏感地隨金表面上或金上薄涂 層中存在的生物分子而改變。易于通過監(jiān)測(cè)這一反射率改變來觀察和 定量溶液相相互作用物與固定化抗體之間的結(jié)合程度。
高效液相色譜法(HPLC)可以用于檢測(cè)尿中的黃尿酸-8-0-b-D-糖 苷。例如，可以使用ds柱上的尿樣固相提取和隨后通過陽離子交換樹 脂柱?？梢酝ㄟ^UV、熒光或光散射技術(shù)進(jìn)行樣品檢測(cè)(例如，參見 Marsilio等，Clinical Chemistry. 1998; 44: 1685-1691)。還可以 將毛細(xì)管電泳(CE)或毛細(xì)管電泳-質(zhì)鐠(CE-MS)與通過固相提取任選預(yù) 處理的尿樣用于對(duì)生物樣品柱的黃尿酸-8-0- P -D-糖苷進(jìn)行定量(He 等，J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1999 Apr 30; 727 (l-2): 43-52; Theodoridis et al， J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 2000 Aug 4; 745 (1): 49-82.)。
現(xiàn)在參照下列非限制性實(shí)施例來描述本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1.黃尿酸8-0- P -D-糖苷的合成方案1，黃尿酸8-0- p -D-糖苷的合成
步驟1 :黃尿酸2,3, 4，6-四-O-乙酰基8-0-P -D-糖苷的合成(例 如，參見Real等，J. Biol. Chem. ， 1990， 265 (13)， 7407-7412)
黃尿酸通過商購(gòu)獲自Aldrich， Milwaukee, WI。將在lMNa0H(10 mL)中的黃尿酸(930 mg， 4.53 m邁ol)冷卻至前101C。在IO分鐘內(nèi)滴 加在丙酮(16 mL)中的2, 3，4，6-四-0-乙?；?-a-D-吡喃糖基溴 (2.03 g， 4.94 mmol)。在4小時(shí)內(nèi)將該溶液溫至室溫。在30分鐘內(nèi) 在緩慢加入1M NaOH水溶液(3 mL)并且將溶液攪拌30分鐘。用水和乙 醚萃取該混合物。將含水部分酸化至pH 3. 5并且進(jìn)一步用1: 1四氫呋 喃/乙酸乙酯萃取。用飽和NaCl水溶液洗滌合并的有機(jī)層并且用硫酸 鎂干燥。在過濾后，在真空中濃縮粗的黃尿酸四-0-乙?；?-p-D-糖 苷中間體而得到約1克的粗殘余物。將該殘余物與4: 1 二甲亞砜/水 (28mL)—起研磨，過濾并且干燥至得到215mg黃尿酸四-0-乙跣基8-P -D-糖苷，為黃白色固體中間體。用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)一步純 化母液以便再回收60 mg中間體(C18,含有0. 2%三氟乙酸的水/乙腈； 分步稀釋)，合并產(chǎn)率11.5%。
'H NMR (300 MHz DMSO-A) 5 1.97 (s, 3H), 1.99 (s， 3H)， 2.00 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 4.054.30 (m, 3H)， 5.07 (d, / = 9.6 Hz 1H), 5.23 (dd, / = 9.6, 7.8 Hz 1 H), S.44 (t /= 9.60 1H), 5.67 (d, /= 7.8 Hz 1 H), 6.65 (s, 1H), 7.37 (t, /= 8.1H)， 7.48 (dd， 7.5, 1.2 Hz, 1 H)， 7.81 (dd, /= 8.1, 1.2 Hz, 1 H), 9.44 (bs, 1 H). ESI-MS m/z 536.44 (M+H*).
步驟2:黃尿酸8-0-P-D-糖苷
將來自步驟1的黃尿酸2，3，4，6-四-0-乙?；鵇-糖苷
33(190 mg， 0. 35 mmol)加入到95%甲醇鈉(40mg， 0. 7 mmol)在曱醇(5 mL) 中的溶液中。將該混合物攪拌1小時(shí)。用1MHC1水溶液將該混合物調(diào) 整至pH 3.5。用20 mL乙醚稀釋淤漿并且過濾。用1 : 1甲醇/乙醚 洗滌濾餅并且在真空中干燥而得到118mg黃尿酸8-0-p-D-糖苷，產(chǎn) 率為82%。 FTIR(凈)，
3000-3700 (br s)， 3365， 2934, 1626, 1602 cm". 'H NMR (300 MHz, DMSCW(O S 3.10-3.70 (m, 6 H and H20)， 4.87 (d, /= 7.5 Hz, 1 H), 4.95 (m, 1 H)， 5.16 (m, 1 H), 5.33 (m, 1 H), 5.81 (m， 1 H)， 6.47 (s, 1H), 7.21 (t /= 8.0他，1 H)， 8.07 (d， / = 7.2 Hz> 1 H), 8.24 (dd, J= 8.4, 1.0 Hz> 1 H), 8.47 (s， <1H, 部分交換)，10.47 (br s, 1 H). I3C-NMR (75.4 MH^ DMSCk/" S 60.74,69.62, 73.49， 76.56' 77.66, 103.73, 107.73, 119.65， 122.72,126.79， 132.00， 146.24, 147,05,162.85， 166.88,178.33. 電噴射離子化質(zhì)諳(ES1-MS)368.31 (M+H+).
實(shí)施例2.黃尿酸8-0-硫酸鹽的合成
方案2:黃尿酸8-(H5克酸鹽的合成
在室溫下向黃尿酸(300 mg， 1.46 mmol)在2. 9 mL 1 N NaOH和 2. 1 mL dH20(去離子水)中的溶液中加入 sulf ertrioxide trimethylamine(407 mg， 2.92 mmol)和5 mL丙酮。在氮?dú)猸h(huán)境中密 封反應(yīng)器(20 x 125咖試管)并且在701C下攪拌16小時(shí)。將該反應(yīng)體 系冷卻至室溫并且在減壓下濃縮至干。用丙酮，乙腈，二氯曱烷，乙 酸乙酯且然后用乙醚連續(xù)洗滌殘余物。在真空中放置收集的固體過夜。 將該固體溶于3 mL dH20,上Sephadex SP-C25柱(4 x 11 cm， 40-125u)并且用dH20洗脫而得到標(biāo)題化合物的鈉鹽(474 mg， 1.44 mmol)， 產(chǎn)率為98.8%，為有光澤的棕色粉末，mp>250X:(分解)。
H NMR (300 MHz, D20) S 6.67 (br s, 1 H), 7.28 (br dd， / = 8.1, 7.8 Hz, 1 H), 7.56 (br d, 7.8 Hz, 1 H), 7.79 (br d， /= 8.1 Hz, 1 H). l3C NMR (75 MHz，D20)5 108.5， 122.1, 124.9 125.6, 126.1， 132.6 140.7, 144.7, 166.3, 181.0. IR (固體，cm-1) 2835， 2545, 1687, 1601, 1372， 1372' 1254.
實(shí)施例3.黃尿酸8-0-硫酸鹽和黃尿酸8-0- P -D-糖苷的分離 采集24小時(shí)期限內(nèi)來自人尿毒癥患者的尿樣。典型的釆集體積為 每位患者2-3升。將各樣品凍干并且用lOOinL去離子水再溶解。使用 凝膠過濾Sephadex G-25柱色i脊法對(duì)再溶解的樣品(25 mL上樣體積) 進(jìn)行大小級(jí)分分離，用pH 6. 8的10 mM乙酸銨在101C下洗脫，并且 通過UV在285 nm和電導(dǎo)下監(jiān)測(cè)。洗脫后(鹽峰值后)，篩選具有UV 活性和重量克分子滲透濃度〈100 mOsm的10 mL級(jí)分以〗更用于Bricker 等的蛙皮測(cè)定的生物活性(Kidney International Vol 44 (1993) Nov; 44 (5): 937-47)。通過凍干濃縮和用1 mL去離子水再溶解具有活性(各 10 mL)的級(jí)分。
使用高效液相色譜法(HPLC; lmL上樣體積)，用十八烷基甲硅烷 基(Phenomenex SphereClone 0DS2， 35"C)半-制備型HPLC柱以4 mL/ 分鐘對(duì)具有生物活性的再溶解的Sephadex G-25級(jí)分進(jìn)一步分級(jí)分離， 其中使用0. 1M乙酸吡咬銀曱醇梯度；0-40W曱醇/ll分鐘，采集2niL 級(jí)分。通過熒光(激發(fā)332 nm，在430 nm發(fā)射)和UV(338 nm)監(jiān)測(cè)洗 脫。從多次試驗(yàn)中采集到具有12.4分鐘保留時(shí)間(RT)的級(jí)分并且濃縮 約10-倍。將級(jí)分重新上上述HPLC系統(tǒng)，其中注射體積1 mL，以與 92% 0.1 M/ 8%甲醇以4 mL/分鐘等度模式運(yùn)行。使用332 nm激發(fā)， 430 nm發(fā)射監(jiān)測(cè)熒光。在338 nm監(jiān)測(cè)UV。這些最大值用于黃尿酸8-0-P-D-糖苷。在12秒(0.8 mL)級(jí)分中收集10-13分鐘之間的洗脫液。 11.2-11.6分鐘RT之間洗脫的級(jí)分包含黃尿酸8-0-p-D-糖普； 12. 0-12. 5分鐘之間洗脫的級(jí)分包含黃尿酸8-0-硫酸鹽。分別收集包含黃尿酸8-0- P -D-糖苷或黃尿酸8-0-硫酸鹽的級(jí)分并且通過介質(zhì)加 熱用Savant Speed-Vac Plus (SC210A)濃縮。使用反相C-18 HPLC柱: Phenomenex P/NO 00G-4375-EO， SYNERGI 4u Hydro-RP 80A 250 x 4. 6 mm， 4微米以分選等級(jí)將收集物再進(jìn)行等度HPLC。在35'C下用等度模 式以1 mL/分鐘與8%曱醇和0. 1% 0. 1M乙酸吡咬錯(cuò)進(jìn)行HPLC純化。通 過在338 nm處的UV吸收和332 nm激發(fā)，430 nm發(fā)射的熒光檢測(cè)監(jiān) 測(cè)洗脫。包含黃尿酸8-0- P -D-糖苷的級(jí)分具有的RT = 10. 2-10. 6分 鐘。來自單獨(dú)黃尿酸8-0-硫酸鹽試驗(yàn)的級(jí)分具有的RT = 11 -11.5分 鐘。收集級(jí)分并且用Speed-Vac濃縮，其中臨時(shí)添加吡啶以便增加pH。 將純化的黃尿酸8-O-p-D-糖苷再上相同的分析柱并且用20%在水中 的曱醇洗脫以便消除乙酸吡啶銪。在通過該技術(shù)濃縮時(shí)黃尿酸8-0-P -D-糖苷形成結(jié)晶。就分離的黃尿酸8-0-p-D-糖苷(dJ^N09)而言 ESI-MS(m/z) 367. 09， 368. 094 (M+H)和229 (M-葡萄糖+ Na+);
'H-NMR (500 E^O) 8 3.58 (dd, / = 9,9.5 Hz 1 H), 3.65 (dd, /= 9,9.5 1 H), 3.67 (m, 1 H), 3.80 (dd, 1H), 3.81(dd， /= 8,9.5Hz), 3.95 (dd， 1H), 5.24 (d, /= 8 Hz 1H), 6.93 (s， 1H)， 7.47 (t, /= 8 Hz, 1 H)， 7.59 (dd, /= 8, 2 Hz, 1H)， 7.卯 (dd, / = 8, 2他)ppm; "C-NMR (126 MH^ EbO/CDjOD) 5 60.8,69.7, 72.9, 75.7, 76.7, 101.2, 108.1, 117.9, 118.2， 124.5, 125.2, 130.6, 143.9, 145.5, 165.9, l肌3ppm.
就分離的黃尿酸8-0-硫酸鹽(C,。H7NO,S)而言ESI-MS (m/z) 284.994, 2S5.9訴(M+H*).
實(shí)施例4.在正常Sprague Dawley大鼠中對(duì)合成的黃尿酸8-0- p -D-糖苷(2 ug i.v.)的尿鈉排泄反應(yīng)
使用PE10管放置用乙醚和尾靜脈導(dǎo)管輕度麻醉的雌性Sprague Dawley大鼠(250 g)。另外，使用KY膠胨和2%利多卡因作為潤(rùn)滑劑插 入尿道導(dǎo)管。將大鼠限制在改進(jìn)的樹脂玻璃管內(nèi)，以便可以用1.5-mL 微量離心管采集尿。在0時(shí)以0. 02mL/分鐘開始鹽水輸注，持續(xù)試驗(yàn) 期限。將相同的i. v.導(dǎo)管用于注射測(cè)試化合物。在IO分鐘期限內(nèi)在 所示的時(shí)間注射在1-mL鹽水體積中的合成黃尿酸8-0-P-D-糖苷2 ug。以14,000 rpm離心管以便從尿中分離任何RBCs。使用相應(yīng)的離子選擇電極測(cè)定尿中的Na+和K+濃度。通過(vol尿/采集時(shí)間期限) x(離子尿濃度)計(jì)算Na+和K+排泄率。結(jié)果如附圖1-4中所示。2ug i.v. 的合成黃尿酸8-0-p-D-糖苷導(dǎo)致正常大鼠持續(xù)的尿鈉排泄反應(yīng)。更 因Na+尿濃度比附圖3和4中所示增加的尿體積增加而導(dǎo)致Na+排泄。 由于在250-g大鼠中指定了胞外體積為50 mL，所以測(cè)試化合物的濃 度為10—6 M，即可能的最小劑量。在一個(gè)類似的實(shí)驗(yàn)中，2 ug i.v.合 成的未衍生的黃尿酸不會(huì)增加Na+排泄。然而，隨后給予合成的黃尿酸 8-0- P -D-糖苷會(huì)導(dǎo)致尿鈉排泄。
實(shí)施例5.在正常Sprague Dawley大鼠中對(duì)合成的黃尿酸8-0-P-D-糖苷(IO ug i.v.)的尿鈉排泄反應(yīng)
使用PE10管放置用乙醚和尾靜脈導(dǎo)管輕度麻醉的雌性Sprague Dawley大鼠(250 g)。另外，使用KY膠胨和2%利多卡因作為潤(rùn)滑劑插 入尿道導(dǎo)管。將大鼠限制在改進(jìn)的樹脂玻璃管內(nèi)，以便可以用1.5-mL 微量離心管采集尿。在0時(shí)以0. 02 mL/分鐘開始鹽水輸注，持續(xù)試驗(yàn) 期限。將相同的i. v.導(dǎo)管用于注射測(cè)試化合物。在IO分鐘期限內(nèi)在 所示的時(shí)間注射在l-mL鹽水體積中的合成黃尿酸8-0-p-D-糖苷10 ug。在所示的時(shí)間時(shí)，鹽水輸注增加10倍至0.2 mL/分鐘，持續(xù)10 分鐘并且返，回到0.02 mL/分鐘，持續(xù)本試驗(yàn)的期限。以14, 000 rpm 離心管以便從尿中分離任何RBCs。使用相應(yīng)的離子選擇電極測(cè)定尿中 的Na+和K+濃度。通過(vol尿/采集時(shí)間期限)乂(離子尿濃度)計(jì)算^+ 和r排泄率。結(jié)果如附圖5-8中所示。10 ug i.v.的合成黃尿酸8-0-P -D-糖苷導(dǎo)致正常大鼠持續(xù)的尿鈉排泄反應(yīng)。K+排泄不會(huì)增加對(duì)黃尿 酸8—0一P一D一糖苷的反應(yīng)。附圖6中的起始尿鈉排泄反應(yīng)(10-20分鐘)
是因附圖8中所示的尿體積增加所致，而不因附圖7中所示的尿^+ 濃度所致。然而，截止到給藥后60-90分鐘，如附圖7中所示，尿鈉 增多是因尿Na+濃度增加所致。
在給藥后140分鐘尿產(chǎn)生減少，導(dǎo)致尿鈉排泄下降。然而，當(dāng)鹽 水輸注增加10倍至0. 2 mL/分鐘，持續(xù)10分鐘時(shí)，Na+排泄率從2 uEq/分鐘增加至10 uEq/分鐘，正如附圖6中觀察到的。這些數(shù)據(jù)與如下 構(gòu)思一致黃尿酸8-D-糖苷抑制遠(yuǎn)端小管上Na+重吸收，但如果 僅是水化作用，那么導(dǎo)致Na+排泄，并且GFR對(duì)達(dá)到遠(yuǎn)端小管的足夠流 體而言是充分的。
實(shí)施例6.在正常Sprague Dawley大鼠中對(duì)合成的黃尿酸8-0-P-D-糖苷(IO ug),隨后是呋塞米(IOO ug) (口服給藥)的尿鈉排泄反 應(yīng)
使乙醚輕度麻醉的雌性Sprague Dawley大鼠(250 g)并且使用KY 膠胨和2%利多卡因作為潤(rùn)滑劑插入尿道導(dǎo)管。將大鼠限制在改進(jìn)的樹 脂玻璃管內(nèi)，以便可以用1. 5-mL微量離心管采集尿。不給予鹽水輸注。 在l分鐘期限內(nèi)在所示的時(shí)間用加料針頭注射在l-mL體積水中的合成 黃尿酸8-0-p-D-糖苷。6分鐘后使用加料針頭類似地給予100 ug呋 塞米。以14, 000 rpm離心管以便從尿中分離任何RBCs。使用相應(yīng)的 離子選擇電極測(cè)定尿中的Na+和K+濃度。通過(vol尿/采集時(shí)間期限) x(離子尿濃度)計(jì)算Na+和K+排泄率。結(jié)果如附圖9-12中所示。合成黃 尿酸8-0- P -D-糖苷(10 ug)因在正常大鼠中產(chǎn)生尿鈉排泄反應(yīng)而具有 口服活性?？诜o藥后6分鐘，呋塞米(100ug)導(dǎo)致如附圖9-11中觀 察到的持續(xù)Na+排泄。用黃尿酸8-0-p-D-糖苷預(yù)治療，隨后用呋塞米 治療能夠使Na+排泄增加，但無法增加附圖10中的K+排泄。單獨(dú)口服 呋塞米導(dǎo)致Na+和K+均排泄(數(shù)據(jù)未顯示)。用黃尿酸8-0- p -D-糖苷 預(yù)治療抑制了呋塞米-誘導(dǎo)的K+排泄。
實(shí)施例7.在正常Sprague Dawley大鼠中對(duì)分離的黃尿酸8-0-P-D-糖苷(3 ug)，隨后是呋塞米(20 ug) (i.v.)的尿鈉排泄反應(yīng)
通過結(jié)扎一個(gè)腎和30-50%的第二個(gè)腎使225 g重的雌性 Sprague-Dawley大鼠發(fā)生尿毒癥。2周后，準(zhǔn)備對(duì)大鼠測(cè)試尿鈉排泄 活性。使用PE10管放置用乙醚和尾靜脈導(dǎo)管輕度麻醉的大鼠。另外， 使用KY膠胨和2%利多卡因作為潤(rùn)滑劑插入尿道導(dǎo)管。將大鼠限制在
38改進(jìn)的樹脂玻璃管內(nèi)，以便可以用1.5-mL微量離心管采集尿。在0 時(shí)以0. 02mL/分鐘開始鹽水輸注，持續(xù)試驗(yàn)期限。將相同的i.v.導(dǎo)管 用于在IO分鐘期限內(nèi)在所示的時(shí)間注射在l-mL鹽水體積中的分離的 黃尿酸8-0-P-D-糖苷。2小時(shí)后，以相同方式注射20ug呋塞米。以 14， 0 0 0 rpm離心管以便從尿中分離任何RBCs 。使用相應(yīng)的離子選擇電 極測(cè)定尿中的Na+和K+濃度。通過(vol尿/釆集時(shí)間期限)x(離子尿濃 度)計(jì)算Na+和K+排泄率。
結(jié)果如附圖13-16中所示。3 ug i. v.分離的黃尿酸8-0-p-D-糖 苷在尿毒癥大鼠中產(chǎn)生持續(xù)的尿鈉排泄反應(yīng)。Na+排泄時(shí)程在如附圖13 中所示尿毒癥大鼠中在70分鐘時(shí)達(dá)到峰值，這與附圖1中所示的合成 黃尿酸8-0-p-D-糖苷在正常大鼠中的時(shí)程類似。附圖14和15中的 K+排泄不會(huì)增加作為對(duì)分離的黃尿酸8-0-p-糖苷的反應(yīng)。對(duì)呋塞米的 利尿反應(yīng)在其時(shí)程與Na+排泄方面是典型的。 一般而言，呋塞米還使 K+排泄達(dá)K+補(bǔ)充為呋塞米臨床應(yīng)用中必不可少的程度。在正常大鼠中 的類似作用例示在附圖25(僅呋塞米)中。在附圖14和15中所示的本 試驗(yàn)中，用黃尿酸8-O-p-D-糖苷預(yù)治療，隨后用呋塞米治療防止了 典型的K+排泄增加。
實(shí)施例8.在尿毒癥SpragueDawley大鼠中對(duì)分離的黃尿酸8-0-硫酸鹽(2. 0 ug) (i. v.給藥)的Na+和r尿排泄反應(yīng)
通過結(jié)扎一個(gè)腎和30-50%的第二個(gè)腎使225 g重的雌性 Sprague-Dawley大鼠發(fā)生尿毒癥。2周后，準(zhǔn)備對(duì)大鼠測(cè)試尿鈉排泄 活性。使用PE10管放置用乙醚和尾靜脈導(dǎo)管輕度麻醉的大鼠。另外， 使用KY膠胨和2%利多卡因作為潤(rùn)滑劑插入尿道導(dǎo)管。將大鼠限制在 改進(jìn)的樹脂玻璃管內(nèi)，以便可以用1.5-mL微量離心管采集尿。在0 時(shí)以0. 02mL/分鐘開始鹽水輸注，持續(xù)試驗(yàn)期限。將相同的i.v.導(dǎo)管 用于注射測(cè)試化合物。在IO分鐘期限內(nèi)在所示的時(shí)間注射在l-mL鹽 水體積中的分離的黃尿酸8-O-硫酸鹽2ug。然后使鹽水是輸注返回到 0.02mL/分鐘，持續(xù)本試驗(yàn)期限。以14， 000 rpm離心管以便從尿中分離任何RBCs。使用相應(yīng)的離子選擇電極測(cè)定Na+和K+排泄率。通過(vol 尿/采集時(shí)間期限)x(離子尿濃度)計(jì)算Na+和K+排泄率。
結(jié)果如附圖17-20中所示。分離的黃尿酸8-O-硫酸鹽(2ug， i. v.) 在尿毒癥大鼠中產(chǎn)生持續(xù)的尿鈉排泄反應(yīng)。尿鈉排泄的時(shí)程在30分鐘 內(nèi)達(dá)到峰值且然后在治療的70分鐘內(nèi)接近控制水平，正如附圖17和 18中觀察到的。K+排泄不會(huì)增加對(duì)分離的黃尿酸8-0-硫酸鹽的反應(yīng)， 正如附圖18和19中所示。
實(shí)施例9.在正常Sprague Dawley大鼠中對(duì)分離的黃尿酸8-0-硫酸鹽(20 ug) (口服給藥)的Na+和K+尿排泄反應(yīng)
使用乙醚輕度麻醉雌性Sprague Dawley大鼠(250 g)并且使用KY 膠胨和2%利多卡因作為潤(rùn)滑劑插入尿道導(dǎo)管。將大鼠限制在改進(jìn)的樹 脂玻璃管內(nèi)，以便可以用1.5-mL微量離心管采集尿。不給予鹽水輸注。 在1分鐘期限內(nèi)在所示的時(shí)間用加料針頭注射在1 -mL體積水中的合成 黃尿酸8-0-硫酸鹽。以14， 000 rpm離心管以便從尿中分離任何RBCs。 使用相應(yīng)的離子選擇電極測(cè)定尿中的Na+和K+濃度。通過(vol尿/釆集 時(shí)間期限)x(離子尿濃度)計(jì)算Na+和K+排泄率。結(jié)果如附圖21-24中 所示。黃尿酸8-0-硫酸鹽(20 ug)在導(dǎo)致正常大鼠尿鈉排泄反應(yīng)方面 不具有口服活性。特別地，在附圖21中Na+尿濃度保持低于50 mM， 而在i. v.給予的黃尿酸8-0-硫酸鹽中，Na+尿濃度在附圖19中從60mM 增加至160mM。此外，黃尿酸8-0-p-D-糖苷在正常大鼠中因附圖11 中的將Na+尿濃度增加至160 mM而具有口服活性。
實(shí)施例10.對(duì)黃尿酸8-0-p-D-糖苷和黃尿酸8-硫酸鹽的多克隆 抗體產(chǎn)生方案
下列方案描述了在研發(fā)用于檢測(cè)和測(cè)定尿和血漿中黃尿酸8-0-P -D-糖苷的ELISA測(cè)定法過程中產(chǎn)生對(duì)黃尿酸8-0- p -D-糖苷的多克 隆抗體。黃尿酸8-0-p-D-糖苷與大蛋白質(zhì)KLH共價(jià)連接而在家兔中 引起免疫反應(yīng)。此外，SBA用作黃尿酸8-0-P-D-糖苷與KLH之間的間
40隔臂(12 A)。間隔臂能夠在免疫反應(yīng)中更好地呈遞黃尿酸8-0-p-D-糖苷。在抗體反應(yīng)篩選過程中，黃尿酸8-0-P-D-糖苷類似地與隨后 包被在ELISA孔上的BSA連接。然后通過孵育具有與黃尿酸8-0- P -D-糖苷綴合的BSA的家兔血清篩選家兔血清的黃尿酸8-0-p-D-糖苷抗 體。通過結(jié)合與指示器酶辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊-抗-家兔抗 體檢測(cè)這些家兔抗體。將底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)與HRP —起賻育并且 在400 nm處測(cè)定產(chǎn)物。
一旦測(cè)定了對(duì)黃尿酸8-0-p-D-糖苷的抗-血清滴度，就通過竟?fàn)?性ELISA，使用特異性多克隆抗體測(cè)試尿樣中存在的黃尿酸8-0-P-D-糖苷。通過ELISA驗(yàn)證黃尿酸8-O-0-D-糖苷通過最新的HPLC方法與 熒光檢測(cè)來進(jìn)行。這種HPLC方法起出在分離人尿中黃尿酸8-0- P -D-糖苷中研發(fā)。還可以檢驗(yàn)?zāi)驑又械狞S尿酸8-0-p-D-糖苷的UV光鐠。 通過最新HPLC方法，尿中黃尿酸8-0-p-D-糖苷的檢測(cè)限2. 7uM,其 中無固相提取(SPE)。預(yù)計(jì)SPE將HPLC檢測(cè)限降至nM。
通過ELISA和SPE/HPLC技術(shù)建立黃尿酸8-0- P -D-糖苷和黃尿酸 8-石危酸鹽的臨床血漿和尿水平。
權(quán)利要求
1. 藥物組合物，包含治療有效量的式I的化合物或其前體藥物或藥學(xué)上可接受的鹽其中R1、R2、R3、R5、R6和R7獨(dú)立為X3R，其中R選自H、鹵素；任選取代的糖、脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基；-P(O)(ORa)(ORb)和-NRaRb，其中Ra和Rb獨(dú)立為H、任選取代的脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；X1、X2和X3獨(dú)立為-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-OS(O)y-、-S(O)y-、-O-、-NHC(O)-、-NHC(O)O-、-S(O)2NH-、鍵或不存在；其中y為0-3的整數(shù)；且R4和R8獨(dú)立為H、(＝O)；羥基；或任選取代的糖、脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或-P(O)(ORa)(ORb)或-NRaRb，其中Ra和Rb獨(dú)立為H或任選取代的脂族化合物、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；和藥學(xué)上可接受的載體。
2. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中Ri、 R3、 R5、 R6和R7獨(dú) 立為H或面素。
3. 權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中Xi不存在或?yàn)殒I并且R4為羥基或H))。
4. 權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其中R2為-C(O)OR。
5. 權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中R2為-C(0)OH。
6. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中R8為任選取代的糖。
7. 權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中X2為-0-并且Rs為任選取 代的單糖。
8. 權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中R8為己醛吡喃糖、戊醛吡喃糖、戊醛呋喃糖或酮糖。
9. 權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中Rg為糖苷。
10. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中式I的化合物為黃尿酸 8-0-P-D-糖苷。
11. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中式X3為-0S(0)y。
12. 權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中式I的化合物為黃尿酸 8-0-硫酸鹽。
13. 藥物組合物，包含(1)治療有效量的式I的化合物或其前體藥物或藥學(xué)上可接受的鹽其中Ri、 R2、 R3、 R5、 R6和R7獨(dú)立為X3R其中R選自H、卣素； 任選取代的糖、脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基； -P(0》(0R" (OR"和-NITRb，其中r和r獨(dú)立為H、任選取代的脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；Xi、 X2和X3獨(dú)立為-C(0)0-、 -OC(O)-、 -C(O)NH-、 -NHC(O)-、-OC (0) NH-、 -NHC (0) 0-、 -OS (0) y-、 -S (0) y-、 -0-、-匪C (0) -、 -NHC (0) 0-、-S(0)2NH-、鍵或不存在；其中y為0-3的整數(shù);且R4和R8獨(dú)立為H、 (-0);羥基；或任選取代的糖、脂族化合物、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或-P(O) (0Ra) (OR》或-NRaRb，其中Ra 和Rb獨(dú)立為H或任選取代的脂族化合物、環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；(2)—種或多種額外的利尿化合物或心血管化合物；和 藥學(xué)上可接受的載體。
14. 權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中額外的利尿化合物選自 髓袢利尿劑、噻溱類利尿劑、保鉀利尿劑、碳酸酐酶抑制劑和滲透壓性 利尿劑。
15. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中額外的利尿化合物選自 呋塞米、布美他尼、托塞米、地尼酸、氯噻溱、氫氯噻溱、螺內(nèi)酯、阿 米洛利、氨苯喋啶、乙酰唑胺、醋甲唑胺、二氯磺胺、氫氟噻嗪、甲氯 噻嗪、吲達(dá)帕胺、美托拉宗、泊利噻溱、氯噻酮、多佐胺、布林唑胺、 甘油、甘露糖和脲。
16. 權(quán)利要求14所述的藥物組合物，其中額外的利尿化合物為呋 塞米。
17. 權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中額外的心血管藥選自血 管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑和p-腎上腺素能阻 滯劑。
18. 權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中額外的心血管藥為賴諾 普利、莫昔普利、依那普利、厄貝沙坦、纈沙坦、氯沙坦、納多洛爾、 普萘洛爾、阿替洛爾、嗎洛爾或比索洛爾。
19. 治療、控制或預(yù)防哺乳動(dòng)物高血壓、水腫、急性腎衰竭、充血 性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹水、眼內(nèi)壓上升、腎病綜合征或涉及流體/鈉平衡失調(diào)的其它疾病狀態(tài)的方法，包含給予藥物有效量的權(quán)利要求1 的藥物組合物。
20. 治療、控制或預(yù)防哺乳動(dòng)物高血壓、水腫、急性腎衰竭、充血 性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹水、眼內(nèi)壓上升、腎病綜合征或涉及流體 /鈉平衡失調(diào)的其它疾病狀態(tài)的方法，包含給予藥物有效量的權(quán)利要求 13的藥物組合物。
21. 對(duì)需要的患者進(jìn)行利尿的方法，包含給予藥物有效量的權(quán)利要 求1的藥物組合物。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的患者具有下列疾病中的 一種或多種高血壓、水腫、急性腎衰竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰 竭、腹水、眼內(nèi)壓上升或腎病綜合征。
23. 對(duì)需要的患者進(jìn)行利尿的方法，包含給予藥物有效量的權(quán)利要 求13的藥物組合物。
24. 權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的患者具有下列疾病中的 一種或多種高血壓、水腫、急性腎衰竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰 竭、腹水、眼內(nèi)壓上升或腎病綜合征。
25. 特異性結(jié)合黃尿酸-8-0-p-D-糖普的分離抗體。
26. 權(quán)利要求25所述的抗體，為單克隆抗體。
27. 權(quán)利要求25所述的抗體，為多克隆抗體。
28. 用于測(cè)定血清樣品中黃尿酸-8-O-p-D-糖苷的診斷試劑盒，包 含一種或多種針對(duì)黃尿酸-8-O- P -D-糖苷的單克隆抗體。
29. 測(cè)定人血清樣品中存在的黃尿酸-8-O-p-D-糖苷的方法，包含a. 獲得人血清樣 品;b. 使人血清樣品接觸一種或多種特異性識(shí)別黃尿酸-8-O- P -D-糖 苷的抗體，所述的一種或多種抗體存以預(yù)定量存在，使得一種或多種抗 體的部分保持不與存在于樣品中的人黃尿酸-8-0-p-D-糖苷復(fù)合；和c. 測(cè)定未復(fù)合的一種或多種抗體的量，以便測(cè)定人血清樣品中的 黃尿酸-8-0-P-D-糖苷。
30. 用于監(jiān)測(cè)或檢測(cè)與黃尿酸-8-O-p-D-糖苷異常水平相關(guān)的疾 病的方法，該方法包含a. 使生物樣品接觸針對(duì)黃尿酸-8-糖苷的抗體；和b. 用單克隆抗體檢測(cè)所述生物樣品中的黃尿酸-8-0- P -D-糖苷水 平，其中黃尿酸-8-O- P -D-糖苷在所述生物樣品中的水平升高與疾病相 關(guān)。
31. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的疾病選自高血壓、水腫、 急性腎衰竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹水、眼內(nèi)壓上升、腎病綜合征或涉及流體/鈉平衡失調(diào)的其它疾病狀態(tài)。
32. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的生物樣品為尿樣。
33. 權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的生物樣品為血清樣品。
34. 用于對(duì)生物樣品中黃尿酸-8-0- P -D-糖苷進(jìn)行色語定量的方 法，該方法包含a. 獲得生物樣品；b. 將已知體積的生物樣品注入HPLC單元柱；和c. 測(cè)定生物樣品中與黃尿酸-8-O- P -D-糖苷標(biāo)準(zhǔn)品相比黃尿酸 -8-0-P-D-糖苷的量。
35. 治療與黃尿酸-8-O-p-D-糖苷異常水平相關(guān)的疾病的方法，該 方法包含基于人生物樣品中黃尿酸-8-O- P -D-糖苷檢測(cè)水平給予藥物有效 量的權(quán)利要求1所述的組合物。
36. 權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的疾病選自高血壓、水腫、 急性腎衰竭、充血性心力衰竭、慢性腎衰竭、腹水、眼內(nèi)壓上升、腎病 綜合征或涉及流體/鈉平衡失調(diào)的其它疾病狀態(tài)。
37. 治療與鈉重吸收減少相關(guān)的疾病或病癥的方法，該方法包含給 予治療有效量的黃尿酸-8-O- P -D-糖苷拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及利尿劑物組合物和方法并且特別涉及式I的某些衍生物或其前體藥物或藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體。
文檔編號(hào)G08B13/14GK101443823SQ200580048085
公開日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2005年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月20日
發(fā)明者C·D·凱恩, M·斯徹莫茲勒, M·梅特科尼克, N·布瑞克, S·沙恩克爾 申請(qǐng)人:納圖龍公司